Method Article

MicroRNA Niceleme DNA bağlayıcı Boya Kimya ve Damlacık Dijital PCR kullanarak Sirkülasyon

DOI:

10.3791/54102

⸱

June 26th, 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Experimental, Diagnostic and Specialty Medicine - DIMES, University of Bologna, 2Department of Morphology, Surgery and Experimental Medicine, University of Ferrara, 3Department of Life Sciences and Biotechnology, University of Ferrara, 4Department of Morphology, Surgery and Experimental Medicine and Laboratory for Technologies of Advanced Therapies (LTTA), University of Ferrara

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Boya bazlı bir kimya ve damlacık dijital PCR teknolojisi kullanılarak hücresiz mikroRNA'ların miktar tayini için hassas ve doğru bir yöntem açıklanmaktadır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

mikroRNA (miRNA'ların) (hücre içermeyen) dolaşımdaki kan akışı içine hücrelerden salınırlar. dolaşımdaki Belirli mikroRNA miktarı bir hastalık durumu ile bağlantılı hastalık belirteç olarak kullanılmak üzere bir potansiyele sahip olmuştur. Dijital PCR teknolojisi bir boya temelli kimya kullanılarak ve damlacık microRNA ölçümü dolaşan için hassas ve doğru bir yöntem son zamanlarda geliştirilmiştir. Spesifik olarak, nükleik asit (LNA) belirli miRNA'ların mutlak miktarının elde edilmesi mümkün olmaktadır, uyumlu bir damlacık dijital PCR sisteminin yeşil floresan DNA bağlayıcı boya ile miRNA spesifik primerler tabanlı Kilitli kullanılarak. Burada, bu tekniği gerçekleştirmek gibi plazma ve serum gibi biyolojik sıvılarda, içinde miRNA miktarını değerlendirmek için nasıl tarif uygulanabilir ve etkili hem de.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MicroRNA'lar (miRNA'lar), aktif salınım veya nekrotik ve apoptotik süreçlerin bir sonucu olarak potansiyel olarak organizmanın tüm hücreleri tarafından kan dolaşımına salınır. Hücresiz miRNA'lar, kan dolaşımında ya serbest kararlı moleküller olarak ya da lipoproteinlere bağlı olarak ya da eksozomlar ve mikro-parçacıklar 1-3 içinde sarılmış olarak tespit edilmiştir. Hücreden hücreye iletişimciler 4 olarak işlev gördüklerine inanılmaktadır ve miktarları kanser, kalp bozuklukları veya otoimmün hastalıkların varlığında değişir 5-7. Doğru ve tekrarlanabilir nicelikleri, hastalık biyobelirteçleri olarak değerlendirilmelerinin temelidir. Bununla birlikte, başka bir yerde daha önce açıklanan birkaç nedenden dolayı 8,9, serum veya plazmada ve diğer vücut sıvılarında miRNA miktar tayini çok zor olabilir 10,11. Yakın zamanda, miRNA'ya özgü LNA primerlerine ve DNA bağlayıcı boya damlacık dijital PCR (ddPCR) teknolojisine dayalı olarak dolaşımdaki miRNA'ların mutlak miktar tayini için bir yöntem geliştirdik 12. Bu metodoloji, miRNA meme kanseri biyobelirteçlerinin doğrulanmasına uygulanmıştır 13,14.

Her ters kopyalanmış miRNA molekülünün nanolitre boyutunda bir damlacık içinde bölünmesinden sonra, her numunedeki her miRNA'nın kopya sayısını saymak, temel olarak yeşil ve dolayısıyla pozitif floresan damlacıkların sayısını saymak mümkündür. Bir PCR reaksiyonu meydana gelir gelmez, kantitatif RT-PCR'DE (RT-qPCR) olduğu gibi standart bir eğri oluşturmaya veya hedef miktar hesaplamasında PCR verimliliğini hesaba katmaya gerek kalmadan pozitif bir sayım elde edilir. Ek olarak, ddPCR'nin dolaşımdaki miRNA miktar tayininde RT-qPCR'den daha hassas ve doğru olduğu kanıtlanmıştır 15. Bu makalede, bu metodolojinin ayrıntılı protokolünü sunuyoruz, en ilgili adımları tartışıyoruz ve özellikle serum ve plazma klinik örneklerini ele alıyoruz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Plazma ya da serum gelen mikroRNA İzolasyon

Not: Plazma ve serum hazırlama miRNA miktarının dolaşımdaki ilgili bir adımdır. plazma ve serum hazırlanması için herhangi bir tercih işlemi yoktur. dikkate Önemli olan tek şey aynı deneyden tüm örnekler aynı iş akışı kullanarak işlenmelidir olmasıdır. 200 ul serum veya plazmadan başlayın. Toplam RNA ticari olarak temin edilebilir kitler kullanılarak serum veya plazma izole edilebilir.

