Coculture Tahliller Glioblastoma Invasion Makrofaj ve Mikroglia Stimülasyon Eğitim için

Özet

Kanserin kötü huylu davranışını anlamak, tümör hücrelerinin makrofajlar gibi tümör mikro çevresinin bileşenleriyle nasıl etkileşime girdiğine dair doğru modeller oluşturmayı gerektirir. Burada, tümörle ilişkili makrofajlar ve mikroglia ile glioblastoma hücre etkileşimini incelemek için iki yöntem tanımlanmıştır ve burada glioblastoma invazyonu üzerindeki etki değerlendirilmektedir.

Özet

Glioblastom (Evre IV glioma) 1 yıl sonrası tanı medyan sağkalım çok agresif bir insan kanser türüdür. glioblastoma doğuran moleküler olayların daha iyi anlaşılmasına rağmen, bu kanser halen geleneksel tedaviye son derece dirençli olmaya devam etmektedir. yüksek dereceli beyin tümörlerinin cerrahi rezeksiyon nedeniyle glioblastoma hücreleri son derece infiltratif doğaya nadiren tamamlandı. glioblastoma hücre işgali hafifletir tedavi yaklaşımları dolayısıyla cazip bir seçenektir. Laboratuvarımız ve diğerleri bu tümör ilişkili makrofajlar ve mikroglia (ikamet beyin makrofajlar) kuvvetle glioblastoma işgali teşvik göstermiştir. Bu yazıda anlatılan protokol in vitro kültür analizleri kullanılarak glioblastoma-makrofaj / mikroglia etkileşimi modellemek için kullanılır. Bu yaklaşım büyük ölçüde bu habis Behav sağlayan makrofajlar ile iletişimi bozan ilaçların geliştirilmesi ve / veya keşif kolaylaştırabilirIOR. 10 kat - Biz mikroglia / makrofajlar 5 ile glioma hücre işgali teşvik iki güçlü kokültürünün işgali testleri kurduk. Bir flüoresan işaretleyici ya da yapısal olarak bir flüoresan proteini ifade ile etiketlenmiş glioblastoma hücrelerinin matris kaplı polikarbonat odası ekler üzerinde olmayan ve makrofajlar / mikroglia ile kaplama ya da üç boyutlu bir matris içinde yer almaktadır. Hücre işgali filtrenin alt sadece invaziv hücreler görüntü floresan mikroskopi kullanılarak ve saymak tarafından değerlendirilir. Bu tahliller kullanılarak, çeşitli farmakolojik inhibitörleri (JNJ-28.312.141, PLX3397, Gefitinib ve Semapimod) makrofaj blok tanımlanmıştır / mikroglia glioblastoma işgali uyarmıştır.

Giriş

Glioblastom tanı ^1,2 andan itibaren yaklaşık 12 aylık medyan sağkalım agresif bir insan beyin kanseri olduğunu. Glioblastoma standart kemoterapi ve cerrahi rezeksiyon refrakter olarak en ölümcül ve klinik zorlu kanserlerden biridir. glioblastoma yaygın doğası cerrahi tamamen rezeke gelişmiş tümör neredeyse imkansız hale normal beyinden yayılan tümör hücrelerini tanır. Bu son derece invaziv yönü glioblastoma ve diğer gelişmiş astrositomaların damgasını özelliğidir. Bu nedenle, bir çok çalışmanın odağıdır glioblastoma hücre istilası moleküler mekanizması olmuştur. Glioblastoma tümör mikro malignite ^3-6 kurulmasında hayati bir rol oynar. Tümör ilişkili makrofajlar / mikroglia glioblastoma işgali ^7,8 teşvik sorumlu olduğu gösterilmiştir. Bu çalışmaların çoğu, ancak kullanarak makrofajlar / mikroglia etkisini ölçtükfiziksel glioblastoma hücreleri ayırmak tahlilleri. Laboratuvarımız bize glioblastoma işgali cocultures makrofajlar / mikroglia bağlıdır nasıl çalışması ve işgali sırasında görüntü aralarındaki fiziksel etkileşimi sağlayacak izin geliştirilmiş tahlilleri üretmek için yola çıkmıştır.

