Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Fare Omurilik Hücresel Dynamics İki foton Görüntüleme

10.2K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/52580

⸱

22 Şubat 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Molecular Biology and Biochemistry, University of California, Irvine, 2Physiology and Biophysics, University of California, Irvine, 3Neurobiology and Behavior, University of California, Irvine, 4University of California San Francisco Diabetes Center, University of California, San Francisco, 5Pathology, University of Utah

Bu makalede

Özet

Fare omuriliği görüntülenmesi için yeni bir ex vivo hazırlık. Bu protokol, omurilik boyunca canlı hücresel etkileşimlerin iki foton görüntüleme için izin verir.

Özet

İki foton (2P) mikroskobu, canlı, sağlam dokuların derinliklerindeki hücresel dinamikleri ve etkileşimleri ortaya çıkarmak için kullanılır. Burada, murin omuriliğinde canlı hücre görüntüleme için bir yöntem sunuyoruz. Bu teknik, nöroinflamatuar demiyelinizan bozukluklar geçiren omuriliğe transplantasyonu takiben nöral öncü hücre (NPC) dinamiklerini analiz etmek için benzersiz bir şekilde uygundur. NPC'ler aksonal hasar bölgelerine göç eder, çoğalır, oligodendrositlere farklılaşır ve doğrudan remiyelinizasyona katılır. NPC'ler bu nedenle kronik demiyelinizan hastalıkları iyileştirmek için umut verici bir terapötik tedavidir. Nakledilen NPC'ler omuriliğin ventral tarafındaki hasarlı bölgelere göç ettiğinden, geleneksel intravital 2P görüntüleme imkansızdır ve daha önce histokimyasal boyama yaklaşımları kullanılarak yalnızca statik etkileşimler hakkında bilgi mevcuttu. Bu yöntem, ventral omurilikte nakledilen NPC'leri görüntülemek için oluşturulmuş olsa da, tüm omurilik boyunca nakledilen ve endojen hücrelerin çok sayıda çalışmasına uygulanabilir. Bu makalede, gelişmiş sarı floresan protein eksprese eden aksonlar ve gelişmiş yeşil floresan protein eksprese eden nakledilen NPC'ler ile bir omuriliğin hazırlanmasını ve görüntülenmesini gösteriyoruz.

Giriş

Deneysel otoimmün ensefalomyelit (EAE) ve neuroadapted fare hepatit virüsü (Geminin) ile intrakranial enfeksiyon dahil demiyelinizasyon Fare modelleri, moleküler yollar ve hastalıkla ilişkili hücresel etkileşimleri çalışmak için mükemmel araçlardır. Onlar yol ve FDA etkinliği ağırlıklı olarak otoimmünite ve inflamasyon 1 durması hedefleyen, ilaç tedavileri kabul desteklemiştir. Endojen remiyelinizasyon başarısız sonra, ancak, şu anda onaylanan terapiler, etkili bir şekilde, merkezi sinir sisteminde miyelin kaybetmiş lezyonlar, onarım yapmaz. Bu nedenle, hastalığın bu aşamada onarım odaklı tedaviler kronik semptomlar ve yaşam kalitesinin iyileştirilmesi giderilmesi için kritik öneme sahiptir. Son zamanlarda, nöral öncü hücreler (NPC) inflamasyon ve demiyelinizasyon alanları hedef potansiyel rejeneratif tedavi yöntemi olarak ön plana çıkmıştır. Çeşitli çalışmalar, endogeno indükleme NPC yeteneğini ortaya çıkarmıştırBize remiyelinizasyon ve remiyelinizasyon 2-8 doğrudan katılmak. NPC doğrudan remiyelinizasyon dahil Çünkü, bu nakli sonrası endojen hücreler ile kinetik ve etkileşimleri anlamak şarttır. Transplantasyon sonrası, NPC sonra rostrally ve nakli sitesine 5,9 kaudal göreli beyaz cevher hasarı alanları ile ventral göç. göç kinetik çevresel uyaranlara yanıt olarak farklılık; Olmayan bir hasar omuriliğe nakledilen NPC hasarlı omurilik 6 nakledilen NPC daha büyük hızlara sahip. Bir göç süre sonra, bir sağlıklı omurilik 6 bozuk bir omurilik nispetle daha yüksek bir hızda, NPC yaygın olarak çoğalırlar transfer edilir. Son olarak, NPC çoğunluğu oligodentrositlere farklılaştırmak ve doğrudan remiyelinizasyon 4,6,9 başlatmak.

