Yöntem makalesi

Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl hidrolizi, A Kolorimetrik Özellikle Granzim B proteolitik aktivitesini ölçer Deneyi

DOI:

10.3791/52419

⸱

28 Kasım 2014

 ,  , 
1Cancer Immunology Program, Peter MacCallum Cancer Centre

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan, fare veya sıçan Granzyme B'nin (GzmB) proteolitik aktivitesini spesifik olarak ölçen basit, kantitatif bir kolorimetrik testi tanımlıyoruz. Bu protokol, uygun bir tanıma dizisi ile diğer sentetik peptit substratlarının hidrolizi yoluyla diğer granül serin proteazların proteaz aktivitesini belirlemek için kolayca uyarlanabilir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Serin proteaz Granzyme B (GzmB), sitotoksik T lenfositleri (CTL) veya doğal öldürücü (NK) hücreler tarafından salındığında hedef hücre apoptozuna aracılık eder. GzmB, insanlarda ve farelerde en çok çalışılan granzimdir ve bu nedenle araştırmacılar, patofizyolojideki işlevini ve rolünü incelemek için özel ve güvenilir araçlara ihtiyaç duyarlar. Bu, özellikle yapısal veya işlevsel olarak ilişkili kaspazlar veya diğer granzimler gibi proteazları tanımayan tahlilleri gerektirir. Burada, GzmB'nin aspartik asit kalıntılarından sonra bölünme tercihini peptit tiyoester Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl kullanarak kolorimetrik bir testte uyguluyoruz. GzmB, bu substratı parçalayabilen tek memeli serin proteazdır. Substrat, insan, fare ve sıçan GzmB tarafından benzer bir verimlilikle parçalanır, bu özellik ticari olarak temin edilebilen diğer peptit substratları tarafından paylaşılmaz, hatta bazıları bu amaç için uygun olarak ilan edilir. Bu protokol, aktive edilmiş NK hücrelerinden veya CTL'den fraksiyone edilmemiş lizatlar kullanılarak gösterilmiştir ve doğru kontrollerin kullanılması koşuluyla, çeşitli prokaryotik ve ökaryotik sistemlerde üretilen rekombinant proteazlar için de uygundur. Bu test, memeli lenfositlerindeki sitotoksik moleküllerin ve çeşitli metodolojilerle ifade edilen rekombinant muadillerinin potansiyel pro-apoptotik aktivitesini belirlemek için oldukça spesifik bir yöntemdir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Granzymes doğal katil (NK) hücreler ve sitotoksik T lenfositler (CTL), 1 salgılama lizozomlarında bulunan serin proteaz ailesidir. Beş farklı granzymes insanlarda (A, B, H, K ve M,) 'de bulunan, ve farelerde on (A - G, K, M ve N) 2,3. Granzim A ve Granzim B (GzmA, GzmB) en bol miktarda bulunan ve geniş ölçüde insan ve kemirgen ortamda araştırılmıştır.

GzmB klasik fonksiyonu hedef hücre sitosol 4 ulaşmak için Granzim izin gözenek oluşturucu protein perforin ile bağlantılı olarak yürütülen, hedef hücrelerde apoptoz endüksiyonu. GzmB sentezleme tümden sitotoksik lenfositlerinin de bulunmasına rağmen, son zamanlarda yapılan çalışmalar bazofiller 6, mast hücreleri 7, plazmasitoid dendritik hücreler 8 ve B hücreleri 9, aşağıdakileri içeren, ancak keratinositler 5 ile sınırlı değildir, başka bir GzmB ifade eden hücre tipleri, çeşitli ele edilmiştir, 10.Bu bağlamda, apoptotik olmayan GzmB fonksiyonları, enflamatuar süreçler, doku tekrar modellemesinde ve diğer bağışıklık düzenleyici özelliklerinin 11-14 katılım kadar ortaya çıkmıştır.

Daha geniş bir biyolojik rolü, daha önce şüphe daha GzmB önerilmiştir göz önüne alındığında, araştırmacılar da tespiti için güvenilir ve özel araçlar gerektirir. Avantajlı olarak ökaryotik serin proteazları 15 arasında benzersiz aspartik asit kalıntısı, bir özelliği karboksil yanı üzerinde bölmek için GzmB spesifik bir gerekliliktir. Fare, insan ve sıçan GzmB ancak fare GzmB uzun alt-tabaka özgüllüğü terminali (P1) Asp, bazı genel alt-tabakalar GzmB tarafından etkin bir şekilde klivaj edilebilir olduğu anlamına gelir, hem insan ve fare 16, bu ustaca farklıdır, yapısal olarak çok benzer Üç türlerinden, üst baş P1 daha karmaşık dizileri ile diğer alt-tabakalara ise, geniş çapta değişkendir sonuçlar verebilir. Geçmişte ve daha yeni li hem deterature, bu gerçeği dikkatle kontrol olsa, önemli karışıklık ve bazı deneysel bulguların biyolojik önemi yanlış yorumlanmasına neden oldu, kinetik çalışmalar durumu 17 düzeltmek için çalışmışlardır.