Klasik deneyleri hücre işgali "standart" Boyden çemberinin kemotaksisini ve kemo-istila formatlarını içerir ölçmek için. çalışılacak Burada hücreler belirli bir boyutu (çapı genellikle arasında 0.4 ve 8 uM) gözeneklere sahip altında bir polikarbonat filtresi içeren plastik odasına yerleştirilir. hücrelerinin istilasını süreci genellikle hücre dışı matris proteini arasında oluşan fiziksel bir bariyer kapsar. kemo-istila deneyinde, kullanılan tercih edilen matris Matrigel (bundan böyle "matris" olarak anılacaktır), Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) tarafından salgılanan bir hücre dışı matris proteini karışımı, fare sarkoma hücreleri ve büyük ölçüde col oluşmaktadırlagen tip IV ve laminin. Chambers, sonra ya da işgali uyarma şüphelenilen büyüme faktörleri olmaksızın hücre kültür ortamı ihtiva eden bir doku kültür çukuruna yerleştirilir. daha yüksek bir frekansta hücre dışı matris kaplı filtre ile istila ve filtrenin alt tarafına bağlı bir yüksek invaziv kapasitesine sahip hücreler. Biz glioblastoma hücre işgali üzerine mikroglia ve tümör ile ilişkili makrofajlar rolünü değerlendirmek için bu testte değiştirdiniz.

10 kat ^9,10 - Biz mikroglia 5 iki glioblastoma hücre hatları işgali uyarabilir bu kağıt içinde açıklanan kokültürünün analizleri kullanılarak belirlemek mümkün olmuştur. Bu glioblastoma hayvan modellerinde gözlemlenmiştir yansıtan. Ayrıca, glioblastoma hücreleri ve makrofajlar arasındaki etkileşimler / mikroglia daha doğrudan incelenebilir üç boyutlu işgal tahlil geliştirildi. macropha ile uyarılan glioblastoma hücre invazyonu3D tahlilinde ges / mikroglia matrisi kaplı bölme yaklaşımı kullanılarak görülen şeyin karşılaştırılabilir. Benzer deneyler daha önce işgali ^11-13 sırasında makrofajlar ile meme kanseri etkileşimleri incelemek için geliştirilmiştir. Bu yazıda anlatılan iki yöntem glioblastoma hücreleri makrofaj / mikroglia uyarılan işgali moleküler mekanizmasını (ler) incelemek yeteneği yardımcı olmalıdır.

Protokol

1. Hücre floresan etiketleme

NOT: floresan boyalar ⁹ Etiket glioblastoma hücre hatları ve mikroglia. Seçenek olarak ise, ¹⁴ de tarif edildiği gibi konstitütif GFP / RFP gibi floresan proteinleri ifade eden hücre hatları oluşturmak.

1. boyama gününde% 80 konfluent - 6 gözenekli bir plakada Plaka hücreleri 70 olacak şekilde. Fare glioblastoma hücre hattı GL261 ve insan glioblastoma hücre hattı U87, plaka 1 x 10 ⁶ ve 1.5 x 10 ⁶ hücre, sırasıyla boyama önce 6 cm çanak 24 saat üzerinde.
2. DMSO içinde floresan hücre leke boya çözeltisini hazırlayın ve ortama 5 uM boya ekleyin ya Roswell Park Memorial Institute ortamı (RPMI) veya makrofaj serum barındırmayan ortam (MSFM) de vorteks.
3. 37 ° C'de 30 dakika karıştırıldı ve% 5 _CO2 için boya ile inkübe hücreleri.
4. boya içeren ortamı çıkarın ve hücrelere taze ortam (RPMI veya MSFM) ekleyin.
5. 30 dakika boyunca hücreler inkübe edin. Not: Hücreler artıklekeli ve hazır denemede kullanılır.

