Yöntem makalesi

Bir Vakum Stabilize Görüntüleme Penceresi ile Akciğer uzun vadeli Yüksek Çözünürlüklü Intravital Mikroskopi

DOI:

10.3791/54603

⸱

6 Ekim 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Developmental and Molecular Biology, Albert Einstein College of Medicine, 2Department of Obstetrics/Gynecology and Woman’s Health, Albert Einstein College of Medicine, 3Department of Anatomy & Structural Biology, Albert Einstein College of Medicine, 4Gruss-Lipper Biophotonics Center Integrated Imaging Program, Albert Einstein College of Medicine, 5Medical Research Council Centre for Reproductive Health, Queen’s Medical Research Institute, University of Edinburgh

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, vakumla stabilize edilmiş bir görüntüleme penceresi kullanarak sağlam akciğerin gerçek zamanlı olarak uzun süreli yüksek çözünürlüklü, tek hücreli görüntülemesini gerçekleştirmek için çoklu foton mikroskobunun kullanımını açıklar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Akciğer, karaciğer ve kemik gibi ikincil sitelere Metastaz yaklaşık 90% 1 mortalite oranı travmatik bir olaydır. Bu sitelerin, akciğer nedeniyle vücudun hassas doğası ve uygun fizyolojisi sürdürülmesinde hayati rol içindeki kapalı konumuna intravital optik görüntüleme kullanarak değerlendirmek en zor olandır. Klinik yöntemler (pozitron emisyon tomografisi (PET), manyetik rezonans görüntüleme (MRG) ve bilgisayarlı tomografi (BT)) bu doku noninvaziv görüntülerini sağlayabilen olsa da, tek bir piksel ile en erken ekim olayları görselleştirmek için gerekli çözünürlük, eksikliği yaklaşık bin hücrelerinden oluşan. Sadece bir tümör hücresinin geldikten sonra olaylar hayatta kalma ve daha sonraki büyüme için deterministik olan metastatik akciğer tohumlama postülanın Güncel modelleri. Bu tek hücreli çözünürlükte 2 ile gerçek zamanlı intravital görüntüleme araçları tohumlama cel fenotipleri tanımlamak için gerekli olduğu anlamına gelirls bu modelleri test ve. Akciğer yüksek çözünürlüklü optik görüntüleme çeşitli eks vivo preparatlar kullanılarak gerçekleştirilmiştir birlikte, bu deneyler, tipik haliyle tek bir zaman noktası deneyler ve (nedeniyle önemli ölçüde değişmiş ortam sıcaklığı, bolluğu, sitokinler, vb eşya ve olası hatalı sonuçlara duyarlı ) göğüs boşluğuna ve dolaşım sistemi 3 çıkarıldıktan kaynaklanan. Son çalışmalar bir vakum ancak görüntüleme penceresi 2,4,5 stabilize kullanarak mümkün sağlam akciğerin o zaman atlamalı intravital optik görüntüleme olduğunu göstermiştir, tipik görüntüleme süreleri yaklaşık 6 saat ile sınırlı kalmıştır. Burada 12 saatlik bir süre boyunca böyle bir pencere kullanılarak akciğer uzun süreli intravital zaman atlamalı görüntüleme gerçekleştirmek için bir protokol açıklar. Bu yöntem kullanılarak elde edilen zaman atlama görüntü sıralarını akciğer görselleştirme ve hücre-hücre etkileşimleri kantitatif membran dinamikleri ve vasküler perfüzyon sağlar. Biz daha dAkciğer mikrovasküler emsalsiz net bir görünüm verir bir görüntü işleme tekniği Escribe.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yüksek çözünürlüklü intravital optik görüntüleme tek hücreli ve alt-hücresel parametreler ölçülmüş ve sayısal olarak izin birçok biyolojik süreçleri anlamak için çok önemli olduğu kanıtlanmıştır. Kanser araştırmalarında, tümör stromal hücrelerin intravital görüntüleme hayvanda sadece mevcut bir çok mikro-çevresel etkileşimleri 6-11 keşfine yol açmıştır.

In vivo tek bir hücre çözünürlüğü, optik görüntüleme kullanılarak göğüs kanserinde intravasation ve tümör hücrelerinin yayılması ile bağlantılı mikroçevrelerde keşiflerine da prognoz ve göğüs kanseri hastalarında 12-16 tedaviye yanıt için yeni işaretleri yol açmıştır. bozulmamış iç hayati organlara içinde derin görüntülemek için mevcut en iyi görüntüleme teknolojileri tüm organ mükemmel manzarasına sahiptir ve klinik belirti bile önce patolojileri ortaya çıkarabilir klinik yöntemler (MRI, PET CT) 'dir. Bunlar edemiyoruz, however nedeniyle tek bir hücre çözünürlükte onların eksikliği tümör ilerlemesini sürüş metastaz erken aşamaları ve hücresel mekanizmaları ortaya çıkarmak için. Zamanla akciğer metastazı bu modaliteleri görünür, onlar iyi kurulmuş ve artıyor. Onlar çok daha erken, daha önce geliş ve hayatta kalma erken adımları görüntüleme, 19 beklenenden daha gelmesi yaygın tümör akciğere ulaşması ya 17 hayatta olmayan veya başlangıçta atıl 18 kalır hücreleri ve gözlem% 90 için çok önemli hale gelmesi tahmini göz önüne alındığında uzak bölgelerde metastatik tohumlama ve tümör büyümesinin nüks süreci anlamak.

