Yöntem makalesi

Time-lapse aydınlık stereomikroskobi ile Zebra balığı Larva Doku Onarım yakalama

12.6K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/52654

⸱

31 Ocak 2015

 ,  , 
1Davis Center for Regenerative Biology and Medicine, MDI Biological Laboratory

Bu makalede

Özet

Zebra balığı larva kuyruk yüzgeci rejenerasyonunun dinamiklerini parlak alan tabanlı stereomikroskopi kullanarak tüm doku ölçeğinde yakalamak için bir protokol sunuyoruz. Bu teknik, tek hücre çözünürlüğü ile rejenerasyon dinamiklerinin yakalanmasını sağlar. Bu metodoloji, bir CCD kamera ve hızlandırılmış yazılım ile donatılmış herhangi bir stereomikroskoba uyarlanabilir.

Özet

Zebra balığı larva kuyruk yüzgeci, farklılaşmamış mezenşimi çevreleyen iki deri katmanından oluşan larva yüzgeci kıvrımının basit mimarisi ve larva kuyruk yüzgecinin 2-3 gün içinde hızla yenilenmesi nedeniyle doku yenilenmesini incelemek için idealdir. Bu sistemi kullanarak, hızlandırılmış video parlak alan stereomikroskobu ile ampute kuyruk yüzgecinin onarım dinamiklerini yakalamak için bir yöntem gösteriyoruz. Yüzgeç amputasyonunun, amputasyon yarasının kasılmasını ve yara kenarı etrafındaki hücrelerin ekstrüzyonunu tetiklediğini ve sonraki boşluklarına yol açtığını gösteriyoruz. Yüzgeç rejenerasyonu kısa bir gecikmeden sonra proksimal yönden distal yöne doğru ilerler. Ek olarak, larvaların gelişimsel büyümesi tüm aşamalarda gözlenebilir. Sunulan yöntem, zaman atlamalı özelliklere sahip herhangi bir stereomikroskoba kolayca uyarlanabilen basit bir mikroskop ortamında yüzgeç gelişimi ve büyümesi gibi tüm doku ölçeğindeki davranışları gözlemlemek ve analiz etmek için bir fırsat sağlar.

Giriş

Bir organizmanın yaralanma sonrası doku onarım süreçlerini düzenleme yeteneği, hayatta kalması için çok önemlidir 1. Tüm hayvanlar yaralarını iyileştirme kapasitesine sahipken, dokuların yenilenme derecesi türler arasında büyük farklılıklar gösterir. Zebra balığı, semenderler ve kurbağa kurbağa yavruları gibi omurgalı türleri, uzantıları, gözlerinin bölümleri, kalpleri ve merkezi sinir sistemi 2-4 dahil olmak üzere kayıp dokuları yenileme konusunda olağanüstü bir yeteneğe sahiptir. Afrika dikenli faresi ve tavşanları gibi memeli türleri, kulak kepçelerindeki 5-7 delikleri yeniden oluşturma yeteneğine sahiptir ve insanlar ve fareler, fetal ve gençlik aşamaları 8-12 sırasında karaciğerlerinin bölümlerini ve rakam uçlarını yeniler. Bazı türlerin dokuları neden ve nasıl diğerlerinden daha etkili bir şekilde yenilediği henüz tam olarak anlaşılmamış olsa da, benzer genetik yolların varlığı, bu mekanizmaların büyük bir yenilenme potansiyeli olmayan türlerde uykuda olabileceğini düşündürmektedir 13,14. Bu nedenle, tatmin edici rejenerasyon sonuçları olan türlerde doku onarımı ve rejenerasyon mekanizmalarının aydınlatılması, insanlarda rejenerasyona fayda sağlayacaktır.

Larva zebra balığı kuyruk yüzgecini, zaman atlamalı parlak alan stereomikroskopisi ile rejenerasyonunu göstermek için bir paradigma olarak seçtik. Zebra balığı larva kuyruk yüzgeci, medial yerleşimli mezenkimal hücreleri çevreleyen cildi innerve eden somatosensoriyel aksonlar ile iki katmanlı, katlanmış bir epitelden oluşan daha karmaşık yetişkin yapılarına kıyasla anatomik olarak basittir 15. Anatomik farklılıklara rağmen, larva kuyruk yüzgeci rejenerasyonu, moleküler imzalar ve büyüme tepkileri açısından yetişkin yüzgeç rejenerasyonu ile bir şekilde karşılaştırılabilir 16,17. Bununla birlikte, yetişkin yüzgeci ile karşılaştırıldığında, larva kuyruk yüzgeci rejenerasyonunun görüntülenmesinin çeşitli avantajları vardır: 1) larva yüzgeci rejenerasyonu sadece 2-3 gün içinde tamamlanır 16, 2) larvalar düşük erimiş agaroza monte edilebilir ve 3) larvalar, yumurta sarısı kesesinin varlığı nedeniyle döllenmeden ~ 5 gün sonrasına (dpf) kadar beslenmeye ihtiyaç duymaz. Bu, zebra balığı larvalarını in vivo doku onarım dinamiklerini gözlemlemek için ideal kılar.

Sunulan yöntem, yüzgeç rejenerasyonunun erken süreçlerinin altında yatan ayrıntılı dinamiklerin yakalanmasını sağlar. Birçok çalışma, embriyonik ve larva zebra balıklarında hücresel ve hücre altı biyolojik süreçleri incelemek için floresan tabanlı konfokal mikroskopi kullanmıştır. Bununla birlikte, gelişmiş konfokal görüntüleme kurulumları genellikle herkes tarafından erişilebilir değildir ve diğer görüntüleme tekniklerine kıyasla oldukça pahalıdır. Buna karşılık, sunulan metodoloji, Axiovision yazılımı ve hızlandırılmış bir modül ile donatılmış bir Discovery V12 stereomikroskop kullanır ve böylece doku davranışlarını incelemek için pahalı görüntüleme ekipmanlarına daha uygun fiyatlı bir alternatif sunar. Bu yöntemin, minimum maliyetle yüksek temporal çözünürlükte doku rejenerasyonunu görüntülemek için kullanılabileceğini gösteriyoruz. Bu yöntemin çıkarımları, farmakolojik ve genetik taramalar yoluyla terapötik gelişim için organ kültürlerini kullanarak memeli rejenerasyon çalışmalarını ilerletmek için temel biyolojinin ötesine geçebilir ve sınıf ortamında bir öğretim aracı olarak hizmet edebilir.