2. Ön kaplı Matrix Odası Coculture Invasion Testi

1. Forbol miristat asetat (PMA) ¹⁵ kullanılarak, THP-1 hücreleri ayırt.
   1. Plaka 2 - 6 bölmeli bir kültür tepsisi RPMI /% 10 FBS, 1.5 ml 3 x 10 ⁵ THP-1 hücreleri. Kaplamadan hemen sonra, 100 nM PMA ekleme ve 48 saat boyunca 37 ° C'de,% 5 _CO2 inkübe edilir.
      Not: 48 saat sonra, başarılı bir farklılaşma geçirmiş THP-1 hücreleri yapışkan olacak ve de yuvarlak bir morfolojisi alarak altına yayılır.
   2. 1x bir kez PBS ile yıkanarak PMA çıkarın ve taze RPMI /% 10 FBS ile değiştirin. Hücreler tayininde kullanıma hazır olana kadar başka bir 48 saat bekleyin.
2. Bir tek başına medya 500 ul içeren (hiçbir serum) onları yerleştirerek ve üstüne tek başına medya 500 ul ekleyerek matris önceden kaplanmış odaları dengelenmesi. 37 ° C de 2 saat ve% 5 _CO2 için bir oda inkübe edin.
   Not: Ön kaplı odaları üreticiden satın alındı; Malzemeleri / Ekipman Tabloya bakınız.
3. yavaşça hücreler (floresan etiketli glioblastoma hücre hatları ve mikroglia / makrofajlar) çıkarmak için, aspirasyon ile hücrelerden ortamı çıkarın. 2 mM EDTA / PBS ile yemeğin üzerine hücreleri yıkayın. 2 mM EDTA / 500 ul PBS ilave edin ve 5 inkübe edin - 37 ° C'de bir hücre kuluçka makinesi içinde, 10 dakika ve% 5 _CO2.
4. % 0.3 Sığır Serum Albumin (BSA) ihtiva eden ortam 5 ml içinde süspanse hücreleri.
5. 120 x g'de 5 dakika boyunca santrifüje.
6. MSFM /% 0.3 BSA ortam aspire supernatant ve tekrar süspansiyon pelet ya da (U87 ve THP-1 hücreleri için) RPMI /% 0.3 BSA (GL261 hücreleri ve mikroglia için) hücre konsantrasyonu 1 x 10 ⁶ hücre / ml'ye eşit olduğu şekilde . hücreleri saymak için bir hemasitometre kullanın.
7. 24 gözlü plakanın her bir kuyucuğu 500 ul ortam /% 0.3 BSA ekleyin.
8. En az 2 saat (adım 2.2) için dengelenmiş olan odaları bulunan ortamı çıkarın. Yeri Chambeiyi 500 ul medya /% 0.3 BSA (adım 2.7) ihtiva eden rs.
9. inhibitörleri makrofaj üzerindeki etkisini incelemek için kullanılıyorsa / mikroglia alt ve odanın üst kısımlarına hem uygun konsantrasyon ekleyin glioma işgali uyarılır.
   Not: CSF-1R konsantrasyonları GL261 glioblastoma istilası Referans ⁹ bulunabilir uyarılmış tam mikroglia inhibe etmek için kullanılır inhibitördür.
10. Fare glioblastoma (2.10.1) ve insan glioblastoma (2.10.2) kullanılan hücre hatları bağlı olarak, aşağıdaki iki adımda tarif edildiği gibi üst bölmeye hücreleri ekleyin.
    1. 1.5 x 10 ⁵ GL261 (glioblastoma) hücreleri (150 ul) ve 5 x 10 ⁴ fare mikroglia (50 ul) (ortam detayları için adım 2.6) karıştırın. 300 ul MSFM /% 0.3 BSA eklenerek 500 ul hacim kazandırın. Üst bölmeye hücre karışımı ekleyin ve 48 st için 37 ° C,% 5 _CO2 inkübe edilir.
       NOT: i tarif edildiği gibi Fare mikroglia yenidoğan farelerin izole edilmiştirn, ^{1 ila 6.}

7.5 x 10 ⁴ U87 (glioblastoma) hücreleri (75 ul) ve 2.5 x 10 ⁴ THP1 (makrofaj) hücreleri (25 ul) karıştırın. 400 ul RPMI /% 0.3 BSA ilave edilerek 500 ul hacim getirin. üst bölmeye hücre karışımı ekleyin. 24 saat boyunca 37 ° C'de,% 5 _CO2 hücreleri inkübe edin.