Akciğerde bu gözlemleri Sahne ancak son derece zor olduğu kanıtlanmıştır; görüntüleme çalışmalarının büyük çoğunluğu yalnızca tek zaman noktalarında akciğer içine bir görünüm vermek ex vivo veya eksplant hazırlıkları 20-23 kullanmışlardır. Bu hazırlıklar yararlı bilgiler sağlamakla birlikteım, onlar mikroçevresinin çeşitli bileşenleri arasında meydana gelen etkileşimlere, sebep-sonuç ilişkileri ve dinamikleri tam bir anlayış vermeyin. Uygun bir dolaşım sistemi (ve homeostasis eşlik eden dengesizlik) ve vücudun bağışıklık sisteminin geri kalanından kesilmesi eksikliği arzulu bu hazırlıkların in vivo sağlam dokuda oluşturmak sonuçlara doğrulamak için yapar.

Birçok grup Wearn ve Alman plevra tabakası 24 açığa cerrahi olarak ilk ve Terry implante edilebilir görüntüleme penceresi 25 kullanan ilk olmak sağlam akciğer 2,4,5,24-33 intravital görüntüleme gerçekleştirdik.

Akciğerde Yüksek çözünürlüklü görüntüleme ölçüde akciğer sürekli hareket tarafından engellenmektedir ve çeşitli teknikler bu sınırlamayı aşmak için geliştirilmiştir. Wagner ve Filley 27 köpek akciğer doğal hareket okuduve Wagner doku 28 hareketsiz onun pencere cerrahi hazırlık vakum kullanılan iken nispeten sabit bölge üzerindeki implante pencereyi bulmak için cerrahi protokol tasarlanmış. Bronş sıkıştırma, sıralı apne ve kapı görüntüleme, örneklemeyi edinimi, akciğer lobu ve vakum 34 yapışması: O zamandan beri, çeşitli teknikler görüntüsüne dahil akciğer faydalanılmıştır. Bunların her biri kendi avantajları ve dezavantajları vardır ve hiç kimse teknik başka 34'e kadar üstün ortaya çıkmıştır. Örneğin, bronş sıkma ve ardışık apne akciğer gazların normal alışverişini değiştirebilir ve atelektazi neden olabilir. Geçitli görüntüleme ve oversampled edinimi bu dezavantajları muzdarip ama yüksek hızda veya özel görüntüleme cihazları yaygın olarak erişilebilir değil gerekmez. Sonunda akciğer hem yapıştırma ve vakum tekniği yukarıda belirtilen sakıncaları hem önlemek, ancak bakım tak değilse kesme kuvveti kaynaklı yaralanma görülebiliren. Son yıllarda, vakum penceresi minyatürize edilmiş ve konfokal ve multiphoton mikroskopi 4,5,33 ve mükemmel yüksek çözünürlüklü görüntü kullanılarak farelerde kullanılmak üzere adapte elde edilmiştir 2. Tablo 1, bu zengin geçmişini özetleyen ve yeni tarif o kağıtları özeti intravital akciğer görüntüleme pencereleri kullanımında gelişmeler.

Bu protokol mümkün olan en yüksek hücre içi çözünürlük ile canlı, sağlam akciğer görüntü metastaz genişletilmiş time-lapse multiphoton intravital mikroskopi kullanımını tarif etmektedir. Görüntüler yüksek sayısal açıklık objektif lens ve çoklu photomultiplier tüp (PMT) dedektörleri ile donatılmış bir multiphoton mikroskop kullanarak en fazla 12 saat boyunca elde edilir. Transgenik fare modelleri flüoresan yüksek molekül ağırlıklı dekstran ve floresan protein transfekte edilmiş tümör hücreleri (damar ve tümör hücreleri respectivel etiket ile floresan etiket yerel makrofajlara kullanılırY). floresan etiketli hücrelerin bu seçim tümör hücre endotelyal hücre-makrofaj etkileşimleri ve dinamikleri görselleştirme sağlar iken, bu protokol floresan veya floresan olmayan fare herhangi suşu için çalışacaktır. Kazanılmasından sonra, artık sürüklenme hareketi (varsa) etiketsiz dolaşan kan hücrelerinin neden yanıp sönen ortadan kaldırmak için 35,36 ve özel makrolar zaman ortalama damar kanalı eklentisi Fiji kullanılarak elimine edilir.