miyelin kaybetmiş lezyon karmaşıktır ve çeşitli aşamalarında bir hücre, farklı popülasyon ihtiva edebilirctivation. Örneğin, bir aktif multipl skleroz (MS), lezyon aktive edilmiş T hücreleri, M1, mikroglia ve M1 makrofajlar, ancak kronik sessiz MS lezyon temel olarak birkaç enflamatuar hücreler 10-13 ile reaktif astrositler içerebilir önemli bir nüfus içerebilir. Çünkü efektör hücrelerin çeşitliliği, demiyelinizasyon fare modellerinde iki-foton (2P) görüntüleme lezyon içinde yerel hücresel etkileşimleri anlamak için son derece yararlı bir araçtır. MS ve birçok yaygın olarak kullanılan MS araştırma modellerinde, lezyonların çoğunluğu nedeniyle lezyon derinliği ve omurilik yüksek yağ içeriği omurilik, intravital 2P görüntüleme erişilemez bir bölge ventral tarafında yer almaktadır. Ventral spinal kord boyunca lezyonlarında bu konuları ve çalışma hücre-hücre etkileşimleri aşmak için biz ex vivo 2P görüntüleme hazırlık 6 basit geliştirdik.

Bu çalışma gösterdi Önceki yöntemler yayın, takipMHV kaynaklı demiyelinasyon 14 JHMV suşu ardından fare omuriliğe gelişmiş yeşil floresan protein (EGFP) -expressing NPC nakli için prosedür. Beş haftalık fareler JHMV ile enfekte ve gün 14 sonrası enfeksiyon torakal seviyede 9'da eGFP-NPC ile nakledilen. Burada sunulan protokol bir ex vivo agaroz hazırlık yapmak, omuriliği ayıklamak ve gelişmiş sarı floresan protein (EYFP) -expressing akson görüntü nakledilen eGFP-NPC etkileşimleri konusunda ayrıntılı adımları sağlar. Nöronal spesifik Thy1 promotörün kontrolü altında EYFP sentezleyen Fareler Bu prosedür 15 kullanılmıştır. Sadece akson bazı bireysel aksonlar görüntüleme için yararlı hale EYFP ifade eder. Burada 7 gün transplantasyon sonrası çıkarılmış omurilikleri göstermektedir; Bununla birlikte, omurilik transplantasyonundan sonra herhangi bir zaman noktasında elde edilebilir. Zarar görmüş aksonlar NPC etkileşimlerini gösterirken, protokol genetik floresan işaretler ile kombinasyon halinde de kullanılabilirdiğer hücre türleri fare omurilik oluşan hücresel etkileşimler çok sayıda araştırmak.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

NOT: Etik Açıklama: hayvan taşıma için protokol California, Irvine, protokol # 2010-2943 Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı.