1. kuluçkadan sonra hafif aspirasyon ile odasının üst hücreleri çıkarmak ve PBS içinde% 3.7 formaldehit içinde yerleştirerek odaları düzeltin. Chambers, oda sıcaklığında 15 dakika boyunca (ya da gece boyunca 4 ° C) sabitleştirici kalmasına izin verir. Nazik aspirasyonu ile Fiksatif çıkarın ve PBS 1x 500 ul ile değiştirin. görüntü analizi için bölüm 4 geçin.
   NOT: Deney şu anda durdurulmuş ve 1x PBS içinde görüntüleme için kaydedilebilir. Floresan boya sinyalleri tespit sonrasında en fazla 2 hafta tespit edilebilir.

Matrix glioma ve makrofajlar / mikroglia katıştırma 3. Invasion Testi "3D"

1. gece boyunca 4 ° C'de çözülme matriks karışımı. kaputu buz üzerinde matris kullanarak tüm diğer manipülasyonlar gerçekleştirin.
2. Buz üzerinde% 0.3 BSA ile ortam matrisin 10 mg / ml konsantrasyon (MSFM veya RPMI) hazırlayın.
   Not: matris stok konsantrasyonu tipik olarak yaklaşık 15 mg / ml'dir.
3. matris içinde süspansiyon için (adım 1 'de etiketli) hücreler hazırlamak için, aspirasyon ile hücrelerden ortamı çıkarın. 2 mM EDTA / PBS ile yemeğin üzerine hücreleri yıkayın. Hücrelere 2 mM EDTA / 500 ul PBS ilave edin ve 5 inkübe edin - 37 ° C'de kuluçka makinesi içinde, 10 dakika ve% 5 _CO2.
4. % 0.3 BSA ihtiva eden ortam 5 ml içinde süspanse hücreleri.
5. 120 x g'de 5 dakika boyunca santrifüje.
6. pelet Süpernatant aspire. Hücre konsantrasyonu 1 x 10 ⁶ hücre / ml'ye eşit olduğu şekilde ortam /% 0.3 BSA içinde süspanse pelet. hücreleri saymak için bir hemasitometre kullanın.
7. 1.5 ml mikrofüj tüpüne + 5 x 10 ⁴ mikroglia hücreleri (50 ul) (150 ul) 1.5 x 10 ⁵ GL261 hücreleri ekleyin.Ayrı bir 1.5 ml mikrofüj tüpe 2 x 10 ⁵ GL261 hücreleri (200 ul) eklenir.
   Not: Tek başına mikroglia olmayan GL261 hücreleri, kontrol olarak hizmet eder.
8. 120 x g'de 5 dakika boyunca mikrofuj Spin hücreleri.
9. buz üzerinde 200 ul soğuk matris içinde süspanse edin hücreleri.
10. 8 mcM gözenek boyutu odası ucun üst bölmesinin merkezi üzerine plakası 50 ul (50,000 hücreler).
11. polimerizasyon meydana gelmesi için, 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
12. Alt de üst bölmesi ve 700 ul serum içeren hücre büyüme ortamına 200 ul serumsuz ortam ekleyin.
13. 48 saat boyunca 37 ° C'de,% 5 _CO2 inkübe edin.
14. kuluçkadan sonra hafif aspirasyon ile odasının üst hücreleri çıkarmak ve PBS içinde% 3.7 formaldehit içinde yerleştirerek odaları düzeltin. Chambers, oda sıcaklığında 15 dakika boyunca (ya da gece boyunca 4 ° C) sabitleştirici kalmasına izin verir. Nazik aspirasyonu ile Fiksatif çıkarın ve PBS 1x 500 ul ile değiştirin. bölüm 4 fo geçinr görüntü analizi.