Bu protokol, görüntüleme metastaz odaklanırken, teknikler akciğer yüksek çözünürlüklü tek hücreli bir görüntüleme ile gözlemlenebilir diğer biyolojik süreçlerde uygulanabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol açıklanan tüm işlemler Tıp Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi Albert Einstein College of tarafından önceden onay da dahil olmak üzere omurgalı hayvanların kullanımı için kurallara ve yönetmeliklere uygun olarak yapılmıştır.

1. Yaratma floresan etiketli Fare Modeli ve Tümör Hücreleri

  1. PBS, 100 ml BSA 0.1 g karıştırılarak% 0.1 (a / h) inek serumu albümini / fosfat tamponlu tuzlu su (BSA / PBS) tamponu 100 ml hazırlayın.
  2. dengeli transfeksiyon floresan işaretli tümör hücrelerinin hazırlanması.
    NOT: Burada E0771-LG hücreleri damardan ebeveyn E0771 hücreleri 38 ile enjekte C57BL / 6 fare akciğer geliştirilen metastatik tümörler izole edildi E0771 fare meme adenokarsinoma hücreleri 37 derece metastatik türevi kullanın.
    1. Transfeksiyondan 24 saat önce, levha 1 x 10 Antibiyotik, 2 ml bir 60 mm doku kültürü tabağına 5 EO771-LG hücreleritlc bilgilerini% 10 FBS (fetal inek serumu) DMEM (Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı) ve 37 ° C 'de inkübe etmek ve% 5 CO2.
    2. Transfeksiyon zamanda, düşük serum ortamında 190 ul ilave edilmeden önce 30 dakika boyunca transfeksiyon reaktifi 10 ul floresan protein vektörünün 2 ug inkübe edin.
    3. Yıkama EO771-LG Dulbecco fosfat tamponlu tuzlu su (D-PBS) ile hücreler bir kez yavaşça transfeksiyon karışımı ekleyin.
    4. 6 saat boyunca 37 ° C'de,% 5 CO2 inkübe edin.
    5. 2 gün bitmiş DMEM, 2 ml (% 10 FBS, 1 mM piruvat, 100 U / ml penisilin / ml streptomisin, 100 ug) transfekte hücreler ve kültür yıkanır.
    6. Steril PBS ve 2 ml hücreleri yıkayın% 0.25 tripsin-EDTA, 500 ul ve 37 ° C'de 2 dakika boyunca inkübe edin.
    7. hücre süspansiyonu toplayın ve tam DMEM en az 1 hacmi ile karıştırın ve 280 x g aşağı doğru döndürün.
    8. tam DMEM 1 ml hücrelerin tekrar ve içine hücre kültürü genişletmek10 cm doku kültürü çanak.
    9. her üç günde bir ortam değiştirme bir hafta bitmiş DMEM ve kültür 8 ml G418 seçici antibiyotiği 700 ug / ml ekleyerek transfekte edilmiş hücrelerin seçimi başlatın.
  3. Floresans ile aktive edilen hücre sıralama (FACS) 39,40 ile G418 içinde seçimi altında olmuştur transfekte edilmiş hücrelerin flüoresan nüfus zenginleştirmektedir.
    1. 5 ml PBS ile hücreleri yıkanır ve 1.5 ml% 0.25 tripsin ekleyin.
    2. 37 ° C'de 2 dakika süreyle inkübe edin ve tam DMEM en az bir hacim ile karıştırın.
    3. hücre süspansiyonu toplayın ve 280 xg'de aşağı spin ve steril% 0.1 1 mL (w / v) BSA / PBS tampon hücreleri yeniden askıya.
    4. 40 mikron örgü ile hücre süspansiyonu Filtre ve sıralama için% 0.1 BSA / PBS tamponu ile 1 ml ses seviyesini ayarlamak.
