Farklı Fare Cilt Bölgelerinden sitoflüorimetrik analize için tek hücre süspansiyonları hazırlanması

Özet

Cilt, karmaşık bir bağışıklık hücresi ağına ev sahipliği yapar. Tek hücreli bir süspansiyon elde etmek ve deride bulunan farklı lökosit popülasyonlarını akış sitometrisi ile analiz etmek için hayvanın vücudunun farklı bölgelerinden fare derisinin sindirimi için etkili bir metodoloji açıklıyoruz.

Özet

Deri, dış çevre ile etkileşim halinde olan bir bariyer organdır. Sürekli olarak potansiyel mikrobiyal istilaya maruz kalan dermis ve epidermis, hem homeostatik hem de enflamatuar koşullarda çeşitli bağışıklık hücrelerine ev sahipliği yapar. Bu nedenle, sitoflorimetrik analizler için cilt hücresi salınımını elde etmeye yönelik araçlar, ciltte bulunan karmaşık bağışıklık hücreleri ağını ve mikrobiyal uyaranlara tepkilerini incelemek için çok yararlıdır. Burada, tek hücreli süspansiyonları hızlı ve verimli bir şekilde elde etmek için fare derisinin sindirimi için etkili bir metodoloji açıklıyoruz. Bu protokol, yüzey antijen ekspresyonundan ödün vermeden maksimum hücre canlılığının korunmasına izin verir. Ayrıca kulak, gövde, kuyruk ve ayak pedi gibi farklı anatomik konumlardan deri örneklerinin nasıl alınacağını ve sindirileceğini de açıklıyoruz. Elde edilen süspansiyonlar daha sonra boyanır ve farklı lökosit popülasyonları arasında ayrım yapmak için akış sitometrisi ile analiz edilir.

Giriş

Deri, vücudun en büyük organlarından biridir ve geniş yüzeyi sürekli olarak dış ortama maruz kalır. Bu nedenle deri, homeostazı sürdürmek için hem fiziksel yollarla hem de potansiyel patojen girişine karşı aktif koruma sağlayarak organizmayı potansiyel tehditlerden korumak zorundadır. Bağırsak ve akciğer mukozasına benzer şekilde, deri, bağışıklık gözetimini sürdürmek için sürekli olarak epitel ile etkileşime giren çeşitli bağışıklık hücrelerine ev sahipliği yapar. Cildin hem immün hem de immün olmayan hücrelerini içeren bu karmaşık sistem, 1978'de "Deri ile ilişkili lenfoid doku" (SALT) ¹ teriminin ilk kez bu karmaşıklığı tanımlamak için icat edildiği immünolojinin ilk günlerinden beri kabul edilmiştir.

Deride bulunan çok sayıda bağışıklık hücresi, organizmanın sadece potansiyel istilalarla savaşmasına değil, aynı zamanda yara iyileşmesini düzenlemesine ve kendi antijenlerine ve cilt mikrobiyotasına karşı toleransı sürdürmesine de yardımcı olur ^2,3.

Deride yerleşik bağışıklık hücreleri arasında, Dendritik Hücreler (DC'ler) bağışıklık tepkilerini şekillendirmede ve homeostazı sürdürmede çok önemli bir role sahiptir ⁴. Dermal DC'ler ve Langerhans hücreleri, patojen istilalarına kolayca yanıt verir ve lenf düğümlerine göç ettikten sonra T hücrelerini aktive eder ve yeni üretilen efektör T hücreleri üzerinde cilt hedef arama reseptörlerinin ekspresyonunu indükler ⁵. DC'ler ayrıca cilt homeostazının düzenlenmesinde temel bir role sahiptir. Homeostatik koşullarda dermisten lenf nodlarına göç eden DC'ler, çoğunlukla cilt antijenleri ^6-8'e özgü düzenleyici T hücrelerinin (Treg'ler) farklılaşması yoluyla T hücresi toleransını indüklemek amacıyla deri sekestre antijenlerini taşırlar.

