Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Yöntemler Küçük RNA'ların ve Ribosomal doluluk Düzenleyici Rolü Araştırma

8.4K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/53214

⸱

4 Aralık 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Genetics and Microbiology, Duke University School of Medicine, 2Center for Genomic and Computational Biology, Duke University School of Medicine, 3Department of Cell Biology, Duke University School of Medicine

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

İnsan mikroRNA'ları, konak eritrositlerinden Plasmodium falciparum parazitlerine yer değiştirir. Burada, sentetik mikroRNA'ları konakçı eritrositlere transfekte etmek ve tüm RNA'ları P. falciparum'dan izole etmek için kullanılan teknikler açıklanmaktadır. Ek olarak, bu makale, parazit transkriptlerinin ribozomal doluluğunu ve translasyon potansiyelini belirlemek için P. falciparum'da bir polizom izolasyon yöntemini detaylandıracaktır.

Özet

Orak hücre alel sorumlu genetik varyasyon (HbS) sıtma parazitinin, P. tarafından enfeksiyonu karşı eritrosit sağlar Falciparum. Multifaktöryel olduğu bilinmektedir, bu direncin, moleküler temeli, tam olarak anlaşılamamıştır. Son çalışmalar kez sıtma parazitleri transloke eritrosit microRNA, ayırıcı ifadesi, gen düzenlemesi ve parazit büyümesi hem de etkilediği bulundu. Bu miRNA'ların sonra parazit mRNA'ların gizli alt grupları ile 5 'RNA füzyon ile bir kimerik RNA transkripti oluşturarak mRNA translasyonunu inhibe ettiği gösterilmiştir. Burada kullanılan teknikler gen regülasyonu ve P. translasyonel potansiyeline fonksiyonel rolü ve varsayılan mekanizma altında yatan eritrosit microRNA incelemek için falsiparum, ev sahibi eritrositlerin içine modifiye sentetik microRNA transfeksiyonunun dahil detaylı olarak açıklanacaktır. Son olarak, polisom gradyan yöntemi tra derecesini belirlemek için kullanılırBu transkriptlerin nslation. Birlikte, bu teknikler bize eritrosit microRNA düzensiz düzeyleri orak eritrositlerin hücre içsel sıtma direncine katkıda bulunduğunu göstermek için izin verdi.

Giriş

Cinsi Plasmodium apicomplexan parazitlerin neden Sıtma, Her yıl dünya çapında yaklaşık 200 milyon kişiyi enfekte ve yaklaşık 600.000 kişinin ölümüne neden olan 1, en ​​yaygın insan parazitik bir hastalıktır. İnsanları enfekte eden beş Plasmodium türleri arasında, insan hastalığı ile en çok ilgili P. ve P. falciparum Şiddetli sıtma komplikasyonlar için onların yaygın dağılımları ve potansiyel nedeniyle Vivax. Sıtma parazitinin yaşam döngüsü sivrisinekler ve insanlarda hem de enfeksiyon gerektirir. Virüslü bir sivrisinek bir insanı ısırdığında, parazitler replikasyon başlangıç ​​yuvarlak meydana karaciğer, kan dolaşımı yoluyla seyahat. Ev sahibi hepatosit gelen merozoitler kopma sonra, aseksüel veya cinsel ya çoğaltma başlatarak, yakındaki kırmızı kan hücreleri enfekte. P. 48 saat sürer replikasyon aseksüel aşaması, en mal kaynağı hem beri falciparum, bu çalışmanın odak noktasıaria semptom ve kolayca in vitro değinmeyecek.

Gelişmiş anti-sıtma terapileri de dahil olmak üzere kamu sağlığı girişimlerinin, bir dizi biraz küresel sıtma yükünü azalttık ederken, ilaca dirençli parazitlerin devam çıkması sıtma kontrolü çabaları için bir sorun oluşturur. Yeni tedavi yaklaşımları önerebilir bir alan genetik varyantlar sıtmaya karşı direnç kazandıran nasıl çeşitli üzerinde çalışmadır. Sıtmanın endemik olduğu bölgelerde, eritrosit polimorfizmleri çeşitli 2,3 oldukça yaygındır. Orak hücre belki de en belirgin olduğu bu mutasyonlar, semptomatik sıtma enfeksiyonu 4 başlamasından büyük bir direnç ile ilişkilidir. Onlar sıtma enfeksiyonu karşı eritrositler nedeni olan altta yatan mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır. Hemoglobin mutasyonları ile parazitlenmiş eritrositler gelişmiş hücresel katılık ve dehidratasyon yoluyla geliştirilmiş fagositoz tabi olanP. azalarak işgali ile ilişkili 5 Falciparum. HbS, HbC allelin de eritrosit yüzeyine ve hücre iskeleti yeniden modellenmesi, daha da parazit gelişimini inhibe 6,7 protein ekspresyonunu etkilemektedir. Son olarak, P. Falciparum homozigot orak içinde kötü büyür (HbSS) sıtma direnci içsel faktörler eritrosit düşündüren, in vitro 8,9 eritrosit. Bu mekanizmaların her bir rol oynuyor gibi görünmektedir Ancak, tam sıtma orak hücre direnci arkasında mekanizmalarını açıklar yoktur.

Yeterince anlaşılamamıştır eritrosit faktörlerden biri potansiyel seti olgun eritrositler içinde miRNA mevcut büyük havuzudur. MikroRNA'lar 3 'UTR içindeki baz çiftlemesi, çeviri ve / veya hedef mRNA stabilitesini aracılık 19-25 nt küçük boyutlu kodlayıcı olmayan RNA'lar, bulunmaktadır. Bu bastırma-o dahil olmak üzere, memeli bağışıklık tepkilerinin kontrolünde implike edilmiştirf virüs replikasyonu, 10, ve bitkilerde virüslere karşı direnç gösterilmiştir Ayrıca eritropoezi 11,12 ve demir metabolizması 13 dahil olmak üzere birçok eritrosit süreçleri düzenleyen gösterilmiştir. Önceki çalışmalar ifadesi dramatik HBSS değiştirilmiş 14,15 eritrosit eritrosit miRNA'lar, bir bol ve çeşitli nüfus tespit edilmiştir. Olgun eritrositler aktif transkripsiyon ve çeviri yoksun olduğundan, bu eritrosit miRNA'lar fonksiyonel rolü belirsizliğini korumaktadır. Önemli malzeme değişimi konak hücreye ve P. arasında oluşur gibi intraerythrocytic gelişim döngüsü (IDC) 16 sırasında falciparum, bu HbS eritrositler içinde değişmiş miRNA profil doğrudan hücre içsel sıtma direncine katkıda bulunabilir iddia edildi.