    5. FACS sıralayıcı 41 kullanılarak floresan spektrum göre% 10 parlak nüfus FACS-sıralayın.
    6. bir hafta u Kültür sıralanmış hücrelernder seçimi (komple DMEM 700 ug / ml G418).
    7. sitometrisi kez daha adımları 1.3.6 1.3.1 tekrarlayarak akışı ile floresan işaretli hücrelerin yeniden seçin.
    8. (Adım 1.3.1-1.3.4) tarif edildiği gibi bir seçim, trypsinize, filtre ve bir ikinci tur sonra% 0.1 BSA / PBS içinde hücrelerin yeniden askıya. FACS ayırıcıyla 96 gözlü plakalara ayırma tek bir hücre için 2 x 10 6 hücre / ml konsantrasyon ayarlayın.
    9. toplanması için tam DMEM 100 ul 3-5 96 oyuklu plakalar hazırlamak. , Sıraladıktan sonra hayatta kalma geliştirmek EO771-LG hücreleri 42 yetiştirilmiştir yemekler süzülmüş kültür ortamının 100 ul ekleyin.
    10. 96 gözlü plakalara hücreleri sıraladıktan sonra, 2 gün boyunca kültür hücreleri dönüş (37 ° C,% 5 CO2).
    11. 5x büyütme tersine bir mikroskop altında incelenmesi ile olarak tek klonlar ile kuyu tanımlar.
    12. Trypsinize ve yaşayabilir klonlar genişletmek ve yedekleme için hücreleri dondurma.
      1. gr ile kuyu yıkayınsteril PBS 100 ul klonlar sayesinde. h tripsin / ağ% 0.25 50 ul ilave edin ve 37 ° C'de 2 dakika kuluçkalayın. bitmiş DMEM, 50 ul ilave edin ve 5 dakika boyunca 280 x g'de döndürülür ve steril bir V-tabanlı ya da yuvarlak tabanlı 96 oyuklu plakaya transfer.
      2. Süspanse 700 ug / ml G418 tam DMEM 100 ul hücre 12 oyuklu plakalarda her klon plaka. akana kadar G418 ve kültürü ile tam DMEM 400 ul ekleyin.
      3. , 500 ul PBS ile kuyu yıkayın% 0.25 tripsin, 100 ul ve 37 ° C'de 2 dakika kuluçkalayın. tam DMEM 100 ul ekleyin ve 280 x g'de 5 dakika aşağı doğru döndürün. birbirine karışana kadar 6 kuyulu plakalarda, G418 ve plaka hücrelerle tam DMEM 100 ul hücrelerin tekrar.
      4. birleşmiş kez trypsinize hücreler, aşağı spin ve FBS% 10 DMSO içinde tekrar süspansiyon hücre stokları dondurmak için.
      5. metastatik potansiyelin değerlendirilmesi için 100 mm doku kültürü çanakları içinde onları kaplama ile kültür içinde hücre süspansiyonları 1/10 tutun.
  4. Seçilen klonların metastatik potansiyelini test.
    1. Tripsinize ve 2,5 ml x 10 6 hücre / lik bir konsantrasyon tuz içinde hücrelerin yeniden askıya ve kuyruk damarı yoluyla damardan C57BL / 6 farelerine 200 ul enjekte edilir.
    2. Daha önce 23 açıklandığı gibi 2 hafta sonra, akciğer dokusu toplamak ve yüzey sayısı veya stereolojik yöntemle 43 ile tümör yükünü ölçmek. Intravital görüntüleme için yüksek metastaz potansiyeline sahip klonlar seçin.
  5. MacBlue muhabiri fareler 44 (mavi floresan proteini (OBP) ifadesini (CSF1R -GAL4VP16 / UAS-ECFP 16) sürüş miyeloid spesifik promotör) kaldırın.
    NOT: Genellikle, 8 ve 12 hafta arasında fareler kullanılır, ancak erken 7 olarak ve olabildiğince geç 20 kadar hafta da çalışmak için test edilmiştir fareler.