Bu yazıda, iki ticari olarak temin edilebilen alt tabakalar, yani, Boc-Ala-Ala-Asp-SBzl ve N-asetil-Ile-Glu-Pro-Asp-p-nitroanilid kullanılarak, bu noktaları göstermek için çalışmışlardır. İki reaktifler bölünme (bir floresan serbest paranitroanilide karşı serbest sülfidril) Aşağıdaki farklı reaktif gruplar oluşturmak, ama bu proteolitik bölünme üzerinde hiçbir etkisi ne olursa olsun sahip. Açıklanan protokol, çok eski bir protokol 18 modern bir uyarlamasıdır, fakat, aynı zamanda, GzmA ve GzmH gibi diğer granzymes aktivitesini tespit etmek için bir yöntem çerçeve sağlarken araştırmacılar, uygun farklı GzmB alt tabakaları kullanır yardımcı olacaktır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: farelerden elde edildi Dalaklar (yaş 6-10 hafta) ve tüm hayvan deneyleri Peter MacCallum Kanser Merkezi (E486) hayvan etiği kurallarına göre yapılmıştır.

Örneklerin 1. hazırlanması.

  1. Aktif fare NK hücrelerinin hazırlanması.
    1. Ticari olarak temin edilebilen kitler kullanılarak negatif seçim ile (GzmB gen boş) fareler - / - C57BL / 6 ya da B6.GrzmB dalak tek hücre süspansiyonları, birincil saf NK hücrelerini izole edin.
    2. Üreticilerin protokolünü izleyin. Kısaca, manyetik T ve B hücreleri, dendritik hücreler, granülositler, makrofajlar ve spesifik yüzey belirteçleri karşı biyotin-konjuge antikor ile kırmızı kan hücreleri gibi "NK-olmayan" hücreleri etiketlemek. "Non-NK" hücreleri tüketmek anti-Biyotin boncuklar ile manyetik ayırma kullanın.
    3. Kültür, 24 oyuklu plakalar içinde 700,000 hücre / ml IL-2 (1000 U / ml) ihtiva eden ortam içinde 5-7 gün için, NK hücreleri izole37 ° C'de   ° C.
    4. Seçenek olarak ise, kullanım 19 T-hücreleri, OT1 T hücresi reseptörü transgenik fareler 20 birincil antijen sınırlı CTL CTL salgılanan GzmB 19 aktivitesini belirlemek için aktif NK hücrelerinden karma lenfosit kültürleri 21 ya da yüzer üretilen aktif.
  2. Insan NK hücre hattı ve birinci NK hücrelerinin izolasyonu bakımı.
    1. % 10 cenin dana serumu ile takviye edilmiş Roswell Park Memorial Institute (RPMI) ortamında insan NK lösemi (YT hücre) koruyun. Seçenek olarak ise, sağlıklı bireylerden alınan periferal kanda, primer, NK hücrelerinin saflaştırılması ve daha önce tarif edildiği gibi 22, IL-2, 100 U / ml sonda yoğunluğunda içeren bir ortam içinde 2-3 gün için harekete geçirir.
  3. Hücre lizatlarının üretilmesi.
    1. PBS (pH 7.4) içinde hücreleri üç kez yıkayın, sonra Nonidet P-40 liziz tamponunda askıya (% 0.1 NP-40, 250 mM NaCI, 25 mM Hepes, 2.5 mM EDTA). İdeal olarak, 5 x 10 6, en az lize 7 T hücreleri> kadar. Proteaz inhibitörleri ekleme, birçok gibi GzmA gibi geri dönüşü olmayan bir serin proteaz inhibitörleri ve özellikle tryptases içindedir. 20 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir ve daha sonra 10 dakika boyunca 15.000 x g'de bir mikrosantrfuj çekirdekleri pelet. Nükleer pelet atın ve yeni bir tüp süpernatant aktarın.
  4. Lisatların protein konsantrasyonu belirlenir.
    1. Örneğin Bradford veya bisinkoninik asit (BCA) olarak tercih edilen ticari olarak temin edilebilen bir protokol kullanarak protein konsantrasyonunu belirleyin. Konsantrasyonu ~ 2 mg / ml az olduğundan emin olun. Gerekene kadar -20 ° C'de saklayın lisatları (granzim aktivitesi, -20 ° C'de birkaç ay boyunca stabildir).