Bu çalışmalar sonunda, izole tespit ve fonksiyonel m olan, insan miRNA'nın rolünü araştırmak için bir boru hattı geliştirilmesine yol açmıştıralaria parazit P. Bu konak / insan miRNA'lar sonuçta kovalent sigorta ve sonra translasyon parazit mRNA transkriptleri 17 bastırmak olduğunu belirtti falciparum. Bu şekilde trans-ekleme ile oluşturulan ilk çapraz tür kimerik transkript bir örnek Resim ve miRNA mRNA füzyon diğer parazitler gibi diğer türlerde de meydana geliyor olabilir bir şekilde gösterir. Tüm tripanosom mRNAlar trans-splayslanmış bir bağlayıcı lideri (SL) ile polisistronik transkript 18 ayrılmasını düzenleyen bulunmaktadır. P. yana falciparum Dicer / Önce 19,20 için ortologlarını yoksun, bu eritrosit miRNA'lar P. benzer SL makineleri kaçırmak mümkündür falsiparum hedef genlerin entegre. P. Son çalışmalar falsiparum Aslında 5 'lider sekansların bağlantı 21 mevcudiyetine işaret vardır. Bu çalışma transkriptomik ve transla de dahil olmak, insan-parazit miRNA-mRNA füzyon transkriptleri keşfine yol açtı yöntemleri ayrıntılarıtional regülasyon teknikleri. Bu yöntemlerin genel amaçları P. gen regülasyonu, fenotipleri ve çeviri potansiyelinin küçük RNA'ların etkilerini araştırmak için vardır Falciparum transkript.

İnsan-parazit kimerik transkript ilk tanımlama gibi oldukça sadece küçük RNA'lar izole teknikleri kullanarak daha toplam hem de küçük RNA'lar dahil real-time PCR, transcriptome sıralama ve EST kütüphane yakalama gibi RNA analiz tekniklerinin kullanımı üzerine dayanıyordu. Büyük bir havuzda birlikte tüm RNA İzolasyon, ayrı ayrı olarak daha parazit hem transloke insan küçük RNA belirlenmesini yanı sıra daha büyük bir sekansın bir parçası olarak, bu küçük bir RNA dizilerinin varlığının sağladı. Bu daha sonra bu füzyonların fonksiyonel sonuçlarını belirlemek için bu füzyon mRNA'ların çeviri devletin bir analizini gerekli.

Parazitin genom bir karakterizasyonu kapsamlı çabalar ikend transcriptome parazitin biyoloji 22-25 anlayışına eklemiş, çok daha az P. yaşam döngüsü boyunca mRNA transcriptome öteleme yönetmelik hakkında bilinen Falciparum 26. Parazitin proteom Bu sınırlı anlayış parazitin biyoloji anlayışını ve anti-sıtma terapötik nesil için yeni hedefler belirlemek için yeteneği hem de engellemiştir. Parazitin hücre biyolojisi anlayış bu boşluk P. translasyonel düzenlemeyi incelemek için yeterli tekniklerin olmaması nedeniyle büyük ölçüde devam etmiştir Falciparum. Yakın zamanda kağıt P. ribozomal ayak izi kullanımını tarif Falciparum küresel çeviri durumunu belirlemek için 21. Transkript öteleme potansiyelinin biri iyi kurulmuş ölçüm Polizom profilleme tarafından belirlenen ilgili ribozomların sayısıdır. Bununla birlikte, ne bu teknik, P. uygulanır Falciparum </ em>, en Polisomlar kurtarmak edemiyor ve ağırlıklı olarak monosomes yakalar. Son zamanlarda, çeşitli gruplar 27,28 P. optimize Polisomlar korumak ve ev sahibi kırmızı hücrelerin 28 kendi aseksüel gelişimi sırasında bu sıtma parazitlerinin ribozomal doluluk ve translasyonel potansiyelini karakterize etmek aynı zamanda eritrosit ve parazit parçalama yoluyla falsiparum Polizom teknikleri.

Topluca, bu yöntemler, insan miRNA ve parazit mRNA'larının gözlenen füzyon daha önce bildirilen yöntemler kullanılarak 27 gösterilmiştir olanlar füzyon mRNA'lann, parazit protein çevirisini modüle ve HBA sıtma direncinin önemli bir belirleyicisidir ve HbSS 17 eritrosit göstermektedir. Bu yöntemler, bu füzyon RNA'lar P. içinde olup olmadığını, RNA ekleme olaylarını tanımlamak ve fonksiyonel keşfetmek isteyen herhangi bir sisteme yararlı olacaktır falciparum ya da olmasın diğer ökaryotik sistemlerde.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1: P. Küçük ebatlı RNA İzolasyonu IDC Sırasında Falciparum