Omurilik 1. Kaldırma

  1. Bölmesine euthanizing içinde ~% 100 sıvı izofluran, USP ile ıslatılmış kağıt havlu yerleştirin ve üstüne kuru kağıt havlu yerleştirin. Fare izofluran dokunmadan değil çok kuru kağıt havlu üstüne odasında fare yerleştirin ve oda kapalı olduğundan emin olun. Fare ötenazi olduğundan emin olmak için nefes kesilmesinden sonra en az bir dakika bekleyin.
  2. Fare ötenazi sağlamak için boyun spinal transeksiyonu gerçekleştirin. Bu omuriliği zarar verebilir gibi bir servikal dislokasyon yapmayın.
  3. Saç ıslak% 70 etanol ile fare püskürtün.
  4. (Yaklaşık servikal lamina 1 omuriliğe maruz C1 fare arkasından saç ve cilt kaldırmak için keskin bir makas kullanın İnce) Sakral lamina 4 (S4) için.
  5. Bir 10. bıçak ile bir neşter kullanarak, kas ve yağ ayırmak için omurganın sol ve sağ kesiler yapmak. Bu omurilik çıkarılması çok daha kolay hale getirecek.
  6. opsiyonel: eğimli bir Luer rongeurs ilave etini kepçe için kullanılabilir.
  7. Tırtıklı Graefe forseps ile omurilik vertebra üst tutarken, omurilik dokunmamaya dikkat ederek, yukarı C1 maruz omuriliğin içine kavisli tarafı titanyum kavisli Vannas makas yerleştirin.
  8. Tüm yol sağa titanyum kavisli Vannas makas kaydırın ve bir küçük bir kesim yapmak. Küçük krizi sesi duydum ve makas omurları kesilerek olarak hissettim edilmelidir. Kablonun kadar sol tarafında bu kesim tekrarlayın. Çok hızlı gitmek veya bu makas ile kabloya zarar riski gibi bir kesim çok büyük yapmak için dikkatli olun.
  9. Tek lamina omurları kenarları kesilir kez forseps ile kaldırılması gerekir. Rtutun ve omurilik vertebra geri çekmeye devam S4 kadar her tabakanın için bu adımı EPEAT.
    NOT: nakli sitesine kısmak kez nakli sitenin üstünde vertebra olasılıkla kapalı gelecektir. Sadece nakli sitesi altında başlayan prosedürü devam edin.
  10. İsteğe bağlı: nakli site ve ölçü ve ~ nakli sitesine 20 mm rostral ve kaudal kesmek nerede görmek için aşağı omurga yatıyordu.
    NOT: Daha fazla genellikle 15 mm'den daha öteye göç yok nakledilen NPC olarak ihtiyaç olmayacaktır NPC nakli. gerekli omurilik miktarı nakledilen hücre tipi deney ve göç özelliklerine bağlı olacaktır. Nakli sitesine eşit uzaklıkta olan rostral ve kaudal kesim yapma görüntüleme sırasında daha kolay bulunduğu için nakli sitesini sağlayacaktır.
  11. # 11 bıçak ile bir neşter kullanılarak dikkatle sağda ganglionlar kesti ve rostral sonunda başlayan omurilik ventral tarafında sol. Bu ağırlıkhasta daha kolay ventral omurları kaldırılacak omuriliği etkinleştirin.
    NOT: Hızlı Bitti (1,7-1,11 adımları), spinal kord kurumasına olmayacaktır. Bununla birlikte, 1 x PBS nemli tutmak için kordon tatbik edilebilir.
  12. Fareyi ters çevirin ve böylece omurilik aşağı bakacak fareyi tutun. Dikkatle kapalı dişli Graefe forseps kullanarak omuriliği dışarıda soyun. Omuriliği nicklemek olmadan, dikkatle omurilik tek sağlam bir parça dışarı kaldırdı izin vermek için kalan ganglionlar kesti.
  13. Spinal kord RPMI-1640 olduğundan emin olun ve 2P mikroskop ulaşım için buz üzerine yerleştirin.