1. (miRNA dahil) Toplam RNA Protokolü İzolasyon

  1. Buz üzerinde Çözülme serum / plazma örnekleri.
  2. 200 ul serum / plazma liziz reaktifi (örn., QIAzol) 1 ml ilave edilir.
  3. vorteks karışım, 5 dakika boyunca oda sıcaklığında tezgah üzerinde Homojenat içeren tüp yerleştirin.
  4. C. sentetik miRNA cel-miR-39-3p bir 4.16 nM çözeltisi 3 ul ekleyin elegans.
  5. kloroform 200 ul ekle. 15 saniye boyunca kuvvetlice tüpü çalkalayın. Yeri inci2 dakika boyunca oda sıcaklığında tezgah e tüpü.
  6. 4 ° C'de 12,000 x g'de 15 dakika boyunca santrifüj aşamaları ayırma elde etmek üzere, üst sulu faz RNA içerir.
  7. , Yeni bir tüpe 700 ul sulu faz transfer herhangi bir beyaz interfaz malzeme transferini engellemek.
  8. % 100 etanol 1 ml ilave edilir ve çevirerek karıştırın.
  9. Pipet yukarı mini spin kolon içine numune 700 ul 2 ml toplama tüpü yerleştirilir. 15 saniye boyunca 12.000 xg'de kapağı ve santrifüj kapatın. flow-through atın.
  10. Kalan örnek kullanarak bu adımı yineleyin.
  11. Mini döndürme kolonuna 700 ul Tampon RWT ekle sütunu yıkamak için 12,000 xg'de 15 sn için kapağı ve santrifüj kapatın. flow-through atın.
  12. Mini spin kolon içine Pipetleyin 500 ul Tampon RPE. 12.000 rpm'de 15 saniye boyunca kapağı ve santrifüj kapatın. flow-through atın. Yine bu adımı yineleyin.
  13. spin kolon kurumasını 2 dakika süreyle tam hızda mini spin kolon santrifüjKalıntı etanolden membran.
  14. Sütunun membran üzerinde yeni bir 1.5 ml'lik bir toplama tüpü ve damlalıklı 35 mL RNaz içermeyen su mini spin kolon aktarın.
  15. RNA elüte etmek için 12,000 x g'de 1 dakika boyunca santrifüj.
  16. -80 ° C'de RNA saklayın.
    Not: RNA konsantrasyonu, doğru olarak belirlenebilir edemediğinden, giriş miktarı için bir ölçü olarak, sabit hacimli kullanımı.

2. mikroRNA Ters Transkripsiyon

  1. 5x reaksiyon tamponu, nükleaz içermeyen su: ters transkripsiyon (RT) reaktif karışımı bileşenleri çözülme. Yavaşça karıştırın buz üzerinde tüpler ve yeri tersini. Kullanımdan hemen önce, dondurucudan enzim karışımı çıkarın ve buz üzerine yerleştirin. tüm reaktifler aşağı doğru döndürün.
  2. Tablo 1 'de tarif edildiği gibi buz üzerinde RT reaktif karışımı hazırlayın. En az% 10 aşan karışımı hazırlayın.
  3. Pipetleme tarafından reaksiyonu karıştırın ve daha sonra aşağı doğru döndürün.
  4. 42 ° C'de 60 dakika boyunca inkübe edin.
  5. Rever Isı inaktive95 ° C'de 5 dakika boyunca SE transkriptaz.
  6. Hemen ardından 4 ° C'ye soğutun.
  7. -20 ° C'de cDNA saklayın.

3. cDNA Sulandırma

  1. nükleaz içermeyen su içinde planlanan ddPCR reaksiyonları için gerekli olan cDNA şablon miktarının seyreltilir. 1:50 ve 1 arasında cDNA reaksiyonu sulandırmak: 500 suda, hedef miRNA bereket bağlıdır. -20 ° C'de seyreltilmiş cDNA saklayın. seyreltilmiş cDNA -20 ° C'de en az 3 ay boyunca stabil olduğu kanıtlanmıştır.

4. damlacık oluşturma ve PCR

Not: damlacık oluşturma her seferinde 8 numuneler üzerinde yapılmalıdır. Teknik çoğaltır nedeniyle 12,15 .A Şablonsuz kontrol (NTC) bir numunesi, her plaka çalıştırılmalıdır bu teknolojinin yüksek ölçüde tekrarlanabilirliği ve her biri farklı ddPCR durum için gerekli değildir.