  1. Eşeysiz kültüründe 29 sıtma parazitleri edinin.
    NOT: Gerekli kültür boyutu istenen başvuru üzerine göre değişir; Bununla birlikte,% 3-5 parazitemi ve% 5 hematokrit bir 10 ml kültür, gerçek zamanlı PCR (RT-PCR) için yeterli RNA içerir. Tekniği başlangıçta asenkron kültürler için optimize edilmiş, ancak enfeksiyon döngüsü sırasında belirli bir zaman noktaları arzu edildiğinde, halka sahne parazitler geç 10-12 saat işgal sonrası daha sorbitol senkronizasyonu ile senkronize edilebilir. Senkronizasyon bir devir (yaklaşık 48 saat) 29 sonra tekrar edilmelidir.
  2. Havuz enfekte hücreler bir araya (~ 5 x 10 9 eritrositler% 3-5 parasitemia at) ve kırmızı pelet hücreleri frensiz 5 dakika boyunca 800 xg'de tüp ve santrifüj üstüne soğuk PBS doldurun.
  3. Santrifüj işleminden sonra, ekli, dikkatli bir aspirasyon pipet kullanarak süpernatant kaldırmakbir vakuma, eritrosit pelet yana çıkarmak kolaydır. Soğuk 1x PBS ile bir kez daha topak yıkayın.
  4. 30 dakika boyunca buz üzerinde tekrar süspansiyon hücre (1x PBS içinde) soğuk% 0.15 saponin içinde pelet ve yer.
  5. 4 ° C'de 12 dakika süreyle 1500 xg'de Santrifüj hücreleri, soğuk PBS süpernatant (renkli koyu kırmızı olacak) ve tekrar süspansiyon pelet çıkarın. Bir kez daha bu adımı yineleyin.
    NOT: Bu mikroRNAlar parazit olan mikroRNA yansıtıcı olup eritrosit kirlenme olmasını sağlamak için, parazit, tecrit koşulları bir takım test edilmiştir: 1) bir saponin liziz, 2) bir saponin liziz RnazA konakçı hücre miRNA'ların tedavisi ve 3 ile birlikte ) Metil-beta-siklodekstrin tedavi konak eritrositlerinden parazit kaldırmak için. Tüm tedaviler benzer sonuçlar verdi.
  6. Lyse lizis tamponu tavsiye 600 ul kullanarak izole parazit pelet. Liziz tamponu Bu birim ~% 2 hematokrit ile% 5 parazitemi 30 mi kadar kültürler için yeterlidir.
    NOT: Daha büyük parazit kültürleri için, bu hacim artırılabilir. En az 1 dakika boyunca tam bir vorteks ile parazit pelet tamamen parçalama sağlamak için önemlidir. Ayrıca, ekstre kolaylığı için, lize numuneleri 1,7 ml mikrosantrifüj tüpüne transfer edilebilir.
  7. Homojenat, ilave madde (2 M sodyum asetat, pH 4) arasında, 60 ul ya da aşama 6'da kullanılan parçalama tamponu 1/10 hacim.
  8. 10 dakika boyunca buz üzerinde örneklerin bırakın.
  9. 600 ul veya her biri 1 dakika numune ve vorteks asit fenol choloroform arasında, Aşama 6'da ilave lizis tamponu miktarına eşit bir hacim.
  10. 5 dakika boyunca 10.000 x g'de santrifüjleme ile örnekleri, sulu ve organik fazlar ayırın. Bu durum döner tüm hemoglobin / hemozoin organik fazda olmasını sağlamak için daha uzun kit önerdiği daha uzundur.
  11. Üst (sulu) tabakayı toplayın ve yeni bir tüp aktarın. Sulu faz yanlısı anlaşılacağı renk (daha büyük olasılıkla) kahverengi, beyaz ya da tekrarlayın 9 ve 10 numaralı adımlarıtein kirlenme.
  12. Pipetle elde edilen üstte kalan sıvı kısmın hacmi tayin edilir ve daha sonra% 100 etanol (~ 800 | il), 1.25 birimleri eklemek 1,7 ml mikrosantrifüj tüpü 5 kez ters yüz edilerek karıştırılır.
  13. 1 dakika süre ile ya da vakum manifoldu kullanılarak 14.000 x g'de santrifüjleme ile, ya bir mesafede RNA bağlayıcı filtre kartuşundan her bir örnek (ticari olarak temin edilebilir çeşitli olan) geçirin.
  14. MiRNA 700 ul tampon 1 1 dakika için 14,000 xg'de iplik, bir mıkro kullanarak yıkama ile filtre kartuşunu yıkayın.
  15. Iki kez 1 dakika her biri için 14.000 x g'de santrifüjleme ile 500 ul yıkama tamponu ile filtre kartuşunu 2/3 yıkayın.
  16. 1 dakika her biri için 14.000 x g santrifüj, 50 ul iki yıkamalarda, 95 ° C 'ısıtılmış olan 100 ul DEPC su ile Elute RNA. 260 nm'de UV absorbansı ile RNA konsantrasyonu ölçümü.
    NOT: RNA jel (TBE üre-akrilamid veya denatüre edici formaldehit agaroz jel olarak) olabilir be izole RNA'ların büyüklük dağılımını değerlendirmek için kullanılan.
    NOT: Bu RNA mikrodizinin RNA-dizisi, Northern blot ve ribonükleaz koruma deneyi ile analiz için uygundur.

2: P. Küçük ebatlı RNA'ların kantitasyonu IDC Sırasında Falciparum

  1. 260 nm'de UV spektrofotometrisi kullanılarak adım 1 'de izole edilmiş tek tek örneklerinin konsantrasyonunu belirler.
  2. İstenilen RNA türleri için real-time PCR primerleri oluşturun. MRNAların ya da füzyon miRNA mRNA biz SYBR yeşil için primerler dizayn ederken miRNA için yalnız biz, önceden hazırlanmış miRNA qPCR deneyleri kullanılır. Ters mRNA dizisi (: ATCGAACATGCTGTGAACAT PKA-R) 'de miRNA'nın alt bir gen spesifik primer ~ 100 bp iken: Füzyon RNA'lar için, ileri primer MiRNA dizisi, (AAACCGTTACCATTACTGAGTT miR-451) idi.
  3. Kullanarak, RNA numuneleri, ya mRNA ve / veya miRNA için miRNA'ların (RNA 20-40 ng kullanımı), tek başına veya rastgele heksamerler bir firkete primeri cDNA sağlayın-mRNA füzyon türleri (RNA'nın 1 | ig kullanılarak). Oda sıcaklığına kadar daha sonra soğuk, 65 ° C 'de 5 dakika süre ile, RNA ve primerler karıştırın. Daha sonra, ters transkriptaz karışımı ekleyin (0.5 ul ters transkriptaz, 0.5 ul RNaz inhibitörü, 1 ul dNTP (her biri 2.5 mM), 4 ul 5x tamponu, 2 ul 0.1 M DTT, 1 ul H2O).
    1. SYBR yeşil veya TaqMan probu ya saptayabilen bir termo Run örnekler. Spesifik genlerin PCR 30 kantitatif yeşil SYBR using, 40 çevrim için, bir 3-aşama PCR, 15 sn için 95 ° C, en primer tavlama sıcaklığı eksi 30 saniye için 5 ° C olarak çalışır, ve 30 saniye süreyle 68 ° C olan Ticari SYBR yeşil master miks. MiRNA gerçek zamanlı PCR, 40 çevrim için, 1 dakika süre ile, iki aşamalı bir PCR gibi 15 sn için 95 ° C ve 60 ° C çalıştırıldı.
    2. ΔΔCt yöntemiyle tahlilleri sayısal olarak ve her iki Rab GTPaz (PF08_0110) ya da 18S rRNA 31 karşı normalize.