Protokol

Zebra balığı (sedef suşu) kuruldu protokollere göre yetiştirilen ve yükseltilmiştir. Tüm çalışmalar anestezi ve ötenazi 1 mM Tricaine süre ile 0.4 mM Tricaine kullanılarak acıyı azaltmak için yapılmıştır. Uygun komitesi (MDI Biyolojik Laboratuvarı hayvan çekirdek IACUC numarası 13-20) tarafından onaylanan Zebra balığı embriyolar ve larva iyi hayvan uygulamalarına tam uyum içinde ele alınmıştır. Bu çalışma protokolü # 14-09 altında Ulusal İnsan Genomu Araştırma Enstitüsü Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu, MDIBL Kurumsal Güvence # A-3562-01 tarafından onaylandı.

Not: Aşağıdaki adımlarda özetlenmiştir larva zebrafish fin rejenerasyon yakalar görüntüleme prosedürü:

Larva Aşamaları için Zebra balığı 1. yükseltilmesi

  1. Yumurta toplama ve 0.00004% metilen mavisi ile takviye edilmiş deiyonize su içinde% 0.03 Anında Okyanus tuzunu ihtiva eden bir 100 x 25 mm Petri kabı içine yaklaşık 50 yumurta yerleştirin. Bir 28.5 ° C inkübatör O / N inkübe.
  2. ertesi sabah cam pipet ile ölü embriyolar kaldırmak ve deiyonize su (adlandırılır embriyo orta) 0.03% Anında Okyanus tuzu ile bir süzgeç yumurta durulayın.
    Not: tercih edilebilir gibi Zil sesleri 18, Hanks 18, E2 19, E3 20, ve Danieau 21 gibi orta.
  3. sup> çanak taze embriyo orta ekleyin. Pigmentli türleri kullanılarak Eğer PTU melanogenezis ve larva, böylece renk değişimlerini önlemek üzere, isteğe bağlı olarak, 0.2 mM 1-fenil-2-tioüre (PTU) ekleyin. Embriyolar daha 2 gün sonra döllenme veya herhangi bir diğer istenen larva aşamasına kadar inkübatör geliştirmek edelim.

Görüntüleme Odası 2. Hazırlık

  1. Yöntem 1: PVC veya teflon borudan yapılmış Görüntüleme odalar (Şekil 1)
    Not: Bu yöntem konka ve Adams (1998) 22 benzerdir.
    1. 25 mm dış An ile bir nalburdan içme suyu kalite plastik veya teflon tüp Edinmeda 20 mm iç çap. Her bir tarafında düz bir yüzeye sahip, yaklaşık 10 mm kalınlıkta halka yapma hortumu kesilir. Kenarları düzeltmek için> 200 kum zımpara kullanın.
    2. Sıcak su ve% 70 etanol ile halkaları temizleyin ve onlara hava kurumaya bırakın.
    3. Bir pipet ucu ile bir halkanın bir yarısına silikon yağı uygulamak ve 75 mm x 25 mm ebadındaki bir cam kapak kayma halkası ekleyiniz. Seçenek olarak ise, silikon yağı yerine bir pipet ucu ile dolu bir 3 ml şırınga kullanın.
      Not: 3 ml'lik enjektöre silikon gres eklemek ilk 30 ml şırınga silikon gres ekleyin ve 3 ml şırınga doldurmak için kullanmak zor olduğundan.
  2. Yöntem 2: Bir görüntüleme haznesi olarak bir Petri hazırlanması.
    1. Kapak (Şekil 2A) bağlı bir cam lamel ile 35 ya da 60 mm çapında Petri kapları elde edin. Distel'de ve Koester (2007) 23, Şekil 3'te gösterildiği gibi, alternatif olarak, saat kadar küçük bir açıklık matkapEski bir küçük Petri kabı kapağının içine lamel ve 3 ml şırınga ile dış silikon gres uygulayın. Temiz bir pipet kullanarak, dikkatle dışarıdan (Şekil 2B) bir yuvarlak veya istenen kalınlıkta kare lamel veriyoruz.
  3. Agaroz sıkıca görüntüleme işlemi sırasında takılı kalır monte edilmesi için kullanılan sağlamak için, halka içinde bir ince plastik ağ ekleyin. İlk olarak, bir açı ile ince makas kullanarak iç halka çapı boyutu içine, bir nalburdan alınan pencere ekranın yapılmış örgü kesti. Sonra mesh ortasına> larva iki boyutu küçük bir dikdörtgen kesip (Şekil 1, 2).
  4. Kapak slip ve oda halkası (Şekil 1A) arasındaki ara için toksik olmayan silikon yağı dört küçük noktalar uygulanır.
  5. Cam lamel altına sıkıca örgü takmak için forseps kullanın.

3. Montaj ve Ön-inj Görüntülemeedili- Larva (Bu adım isteğe bağlıdır)

Not: fin rejenerasyon sonra amputasyon uçak Zebra balığı larvaları tanınabilir olmadığı gibi bu adım, ampute ve rejenere fin uzunluğu arasındaki karşılaştırmalar için uygundur.