2. multiphoton Mikroskop Seti yukarı ve Görüntüleme Hazırlık

NOT: Bu protokol, her m gerçekleştirilebilir birlikteultiphoton mikroskop, bu protokolde gösterilen veri elde etmek için kullanılan sistem detaylı 45 daha önce tarif edilmiştir.

  1. iki foton lazerler ve en az bir saat öncesinde istenen görüntüleme süresi dedektörler de dahil olmak üzere tüm mikroskop ve lazer bileşenleri açın.
  2. okunur ameliyattan hemen önce, hemen mikroskop önce ışın yolu optik güç ölçer başkanı yerleştirerek mikroskop ışık girdi gücünü ölçmek ve 880 nm maksimum ışık yoğunluğu kadar lazer uç boşluğu ayna düğmeleri ayarlamak optik güç metre.

3. Vakum Sistemi kurma

  1. Siyanoakrilat ile görüntüleme penceresi (Company Şekil 1) içine lamel Tutkal. Tamamen kuru yapıştırıcı için en az 4 saat bırakın.
    NOT: Bu adım, vaktinden önce gerçekleştirilmelidir.
  2. küçük açıklıktan ilk satırında 100 ul pipet kesin ve ince v kesilmemiş ucunuacuum hortumu.
  3. Şekil 1 ve Ek Şekil 2'ye göre yeni bir elektrik bağlantı sistemi.
  4. üzerinde vakum ve bloke açık uçlu, <3 inHg için vakum regülatörü ayarlayın.
    Not: vakum seviyesinde son ayarı, in vivo olarak damar gözlemlenerek yapılacaktır.
  5. görüntüleme plakası ile uzak wicked olmaktan objektif lens daldırma ortamı önlemek için görüntüleme plakanın alt petrol gres ince bir tabaka sürün.
  6. Mikroskop sahnede görüntüleme plaka koyun.
    NOT: Özel görüntüleme plakası (Company Şekil 3) 1/8 bir sayfadır "kalın alüminyum hem de sahne eklemek alana sığacak ve görüntüleme penceresini tutmak için merkezi bir delik ile karşı işlenmiş.
  7. aşağı lamel ile görüntüleme plakasına vakum penceresini yerleştirin.
  8. Sterilize tüm yüzeyleri ve aletleri görüntüleme sahne plakası dahil ve görüntüleme kazanmak% 70 etanol ile Dow.
  9. Vakum penceresine pipet kesilen ucunu ve görüntüleme plakasına hortum aşağı bantlayın.
  10. görüntüleme penceresine objektif yakın getirin ve objektif ve lamel arasındaki su büyük damla yerleştirin.
  11. Vakum penceresinin merkez açılmasını engelliyor ve objektif ve lamel arasındaki su damlası aspire almaz doğrulayarak lamel hiçbir sızıntı olmadığından emin olun.
    NOT: penceresinin üzerine yerleştirilen bir eski stil bilgisayar faresi top merkezi açılmasını engelliyor için yararlıdır.

4. Cerrahi

  1. Steril cerrahi zemin hazırlayın.
    1. kolayca ulaşılabilecek tüm enstrümanları yerleştirin. Cerrahi alan ve% 70 etanol ile cerrahi aletler dahil tüm yüzeyleri ve aletleri sterilize edin.
  2. Bir çift düğüm ile burç üzerinde, kateter ¼ inç 2-0 sütür 3 inç uzunluğunda kravat.
  3. Kuyruk ven kateter fol hazırlayınHarney ark. 46 tarafından yayınlanan protokolü lowing.
  4. ~ 5 dakika sonra kuyruk damarından kan akımını arttırmak için kateter yardımı için bir enfraruj (IR) bir ısı lambası kullanılarak kafesine hayvan ısıtın. Bir ısı lambası veya bir ısınma pad kullanarak cerrahi prosedür boyunca fizyolojik sıcaklıklarda ısıtılan hayvan tutmak için tavsiye edilir.
  5. % 5 izofluran ile hayvan anestezisi ve bir ayak tutam yanıt olduğunu doğrulayın.
  6. hayvanın gözleri oftalmik merhem sürün.
  7. hayvanın sol kanattan gelen saç kaldırmak için 10-30 saniye tüy dökücü losyonu uygulayın; arka ¼ için göğüs orta hat ve sadece göğüs kafesi altında aksilladan.
  8. herhangi bir aşırı losyon temizleyin ve% 70 alkol ile maruz kalan deri sterilize edin.
  9. Kuyruk veni kateteri için PBS ile doldurulmuş steril bir şırınga takın ve Harney et at tarafından yayınlanmıştır protokol izlenerek yerine yerleştirin ve bant. 46. bantla sıkıca iğne kendisine yapıştırılır ve kuyruk ve bant arasındaki boşlukta serbest değildir emin olun.
  10. Das et al. 47 veya DuPage ve arkadaşları tarafından yayınlanan protokolünü takip etmek için fare entübe. 48
  11. ventilatör açın ve min başına 135 nefes ve izofluran-oksijen karışımının 200 ul tedarik ayarlayın.
  12. ventilatöre trakeal kateter bağlayın.
  13. Cerrahi alana fareyi hareket ettirin. Kateter çıkarmak için değil aşırı özen gösterin.
  14. Ön dişlerin altında fare burun etrafında 2-0 dikiş kravat.
  15. burnu kateteri bantlayın.
  16. Cerrahi alanın dışında tutmak için kateter sol ön ayakları bantlayın.
  17. % 2.5 bakım seviyesine izofluran anestezisi indirin ve bir ayak tutam yanıt olduğunu doğrulayın.
  18. Keskin bir makas kullanarak, sol göğüs duvarı üzerinde derinin 1 cm 2 çıkarın.
  19. Kaldırma tO yağ yastığı meme ve koter kalemle açıkta kan damarları dağlamak.
  20. keskin bir makas ile keserek yağ yastığı rezeke.
  21. keskin bir makas ile keserek göğüs kafesi kas tabakası aşağı kaldırın. ön ayakları dibinde aksiller ven çalışan kesmemeye özen gösterin.
  22. Yakala ve 6. kaburga kaldırmak için forseps kullanabilir. sığ bir açıda keskin bir makas kullanarak (~ 5 °) deride açılma kenarına yakın kaburga kesti. maruz akciğer dokusunun dokunmamaya aşırı özen gösterin.
  23. Arka arkaya dört kaburga kaldırarak tüm akciğer lobun maruz göğüs duvarından açıklığı genişletmek.
    Not: kalbi önlemek için sternum en az 5 mm uzakta açılış tutun.
  24. Dikkatle kuyruk ve trakeal kateter tutarak fareyi kaldırın ve mikroskop görüntüleme aşamasına fareyi hareket ettirin.
  25. Vakum off ile PBS ile vakum pencerenin odasını doldurun.
  26. fareyi ters çevirin ve maruz pozisyonVakum görüntüleme penceresi üzerine akciğer.
  27. Yavaş yavaş küresel vanası kullanılarak cıva yaklaşık 3-5 inç vakum açın.
  28. Yan Şekil 2'de gösterilen aşamada plaka fare ve bandın göğüs iki kez ikiye katlanmış dokuma kağıdından yapılmış bir yasaklama demetini yerleştirin.
  29. Hayvanın üst uyluk pulse oksimetre uyluk sensörünü Klip ve yazılımını başlatın.
  30. Sahnede çevre odasına yerleştirin ve fizyolojik bir sıcaklıkta fare tutmak için ısı açmak.
  31. anestezi korumak ve kan akışını korumak için 1-1.5% izofluran düzeyini azaltır.