Görüntüleme Omurilik 2. Hazırlık

  1. Agaroz omuriliği katıştırma
    1. Görüntü vermeden önce, buz üzerinde soğutulmuş, RPMI-1640 içinde ve izole spinal tutun.
    2. Agaroz (düşük jelleşme sıcaklığı) tartıldı ve 1 x PBS, 5 ml% 5 solüsyon hazırlanır. Ag çözmek için 15 saniye için% 5 agaroz çözümü mikrodalgaortaya çıkan ve 37 ° C serin çözüm sağlar.
    3. Ventral yüzü yukarı bakacak Parafilm bir levha üzerine yerleştirilerek omuriliği hazırlayın.
    4. Pipet omurilik ventral yan üzerinde 5% agaroz çözeltisi, yaklaşık 5 mi. Agaroz, oda sıcaklığına kadar soğutma yoluyla katılaşır olsun. Tam katılaşma yaklaşık 5 dakika sürer.
    5. 22 mm kare kapak kayma doku yapıştırıcı hafif bir kat uygulayın.
    6. Parafilm ventral tarafı yerleştirerek, gömülü omuriliği ters çevirin. dorsal tarafı şimdi karşı karşıya olacak. Dorsal tarafına kapak kayma uyun ve yapıştırıcı katılaşmaya RMPI agaroz gömülü omurilik / kapak kayma hazırlık daldırın. Aşırı bir jilet kullanarak agaroz katılaşmış çıkarın.
  2. Mikroskop sahnede omuriliği Montaj
    1. Kapak kayma altına vazelin uygulayın. Bu perfüzyon sırasında hazırlık stabilize edecek.
    2. Bir omurilik hazırlık yerleştirin25X daldırma hedefi doğru yukarı bakacak ventral yüzü mikroskop sahnede iyi görüntüleme. ısmarlama görüntüleme de yaklaşık 20 mm, 50 mm uzunluğunda derin ve karşısında 50 mm.
    3. Resim oksijenli ısıtılmış ile hazırlanması (37 ° C) superfusing ise serumsuz (95: karbon dioksit karbojen: 5 oksijen), RPMI-1640 ortamı.
      1. Pre-sıcak su banyosu içinde 37 ° C'ye kadar ortam ve ortam şişeye borunun sokulmasıyla boru pompasına bağlanır.
      2. Bölmeye boru bağlantısı 37 ° C arasındaki bir ısıtıcı cihaz ile ortam sıcaklığı muhafaza edin. Superfuse ortam maddesi de yoluyla 3 mL / tüp pompası (Şekil 1B) bağlı bir hortum kullanılarak Min.