  1. Numunenin Hareketsizleştirmesi için embriyo ortamda bir 0.5-1.2% düşük erime agaroz çözeltisi hazırlayın.
  2. Bir mikrodalga fırında agaroz ısıtın ve bir ısıtma bloğu içinde 42 ° C'ye kadar ön-ısıtılır, 1.5 ml tüpler içinde bir sıvı agaroz aktarın.
  3. Sıcak agaroz bu sıcaklıkta birkaç hafta içinde muhafaza edilebilir 42 ° C, soğumasını bekleyin. Bu hayvanlara zararlı olacak gibi, agaroz üzerinde 42 ° C içine larva pipetleme önlemek için deneyin.
  4. 60 mm çapında Petri kabındaki embriyo ortamı içinde 0.4 mM Tricaine (pH 7) 10 ml kullanılarak çeşitli larva anestezisi. Zebra balığı Kitap Tarifler 18 göre Tricaine hazırlayın.
    1. 99: 1000 sulandırılmış olarak Seçenek olarak ise, bir 1 10 ml kullanımı60 mm çapında Petri kabındaki%, 2-fenoksietanol. Devam etmeden önce kendi dokunmatik yanıtı değerlendirmek için bir şapkalı Microloader pipet ile larva Poke. Sadece duyarlı olmayan larvaları kullanın.
  5. Bir cam Pasteur pipeti kullanılarak 42 ° C agaroz çözeltisi içine bir larva aktarın. Aksi takdirde agaroz çok seyreltilmiş ve katılaşmaya edilmeyecektir, agaroz içine aşırı sıvı transferi yapmayın.
  6. Pipet kalan sıvı atılır ve küçük bir petri kabının (35 ya da 60 mm çapında) içine agaroz bir damla larva aktarın. Kuyruk yüzgecinin görüntüleme için yan larva yerleştirin.
  7. Agaroz katılaşmaya izin verin. Plastik pipet ile agaroz değerlendirmek; çok sıvı ise ucu agaroz içine batırmak olacaktır. Agaroz katılaşmış sonra, küçük bir girinti, bir pipet ile dokunmadan üzerine görünür olacaktır. Katılaşma sonrasında, Tricaine çözüm ekleyin ve zaman atlamalı görüntüleme için daha sonra kullanılacak stereomikroskopta geçin.
    Not: Bu adım ayrıca, embriyonun ortam içinde% 1.5 agaroz ile kaplanmış bir Petri tabağına anestezi uygulanmış larva yerleştirilmesi ile gerçekleştirilebilir.
  8. Time-lapse yazılımı ile Stereomikroskopta kullanın. Time-lapse görüntüleme için daha sonra kullanılacak uygun bir objektif ve büyütme seçin. Burada, bir stereomikroskop bir 3.5 x 16 mm çalışma mesafesi objektif lens kullanmak. İstediğiniz gibi, alternatif mikroskoplar ve objektif lensleri kullanmak ama görüntüleme işlemi sırasında olası xy-sürüklenme ve fin büyümesi için hesap için uygun bir büyütme seçin.
  9. Mikroskop kamera algılama modunu seçin.
  10. Yazılımda, ekranda larva görmek için 'canlı' modunu seçin.
  11. Parlaklığı otomatik olarak algılamak için 'Properties' penceresini açın.
  12. Elle mikroskop trans-aydınlatma üssünde kontrast ayarı.
  13. Görüş alanının dışına larva taşıyın ve arka plan hay en aza indirmek için Gölgeleme Düzeltme özelliğini seçinimkb.
  14. Geri görüş alanı içine larva yerleştirin ve fotoğrafını çeker. Görüntü kaydetme.
  15. İlk kafasından agarozun kazıyarak larva agaroz çıkarın. Larva hafifçe başlıklı Microloader pipet ucu veya bir böcek iğne ile kalan agaroz uzak kafa çekerek agaroz dışına kaymış olabilir Bu şekilde.
  16. Bir cam Pasteur pipet ile taze Tricaine çözüm içine larva transferi.

4. Amputasyon Deneyi

  1. Embriyo ortamı kullanılarak bir% 1.5 agaroz çözeltisi hazırlayın ve bir Petri kutusu içine, ince bir tabaka dökün. Agaroz katılaşmaya edelim.
  2. Steromikroskopla, katılaşmış agaroz üzerine larva yanlamasına yerleştirin ve hafif basınç (Şekil 3A) ile 23 G şırınga iğnesi ile kuyruk yüzgeci organını.

5. Time-lapse Görüntüleme için larva Montaj

  1. 3.5 (Şekil 3B) - adımlarda 3.1 açıklandığı gibi devam edin.
  2. , Görüntüleme odası halka (adım 2.1) içine larva içeren 42 ° C'de 0.5-1.2% sıvı agaroz bir damla transfer larva yönlendirmek ve agaroz katılaşmaya edelim. Tricaine çözeltisi ile halka doldurun. Petri kabı odası (2.2 adım) kullanılmaktadır Alternatif olarak, eğer, kapak lamel üzerine monte larva ve Tricaine çözeltisi ile kapağı doldurun.
  3. Gerçekleşmesi için uygun yara iyileşmesi veya doku rejenerasyonu sağlamak için, dikkatli bir şapkalı Microloader pipet veya bir böcek pin kullanarak uzak kuyruk yüzgeci çevreleyen agaroz kazıyın. Fin tekrar tekrar (Şekil 3C) zarar vermemeye çalışın.
  4. Agaroz çıkarıldı içeren Tricaine çözeltisi süzün ve taze Tricaine çözeltisi ile oda halka doldurun.
  5. Kamara halka üstüne silikon gres sürün ve 75 mm x 25 mm cam slayt ekleyin. Onlar aydınlık görüntüleme müdahale ve zamanla larva kurutulması gibi, odasında hava cepleri önlemek için deneyin.
  6. Bir Petri kabı olarak kullanıyorsanızBir görüntüleme odası, alt bölmenin üst kenarının silikon yağı uygulamak ve Tricaine çözeltisi ile alt bölmeyi doldurmak. Dikkatle kapağı Tricaine çözüm süzün ve hava cepleri önlemek için hafif bir açıyla alt odasının Tricaine çözeltisi içine larva batırmak için kapağı ters çevirin. odacık silikon gres nedeniyle kapalı olacaktır.