3: GirişSıtma Parazitler içine Küçük RNA'lar

  1. Transfeksiyon başına kırmızı kan hücrelerinin 300 ul Pelet freni 1, 5 dakika boyunca 800 x g'de santrifüj ile tam bir sıtma medya (eritrosit 250 ul, yaklaşık 1.5 x 10 9 hücreleri, sonuçta kullanılacağı).
  2. RPMI ve tam cytomix (120 mM KCI içinde tekrar süspansiyon ile iki kez yıkanır, eritrositleri, 0,15 mM CaCl2, 10 mM K 2 HPO 4 / KH 2 PO 4, pH 7.6; 25 mM HEPES, pH 7.6, 2 mM EGTA, pH 7.6; 5 mM MgCl2; fren 1, 5 dakika boyunca 800 x g'de santrifüje tabi tutulmasımn ardından% 50 hematokrit) KOH ile ayarlandı.
  3. 0.2 cm elektroporasyon küvetine hücreleri aktarın.
  4. Küvetler özel sentetik oligonükleotidlerin, 10 ug veya uygun miktarda ekleyin ve kültürleri tekrar süspansiyon.
  5. 310 V / 950 iF için elektro-ayarlayın ve her küvete bir darbe teslim.
  6. Önceden ısıtılmış tam mal olarak küvetin içinde eritrosit 300 ul yeniden süspansearia araçları ve 24 yuvalı plakalar içinde onları plaka ve sıtma kan gazı karışımı ile hava geçirmez bir kapta 37 ° C'de inkübe (% 3 O 2,% 5 CO2).
  7. 4 saat sonra,% 1 yaklaşık son parazitemi senkronize geç trofozoitleri ile transfekte eritrositlerde bulaştırmak.
  8. Enfekte kültürlere, her 4-6 gün taze olarak transfekte eritrositlerde ekleyin ve bölüm 4 de belirtildiği gibi, YOYO-1 lekelemesi kullanılarak FACS ile% paraziteminin belirler.

4: Parazit Enfeksiyon Oranı üzerine Eritrosit mikroRNAlar Etkisinin Belirlenmesi

  1. 1.7 ml mikrosantrifüj tüpü içinde mikropipetöre sabit ve yerine göre yeniden süspanse kültürü 100 ul al. 5 dakika boyunca 800 x g'de santrifüj ile bir masa üstü mikrosantrifüj 1 1x PBS ilave edildi ve santrifüj ile iki kez yıkanır.
  2. % 0.025 glutaraldehit 1 ml süspanse pelet. Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca inkübe edin.
    Not: örnekler 4 ° C'de birkaç hafta muhafaza edilebilir. Daha sonra, enfekte R pelet5 dakika boyunca 800 x g'de santrifüj ile BC ler. 1x 1 ml PBS ile iki kez yıkanır.
  3. % 0.015 saponin 1 ml süspanse pelet. 15 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edilir. Pelet 5 dakika boyunca 800 x g'de santrifüj ile RBC bulaştırılır. 1x 1 ml PBS ile iki kez yıkanır. Repeat.4.3. 1x PBS 1 ul (1,000X), DNA leke ihtiva eden 1 ml içinde süspanse hücreleri.
  4. 488 nM eksitasyon, bir akış sitometresi üzerinde parazitemi derece belirlemek ~ 530 nM (FL-1) emisyonu.
  5. İlk olarak, kapı FSC ve SSC dayalı sitometresi akış eritrosit odaklanmak. Sonra FL-1 kanal floresan kapı RBC parazitemya derecelerde (enfekte eritrositler) ölçün.
    NOT: Daha sonra sahne parazitler erken evre parazitler daha 10X daha floresan, ve bulaşmamış eritrosit yukarıda ~ 100X. Aynı zamanda, düşük hızda toplama gürültü azaltma eğilimi gösterir. Son olarak, bu yaklaşım 3H-Hipoksantin Kuruluş ve Giemsa boyama, daha önce 13 rapor hem de ve tüm teknikler gav kıyasla olmuşturbenzer sonuçlar e.

5: miRNA-mRNA Fusion Ürünlerinin Biotin-etiketleme ve Elution

  1. Doğrudan kovalent 5 'ucuna operatif şekilde bağlanmış destiyobiyotin ile özel sentetik RNA oligonükleotidleri (DB) sipariş.
  2. Aşama 3'te gösterildiği gibi, destiobiyotin-konjüge edilmiş (DB) miRNA'nın ve modifiye edilmemiş miRNA (negatif kontrol) ile birlikte enfekte olmamış eritrositlerde transfekte.
  3. P. ile transfekte eritrositlerde Infect falsiparum% 0.5 (adım 1.1) bir başlangıç ​​parazitemya için parazitleri.
  4. Aşama 1 'de yukarıda tarif edildiği gibi parazit RNA daha sonra 4 gün (96 saat) ekstrakte edin.
  5. Streptavidin boncuk dolu 50 ul parazit RNA 10 ug inkübe, mikropipet vasıtasıyla ilave edilmiş ve 4 ° C 'de 1 saat süre ile, bir mikrosantrifüj tüpü rotator döndürün.
  6. 30 saniye için 800 x g'de boncuk Pelet ve 20 mM KCI, 1/1000 RNaz inhibitörü ile yıkayın.
  7. 2 mM biyotin ve 200 ul RNA yakalama elüsyon tamponu (20 mM KCI, 1/1 ile karşılaştırma yoluyla boncuklar Elute RNA'lar4 ° C'de, 000 RNaz inhibitör ve 2 mM biyotin) ° C sıcaklıkta gece boyunca rotasyon ile.
  8. Belirtilen P. zenginleştirme derecesini belirlemek Adım 2'de gösterildiği gibi, SYBR yeşil QRT-PCR ve TaqMan qPCR mikroRNA zenginleştirme (pozitif kontrol) ile falciparum transkript.