Ventral Omurilik 3. 2P Görüntüleme

  1. Mikroskop Kurulum
    1. 900 nm ayarlı Sapphire lazer: Bir Chameleon Ultra Ti kullanarak Thy1-EYFP omurilik görüntüleri edinin. Lazer gücünü zayıflatır<% 5 örnek minimum fototoksisite 16 sağlamak. Istikrarlı görüntüleme sağlamak için, ve doku sürüklenme ve hücresel hasarı önlemek için tek bir satır içi çözüm ısıtıcı kullanarak sabit 37 ° C'de oksijen-perfüze RPMI-1640 perfüze sıcaklığını korumak.
    2. EGFP ve EYFP floresan sinyalini ayırmak için, bilerek görünürlüğünü artırmak için yeşil emisyonu bölme, üç kanal içine 2P emisyon ayırmak için seri bir 520 nm tek kenar dikroik ve 560 nm tek kenar dichroic ışın ayırıcı yerleştirin.
      NOT: Bu kanal mavi-yeşil (emisyon <520 nm), (520-560 nm), yeşil-sarı, kırmızı ve (emisyon> 560 nm) olarak adlandırılır. Fotomultiplier tüpler her kanalda yayılan ışığın saptar.
  2. Ilgi yerlerinin görüntüleme alanları
    1. Mercek ve parlak bir alan ışık kaynağı kullanarak, bir referans noktası ayarlamak için omuriliğe ventral kenarında daldırma hedefi odak.
    2. Emin ortam ışık kaynağı kapalı ve sw olunLazer deklanşörü açarak 2P uyarım kaşıntı.
    3. Varsa ilgi alanları için doku ararken, son görüntüler satın alırken daha düşük bir çözünürlük ayarı, dijital zoom olmadan yüksek hacim ve yüksek tarama hızı kullanın. Ilgi bölge için doku arıyor bu sistem ile tipik ayarlar şunlardır: çözünürlük: 256 piksel; hacim: x = y 600 mikron = 600 mikron, z = 0-300 mikron.
    4. Spinal kord ventral kenarında EYFP aksonlar gözlemleyin. Kolajen (mavi) ikinci harmonik sinyal omurilik dokusu kenarında parlak olacaktır. EYFP aksonlar sadece kolajen ikinci harmonik sinyal dorsal bulun ve EYFP sinyali yeşil-sarı kanalda görüntülenmiştir.
    5. Omurilik hazırlama 14 uzunlamasına merkezi nakli sitesi bulun. EGFP-NPC nakli sonrası fareler 1 gün için, derin dokuya z düzleminde ışın yolunu odaklanarak nakli sitesini bulun. nakli sitesi will hayvanlar arasında biraz değişir ama genel olarak ventral kenarından ~ 200 mikron yer almaktadır. 1 gün sonra transplantasyonundan sonra farelerde ventral ve lateral kenarları daha yakın, beyaz madde yollarının EGFP-NPC kümeleri dikkate alınmalıdır.
  3. Nihai görüntüleri alınıyor
    1. 512 piksel görüntü çözünürlüğü Edinme; hacim: x = 270 y um, = 212 mikron ve z = 100 mikron kullanarak Slidebook 6 yazılımı. 2.5 mikron artışlarla sıralı odak uçakları alarak z-yığınları Derleme.
    2. Spinal kord herhangi göç nesnelerin hızlı ölçümünü sağlamak için ofset uygun geçmeli ile çift yönlü tarama gerçekleştirin. Omurilik yaklaşık 1 kare / sn içinde ideal bir kazanım kare hızı hücresel hız belirlemek için emin olun.
      NOT: Görüntüleme ayarları, satın alma kare hızı, görüntüleme çözünürlüğü ve görüntüleme hacimleri gibi bireysel kullanıcı tercihlerine, değiştirilebilir. Büyük görüntüleme hacimleri genellikle GIV de kazanmak için daha uzun sürertr çözünürlük.