  1. Çözülme ve ana karışımı dengeye (örn., EvaGreen Master Mix) oda sıcaklığında, mikroRNA primer seti ve cDNA.
  2. Master Mix th Mixoroughly Tüpü birkaç kez baş aşağı çevirerek. tüm reaktifleri aşağı doğru döndürün.
  3. Tablo 2'de tarif edildiği gibi ddPCR karışımı hazırlayın. Birden ddPCR reaksiyonlar gerçekleşirken zaman, ddPCR çalışma-çözeltisi karışımı hazırlayın. en az% 10 aşan karışımı hazırlayın.
  4. monte kez iyice karıştırın ve ddPCR karışımı aşağı doğru döndürün.
  5. ddPCR 12 ul, 96 oyuklu bir plaka, PCR ya da PCR tüpleri içine karıştırmak dağıtın.
  6. de / her bir tüpe seyreltildi cDNA şablonunun 8 ul ekle.
  7. tutucu içine damlacık jeneratör kartuşu takın.
  8. Aktarım hava kaçınarak kuyunun dibinde kabarcıkları dikkatle ise damlacık jeneratör kartuşunun örnek kuyu (orta sıra) her Hazırlanan numune 20 ul.
  9. damlacık jeneratör yağı 70 ul her petrol kuyusu (alt sıra) doldurun.
  10. kartuş yuvasına üzerinde conta kanca ve damlacık jeneratör yerleştirin.
  11. Üreticinin pr göre damlacık nesil başlatmak için kapağını kapatınotocol. damlacık oluşturma bittiğinde, kapağı açın atılabilir conta çıkarın. kartuşun üst kuyular damlacıkları içerir.
  12. 96 oyuklu bir PCR plaka tek bir sütuna sekiz en oyuklara (damlacıklar) içeriğinin pipetleyin yavaş ve düzgün 40 ul.
  13. hemen buharlaşmasını önlemek için damlacıkların aktardıktan sonra folyo ile PCR plaka mühür. Damlacık okuyucu iğne ile uyumlu delinebilir folyo plaka contaları kullanın.
  14. bir plak kapatıldı, 30 dk içinde termal çevrimi (PCR) başlayın.
  15. Tablo 3'e göre bisiklet protokolü gerçekleştirin.

5. Damlacık Okuma

  1. damlacık okuyucu açın.
  2. damlacık okuyucuya termal döngü plaka taşıyın.
  3. plaka sahibinin tabanına PCR sonrası damlacıkları içeren 96-PCR plaka koyun.
  4. PCR plaka üzerinde plaka sahibinin üst yerleştirin. Sıkıca hem serbest bırakma tırnaklarını basınaşağı tutucuya PCR plakasını sabitlemek için.
  5. Sistem PC'den yazılımını başlatın.
    1. deneyi (Mutlak miktar) tanımlamak için Kur'u tıklatın ve sonra damlacık okumaya başlamak için Çalıştır 'ı tıklatın.
    2. damlacık okuma tamamlandığında, tıklayın açın ve verileri analiz etmek için, lütfen "Analiz".
    3. Pozitif damlacıkları (kement aracı) (Şekil 1B) seçmek için analiz yazılımı 2D genlik arsa kullanın.
    4. Pozitif ve toplam damlaların sayısını kontrol etmek Olaylar sekmesini kullanın. 18.000 toplam sayısı - 21.000 damlacıkları genellikle probeless ddPCR ile elde edilir.
    5. Pozitif damlacıklar seçildikten sonra, Konsantrasyon sekmesinden ihracat .csv seçeneğini kullanarak miRNA konsantrasyon değerleri ihracat.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Plazma ya da serum ml başına özgül miRNA'ların mutlak miktarı, dijital PCR teknolojisi yeşil fluoresan DNA bağlayıcı boya kullanılarak ve damlacık belirlenebilir. 1 son MiRNA konsantrasyonunu belirler pozitif damlacıkları seçim sürecini sunulur şekil (kopya / ml ) analiz yazılımı ile hesaplanmıştır amplifikasyon reaksiyonunda. Kandaki her miRNA miktarı diğerlerine göre biraz miRNA türü daha bol olması, çok farklıdır. ddPCR reaksiyonunda 1:50 seyreltilmiş...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sirkülasyon miRNA'lar son derece düşük konsantrasyonlarda, kanda bulunan plazma ve serum örneklerinden elde edilebilir RNA miktarı düşüktür. Bu nedenle, bu tür mikrodizi ve RNA dizi analizi gibi diğer tekniklerle ölçmek zordur. Ayrıca, veriler normalleştirme üzerinde anlaşma genel bir eksikliği ve kan endojen "referans" miRNA'ların varlığı yoktur. Bu bağlamda, serum veya plazma çok düşük dahi olsa ml başına miRNA kopya sayısını sayma yeteneğine sahip damlacık dijital PCR gibi hassas bir teknoloji, çok ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