6: P. Ribosomal Kişiler belirleme Polizom Ayırma Falciparum

  1. 5 ml% 15 sukroz çözeltisi (400 mM potasyum asetat, 25 mM potasyum HEPES, pH 7.2, 15 mM magnezyum asetat, 200 uM sikloheksimid, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 40 U / ml RNase inhibitör ve% 15 sükroz yerleştirin ) Bir SW41 bir ultra santrifüj tüpüne (14 x 89 mm) içine.
  2. 5 ml'lik bir şırınga kullanarak, 5 ml% 50 sukroz çözeltisi (400 mM potasyum asetat, 25 mM potasyum HEPES, pH 7.2, 15 mM magnezyum asetat, 200 uM sikloheksimid, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 40 U / ml RNase ekleme Önleyici ve uzun çelik iğne kullanılarak% 15 sukroz altında% 50 sukroz), sonra iğneyi çıkarın.
  3. Parafilm ile gradyan tüpün üst Seal haddeleme önlemek için sabit pozisyonda, onun yüzüne yavaşça tüp eğin, böylece masa üzerine yatay olarak yalan söylüyor. En az 2 saat boyunca yan tüp tutun. Beklerken, adım 6.5 ile başlar.
  4. 2 saat sonra, yavaş yavaş, dik boru eğme ve önceden örnek yükleme en az 15 dakika (aşama 14) için soğumasına izin buz tüp aktarın.
  5. 100-500 toplam RNA ug veya% 3-5 parazitemi kabaca 100 ml'lik asenkron kültürünü oluşturmak için yeterli Plasmodium enfekte olan kan sahne kültürü toplayın. 10x (2 mM) sikloheksimid (CHX) ihtiva eden kültür ortamına bu hacim inci 1/10 ilave edin ve 10 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
    1. Santrifüj Pelet kültürler santrifüj ile 7 dakika (fren 1) için 500 xg'de sonra PBS 200 uM CHX içeren 1x oda sıcaklığı ile iki kez yıkayın. 200 uM CHX içeren 1x PBS içinde parazit kültürleri yeniden süspanse ve buz üzerinde saklayın.
  6. RBC pelet hacmi tahmin edin. Liziz tamponu (400 mM potasyum asetat, 25 mM potasyum HEPES, pH 7.2, 15 mM magnezyum asetat, 200 uM CHX, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 40 U / ml RNase inhibitör,% 1 (h / h) IGEPAL CA ekleme -630, ve% 0.5 4.25 ml nihai hacme kadar RBC pelet DOC) (w / v). 4 ° C'de inkübe lizat Dönerken 10 dakika süreyle ° C.
  7. Mikrosantrifüj tüplerine lizat transferi ve daha sonra 16,000 x g'de 4 ° C'de ve bir mikrosantrfuj örnekleri santrifüj 10 dakika boyunca ° C.
  8. 0.5 M, soğuk sükroz tampon çözeltisi (400 mM potasyum asetat, 25 mM potasyum HEPES, pH 7.2, 15 mM magnezyum asetat, 200 uM sikloheksimid, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 40 U / ml RNase ve 1.25 mi pipetleme sükroz yastıkları hazırlayın Bir SW55 bir ultra santrifüj tüpüne (13 x 51 mm) içine inhibitör ve 0.5 M sükroz).
  9. Dikkatle bir şırınga ve küçük (~ 27) iğne kullanılarak sakaroz yastık üstünde (aşama 7'den) lizat süpernatant 3.75 ml katman. StorBölüm 1 'de gösterildiği gibi, e -80 ° C de geri kalan lisat (~ 500 | il), toplam RNA düzeyini elde etmek için.
  10. 4 önceden soğutulmuş bir ultrasantrifüjdeki rotora içine örnekleri yükleyin 13.2 ml tüpler tutabilir ° C. 366,000 x g'de örnekleri santrifüj ve 146 dakika boyunca 4 ° C.
  11. Bir pipet kullanarak, bir 15 mL konik tüp içine süpernatant aktarın. Serbest (ribozomlar tarafından bağlı olmayan) RNA'lar RNA izolasyonu için -80 ° C'de süpernatan saklayın.
  12. Ribozom yeniden süspansiyon tamponu (400 mM potasyum asetat, 25 mM potasyum HEPES, pH 7.2, 15 mM magnezyum asetat, 200 uM sikloheksimid, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, ve 40 U / ml RNase İnhibitörü) 500 ul ribozom pelletini 5 dakika boyunca pipetleme.
  13. 16.000 x g'de, 4 ° C'de bir mikrosantrfuj örnekleri santrifüj   10 dakika boyunca ° C.
  14. Buz üzerinde adım # 4 den degrade tutarken, sonra dikkatlice degrade usi üstünde ribozom süspansiyon tabaka, Parafilm kaldırmakng bir şırınga ve küçük (~ 27) iğne.
  15. Önceden soğutulmuş bir ultra santrifüj tüpü rotor içine yükleyin ve 200,000 x g ve 180 dakika boyunca 4 ° C 'de yüklü gradyanlar santrifüj. Spin tamamlandığında, mağaza 4'te degradeler santrifüj Hazır olana kadar ° C kincinin üzerine yüklemek için.
  16. Gradyan kısımlara içine boş bir ultra santrifüj tüpüne (bu, önceki bir çalışmada kullanılan tüp olabilir) takın ve 100 x 10 hızda 5 dakika boyunca düzgün miktarlan RNAse bulunmayan su ile yıkayınız.
  17. Adımda 6.16 yıkama sırasında, UV absorbans dedektörün hassasiyetini ayarlamak. İyi bir başlangıç ​​hassasiyeti 0,2, ancak bu, daha sonra (parazit sayısı, vs göre değişir olan) bir 254 sinyaline göre çalışır ayarlanabilir gerekebilir.
  18. Dedektör hassasiyeti ayarlandıktan sonra su detektörü akan iken, sıfıra taban sinyalini ayarlayın.
  19. Çizgiler daha sonra rem boş ve kadar fraksiyon toplayıcı yıkadıktan sonra, sıvı akışını tersineBoş ultrasantrifüjdeki tüpü ove.
  20. Iğne aparatı çıkıncaya kadar kincinin ile% 60 sukroz solüsyonu çalıştırın.
  21. Sıkın üzerinde dikkat çekici, yükleme odasının üstündeki ilk degrade içeren tüp takın ve mühür sıkın. Daha sonra, iğne ile, tüpün alt kısmını delmek.
  22. (Pompanın önündeki akış hızı kontrol düğmesi ile kontrol) 12.5 x 10 sıvı akış hızı Reset sonra 18 sn kesirler toplamak için otomatik fraksiyon toplayıcı ayarlamak (~ 330 ul / fraksiyon) mikrosantrifüj tüplerinde.
  23. Ileri% 60 sukroz çözeltisi akışını başlatın.
  24. Degrade çözümünün ilk açılan mikrosantrifüj tüp içine düştüğünde, hemen fraksiyon toplama ve A 254 sinyalin canlı kayıt, hem başlar.
  25. Keskin bir düşüş% 50 ve% 60 sükroz çözeltiler arasındaki ara yüze karşılık gelen bir 254 sinyalinde bir gözlenmiştir, sıvı akışı ve bir 254 durdurulmasına kaydı.
  26. Gradyan kesirler de saklayın -80   Daha sonra kullanmak üzere ° C.
  27. % 60 sakaroz çözeltisini ultrasantrifüjdeki tüp dışarı boşaltır kadar 100 x 10 hızında sıvı akışını tersine.
  28. Damıtmak için ek degrade varsa, yükleme odasından boş ultrasantrifüjdeki tüp kaldırmak ve adım 6.21 den yeniden başlatın. Tüm numuneler tamamlandığında ise adımlarla 6.16 ve 6.19 gerçekleştirildi gibi aparat yıkayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