6. Time-lapse Görüntüleme

  1. 23,24 (Şekil 4), bir mikroskop inkübasyon odası .Place ve ısı açmak tarif edildiği gibi ısıtılmış bir inkübasyon odası birleştirin. 20 dakika veya sıcaklık stabilize kadar - yaklaşık 10 28 ° C sıcaklık ayarlayın.
  2. Isıtmalı kuluçka odasının önünü açmak ve objektif doğru yukarı bakacak şekilde lamel ile mikroskop standın üzerine görüntüleme odasına yerleştirin.
  3. Görüş alanının 2/3 boş kalır bir şekilde larva fin yerleştirin. Bu yakalama sağlarlarva yeniden konumlandırmak için kalmadan büyüme ve görüntüleme prosedürü boyunca fin yenilenmesi.
    1. Önceki aydınlık yoğunluğu veya agaroz potansiyel vardiya değişiklikleri önlemek için time-lapse kayıt başlamadan 30 dakika ~ 28 ° C monte larva ayarlayın. Alternatif olarak, kısa ayar süre sonra görüntüleme başlatmak için önceden ısıtılmış tampon kullanmak.
  4. Time-lapse kayıt kurmak için, Axiovision yazılımı 6D boyutlu Toplama penceresini açın ve z-yığın ve zaman atlamalı seçeneğini seçin.
  5. Z-yığın sekmesi ve Dilim Modunda) İsteğe bağlı, dilim kalınlığı seçin ve ardından Başlat / Durdur modunu seçin.
  6. Yığınının üst ve alt pozisyonlar tanımlar.
  7. Time-lapse sekmesinde, aralık ve film süresini seçin ve ardından start düğmesine basarak filmi başlatın. Biz 30 dakika aralıkları yeterli ve bu aralık aşırı veri oluşturmak olmadığını bulundu; Ancak shorteR aralıkları kullanılabilir.
  8. Larva ön-ayarlı değil ise ilk bir saat içinde pozisyon ve z-yığın boyutlarını kontrol edin. Gerekirse larva kaymış olabilir gibi, bir gün sonra tekrar larva yeniden konumlandırmak.
  9. Time-lapse kayıt sonunda dosyayı kaydedin ve post-processing ve Imaris 25 ya da açık kaynak kodlu yazılım paketleri Görüntü J 26 ve Fiji 27 gibi, mevcut görüntü analiz yazılımı kullanarak sayımsal devam edin.

7. Veri analizi

  1. Fin uzunluğu belirlenmesi.
    1. Görüntüleme yazılımı time-lapse film açın ve yazılım performansını artırmak için özel dosya formatında dosyaları kaydetmek.
    2. Öngörülen yığınlar gibi bireysel bölümleri görüntülemek için dik bir görünüm seçin. Sürüklenme düzeltme için, Fiji menüsü altında, Eklentiler, ardından Kayıt ve 'Doğru 3D kayması' seçeneğini seçin. Bu Fiji penceresini açın ve sürüklenme düzeltmeleri yapacak. DoğruImaris Spotlar işlevi dönme sürüklenme. Alternatif olarak, Görüntü J StackReg ve TurboReg eklentileri yüklemek ve Fiji ithal. StackReg eklentisi istenen dönüşüm algoritması seçin.
    3. Mesafeleri (örneğin, yara çap veya fin uzunluk) ölçmek için, sol üst araç çubuğunda 'Ekle Yeni Ölçüm Puanları' seçeneğini seçin.
      1. Sol alt menüde 'görünür İstatistik Değerler Yapılandırma listesinden' altında, istatistik değerleri görüntülenecek seçin.
      2. Ayarlar sekmesi altında 'Hat Modu' In Çiftleri (AB, CD ...) 'seçiniz.
      3. Seçin 'Name' ve 'Distance' 'Özellikler Etiketler', ölçüm hattına yanında A ve B noktaları arasındaki mesafeyi görüntülemek için.
      4. 'Düzenleme' moduna geçin ve Notokordun sonunda ilk noktasını seçmek için shift tuşuna basılı tutun. Sonra uzak fin marjı ikinci noktasını seçmek için aynı yapılandırmayı kullanın.
      5. 'İstatistikler' sekmesi altında, görüntülemek ve görüntüde mesafeyi ihracat sağ alt tarafındaki disk düğmesine (İhracat Tümü) seçin.
      6. Sağdaki resimde aşağıdaki kaydırma çubuğunu hareket ettirerek seçilen zamanlarda ölçümler tekrarlayın. Bunun yerine yeni Ölçüm Noktaları yaratma, önceki olanları öncelikle sol fare tuşu ile noktayı seçerek, daha sonra aynı anda yeni konumda shift ve farenin sol tuşuna basarak yeniden konumlandırılmış olabilir.
    4. Alternatif Ölçme Puan seçeneği, mesafeleri ölçmek için dilim görüntüleyici kullanmaktadır. Dilim görünüm modunda, istenilen konuma ilerleyin ve sol fare tuşu ile birinci ve ikinci pozisyona tıklayınız. mesafe görüntülenir. Bu seçenek, ancak veri ihracat için izin vermez.
  2. ImageJ fin uzunluk ve alan belirleme.
    1. .zvi Dosya biçimini tanıyan bir eklenti kullanarak ImageJ time-lapse film açın. Alternatif olarak, bir Qu yüklemekickTime dosyası veya tiff dizisi.
      Not: sıkıştırılmamış tiff dosya biçimini kullanarak, görüntü boyutları belirtilmesi gerekmez.
    2. Dosya bilgileri olmadan farklı bir dosya biçimi açılması durumunda, ilk görüntü mesafe ve birim tanımlamak için 'Analiz' menüsü altında 'Set Ölçeği' seçeneğini seçin. 'Piksel Mesafe' 'Set Ölçek menüsünden', tip, piksel değeri 'Bilinen mesafe' tip altında (bu görüntüye eklenen bir ölçek çubuğu piksel sayısını ölçerek elde edilebilir sonra) sonuç elde etmek ölçün tıklayın ve 'uzunluğu Birimi' (genellikle 'um'). Tamam'ı tıklatın.
    3. Fin alan ölçümleri araç çubuğunda 'Freehand Seçim' aracını seçin ve sol fare düğmesini basılı aşağı ise yüzgeç anahat boyunca çizerek fin alan anahat için. Fin uzunluk ölçümleri için, 'Düz' satırı aracını seçmek ve olmaya istenen nokta arasında bir çizgi çizinölçüldü.
    4. Fin alanı ve uzunluğu görüntülemek için 'Analiz' altında 'Tedbir' seçeneğini tıklayın. Filmin çoklu zaman noktaları için gerekli sıklıkta bu adımı tekrarlayın.
  3. Veri istatistik yazılımı kullanarak grafiksel olarak görüntülenebilir.