5. Intravital Görüntüleme

  1. lamel yakın 25 x 0.95 Sayısal açıklık (NA) objektif lens getirmek ve aralarındaki su büyük damla ekleyin.
  2. Epifloresans modunu kullanarak, FITC kanalı görüntüleyebilir ve odak noktası haline akciğer dokusunun getirmek.
  3. ameliyat öncesi yapılan değilse, benKuyruk veni kateteri vasıtasıyla nject tümör hücreleri.
    1. Kuyruk ven kateter PBS şırınga ayırın.
    2. Tümör hücresi süspansiyonu (PBS en fazla 2 x 10 7 hücre / ml) 100 ul steril bir şırınga yerleştirin.
      NOT: Bu adım farklı zaman noktalarında akciğer kanser hücresi varış incelemek için önceden yapılabilir.
    3. Kuyruk ven kateter üzerine tümör hücreleri ile şırınga bağlayın.
    4. Yavaş yavaş kuyruk damar içine tümör hücrelerini enjekte edilir.
    5. Kuyruk ven kateter tümör hücreleri şırınga ayırın.
    6. Kuyruk ven kateteri PBS şırınga bağlayın.
      NOT: enjeksiyonundan sonra oküler üzerinden dekstran sinyalden tümör hücrelerini ayırt etmek zorlaşır olarak dekstran enjekte etmeden önce tümör hücrelerinin tüm yerleri belirleyin.
  4. görüntü tümör hücrelerinin bulun
    1. Bireysel tümör hücrelerini görüntülenmesi için, tüm tümör hücrelerini bulmak ve inci ile konumlarını kayıtYazılımın e çoklu paneli.
      1. mikroskop oküler tümör hücrelerini gözlemleyerek görüntünün bakış tüm alanları bulun.
      2. Yazılımda, Multi-Nokta butonuna tıklayarak çoklu paneline geçiş ve Add pozisyonu butonuna tıklayarak hücrenin konumunu saklamak.
    2. mozaik görüntüleme için, mozaik kaynağını bulmak ve görüntüleme koordinatlarını ayarlamak
      1. yapının sol üst köşesinde bir pozisyon bulmak Çekilecek.
      2. sahne denetleyicisi "Sıfır" düğmesine basarak sahneye Sıfır x, y ve z koordinatlarını.
      3. "Load" butonuna tıklayıp listeyi seçerek mozaik koordinatların uygun listesini yükleyin.
        NOT: görünümünün 500 mikron alanının% 20 örtüşme ile 2 x 2 mozaik için bir örnek liste olur: Poz.1 = (0,0), Pos. 2 = (400,0), Poz. 3 = (0400), Poz. 4 = (400.400).
  5. şırıngayı w kaldırve kuyruk ven kateteri PBS i dekstran içeren şırınga ile değiştirin.
  6. Yavaş yavaş çizgiyi temizlemek için steril PBS 50 ul enjekte ardından 20 mg kuyruk ven kateter yoluyla fare içine PBS içinde çözünmüş / ml 155 kDa rodamin-dekstran 100 ul kadar enjekte edilir. hattına herhangi bir kabarcıkları tanıtmak etmeyin. fareye uygulanan toplam hacmi 4 ml / kg / saat aşmayacak şekilde gerektiğinde dekstran kanseri hücre enjeksiyonundan sonra en az bir saat enjekte edilir.
  7. görüntüleme parametrelerini ayarlayın.
    1. multiphoton moduna mikroskop geçin.
    2. Zamanlama Sinyaller düğmesini tıklayarak ve Zoom Faktörü alanını güncelleyerek 2X faktöre zoom ayarlayın.
    3. Lazer gücü ayarlamak için ~% 10 (~ numune 10-15 mW) 10 Tsunami Güç kaydırıcısını ayarlayarak sonra Dedektörler ve Lazer düğmesini tıklayarak ve.
  8. Resim Her bir yer tümör hücrelerinin varlığını tespit etmek ve vascu akışını ve bütünlüğünü görselleştirmeklature.
    NOT: Gemiler tamamen akan eritrositler ile perfüze görünmelidir ve floresan dekstran ekstravasküler alanlara sızıntı olmadan gemilerin içinde bulunan edilmelidir. Yaklaşık 10-20 tümör hücreleri vakum penceresinin açık diyafram içinde olması beklenir.