    3. Böyle Bitplane Imaris 7.7 olarak görüntü analiz yazılımı ile kırpma, pürüzsüz, ve Pseudocolor Slidebook görüntü dosyaları, analiz. Slidebook ve Imaris bir otomatik işlem kullanarak ardışık görüntüleme birimleri penye nihai time-lapse videolar üretmek.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Çıkarılan omurilik görüntüleme protokolü omurilik içinde herhangi bir floresan görselleştirmek için kullanılabilir iken, bizim temsilcisi sonuçları EYFP-akson ile eGFP-NPC etkileşimleri göstermek. Öncelikle, biz Şekil 1A gömülü ventral spinal kord hazırlanmasını göstermektedir. Sonra, Şekil 1B 2P mikroskop kurulum ve anahtar bileşenleri göstermektedir. 2 ventral spinal kord içinde bir tek z-yığın içinde eGFP ve EYFP floresan gösterir Şekil. Ardışı...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Gerçek zamanlı sağlam doku 2P görüntüleme demiyelinize fare omuriliğe nakli sonrası NPC kinetik ve etkileşimleri araştırmak için gereklidir. Intravital 2P görüntüleme yaygın yaşayan farelerde omurilik dorsal tarafında hücresel dinamikleri belirlemek için kullanılır, ve hastalık 17-19 demiyelinizan dorsal demiyelinizasyonu incelemek için kullanılır olmuştur. Transplant NPC 2P mikroskopi kullanılarak yerinde görüntüye çok derin yatıyor ventral beyaz cevher, göç Ancak, bir ex vivo hazırlık gereklidir. B...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların hiçbir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma kısmen Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) Hibeleri R01 GM-41514 (MDC'ye), R39 GM-048071 (IP'ye) ve R01 NS-074987 (TEL'e) ve Ulusal Multipl Skleroz Derneği (NMSS) İşbirliği Merkezi Araştırma Ödülü CA1058-A-8 (C.M.W., T.E.L. ve MDC'ye), NMSS Hibe RG4925, NIH Eğitim Bursu T32-AI-060573 (MLG'ye), NMSS Doktora Sonrası Bursu FG 1960-A-1 (JGW'ye) ve George E. Hewitt Tıbbi Araştırma Vakfı'ndan (MPM) finansman.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Isoflurane, USPPiramal Critical Care, IncN/A
İnce makasGüzel Bilim Araçları14060-09keskin
neşter bıçağı #10Güzel Bilim Araçları10010-00
neşter sapıGüzel Bilim Araçları10003-12
Luer rongeursGüzel Bilim Araçları16001-15
Graefe forsepsGüzel Bilim Araçları11052-10
Vannas makasGüzel Bilim Araçları15615-08
neşter bıçağı #11Güzel Bilim Araçları10011-00
RPMI-1640Gibco12-115F
agaroz, düşük jelleşme sıcaklığıSigmaA9414-25G
ParafilmFisher Scientific13-374-12
Vetbond (doku yapıştırıcısı)3M1469SB
22 mm kare kapak kaymasıFisher Scientific12-547
25X daldırma objektifi, 1.1 NANikonCFI Apo, LWD 25XW
Tek sıralı çözelti ısıtıcısıWarner Instruments64-0102
520 nm tek kenarlı dikroik ışın ayırıcıSemrockFF520-Di02-25x36Brightline
560 nm tek kenarlı dikroik ışın ayırıcıSemrockFF560-FDi01-25x36Brightline
fotoçoğaltıcı tüplerHamamatsuR928
C/L değişken hızlı boru pompasıMasterflex77122-22
dijital termometreComar Instruments3501
Bukalemun Ultra Ti: Safir lazer TutarlıYok
Slidebook 6 yazılımı3iYok
Imaris 7.7 yazılımıBit DüzlemiYok
, , , , ,