Sonuçlar

sunulan teknik, amputasyon yanıt doku onarımı dinamiklerini açıklamak için uygundur. Film yüzgecinin amputasyonu başlangıçta mevcut olan aktin-miyozin kablolar üzerinden kasılmalar ile karakterize bir çanta-string etkisi, tetikler olduğunu göstermektedir 28 fin-kat (Şekil 5 A, B). Eş zamanlı, hücreler yara (film bakınız) uzatılır. daralma dolayısıyla muhtemel hücre ölümüne geçmesi mukadder hücreleri çıkarmak için bir araç olabilir. Bizim sonuçlar daha fin rejenerasyon yaklaşık 14 saat sonrası amputasyon kadar başlatmak değil ise (Şekil 5C amputasyon aşağıdaki 36 saat süresi boyunca yüzgeç uzunluğu ve alanı ile ölçülen larva gelişim büyüme, bağımsız rejenerasyon (film) oluşur göstermektedir D). 1.5 gün sonra toplam rejeneratif fin fin büyüme orijinal uzunluğunun (Şekil 5E) yaklaşık% 60 idi. Birlikte ele alındığında, bu sonuçlar o amputasyon tr göstermektedir yüzgeç kasılması, yara ve zamansal olarak gecikmeli rejeneratif yanıtta hücreler ekstrüzyon iggers. Ekstrüde edilmiş hücreler, büyük olasılıkla hücre ölümü tahsis edilmiş olsa da, bu hücrelerin içeriği daha fazla belirtmekte yarar vardır.

figure-results-1
Şekil 1. Görüntüleme odası halka montaj

Gösterilir (A), silikon yağı ile bir lamel ile bağlı olan bir plastik halkasıdır. Bir plastik örgü silikon yağı, dört küçük noktalarla bölmenin içine takılır. (B) monte edilmiş larva ihtiva eden bölme Tricaine çözeltisi ile doldurulur ve bir cam slayt üstüne takılır. (C) 2 gün eski larva (ok) örgü ilgili boyutunu göstermeye yüksek büyütmede gösterilmiştir monte."_blank"> Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.

figure-results-2
Şekil 2. Görüntüleme odası montaj Petri kapları yapılmış. Gösterilen (A) cam lamel bağlı plastik bir kafes ile ticari cam üst cam alt petri olduğunu. Gösterilen (B) kapak ve silikon gres ile dışarıdan bağlı bir lamel içine delinmiş bir delik olan bir öz-inşa Petri kabı odasıdır. örgü ve larva Tricaine çözeltisi ihtiva odasının içine monte edilmiştir. Odasını kapatmak için, silikon gres alt bölmeye ve bağlı üst kapak üst, dış kenarı uygulanır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-3
Amputasyon ve görüntüleme için bir larva montaj 3. Düzeni Şekil. (A) amputasyon için, bir agaroz kaplı Petri kabı üzerine bir anestezi larva yerleştirin ve bir şırınga iğnesi ile kuyruk yüzgeci organını. Montaj için (B), 42 ° C sıvı agaroz ile dolu bir 1.5 ml tüp içine bir transfer pipet ile larva transferi ve görüntüleme odasına larva içeren bir damla pipet, balık yönlendirmek ve embriyo orta ile agaroz katılaşmış kapak. (C) başlıklı Microloader pipet veya benzeri bir alet kullanarak kuyruk yüzgecinin agaroz kazıyın ve taze ortam ile embriyo orta yerine. (D) Görüntü steromikroskopla kuyruk yüzgeci. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-4
4. Kendinden inşa ısıtmalı kuluçka odasına Şekil. Gösterilen (AC) karton, bubble wrap ve Velcro yapılmış ısıtmalı kuluçka odası olduğunu. (Başlangıçta tavuk yumurta inkübasyon için tasarlanmış) bir kablolu kubbe ısıtıcı alüminyum bant kullanarak odasına bağlı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-5
5. Fin rejenerasyon dinamiklerini Şekil. Kullanılan kuyruk yüzgeci amputasyon tahlil ve miktar yöntemi (A) Şema fin uzunluğu (kırmızı ok) ve alan (fin kırmızı anahat) belirlemek için. (B) Kuyruk yüzgeci amputasyon başlangıçta fin kasılması, rege takip tetiklernerative doku akıbet. yanal boyutu artış gösterdiği gibi yüzgeç da, gelişimsel büyüme uğrar. Gösterilen (C), 14 hpa ° 'de doğrusal rejeneratif büyüme başlangıç ​​ortaya zamanın bir fonksiyonu olarak kanat uzunluğu vardır. Kanat alanı (D) miktarının belirlenmesi, başlangıçta fin kasılması atfedilebilir boyutu azalma ortaya koymaktadır. ~ 14 saat sonra, bir doğrusal oranda mali boyutu artar. Amputasyon önce yüzgeç uzunluğu ve 36 saat sonra (E) Karşılaştırma ~% 60 büyütme gösterir. Ölçek çubuğu: 100 mikron Kısaltmalar: pre-amp, ön-amputasyon; Saat amputasyon HPA sonrası; regen, rejenerasyon; amp, amputasyon , bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Film . 36 saati boyunca fin rejenerasyonsaat. Gösterildiği rejenerasyon sırasında 2.5 günlük larva bir kuyruk yüzgeci olduğunu. Başlangıç ​​30 dakika sonrası amputasyon rejeneratif büyüme 3.5x objektif lens kullanarak stereomikroskopta 30 dakika aralıklarla görüntülü.