P. insan microRNA Küresel profilleme Falciparum

Burada sunulan teknikler çeşitli koşullar içerisinde parazitlerden microRNA çıkarmak için kullanıldı. Unutulmaması gereken bir şey, genellikle bu makalede ve orijinal çalışmada 29 hem de sunulan microRNA verileri için bir referans noktası olarak görev 32, belirtildiği gibi enfekte olmamış eritrositlerde için RNA ekstraksiyonu gerçekleştirilmiştir olmasıdır. Bu daha önceki çalışmalarda da HbSS eritrositler...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

HbS o P. neden olduğu şiddetli sıtmaya karşı koruma sağlar, çünkü büyük ölçüde, sıtmanın endemik bölgelerde en yaygın hemoglobin varyantları biridir Falciparum. Teknikleri P. gen regülasyonu insan microRNA rolünü karakterize etmek gerekli Falciparum Bu yazının boyunca ayrıntılı olarak verilmektedir. Tüm küçük RNA'ların içerecek şekilde toplam RNA ekstre edilmesi ve oldukça basit bir parazit lizis prosedürü uygulayarak olarak, bu füzyon RNA'lar, bağımsız çeşitli teknikler vasıt...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların beyan edecekleri herhangi bir rakip mali çıkarları yoktur.

Teşekkürler

Bu araştırma Doris Duke Charitable Foundation, Burroughs Wellcome Fund, NIH R21DK080994, Duke Chancellor'ın pilot proje fonu, Roche Anemi Araştırmaları Vakfı ve The Bill and Melinda Gates Foundation tarafından finanse edilmiştir. GL, Duke's UPGG ve NIH (Grant # 5R01AI090141-03) ve K.A.W. tarafından NSF Lisansüstü Araştırma Burs Programı tarafından desteklenmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
REAKTİFLER-Tüm reaktifler RNAse içermemelidir.
Diethyl pirokarbonatSigmaD5758DEPC
DEPC ile arıtılmış su (bkz. REAKTİF KURULUMU)
Yoyo-1 DNA floresan boyaThermo Fisher
Gene Pulser II elektroporatörBio-Rad
0,2 cm Elektroporasyon küvetleri
4 M potasyum asetatMallinckrodt6700
2 M potasyum HEPESSigmaH0527pH 7.2
1 M magnezyum asetatSigmaM-2545
1 M ditiyotreitolAraştırma Ürünleri UluslararasıD11000DTT
100 mM fenilmetilsülfonat florürSigmaP7626PMSF, izopropanol içinde çözünmüş
%10 (h/h) Igepal CA-630Sigma-AldrichI3021
%10 (a/h) sodyum deoksikolatSigmaD-6750DOC
SikloheksimidSigmaC-7698CHX
SükrozMallinckrodt8360-04
RNAseOUT (İnvitrojen, kat. no. 100000840)İnvitrogen
RPMI-1640 w/ L-glutaminCellgro10-040-CV
%10 AlbuMAX IInvitrogen11020-039w/v steril suda
GentamisinGibco15750-060
HT takviyesi (100x) (Invitrogen, kat. no. 11067030)
%45 (a/h) sükroz (Sigma, kedi no. G8769)
1 M HEPES tamponu (Gibco, kat. no. 15630-080)
1x fosfat tamponlu salin (PBS; Cellgro, kedi. no. 2109310CV)
Corning 500 ml vakum filtreli matara (VWR, kat. no. 430769)
Cam slaytlar (VWR, kat. no. 48311-702)
Giemsa boyası (50X) (VWR, kedi no. m708-01)
mirVana miRNA izolasyon kiti (Ambion, ThermoFisher Scientific).
5' Biyotin konjuge olgun miRNA (dizi, ilgilenilen miRNA'ya göre değişir) (Dharmacon)Biyotin
tozu (Sigma-Aldrich)
1 M Potasyum Klorür
Streptavidin Sefaroz Yüksek Performanslı Boncuklar (GE Healthcare)
Ribozom resüspansiyon tamponu (bkz.
Lizis tamponu (bkz. REAKTİF KURULUMU)