  9. Her yerin başlangıç ​​derinliğini ayarlayın yansıması.
    1. Her konum için, görüntü tümör hücresinin üst dilim sahne denetleyicisi odak düğmesini çevirerek z konumunu ayarlayın.
    2. görüş alanının merkezinde hücreyi yerleştirin.
    3. , Çoklu butonuna tıklayın vurgulayın ve çoklu listesinde hücrenin depolanan konumunu değiştirmek için Sil düğmesine, ardından Ekle tıklayın görüş alanının pozisyona tıklayınız.
    4. Görsel her pozisyonda tümör hücresinin göreceli parlaklığı gözlemlemek.
  10. Çoklu paneli Kaydet düğmesine tıklayarak hücrelerin her yeni konumları kaydetBir dosya adı belirtmek d.
  11. Bireysel tümör hücrelerinin görüntüleme için, yaklaşık eşdeğer parlaklık üç hücreleri almak ve Sil düğmesine tıklayarak ardından listede bulundukları yere tıklayarak ve çoklu listeden tüm diğer konumları silin.
  12. Dedektörler ve Lazer butonuna tıklayın ve sinyaller doygunluk altında olduğu yeşil ve kırmızı kanalları 45 yani PMT kazancı sürgü ayarlayın.
  13. Makrofajlar camgöbeği görünmesi böylece mavi kanal 45 için kaydırma çubuğunu ayarlayın.
    NOT: Herhangi bir ikinci harmonik sinyali sadece mavi kanalda görünecektir ve kanal çıkarma prosedürünü takip ederek mavi makrofajlar ayrılabilir önce 45 nitelendirdi.
  14. 0 mikron z-yığın başlangıç ​​derinliği ve sırasıyla yere z sahne hareketli ve Başlat tıklayıp Bitiş düğmeleri ile 24 mikron son derinliğini ayarlayın.
    NOT: Bu derinliği içinde hücreler en iyi sinyale ile görüntülendi olacakGürültü ve çözünürlük.
  15. 3 mikron z adım boyutunu ayarlayın.
  16. Parametreleri aşağıdaki görüntüleme parametreleri daha önce 45,49 tarif ayarlayın.
    1. Bireysel tümör hücrelerinin görüntüleme için, Zamanlama Sinyalleri düğmesini tıklatın ve sonra (1.5x yakınlaştırma faktörüne eşdeğeri) zum faktörü alanında, çerçeve ortalama alanına 3 giriniz ve Time-Lapse düğmesine tıklayın ve 10 girin içine 4 V girmek Time-lapse alanına.
      NOT: Bu ayarlar 1 çerçeve her 3 saniyede kazanacaklardır.
    2. mozaik görüntüleme için, Zamanlama Sinyalleri düğmesini tıklatın ve (4X yakınlaştırma faktörüne eşdeğer) 1,5 V yakınlaştırma faktörünü girin, çerçeve ortalamalar sayısında 3 girin ve Time-Lapse düğmesine tıklayın ve zaman-içine 10 girin zaman gecikmesi alanını lapse.
      NOT: Bu ayarlar 1 çerçeve her 3 saniyede kazanacaklardır.
  17. kendi düğmeleri tıklayarak çoklu, z-yığını ve t-lapse görüntüleme modları etkinleştirin.
  18. görüntüler elde etmek için kayıt düğmesine basın.
    DEĞİLE: Akciğer dokusu çok hassas ve foto-karşı duyarlıdır. diğer alanlarda zaman atlamalı görüntüleme kan akımı görüntülü alanda durduktan sonra, lazer büyük olasılıkla ise çok yüksek ve sonraki görüntüleme daha düşük güçte yapılmalıdır.
  19. Her 30-45 dk, yavaş yavaş hayvanın hidrasyon korumak için PBS veya serum fizyolojik 50 ul enjekte edilir.

6. Ötenazi

  1. % 5 izofluran artırın.
  2. nefes ve sahne hayvan kaldırmak çözüldükten sonra 30 saniye kadar% 5 izofluran altında hayvan tutun.
  3. tam ötenazi sağlamak için servikal dislokasyon gerçekleştirin.