4. Görüntüleme Tahliller

1. % 3.7 formaldehit odaları çıkarın ve PBS 1x taze 500 ul içeren iyi yıkayın.
   NOT: odalar kurumasına izin vermeyin.
2. bir pamuklu kullanarak, yavaşça filtre yüzeyi kazınarak filtrenin üst kısmı (yan bölmesinin içine bakan) için invazif olmayan hücreler temizleyin. yavaşça başlayın ve giderek basıncı artar. odasının başına bu en az 3 kez yapın.
3. ya bir cam tabanlı çanak odaları yerleştirin veya 24 plaka bırakın.
4. Kamera ve görüntü yakalama yazılımı ^9,10 ile donatılmış bir epifluorescent veya lazer konfokal floresan mikroskop sahnede örnek yerleştirin.
5. temsili alanların birkaç 10X veya 20X fotoğraf çekmek.
6. Örneğin ImageJ gibi bir görüntü analiz yazılımı kullanarak, alt ^9,10 filtreyi geçti glioblastoma hücrelerinin sayısını saymak.
7. "3D görüntüleme Eğer. 4.6 Yukarıda açıklanan - "işgali tahlil (bölüm 3 açıklanan), bir floresan lazer konfokal mikroskop ^5-6 kullanarak Z yığını serisi oluşturmak görüntü için filtrenin alt invaziv hücre popülasyonunu, protokolü takip 4.2 adımları.

Sonuçlar

Burada açıklanan yöntemleri kullanarak, mikroglia ve makrofajlar esas glioblastoma hücre istilasını uyarabilir göstermiştir. İki farklı invazyon tahlilleri kullanılabilir ve Şekil 1 'de tasvir edilmiştir. Şekil 2'de, kurucu floresan proteini MCherry eksprese GL261 hücreler ve 48 saat mikroglia olmayan önceden kaplanmış odaları ekildi. mikroglia invaziv kapasitesi yaklaşık 10 kat artarak, ancak zaman kültür GL261 hücreleri kendi minimal invaziv id...

Tartışma

yüksek dereceli astrositomların ve glioblastoma son derece invaziv doğası bu beyin kanserleri çok ölümcül olun. Bu glioblastoma işgali moleküler ve hücresel mekanizmaları anlamak nedenle büyük önem taşımaktadır. Çok glioblastoma işgali zaten ¹⁷ süreci hakkında öğrenilmiştir. 10 kat - Bu yazıda ayrıntılı tahlil formatları kullanarak, bizim laboratuvar tümörle ilişkili makrofajlar 5 ile glioma hücre işgali uyarabilir, hem fare ve insan modellerinde gösterilmiştir. Bu Coculture modeli sadakatle potansiyel arasın...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Corning BioCoat Matrigel İstila Odası: BD Matrigel Matrix	ile Corning/Fisher Scientific Cat	: 354481
Makrofaj Serumu İçermeyen Ortam (MSFM) (500 ml)	Yaşam Teknolojileri	12065-074
CellTracker Kırmızı CMTPX Boya	Ömrü Teknolojileri/Moleküler Problar	C34552
CellTracker Yeşil CMFDA	Boya Ömrü Teknolojileri/Moleküler Problar	C2925
GL261 hücre hattı	Ulusal Kanser Enstitüsü (NCI)
U87 hücre hattı	Amerikan Doku Tipi Kültür Koleksiyonu	HTB-14
THP-1 hücre hattı	Amerikan Doku Tipi Kültür Koleksiyonu	ATCC TIB-202
RPMI 1640 Orta (500 ml)	Life Technologies/Gibco	11875-093
Formaldehit çözeltisi	Sigma Aldrich	F1635
Corning Transwell polikarbonat membran hücre kültürü ekleri (8 & mikro; M gözenek) paket başına 48.	Corning	CLS3422
Cultrex 3-D Kültür Matrisi Azaltılmış Büyüme Faktörü Bazal Membran Ekstresi, PathClear	Trevigen	3445-005-01
Fetal Buzağı Serumu (FBS)	Yaşam Teknolojileri	Kedi: 10500064
Sığır Serumu Albümini, Fraksiyon V, Isı Şoku İşlemli	Fisherscientific	BP1600-100
0,5 M EDTA	ThermoFisher Scientific	15575-020
phorbol 12-miristat 13-asetat (PMA)	Sigma Aldrich	P8139-1MG