%15 (a/h) sükroz gradyan çözeltisi (bkz. REAKTİF KURULUMU)
%50 (a/h) sükroz gradyan çözeltisi (bkz. REAKTİF KURULUMU)
0.5 M sükroz yastığı (bkz. REAKTİF KURULUMU)
%60 (a/h) sükroz takip çözeltisi (bkz. REAKTİF KURULUMU)
Plazmodyum hücre kültürü ortamı (bkz. REAKTİF KURULUMU)
RNA yakalama Yıkama Tamponu (bkz. REAKTİF KURULUMU)
RNA Elüsyon Tamponu (bkz. REAKTİF KURULUMU)
REAKTİF KURULUMU
Solutions
Plasmodium hücre kültürü ortamı
500 ml RPMI-1640, L-glutamin
ile 0,5 ml gentamisin
5 ml HT takviyesi
2,5 ml %45 glikoz
25 ml %10 AlbuMAX I
12,5 ml 1 M HEPES
0,2 mm vakumlu filtre şişesi ile steril filtre.
<10x CHX< / güçlü içeren güçlü > Plazmodyum hücre kültürü ortamı >
Yukarıdaki Plasmodium hücre kültürü ortamı ile aynı tarif, aşağıdakilerin eklenmesiyle:
2 mM sikloheksimid
Ortamı normal olarak hazırlanır, daha sonra 2 mM'lik bir nihai konsantrasyona CHX eklenir ve süzülür.
< sikloheksimid içeren > 1x PBS< / güçlü >
Sikloheksimid, 200 mM'lik bir nihai konsantrasyona kadar 1x PBS'ye taze olarak eklenir ve kullanıma kadar 4 O < / sup >C'de tutulur.
Ribozom yeniden süspansiyon tamponu
400 mM potasyum asetat
25 mM potasyum HEPES, pH 7.2
15 mM magnezyum asetat
200 mM sikloheksimid (taze ekleyin)
1 mM DTT (taze ekleyin)
1 mM PMSF (taze ekleyin)
40 U/ml RNaseOUT (taze ekleyin)
Lizis tamponu
Yukarıdaki ribozom yeniden süspansiyon tamponu ile aynı tarif, aşağıdakilerin eklenmesiyle:
% 1 (h / h) Igepal CA-630
% 0,5 (a/h) DOC
sükroz çözeltileri< / güçlü >
Yukarıdaki ribozom yeniden süspansiyon tamponu ile aynı tarif, değişen miktarlarda sükroz ilavesiyle:
% 15 (a / h) sükroz % 15 sükroz gradyan çözeltisi
yapmak için% 50 (a / h) sükroz % 50 sükroz gradyan çözeltisi
için 0.5 M sükroz 0.5 M
gibi, sikloheksimid, DTT, PMSF ve RNaseOUT taze olarak eklenmelidir.
% 60 sükroz kovalama çözeltisi sadece sükroz ve su gerektirir, başka hiçbir bileşen
% 60 sükroz kovalama çözeltisi
< güçlü >RNA Yakalama Yıkama Tamponu< / güçlü >
20 mM & nbsp; KCl
5 birim/ml Rnase Çıkışı (Invitrogen)
RNA Yakalama Elüsyon Tamponu
RNA Yakalama Yıkama Tamponu ile aynı tarif, aşağıdakilerin eklenmesiyle:
2 mM Biotin
EKİPMANLAR< / güçlü >
SW55 Ti ultrasantrifüj rotoru (Beckman, kat. no. 342194)
SW41 Ti ultrasantrifüj rotoru (Beckman, kat. no. 331362)
Ultra AçıkTM ½ SW2 için x 13 x 51 mm) ultrasantrifüj tüpleri (Beckman, kat. no. 344057)
Poliallomer 9/16 x 3 ve frak12; SW41 için (14 x 89 mm) ultrasantrifüj tüplerinde (Beckman, kat. no. 331372)
L8-80M ultrasantrifüj (Beckman)
Çelik künt şırınga iğnesi, 4 inç, 16 G (Aldrich, kat. no. Z261378)
27 G½ ile 1 ml şırınga; iğne (Becton Dickinson, kedi no. 309623)
5 ml şırınga (Becton Dickinson, kat. no. 309646)
Parafilm
Tüp döndürücü, uçtan uca
Mikrosantrifüj, soğutmalı
Yoğunluk gradyan fraksiyonlama sistemi (Teledyne Isco, kat. no. 69-3873-179)
TracerDAQ (Ölçüm Hesaplama)
Eppendorf 5810R santrifüj
Eppendorf A-4-81 rotor (Eppendorf, kat. no. 022638807)
100000840yapmaksükroz yastık yapmak için Yukarıdaki gerektirmez yapmak için DEPC ile muamele edilmiş suda% 60 (a / h) sükroz