T hücreleri, ciltte en bol bulunan bağışıklık hücresi popülasyonunu temsil eder. Sadece bir enfeksiyon sırasında cilde sızmakla kalmaz, aynı zamanda ciltte yerleşik lenfositler arasında stabil bir popülasyonu temsil ederler ^9,10. Hem CD8 ⁺ hem de CD4 ⁺ yerleşik bellek (rm) T hücreleri deride bulunur ve bir enfeksiyonu takiben, efektör T hücreleri kandan alınmadan çok önce yanıt verebilir. Deride, ayrıca cilt antijenlerine ve doku homeostazına karşı toleransı koruyabilen bir doku yerleşik Treg popülasyonu bulunur. Bu hücreler, aynı kökenli antijenlerine maruz kaldıktan sonra hızlı ve güçlü bir şekilde aktive olurlar ve bu nedenle bellek Tregs ^11,12 olarak tanımlanmıştır.

DC'ler ve T hücreleri ile birlikte, NK hücreleri, gama delta T hücreleri, grup 2 ILC ¹³, Mast Hücreleri ve Makrofajlar gibi birçok doğuştan gelen bağışıklık hücresi cildi doldurur ve konak korumasına katkıda bulunur. Böylesine karmaşık bir ortamı analiz etmek için, aynı zamanda akış sitoflorimetrik analizi veya sıralama için yüzey belirteçlerinin ifadesini korurken, aynı zamanda yüksek verimlilikle deri örneklerinden tek hücreli süspansiyonlar elde etmek zorunludur.

Murin derisi, esas olarak keratinositler, Langerhans hücreleri ve dendritik epidermal T hücrelerinden oluşan bir dış epidermal tabaka sunar; ve altındaki dermal tabaka. Dermis, bağışıklık hücrelerinin çoğunu barındırır ve kollajen liflerinin, özellikle kollajen-I ve kollajen-IV'ün en bol olduğu hücre dışı bir matris tarafından yapılır. İnsan derisinden farklı olarak, fare derisi kürkle kaplıdır ve bu nedenle daha çok kıl folikülleri ile doldurulur. Aynı zamanda insan derisinden çok daha incedir ve yara iyileşmesine yardımcı olan bir kas tabakası olan panniculus carnosus'u içerir ¹⁴. Bu özellikler, bağışıklık hücrelerini dışarı atmak için dermisin kollajen ağını verimli bir şekilde bozmayı zorlaştırır.

Bu yazıda, yüksek saflıkta kollajenaz 1 ve 2 ve termolizin kokteyline dayanan hücre dışı matrisi sindirmek için uygun bir yöntem sunuyoruz. Ayrıca, farklı bölgelerden alınan derinin analizi farklı deneysel prosedürler gerektirdiğinden, ayak tabanı, kuyruk, kulak ve gövdeden deri örneklerini verimli bir şekilde elde etmek için farklı yöntemler göstereceğiz. Daha sonra DC'lerin (MHCII⁺CD11c^++), Makrofajların (CD11b⁺F4/80⁺CD45+), CD8⁺ve CD4⁺T hücrelerinin varlığını değerlendirmek için numuneleri etiketleyeceğiz.

Protokol

Çalışma onayı: Deneysel protokoller decreto göre İtalyan Sağlık Bakanlığı (Roma, İtalya) tarafından onaylanmıştır n, 27 gennaio 1992 Legislativo. 116 "Attuazione della direttiva n. 86/609 / CEE in materia di protezione degli animali utilizzati bir fini Sperimentali o reklam altri fini scientifici."