Tartışma

sunulan yöntem, bir aydınlık stereomicroscope üzerinde in vivo time-lapse görüntüleme ile Zebra balığı larvaları yaşayan nispeten basit bir set-up kullanarak yara iyileşmesini ve doku rejenerasyonu gözlemlemek için izin verir. Bu prosedür sonucu optimize edecek test ettik bazı önemli yönlerini gerektirir: sürekli büyüyen larva zebrafish büyüme engelleri en aza indirmek olacaktır 1) Düşük agaroz konsantrasyonu (~% 0.5), 2) fin etrafında agaroz çıkarılması önemli değil iyileşme sürecini gizlemek için, 3), bir plastik ağ agaroz Yakalama işlem boyunca sabit bir pozisyonda agaroz ve hayvan korur, ve 4) larva yaşaması için gerekli olan uygun bir sıcaklık-kontrollü bir ortam. Biz karton üzerine bantlanmış kabarcık şal kullanan ısıtılmış kuluçka odasını 23,24, ve sırasında en az dalgalanmalarla sıcaklık ve uygun hava sirkülasyonu kontrol etmek için bir kablolu kubbe ısıtıcı adapte olmasıGörüntüleme işlemi. Bu basit ve maliyet-etkin odası, herhangi mikroskop uyacak şekilde hazırlanabilir. Benzer bir ısıtmalı inkübasyon odası da görüntüleme fareler ve civciv gelişimi 24,29 için kullanılmıştır.

Biz önceden ampute larvalar bir ön-amputasyon görüntüsü için monte edilir öneririz, amputasyon için sökülüp, ve zaman atlamalı görüntüleme için remounted. Nihai görüntüleme odasında tek bir adımda bu adımları gerçekleştirmek için mümkün olsa da, bizim deneyim biz doku gözyaşı ve temiz bir kesim neden yok gibi bir cam lamel kuyruk yüzgeci amputating, optimal değildir bulundu. Bir şırınga iğnesi kullanarak agaroz-tabanlı amputasyon yöntemi başlangıçta Kawakami ve arkadaşları (2004) 16 tarafından açıklanan ve bizim deneyim, aynı zamanda amputasyonlarını gerçekleştirmek için ideal oldu. Böylece, biz sunulan adımları oldukça karmaşık dizi de haklı ve optimal rejenerasyon sonucu sağlar.

Biz larv gösterdi2 dpf'e al Zebra balığı agaroz ve Tricaine çözeltisi 1,5 gün öncesine kadar görüntülü olabilir. Bu sunulan görüntüleme dönem örneğinin sağlığı ile karışmaz Anında Okyanus tuzu ile hazırlanmış, pH-optimum Tricaine (pH 7) çözeltisi kullanılır. Daha önce, ancak, aynı zamanda Danieau ortamında Tricaine ile en az 2 gün 30 konfokal mikroskop larva zebrabalıkları dpf 2.5 zaman atlamalı görüntüleme izin verdiğini gösterdi. Böylece, en uygun tampon koşulları larva sağlık ve görüntüleme süresini uzatabilirsiniz. Seçenek olarak ise, daha düşük Tricaine konsantrasyonları biz de, en az 60 saat süre ile 28 ° C 'de, larva ve yetişkin aşamalarında tolere bulunan anestezi ya da 2-fenoksietanol, için kullanılabilmektedir.

Fin rejenerasyon kusurları önlemek için, biz görüntüleme öncesinde kuyruk yüzgecinin agaroz kaldırıldı. Veri 1.5 gün içinde kanat yaklaşık% 60 yeniden olduğunu gösterir. Bu rejenerasyon oranı 3 gün a tanımlayan bir önceki çalışma ile uyumludur16 dpf 6 Zebra balığı larvaları kadar kuyruk yüzgeci rejenerasyonu için ortalama zamanı. Agaroza alternatif yöntemler ancak görüntüleme için balık monte kullanılabilir. Örneğin, ince bir plazma ışık mikroskobu tabaka 32 için tavsiye edilmiştir 31 ya da fluorinatlı etilen propilen (FEP) tüpler metilselüloz ile kaplanmış ve çok düşük konsantrasyonlarda agaroz (% 0.1) ile dolu pıhtılarını ve sunulan yöntem için de uygun olabilir. Bu numune nedeniyle, bu ortam katılaşması eksikliği odasının altına monte edilir gerektirir ancak biz, metilselüloz ve% 0.1 agaroz önerilmez. Metilselüloz Çok yüksek konsantrasyonlarda üstelik bizim deneyime dayalı hava cepleri oluşturur, ve bu görüntüleme prosedürü engel olabilir. Bu ortam alt bölme kullanarak tercih edilir, bu objektif lens ve numune arasında uygun bir çalışma mesafesi mevcut olması önemlidir. Bu, m unutulmamalıdıro larva sağlık 32 engel olabilecek bir montaj ortamı olarak etilselüloz, sadece 1 gün öncesine kadar tavsiye edilir.