Kaynaklar

  1. Robinson, A. P., Harp, C. T., Noronha, A., Miller, S. D. The experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) model of MS: utility for understanding disease pathophysiology and treatment. Handb Clin Neurol. 122, 173-189 (2014).
  2. Pluchino, S., Zanotti, L., Brini, E., Ferrari, S., Martino, G. Regeneration and repair in multiple sclerosis: the role of cell transplantation. Neurosci Lett. 456 (3), 101-106 (2009).
  3. Hatch, M. N., Schaumburg, C. S., Lane, T. E., Keirstead, H. S. Endogenous remyelination is induced by transplant rejection in a viral model of multiple sclerosis. J Neuroimmunol. 212 (1-2), 74-81 (2009).
  4. Totoiu, M. O., Nistor, G. I., Lane, T. E., Keirstead, H. S. Remyelination, axonal sparing, and locomotor recovery following transplantation of glial-committed progenitor cells into the MHV model of multiple sclerosis. Exp Neurol. 187 (2), 254-265 (2004).
  5. Tirotta, E., Carbajal, K. S., Schaumburg, C. S., Whitman, L., Lane, T. E. Cell replacement therapies to promote remyelination in a viral model of demyelination. J Neuroimmunol. 224 (1-2), 101-107 (2010).
  6. Greenberg, M. L., et al. Two-photon imaging of remyelination of spinal cord axons by engrafted neural precursor cells in a viral model of multiple sclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (22), E2349-E2355 (2014).
  7. Whitman, L. M., Blanc, C. A., Schaumburg, C. S., Rowitch, D. H., Lane, T. E. Olig1 function is required for remyelination potential of transplanted neural progenitor cells in a model of viral-induced demyelination. Exp Neurol. 235 (1), 380-387 (2012).
  8. Pluchino, S., et al. Injection of adult neurospheres induces recovery in a chronic model of multiple sclerosis. Nature. 422 (6933), 688-694 (2003).
  9. Weinger, J. G., et al. MHC mismatch results in neural progenitor cell rejection following spinal cord transplantation in a model of viral-induced demyelination. Stem Cells. 30 (11), 2584-2595 (2012).
  10. Vogel, D. Y., et al. Macrophages in inflammatory multiple sclerosis lesions have an intermediate activation status. J Neuroinflammation. 10, 35(2013).
  11. Coyle, P. K. Ch. 3. Clinical Neuroimmunology: Multiple Sclerosis and Related Disorders. Rizvi, S. A., Coyle, P. K. 3, Springer. 43-70 (2011).
  12. McManus, C., et al. MCP-1, MCP-2 and MCP-3 expression in multiple sclerosis lesions: an immunohistochemical and in situ hybridization study. J Neuroimmunol. 86 (1), 20-29 (1998).
  13. Calderon, T. M., et al. A role for CXCL12 (SDF-1alpha) in the pathogenesis of multiple sclerosis: regulation of CXCL12 expression in astrocytes by soluble myelin basic protein. J Neuroimmunol. 177 (1-2), 27-39 (2006).
  14. Carbajal, K. S., Weinger, J. G., Whitman, L. M., Schaumburg, C. S., Lane, T. E. Surgical transplantation of mouse neural stem cells into the spinal cords of mice infected with neurotropic mouse hepatitis virus. J Vis Exp. 53, e2834(2011).
  15. Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
  16. Nguyen, Q. T., Callamaras, N., Hsieh, C., Parker, I. Construction of a two-photon microscope for video-rate Ca(2+) imaging. Cell Calcium. 30 (6), 383-393 (2001).
  17. Nikic, I., et al. A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis. Nat Med. 17 (4), 495-499 (2011).
  18. Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G., Debarbieux, F. Implanting glass spinal cord windows in adult mice with experimental autoimmune encephalomyelitis. J Vis Exp. 82, e50826(2013).
  19. Farrar, M. J., et al. Chronic in vivo imaging in the mouse spinal cord using an implanted chamber. Nat Methods. 9 (3), 297-302 (2012).
  20. Pakan, J. M., McDermott, K. W. A method to investigate radial glia cell behavior using two-photon time-lapse microscopy in an ex vivo model of spinal cord development. Front Neuroanat. 8, 22(2014).
  21. Fenrich, K. K., et al. Long-term in vivo imaging of normal and pathological mouse spinal cord with subcellular resolution using implanted glass windows. J Physiol. 590 (Pt 16), 3665-3675 (2012).
  22. Germain, R. N., Robey, E. A., Cahalan, M. D. A decade of imaging cellular motility and interaction dynamics in the immune system. Science. 336, 1676-1681 (2012).
  23. Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296 (6089), 1869-1873 (2002).
  24. Dzhagalov, I. L., Melichar, H. J., Ross, J. O., Herzmark, P., Robey, E. A. Two-photon imaging of the immune system. Curr Protoc Cytom. Chapter 12 (Unit12 26), (2012).
  25. Matheu, M. P., et al. Toll-like receptor 4-activated B cells out-compete Toll-like receptor 9-activated B cells to establish peripheral immunological tolerance. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (20), E1258-E1266 (2012).
  26. Matheu, M. P., et al. Three phases of CD8 T cell response in the lung following H1N1 influenza infection and sphingosine 1 phosphate agonist therapy. PLoS One. 8 (3), e58033(2013).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Omurilik G r nt lemeSinirsel nc l H crelerFloresan AksonlarVentral OmurilikCanl H cre G r nt lemeFloresan MikroskopiH cre TransplantasyonuDemiyelinizan BozukluklarGer ek Zamanl G r nt leme
Fare Omurilik Hücresel Dynamics İki foton Görüntüleme
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.