2. Granzim B Aktivite Deneyi

  1. Reaktiflerin hazırlanması
    1. DMSO içinde substratların (Boc-AAD-S-Bzl veya Ac-IEPD-pNA) içindeki bir 10mM stok hazırlayın (~ 5 mg / ml) -20 & # 'de parçalar halinde ve mağaza176 ° C. Taze bir çalışma seyreltme hazırlayın ve Boc-AAD-S-Bzl kısmen DMSO içinde depolama hidrolize olarak, her gün sonra atın.
    2. -20 ° C'de, 250 mM DMSO içinde kolorimetrik reaktif (5,5'-ditiyo-bis (2-nitrobenzoik asit), DTNB) stok (0.09 g / ml) ve mağaza hazırlayın. Her gün taze bir çalışma seyreltme hazırlayın. Bu reaktif sadece SBzl gösterge değil, gruplar pNA alt tabakalar için gereklidir.
    3. Taze tampon (0.1 M HEPES, 0.05 M MgCl2, pH 7.3) her 2-3 hafta sonra yapılır.
  2. Oda sıcaklığına DTNB ve sentetik yüzeylerde getirin. Seyreltik alt-tabakalar (1:16, örneğin, 1.6 ml tampon içinde 100 | il) ve DTNB (1: 250, örneğin 10 2.5 mi tampon maddesi içinde ul) ve iyice karıştırın.
  3. 160 ul son hacim olması için tampon maddesi içinde her bir numunenin 100 ug protein lizat az seyreltin. Bir çok kanallı pipet kullanarak bir "'U' alt vinil 96 oyuklu plaka (~ 33.3 ug / çukur), üç kopya halinde oyuk başına 50 ul ekle.Bir "tampon sadece" kontrol dahil (ayrıca üç kopya halinde).
  4. Ac-IEPD-pNA ile çalışırken örnekleri / tampon kontrolüne seyreltilmiş DTNB 100 ul ekleyin (bu adımı atlayabilirsiniz.
    NOT: GzmB tarafından Ac-IEPD-pNA'nın yarılması doğrudan fluorojenik pNA (Şekil 4B) serbest bırakır.
  5. Sonra hızlı bir şekilde tampon herhangi bir olumsuz kontroller ile başlayan ve beklenen olumlu örnekleri ile terbiye, üçlü her set için seyreltilmiş yüzeylerde 50 ul eklemek için bir çok kanallı pipet kullanın.
  6. Plaka okuyucu plaka koyun. OD 405 nm'de bir mikro-plaka okuyucusu içinde Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl / Ac-IEPD-pNA hidrolizi ile Asp-az aktivitesi ölçülür. 25 okuma, her 15 sn (yaklaşık 6 dk, toplam okuma süresi) almak, bir kinetik tahlil protokolü kullanın.
  7. Plaka okuyucu yazılım Vmax için bir değer oluşturmak değil eğer elle substrat bölünme oranını hesaplamak için her zaman noktasında oluşturulan absorbans okumaları kullanın.

Da 3. Analizta

NOT: Zamanla OD değişikliği (mOD / dk) olarak tanımlanan maksimum hız olarak sunulmaktadır üretilen veriler,.

  1. Verileri analiz etmek için, absorbans değişikliği oranı hesaplanır alt-tabaka bölünme maksimum hızını belirler. Otomatik genellikle bu seçeneği vardır plaka okuyucu yazılımı kullanarak yapın.
  2. Alternatif elle, plaka okuyucu üzerinde kinetik tahlil sırasında oluşturulan absorbans değişim, kinetik araziler görüntüledikten sonra dik düz bir çizgi verir veri noktalarını seçin. En deneyleri için maksimum hız tahlilin ilk 2 dakika içinde elde edilmektedir.
  3. Zaman aralığı bu düz çizgi ve bölünmenin en yüksek OD okuma başlangıç ​​OD okuma çıkartın. İstatistiksel analiz ve grafik ekran için Microsoft Excel / Graph pad ham veri aktarın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Boc-AAD-S-Bzl, alt-tabaka GzmB için spesifiktir