1. Cilt Örnekleri elde edilmesi

1. servikal dislokasyon fare Euthanize.
2. Kulak:
   1. fare kulakları tüysüz bir bölümünü kesip.
   2. forseps ile onları birbirinden çekerek ayrı dorsal ve ventral yüzü. forseps ile yavaşça kulak iç kısmı kazıyarak kalan kıkırdaklar çıkarın.
3. Gövde cilt:
   1. Bir elektrikli tıraş makinesi ile ve narin tüy dökücü losyon ile hem hayvanın tüm cilt tıraş.
   2. (2 cm ² itibaren tüm hayvan derisi kadar) istenen deri örneği kesti.
      1. tüm dorsal keserek eğer ve ventral fare deri, sırt ve sonra fare gövdesi etrafında traş alan sınırları boyunca kesilmiş fare ortasında dikey kesim yapmak.
      2. Yavaşça bir cerrahi makas veya neşter kapalı yuvarlak kenarlı ipuçları ile cilt örneği ayıran forseps ile yine deri örneği tutarak, periton ve sırt kasları cilt ayırmak.
   3. buz, 10 ml PBS ihtiva eden bir 100 aa hücre kültürü plakasının hazırlanması.
   4. Adım 1.3.3 hazırlanan plaka PBS cilt örneği daldırarak ve forseps ile cilt örneği kazıyarak cilt altı yağ ortadan kaldırmak.
4. Kuyruk:
   1. fare kuyruğu kesti.
   2. Bir cerrahi makas veya cerrahi neşter, kuyruk tabanından başlayarak ve kuyruk ucuna kadar ulaşan kuyruk dikey kesim olun.
   3. kuyruk Cildi ayırmak için forseps kullanabilir. kuyruk dibinde kesme kenarını tut ve tutarak ucuna doğru yavaşça çekinforseps ile kuyruk gövde.
   4. nazikçe cilt örneği kazıyarak herhangi bir aşırı yağ çıkarmak.
5. haydut
   1. cerrahi makas ile tüm fare ayak kesip. Herhangi bir saçlı deri kesme kaçınmak.
   2. basamak başlangıcına bileği uzunlamasına ayak cildi kesin.
   3. forseps ile cilt kapma sırasında forseps ile veya elle ayak bileği kemikleri tutun ve bir eldiven kalktıktan sanki basamak doğru cilt çekin.

2. Sindirim

1. Enzim karışımı (özellikler için Malzeme Listesi bakınız) 300 mg / ml, DNAse1 50 U / ml: Aşağıdaki reçete ile (Malzeme Listesi'nde gibi hazırlandı) stok çözeltisinden sindirim kokteyl hazırlayın. RPMI% 5 FBS sulandırmak.
2. (Gövde ciltler için: Cilt 2 sindirimi Kokteyli ml her 2 cm ^2, en fazla 3 ml toplam) Sindirim Kokteyli 2 ml ile 35 mm Petri kabı içine küçük parçalar halinde makas ile cilt örnekleri doğrayın.
3. 90 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Yavaşça inkübasyon sırasında petri 1-2 kez çalkalayın.
4. RPMI1640% 5 FBS 1 ml içeren 66 mm Petri kabındaki 70 mikron hücre süzgecinden üzerinde sindirilmiş cilt örnekleri dökün.
5. RPMI 1640,% 5 FBS, 5 ml süzgeç yıkayın.
6. Bir şırınga pistonu ile hücre süzgecinden örnek sıkın.
7. Gömme piston, Petri kabı ve RPMI1640% 5 FBS, 20 ml süzgeç, 50 ml'lik bir tüp içine aktarılır.