(-, 2010/15 9980 5 mille n başına. Özel Program Moleküler Klinik Onkoloji) ve Üniversite ve Öğretim İtalyan Bakanlığı MF (MFAG 11676) Kanser Araştırma İtalyan Derneği (AIRC) den ve MN için fon tarafından desteklenen MN Araştırma FIRB 2011 (Proje RBAPIIBYNP).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
miRNeasy Mini KitQiagen217004miRNA dahil toplam RNA için sütunlar, serum/plazma
100 nmole RNA oligo'dan ekstraksiyon Cel-miR-39-3pEntegre DNA TeknolojileriÖzelDizi: UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG
Evrensel cDNA sentez kiti II, 8-64 rxnsExiqon203301MicroRNA ters transkripsiyon için Kit
MicroRNA LNA PCR primer seti Exiqon204000-206xxx ve 2100000-21xxxxxDamlacıklar içinde miRNA amplifikasyonu için astarlar
QX200 damlacık üreteciBioRad186-4002Damlacık okuma için kullanılan cihaz
QX200 damlacık okuyucuBioRad186-4003Damlacık üretimi için kullanılan cihaz
QuantaSoft yazılımıBioRad186-3007Veri toplama ve analizi
PX1 PCR plaka kapatıcıBioRad181-4000Plaka mühürleyici
DG8 damlacık jeneratörü kartuşları ve contalarıBioRad186-4008Damlacıklar oluşturmak için numune ve yağı karıştırmak için kullanılan kartuşlar
QX200 ddPCR EvaGreen süper karışımBioRad186-4033/36PCR süper karışım
QX200 damlacık üreteci yağıBioRad186-4005Damlacık üretimi için yağ
için yazılım EvaGreen boyası için

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Arroyo, J. D., et al. Argonaute2 complexes carry a population of circulating microRNAs independent of vesicles in human plasma. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 5003-5008 (2011).
  2. Skog, J., et al. Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers. Nat Cell Biol. 10, 1470-1476 (2008).
  3. Vickers, K. C., Palmisano, B. T., Shoucri, B. M., Shamburek, R. D., Remaley, A. T. MicroRNAs are transported in plasma and delivered to recipient cells by high-density lipoproteins. Nat Cell Biol. 13, 423-433 (2011).
  4. Braicu, C., et al. Exosomes as divine messengers: are they the Hermes of modern molecular oncology. Cell Death Differ. 22, 34-45 (2015).
  5. Creemers, E. E., Tijsen, A. J., Pinto, Y. M. Circulating microRNAs: novel biomarkers and extracellular communicators in cardiovascular disease. Circ Res. 110, 483-495 (2012).
  6. Guay, C., Regazzi, R. Circulating microRNAs as novel biomarkers for diabetes mellitus. Nat Rev Endocrinol. 9, 513-521 (2013).
  7. Schwarzenbach, H., Nishida, N., Calin, G. A., Pantel, K. Clinical relevance of circulating cell-free microRNAs in cancer. Nat Rev Clin Oncol. 11, 145-156 (2014).
  8. Moldovan, L., et al. Methodological challenges in utilizing miRNAs as circulating biomarkers. J Cell Mol Med. 18, 371-390 (2014).
  9. Tiberio, P., Callari, M., Angeloni, V., Daidone, M. G., Appierto, V. Challenges in Using Circulating miRNAs as Cancer Biomarkers. Biomed Res Int. 2015, 731479(2015).
  10. Jarry, J., Schadendorf, D., Greenwood, C., Spatz, A., van Kempen, L. C. The validity of circulating microRNAs in oncology: five years of challenges and contradictions. Mol Oncol. 8, 819-829 (2014).
  11. Witwer, K. W. Circulating MicroRNA Biomarker Studies: Pitfalls and Potential Solutions. Clin Chem. 61, 56-63 (2015).
  12. Miotto, E., et al. Quantification of Circulating miRNAs by Droplet Digital PCR: Comparison of EvaGreen- and TaqMan-Based Chemistries. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 23, 2638-2642 (2014).
  13. Ferracin, M., et al. Absolute quantification of cell-free microRNAs in cancer patients. Oncotarget. , (2015).
  14. Mangolini, A., et al. Diagnostic and prognostic microRNAs in the serum of breast cancer patients measured by droplet digital PCR. Biomarker Research. , (2015).
  15. Hindson, C. M., et al. Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR. Nat Methods. 10, 1003-1005 (2013).
  16. Mestdagh, P., et al. Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study. Nat Methods. 11, 809-815 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Circulating MicroRNADroplet Digital PCRDNA binding DyeLNA based PrimersAbsolute QuantificationPlasma Serum AnalysisEvaGreen Master MixDroplet GenerationThermal CyclingQuantaLife Software

Related Articles