Kapaktaki örneği Montaj yavaş yerçekimi aşağı sürüklenme neden olabilir. Bu nedenle, ya bir tek bir düzlem ya da son film monte edilmesi için ekstre edilebilir odak düzleminde yalnızca görüntü içine yansıtılabilir her bir zaman noktasında en görüntü birden çok bölüm önerilir. Alt odasına numune Görüntüleme potansiyel düşüş sürüklenme önlemek için alternatif bir yöntem olabilir. Plazma örneği stabilize olabilir, bu nedenle dış saran tabakası (EVL, periderm) 31 sopa ve gibi plazma pıhtıları, sürüklenme önlemek için yararlı olabilir. Ancak bu aynı zamanda uzun larva Zebra balığı larva sağlığı veya fin rejenerasyon ile müdahale olmadan plazma pıhtıları muhafaza edilebilir olarak nasıl, test edilmesi gerekmektedir.

Bizim film bireysel bölümleri kullanılarak toplandı (26 mikron)Görüntüleme işlemi sırasında fin potansiyel z-sürüklenme oluşturuyor fin (~ 10 mikron) ve tam kalınlığı kaplı kaydedilmiş z-yığını, bir. 3-D bilgileri korumak amacıyla, bu tek görüntülere z-yığınları proje de mümkündür. Bu görüntünün bulanıklık neden olabilir, çünkü aydınlık dekonvolüsyon arzu edilebilir. Örneğin Deconvolve veya AutoQUANT X3 Yazılım, bu amaç için kullanılabilir. Seçenek olarak ise, (Tadrous 33 tarif edilmiştir) matematiksel algoritma yüksek sinyal-gürültü oranı (SNR), bir nokta-yayılmış işlevini elde etmek için uygulanabilir. Yüksek SNR Edinme aydınlık deconvolution önemli engellerden biridir. Bu yöntem, yüksek kontrast ve ince numune kalınlığının gerektirmekle birlikte, bunun nedeni indirgenmiş genişliğe kuyruk yüzgecinin görüntüleme için uygun olacaktır.

Sunulan görüntüleme yönteminin açık bir avantajı CCD kamera ile donatılmış herhangi bir stereo hızla adapte olmasıdırd time-lapse yazılım ve düşük maliyetli bir alternatif daha pahalı konfokal görüntüleme sistemleri sunmaktadır. Bu yöntem hücre tespiti için floresan kullanmaz iken, deklanşör kontrolü ve sonrası görüntüleme Dekonvolüsyonun yazılımı 34 otomatik bir sistem kullanılarak bu tür uygulamalar için uzatılabilir. Bu daha uzun süreler boyunca tek bir hücre ya da hücre içi çözünürlük ile yara onarımı ve yenilenmesi süreçlerini gözlemlemek için kullanıcıların sağlayacak.

Optik netlik ve kolaylığı embriyonik ve larva Zebra balığı ile ele alınabilir ve herhangi bir stereo bu yöntemin uyum, bir sınıf ortamında temel omurgalı biyoloji öğretimi için uygun hale getirir. Bu yöntem doku onarımı ve yenilenmesi altında yatan temel biyolojik süreçlerin daha iyi anlaşılması öğrencilere sağlayabilir. Benzer bir yöntemle yakalanan diğer biyolojik süreçler Zebra balığı embriyonik gelişim 23,34 ve kalp vardırfonksiyonu (yayımlanmamış). Bu yöntem aynı zamanda genetik ve farmakolojik manipüle edilmiş larva izleme yara onarım ve yenilenme imkanı sunuyor.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Teşekkürler

Zebra balığı bakımı için MDI Biyolojik Laboratuvarı hayvan çekirdek hizmet tesisine teşekkür ederiz. Bu yayında rapor edilen araştırmalar, Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü'nden P20GM104318 (COBRE için) ve P20GM103423 (INBRE) hibe numaraları ve Savunma Bakanlığı - USAMRAA (W81XWH-BAA-1) hibesi altında Kurumsal Gelişim Ödülleri (IDeA) tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

Equipment
Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Reagents
Bullseye AgaroseMidSciBE-GCA500
Düşük erime agarozFisher BioReagentsBP1360-100
1-fenil-2-tiyoüreAlfa AesarL06690
Anında Okyanus Akvaryum TuzuEvcil hayvan mağazası
Metilen Mavisi (%0,1 çözelti)SigmaM9140
Trikain (Etil 3-aminobenzoat metansülfonat)Sigma-AldrichE10505
2-FenoksietanolSigma-Aldrich77699
Petri Kabı 35 x 15 mmBD Falcon351008
Petri Kabı 60 x 15 mmBD Falcon351007
Petri Kabı 100 x 25 mmBD Falcon351013
5.75 inç boroschillate cam pipetlerFisher
35 mm Cam Üst Cam Alt Tabak (Cam: 0.085-0.115mm)MatTek CorporationD35-20-0-TOP
Superfrost/Plus mikroskop slaytlarıFisherbrand12-550-15
Cam lamellerElektron Mikroskobu Hizmetleri72191-75
Cam lamellerWarner InstrumentsCS-18R15
Phifer Phiferglass Sineklik Kömürü - 48 "Home Depot
Yüksek vakumlu gresDow Corning
Microloader pipet uçları 20 ve mikro; lEppendorf930001007
İnce Makas - Keskin Açılıİnce Bilim Araçları14037-10
3 ml Luer-Lok™ tek kullanımlık şırınga BD309657
60 ml Luer-Lok™ tek kullanımlık şırıngaBD309653
23 G şırınga iğneleriBD305145
Dumont #5 ForsepsGüzel Bilim Araçları11295-00<
LabDoctor Mini Kuru BanyoMidSci
Discovery.V12 Bileşik mikroskop Zeiss
Plan Apo S 3.5X objektifZeiss
AxioCam MRm Zeiss
Axiovision yazılımı, Sürüm 4.8.2SP1 (12-2011)Zeiss
td colspan="4">