serin proteaz GzmB sitotoksik lenfositleri (CTL ve NK hücreleri) önemli bir bileşeni olan ve bu tip virüs ile enfekte olmuş veya dönüştürülmüş hücreler gibi hedef hücrelerin hızlı apoptotik ölümünü teşvik etmek için ağırlıklı olarak sorumludur. Bu durum, seçilen proteinler bazı özel aspartat kalıntısı sonra yarılma için alt-tabaka tercihine büyük ölçüde, bir öznitelik de aspartat kalıntısı sonra bölmek kaydıyla proteazlar, fark...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tarihsel olarak granzymes hedef hücreler hızlı bir apoptotik ölümünü indükleyebilen sitotoksik lenfositleri (CTL ve NK hücreleri) anahtar etkeni moleküller olarak tespit edilmiştir. Bu, aspartat (D) artıklarının hedef alt-tabaka molekülleri ayrılır ve böylece aşağı doğru hedeflerin çeşitli yanı sıra her ikisi de yaran ön-kaspaz kaspaz kaskadını aktive mümkün GzmB aksiyonu için esas oldu. Bununla birlikte, şu anda GzmB sentezleme lenfoid sitotoksik hücreler ile sınırlı değildir ve bunların fonksiyonu, hedef hücre tanıma ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Deutsche Forschungsgemeinschaft'tan (DFG, Alman Araştırma Vakfı) MH'ye HA 6136/1-1 hibesi ile destek aldı. JAT, Avustralya Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi'nden Program ve Proje Hibeleri ile desteklenmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Boc-Ala-Ala-Asp-S-BzlSM Biochemicals LLC, CASMSB05Granzyme B substratı (fare ve insan)
Ac-IEPD-pNA SM Biochemicals LLC, CASMPNA009Granzyme B substratı (sadece insan)
N-α-CBZ-L-lizin-S-BzlSigma-AldrichC3647Granzyme A substratı
Suc-Phe-Leu-Phe-S-BzlSM Biochemicals LLC, CASB025Granzyme H substrat
5,5'-dithio-bis (2-nitrobenzoik asit) & nbsp;Sigma-AldrichD8130DTNB, Ellman' s Reaktif
NK hücre izolasyon kiti II fareMiltenyi Biotec GmbH130-096-892negatif seçim kiti
NK hücre izolasyon kiti insanMiltenyi Biotec GmbH130-092-657negatif seçim kiti
Plaka okuyucuBiorad iMarkBiorad Microplate Manager Yazılım Sürümü MPM6.3
Serocluster U-alt vinil 96 oyuklu plakaCorning, MA, ABD2797