Kaynaklar

  1. World Health Organization. World Malaria Report. , (2014).
  2. Livincstone, F. B. Malaria and human polymorphisms. Annu Rev Genet. 5, 33-64 (1971).
  3. Nagel, R. L., Roth, E. F. Malaria and red cell genetic defects. Blood. 74, 1213-1221 (1989).
  4. Aidoo, M., et al. Protective effects of the sickle cell gene against malaria morbidity and mortality. Lancet. 359, 1311-1312 (2002).
  5. Tiffert, T., et al. The hydration state of human red blood cells and their susceptibility to invasion by Plasmodium falciparum. Blood. 105, 4853-4860 (2005).
  6. Fairhurst, R. M., et al. Abnormal display of PfEMP-1 on erythrocytes carrying haemoglobin C may protect against malaria. Nature. 435, 1117-1121 (2005).
  7. Cyrklaff, M., et al. Hemoglobins S and C interfere with actin remodeling in Plasmodium falciparum-infected erythrocytes. Science. 334, 1283-1286 (2011).
  8. Friedman, M. J. Erythrocytic mechanism of sickle cell resistance to malaria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75, 1994-1997 (1978).
  9. Pasvol, G., Weatherall, D. J., Wilson, R. J. Cellular mechanism for the protective effect of haemoglobin S against P. falciparum malaria. Nature. 274, 701-703 (1978).
  10. Lecellier, C. H., et al. A cellular microRNA mediates antiviral defense in human cells. Science. 308, 557-560 (2005).
  11. Niu, Q. W., et al. Expression of artificial miroRNAs in transgenic Arabidopsis thaliana confers virus resistance. Nature biotechnology. 24, 1420-1428 (2006).
  12. Zhao, G., Yu, D., Weiss, M. J. MicroRNAs in erythropoiesis. Curr Opin Hematol. 17, 155-162 (2010).
  13. Lee, Y. T., et al. LIN28B-mediated expression of fetal hemoglobin and production of fetal-like erythrocytes from adult human erythroblasts ex vivo. Blood. 122, 1034-1041 (2013).
  14. Sangokoya, C., Doss, J. F., Chi, J. T. Iron-responsive miR-485-3p regulates cellular iron homeostasis by targeting ferroportin. PLoS genetics. 9, e1003408(2013).
  15. Chen, S. Y., Wang, Y., Telen, M. J., Chi, J. T. The genomic analysis of erythrocyte microRNA expression in sickle cell diseases. PLoS ONE. 3, e2360(2008).
  16. Sangokoya, C., Telen, M. J., Chi, J. T. microRNA miR-144 modulates oxidative stress tolerance and associates with anemia severity in sickle cell disease. Blood. 116, 4338-4348 (2010).
  17. Deitsch, K., Driskill, C., Wellems, T. Transformation of malaria parasites by the spontaneous uptake and expression of DNA from human erythrocytes. Nucleic acids research. 29, 850-853 (2001).
  18. Liang, X. H., Haritan, A., Uliel, S., Michaeli, S. trans and cis splicing in trypanosomatids: mechanism, factors, and regulation. Eukaryotic cell. 2, 830-840 (2003).
  19. Baum, J., et al. Molecular genetics and comparative genomics reveal RNAi is not functional in malaria parasites. Nucleic acids research. 37, 3788-3798 (2009).
  20. Hall, N., et al. A comprehensive survey of the Plasmodium life cycle by genomic, transcriptomic, and proteomic analyses. Science. 307, 82-86 (2005).
  21. Caro, F., Ahyong, V., Betegon, M., DeRisi, J. L. Genome-wide regulatory dynamics of translation in the asexual blood stages. eLife. 3, (2014).
  22. Oehring, S. C., et al. Organellar proteomics reveals hundreds of novel nuclear proteins in the malaria parasite Plasmodium falciparum. Genome biology. 13, R108(2012).
  23. Lasonder, E., et al. Analysis of the Plasmodium falciparum proteome by high-accuracy mass spectrometry. Nature. 419, 537-542 (2002).
  24. Bozdech, Z., et al. The transcriptome of the intraerythrocytic developmental cycle of Plasmodium falciparum. PLoS biology. 1, E5(2003).
  25. Gardner, M. J., et al. Genome sequence of the human malaria parasite Plasmodium falciparum. Nature. 419, 498-511 (2002).
  26. Zhang, M., Joyce, B. R., Sullivan, W. J. Jr., Nussenzweig, V. Translational control in Plasmodium and toxoplasma parasites. Eukaryotic cell. 12, 161-167 (2013).
  27. Lacsina, J. R., LaMonte, G., Nicchitta, C. V., Chi, J. T. Polysome profiling of the malaria parasite Plasmodium falciparum. Molecular and biochemical parasitology. 179, 42-62 (2011).
  28. Bunnik, E. M., et al. Polysome profiling reveals translational control of gene expression in the human malaria parasite Plasmodium falciparum. Genome biology. 14, R128(2013).
  29. LaMonte, G., et al. Translocation of sickle cell erythrocyte microRNAs into Plasmodium falciparum inhibits parasite translation and contributes to malaria resistance. Cell host & microbe. 12, 187-199 (2012).
  30. Lambros, C., Vanderberg, J. P. Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture. The Journal of parasitology. 65, 418-420 (1979).
  31. Bourgeois, N., et al. Comparison of three real-time PCR methods with blood smears and rapid diagnostic test in Plasmodium sp. infection. Clinical microbiology and infection : the official publication of the European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 16, 1305-1311 (2010).
  32. Abruzzo, L. V., et al. Validation of oligonucleotide microarray data using microfluidic low-density arrays: a new statistical method to normalize real-time RT-PCR data. Biotechniques. 38, 785-792 (2005).
  33. Sangokoya, C., LaMonte, G., Chi, J. T. Isolation and characterization of microRNAs of human mature erythrocytes. Methods in molecular biology. 667, 193-203 (2010).
  34. Rathjen, T., Nicol, C., McConkey, G., Dalmay, T. Analysis of short RNAs in the malaria parasite and its red blood cell host. FEBS Lett. 580, 5185-5188 (2006).
  35. Xue, X., Zhang, Q., Huang, Y., Feng, L., Pan, W. No miRNA were found in Plasmodium and the ones identified in erythrocytes could not be correlated with infection. Malar J. 7, 47(2008).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Eritrosit MikroRNA'larıPolizom ProfillemeRNA TransfeksiyonuKüçük RNA AnaliziFüzyon Transkript TespitiGen Düzenleme ÇalışmasıSıtma Direnç MekanizmasıRNA Zenginleştirme Yöntemi
Yöntemler Küçük RNA'ların ve Ribosomal doluluk Düzenleyici Rolü Araştırma
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.