Kaynaklar

  1. San Miguel-Ruiz, J. E., García-Arrarás, J. E. Common cellular events occur during wound healing and organ regeneration in the sea cucumber Holothuria glaberrima. BMC Dev Biol. 7, 115(2007).
  2. Poss, K. D., Keating, M. T., Nechiporuk, A. Tales of regeneration in zebrafish. Dev Dyn. 226, 202-210 (2003).
  3. Akimenko, M. A., Marí-Beffa, M., Becerra, J., Old Géraudie, J. Old questions, new tools, and some answers to the mystery of fin regeneration. Dev Dyn. 226, 190-201 (2003).
  4. Slack, J. M. Regeneration research today. Dev Dyn. 226, 162-166 (2003).
  5. Seifert, A. W., et al. Skin shedding and tissue regeneration in African spiny mice (Acomys). Nature. 489, 561-565 (2012).
  6. Goss, R. J., Grimes, L. N. Epidermal downgrowths in regenerating rabbit ear holes. J Morphol. 146, 533-542 (1975).
  7. Williams-Boyce, P. K., Daniel, J. C. Comparison of ear tissue regeneration in mammals. J Anat. 149, 55-63 (1986).
  8. Allan, C. H., et al. Tissue response and Msx1 expression after human fetal digit tip amputation in vitro. Wound Repair Regen. 14, 398-404 (2006).
  9. Borgens, R. B. Mice regrow the tips of their foretoes. Science. 217, 747-750 (1982).
  10. Han, M., Yang, X., Lee, J., Allan, C. H., Muneoka, K. Development and regeneration of the neonatal digit tip in mice. Dev Biol. 315, 125-135 (2008).
  11. Muneoka, K., Allan, C. H., Yang, X., Lee, J., Han, M. Mammalian regeneration and regenerative medicine. Birth Defects Res C Embryo Today. 84, 265-280 (2008).
  12. Takeo, M., et al. Wnt activation in nail epithelium couples nail growth to digit regeneration. Nature. 499, 228-232 (2013).
  13. Akimenko, M. A., Johnson, S. L., Westerfield, M., Ekker, M. Differential induction of four msx homeobox genes during fin development and regeneration in zebrafish. Development. 121, 347-357 (1995).
  14. Reginelli, A. D., Wang, Y. Q., Sassoon, D., Muneoka, K. Digit tip regeneration correlates with regions of Msx1 (Hox 7) expression in fetal and newborn mice. Development. 121, 1065-1076 (1995).
  15. Brien, G. S., et al. Coordinate development of skin cells and cutaneous sensory axons in zebrafish. Journal of Comparative Neurology. 520, 816-831 (2012).
  16. Kawakami, A., Fukazawa, T., Takeda, H. Early fin primordia of zebrafish larvae regenerate by a similar growth control mechanism with adult regeneration. Dev Dyn. 231, 693-699 (2004).
  17. Yoshinari, N., Ishida, T., Kudo, A., Kawakami, A. Gene expression and functional analysis of zebrafish larval fin fold regeneration. Dev Biol. 325, 71-81 (2009).
  18. Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th, Univ of Oregon Press. Eugene. (2000).
  19. Detrich, H. W., Westerfield, M., Zon, L. I. The Zebrafish: Cellular and Developmental Biology, part A. Preface. Methods Cell Biol. 100 (13), (2010).
  20. Dahm, N. -V. a Zebrafish: A Practical Approach, Issue 975. , reprint, Oxford University Press. 303(2002).
  21. The Zebrafish: 2nd Edition Genetics, Genomics and Informatics. Detrich, H., Westerfield, M., Zon, L. , 2nd, (2005).
  22. Concha, M. L., Adams, R. J. Oriented cell divisions and cellular morphogenesis in the zebrafish gastrula and neurula: a time-lapse analysis. Development. 125, 983-994 (1998).
  23. Distel, M., Köster, R. W. In vivo time-lapse imaging of zebrafish embryonic development. CSH Protoc. 2007, (2007).
  24. Kulesa, P. M., Kasemeier-Kulesa, J. C. Construction of a Heated Incubation Chamber around a Microscope Stage for Time-Lapse Imaging. CSH Protoc. 2007, (2007).
  25. Bitplane. Imaris V 6.1.0 Reference Manual. , (2008).
  26. Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. , Biophotonics International. 36-42 (2004).
  27. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9, 676-682 (2012).
  28. Mateus, R., et al. In vivo cell and tissue dynamics underlying zebrafish fin fold regeneration. PLoS One. 7, e51766(2012).
  29. Jones, E. A., et al. et al.Dynamic in vivo imaging of postimplantation mammalian embryos using whole embryo culture. Genesis. 34, 228-235 (2002).
  30. Rieger, S., Senghaas, N., Walch, A., Köster, R. W. Cadherin-2 controls directional chain migration of cerebellar granule neurons. PLoS Biol. 7, e1000240(2009).
  31. Langenberg, T., Brand, M., Cooper, M. S. Imaging brain development and organogenesis in zebrafish using immobilized embryonic explants. Dev Dyn. 228, 464-474 (2003).
  32. Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139, 3242-3247 (2012).
  33. Tadrous, P. J. A method of PSF generation for 3D brightfield deconvolution. J Microsc. 237, 192-199 (2010).
  34. Distel, M., Babaryka, A., Köster, R. W. Multicolor in vivo time-lapse imaging at cellular resolution by stereomicroscopy. Dev Dyn. 235, 1100-1106 (2006).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Kuyruk Y zgeci RejenerasyonuZaman Atlamal G r nt lemeYara yile mesiY zge AmputasyonuG r nt AnaliziStereo MikroskopiLarval Geli im

İlgili makaleler