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Trapani, J. A., Browne, K. A., Dawson, M., Smyth, M. J. Immunopurification of functional Asp-ase (natural killer cell granzyme B) using a monoclonal antibody). Biochem Biophys Res Commun. 195 (2), 910-920 (1993).
  2. Ewen, C. L., Kane, K. P., Bleackley, R. C. A quarter century of granzymes. Cell Death Differ. 19 (1), 28-35 (2012).
  3. Hoves, S., Trapani, J. A., Voskoboinik, I. The battlefield of perforin/granzyme cell death pathways. J Leukoc Biol. , (2009).
  4. Peters, P. J., et al. Cytotoxic T lymphocyte granules are secretory lysosomes, containing both perforin and granzymes. J Exp Med. 173 (5), 1099-1109 (1991).
  5. Berthou, C., et al. Acquisition of granzyme B and Fas ligand proteins by human keratinocytes contributes to epidermal cell defense. J Immunol. 159 (11), 5293-5300 (1997).
  6. Tschopp, C. M., et al. Granzyme B, a novel mediator of allergic inflammation: its induction and release in blood basophils and human asthma. Blood. 108 (7), 2290-2299 (2006).
  7. Strik, M. C., et al. Human mast cells produce and release the cytotoxic lymphocyte associated protease granzyme B upon activation. Mol Immunol. 44 (14), 3462-3472 (2007).
  8. Jahrsdorfer, B., et al. Granzyme B produced by human plasmacytoid dendritic cells suppresses T cell expansion. Blood. , (2009).
  9. Hagn, M., et al. Human B cells secrete granzyme B when recognizing viral antigens in the context of the acute phase cytokine IL-21. J Immunol. 183 (3), 1838-1845 (2009).
  10. Hagn, M., et al. Human B cells differentiate into granzyme B-secreting cytotoxic B lymphocytes upon incomplete T-cell help. Immunol Cell Biol. 90 (4), 457-467 (2012).
  11. Froelich, C. J., Pardo, J., Simon, M. M. Granule-associated serine proteases: granzymes might not just be killer proteases. Trends Immunol. 30 (3), 117-123 (2009).
  12. Hagn, M., Jahrsdorfer, B. Why do human B cells secrete granzyme B? Insights into a novel B-cell differentiation pathway. Oncoimmunology. 1 (8), 1368-1375 (2012).
  13. Susanto, O., Trapani, J. A., Brasacchio, D. Controversies in granzyme biology. Tissue Antigens. 80 (6), 477-487 (2012).
  14. Walch, M., et al. Cytotoxic cells kill intracellular bacteria through granulysin-mediated delivery of granzymes. Cell. 157 (6), 1309-1323 (2014).
  15. Odake, S., et al. Human and murine cytotoxic T lymphocyte serine proteases: subsite mapping with peptide thioester substrates and inhibition of enzyme activity and cytolysis by isocoumarins. Biochemistry. 30 (8), 2217-2227 (1991).
  16. Casciola-Rosen, L., et al. Mouse and human granzyme B have distinct tetrapeptide specificities and abilities to recruit the bid pathway. J Biol Chem. 282 (7), 4545-4552 (2007).
  17. Kaiserman, D., et al. The major human and mouse granzymes are structurally and functionally divergent. J Cell Biol. 175 (4), 619-630 (2006).
  18. Powers, J. C., Kam, C. M. Peptide thioester substrates for serine peptidases and metalloendopeptidases. Methods Enzymol. 248, 3-18 (1995).
  19. Hagn, M., et al. Activated mouse B cells lack expression of granzyme. B. J Immunol. 188 (2), 3886-3892 (2012).
  20. Konjar, S., et al. Human and mouse perforin are processed in part through cleavage by the lysosomal cysteine proteinase cathepsin L. Immunology. 131 (2), 257-267 (2010).
  21. Sutton, V. R., et al. Residual active granzyme B in cathepsin C-null lymphocytes is sufficient for perforin-dependent target cell apoptosis. J Cell Biol. 176 (4), 425-433 (2007).
  22. Trapani, J. A., Smyth, M. J., Apostolidis, V. A., Dawson, M., Browne, K. A. Granule serine proteases are normal nuclear constituents of natural killer cells. J Biol Chem. 269 (28), 18359-18365 (1994).
  23. Cullen, S. P., Adrain, C., Luthi, A. U., Duriez, P. J., Martin, S. J. Human and murine granzyme B exhibit divergent substrate preferences. J Cell Biol. 176 (4), 435-444 (2007).
  24. Thornberry, N. A., et al. A combinatorial approach defines specificities of members of the caspase family and granzyme B. Functional relationships established for key mediators of apoptosis. J Biol Chem. 272 (29), 17907-17911 (1997).
  25. Bird, C. H., et al. Selective regulation of apoptosis: the cytotoxic lymphocyte serpin proteinase inhibitor 9 protects against granzyme B-mediated apoptosis without perturbing the Fas cell death pathway. Mol Cell Biol. 18 (11), 6387-6398 (1998).
  26. Bots, M., Medema, J. P. Serpins in T cell immunity. J Leukoc Biol. 84 (5), 1238-1247 (2008).
  27. Sun, J., et al. A new family of 10 murine ovalbumin serpins includes two homologs of proteinase inhibitor 8 and two homologs of the granzyme B inhibitor (proteinase inhibitor 9). J Biol Chem. 272 (24), 15434-15441 (1997).
  28. Bird, C. H., Hitchen, C., Prescott, M., Harper, I., Bird, P. I. Immunodetection of granzyme B tissue distribution and cellular localisation. Methods Mol Biol. 844, 237-250 (2012).
  29. Jenkins, M. R., et al. Visualizing CTL activity for different CD8+ effector T cells supports the idea that lower TCR/epitope avidity may be advantageous for target cell killing. Cell Death Differ. 16 (4), 537-542 (2009).
  30. Edwards, K. M., Kam, C. M., Powers, J. C., Trapani, J. A. The human cytotoxic T cell granule serine protease granzyme H has chymotrypsin-like (chymase) activity and is taken up into cytoplasmic vesicles reminiscent of granzyme B-containing endosomes. J Biol Chem. 274 (43), 30468-30473 (1999).
  31. Sutton, V. R., et al. Initiation of apoptosis by granzyme B requires direct cleavage of bid, but not direct granzyme B-mediated caspase activation. J Exp Med. 192 (10), 1403-1414 (2000).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Granzim B AktivitesiNK H cresi LizatProteolitik Aktivite l mSubstrat SpesifitesiDTNB ReaksiyonuMikroplaka OkuyucuGranzim B NakavtSitotoksik Lenfositler

İlgili makaleler