3. Antikorlar ve Etiketleme

1. PBS% 1 FBS (ya da BSA), 5 ml ile iki kez elde edilen süspansiyon yıkayın.
2. istenen antikorlar için elde edilen hücre süspansiyonu etiketleyin.
   1. 100 ul numune yeniden süspanse / PBS% 1 FBS içerisinde seyreltilmiştir aCD16 / CD32 (klon 2.4G2) 2 ug / ml ihtiva eden bir karışım örneği.
   2. Fc reseptörleri üzerinden arzu edilen antikorların spesifik olmayan bağlanma bloke etmek için, 4 ° C'de 15 dakika boyunca inkübe edin.
   3. Tablo l'de gösterilen antikor ekleyin1.
      1. 4 ug / ml'lik bir konsantrasyonda PBS% 1 FBS, 100 ul / numune içinde istenen antikorları seyreltilmesi bir karışım hazırlayın.
      2. tüp içinde, 2 ug / ml'lik bir nihai konsantrasyonda antikor karışımı 200 ul bir hacim olacak şekilde her numune için adım 3.2.3.1 hazırlanan karışımı 100 ul ekle.
   4. 4 ° C'de 30 dakika süreyle inkübe edin ve ışıktan kapsamaktadır.
3. 400 x g'de 5 dakika boyunca PBS% 1 FBS, 1 ml santrifüj ile yıkayınız PBS% 1 FBS, 300 ul süpernatan ve tekrar süspansiyon atın.
4. 2 ug / ml'lik bir son konsantrasyonda DAPI ekleyin ve 10 dakika için ışıktan korunan, 4 ° C'de inkübe edin.
5. FACS ile elde edilen numunelerin analiz.
   1. lökositleri izole etmek için, aşağıda yolluk stratejisini kullanmak:
      1. İlk DAPI- nüfus yolluk herhangi ölü hücreleri ortadan kaldırır.
      2. Şekil 1 'de gösterildiği gibi FSC W çiziminde genel FSC A seç tekli .
      3. Kapı ilgi lökositlerin tipik büyüklüğü ve ayrıntı dayalı hücreler.
      4. Şekil 1'de gösterildiği gibi FSC-A CD45 arsa CD45 + hücreleri seçin.
   2. aşağıdaki gibi yüzey markerlerinin ifadesiyle lökositlerin farklı popülasyonlar ayırt:
      1. CD11c ⁺ MHC II ⁺ hücreleri gibi DC'ler tanımlayın. Bunlar daha sonra CD207- Dermal DC'lerden Langerhans hücreleri ve CD207 + Dermal DCler ayırt CD207 ekspresyonu için analiz edilebilir.
      2. CD64 + F4 / 80 + hücreler olarak makrofajlar tanımlayın.
      3. CD19 + MHC II + hücreleri gibi B hücreleri tanımlamak.
      4. CD8 + ve CD4 + hücreleri gibi T hücrelerini belirlemek.

Sonuçlar

vücudun farklı bölgeden Cilt belirtilen antikorlar ile tanımlanan ve lekeli protokole göre sindirilmiştir. Ayırıcı stratejisi ilk tekli (FSC W genel FSC A) ve lenfosit morfolojisi (SSC-A genel FSC A) hücreleri canlı sonra hücreler (DAPI- hücreleri), kapı seçmek Şekil 1'de tasvir edilmiştir. Gösterdiğinde, hematopoietik kökenli CD45 ⁺ hücreler seçilir.

DCler, anti-CD11c, -MHCII ve -CD45 antikorlar il...

Tartışma

Farklı fare derisi bölgelerden tek hücre süspansiyonları hazırlamak için bir yöntem tanımlanmıştır. Benimsedi¤imiz sindirim bir yöntem olup, yüksek verimler verir, aynı zamanda daha sonra FACS analizi için temel olan yüzey markerlerinin ifadesiyle, koruyor.

kolajenaz I ve II termolizin bir karışımı içinde kullanımı, bu yöntem yüksek tekrarlanabilir hale enzim aktivitesinde toplu farklılıklar az toplu garanti eder. Diğer yayınlanmış yöntemler farklı enzim kokteyller güveniyor ama elimizde onl...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Reagents
Takviyeli RPMI 1640 orta			RPMI1640 L-glu ile takviyeli, beta merkapto etanol
PBS
FBS
Liberaz TM (Enzim Karışımı)	Roche	5401119001	yeniden süspansiyon [2.5  mg / ml] dH2O cinsinden; Alikotları -20 'de saklayın; ° C
Dnase I	Sigma	D4263-1VL	RPMI 1640'ta serum olmadan yeniden askıya alın [1.000  U/ml]
Materials
Cerrahi Makas
Cerrahi Forseps
Cerrahi Neşter
35 mm Petri kapları
66 mm Petri kapları
100 mm Petri kapları
70 ve mikro; m Hücre Süzgeçleri	BD	352350
Sindirim kokteyli			RPMI'de seyreltin, %5 FBS
Liberaz TM			300 & g/ml
DNAse1			50 U/ml
Antikorlar
Name<	strong>Company	Clone	Label
aCD45.2		104	PE-Cy5.5
aCD11c		N418	PE-Cy7
CD11b		M1/70	FITC
F4/80		A 3-1	APC-CY7
aCD4		Gk1.5	APC-CY7
aCD8		53-6.7	PE
aCD64		X54-5/7.1	PE-CY7
aCD207		4C7	APC