7. Görüntü Analizi

  1. Tek hücre görüntüleme deneyleri için:
    1. Fiji içine görüntüleri yüklemek ve bir hyperstack olarak biçimlendirmek.
    2. Hyperstack her z-dilim için, zaman atlamalı film oynatmaya ve artık xy hareketi arayın. Artık xy hareket bulunursa, için yığına StackReg 36 denilen eklentiyi uygulamakhareketi ortadan kaldırır.
  2. mozaik görüntüleme deneyleri için:
  3. Fiji içine görüntüleri yüklemek ve dizin dosya baz adı, mozaik x ve y alanların sayısı ve sayısı gibi görüntüleri hakkında Mozaik Dikiş makro (Company kod dosyası Mozaik Dikiş) ve Bilgi girmeyi açarak onları bir araya dikiş dilimleri ve zaman noktalarının.
    NOT: Java dizinleri nasıl yorumladığını nedeniyle, klasör adları alt ayırıcı olarak iki ters eğik çizgi olması gerekir. Yerleşik eklentisi İkili Dikiş sınırlamalardan dolayı, taban dosya adları herhangi bir tire içermemelidir.
  4. damarsal sınırları net bir görünüm elde etmek için, tek bir görüntü halinde bir araya kan kanalı için zaman noktalarında tüm ortalama ve daha sonra diğer kanalların filmin her kare için arka plan olarak bu görseli çoğaltırlar.
    Not: Bu sadece Kan ortalama gerçekleştirin makro çalıştırarak yapılır (İlave kod dosyası Kan ortalama gerçekleştirin).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yöntem ile elde edilebilir sonuçlar tipini göstermek için, ameliyat öncesi zaman noktaları değişen MacBlue fareler 44 kuyruk venine floresan protein yonca ile etiketlenmiş E0771-LG, tümör hücreleri enjekte ettik. Ameliyattan sonra, 155 kD rodamin etiketli dekstran damarlar ve zaman atlamalı görüntüleme yapıldı işaretlemek için IV enjekte edildi.

Fareler 24 saat sonrası enjeksiyon görüntüleme yaparken, tek hücre m...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu tür proteinler ve antikorlar gibi floresan etiketli fonksiyonel etiketleri ile kombine in vivo optik görüntüleme Yüksek çözünürlüklü metastatik kaskad anlayışımızı büyük oranda arttırmıştır. Bu, doğrudan görselleştirme ve tek hücreli ve tümör hücrelerinde alt-hücresel parametrelerin, konakçı hücreler ve bunların mikro-ölçümünü sağladı. Primer tümörün içindeki bu görüntüleme büyüme işgali ya da yayma 6,7 birinin destekleyici ayrık mikroçevrelerde keşfine, örneğin, yol açmıştır. Işgali duru...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu araştırma, JWP ve Entegre Görüntüleme Programı R01CA172451 olan NIH-CA100324, Einstein Ulusal Kanser Enstitüsü'nün kanser merkezi destek hibesi P30CA013330 tarafından desteklenmiştir. Bu teknoloji, Gruss-Lipper Biyofotonik Merkezi'nde ve Albert Einstein Tıp Fakültesi'ndeki Entegre Görüntüleme Programında geliştirilmiştir. Bu Merkezlerin bu çalışmadaki desteğini kabul ediyoruz. Yazarlar, Einstein makine atölyesinden Mike Rottenkolber, Ricardo Ibagon ve Anthony Leggiadro'ya yetenekli ve zamanında işçilikleri için, Matthew Krummel'in laboratuvarına pencere tasarım çizimlerini cömertçe paylaştıkları için, Kevin Elicieri ve Jeremy Bredfeldt'e mikroskopi konusundaki uzmanlıkları ve amplifikatör önerileri için ve Allison Harney ve Bojana Gligorijevic'e bilgilendirici tartışmalar için teşekkür eder.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Nikel Kaplama Pirinç Vakum Regülatörü 1/8 NPT Dişi, Göstergeli, 0 - 20" Hg Vakumlu McMasterCarr4172K12 Vakum Regülatörü
1/4 "Hortum ID X 1/8" NPTF Erkek Boru için Pirinç Dikenli Hortum Montaj AdaptörüMcMaster Carr5346K13Vakum Regülatörü Hortum Adaptörü
Pyrex Marka Tüpülasyonlu Filtreleme Şişeleri; 4 No'lu lastik tıpa için boyunlu aletli; Kapasite: 50 mlCorning Yaşam Bilimleri Camı5360-50Vakumlu Şişe
Yuvarlak Cam Lameller Kalınlık # 1.5, 0.16 - 0.19 mm 10 mm çap & nbsp;Ted Pella, Inc.260368Kapak fişleri
Exel International Tek Kullanımlık Safelet I.V. Kateterler; 22 g x 1 inç Exel International26746Trakeal Kateter
PERMA-HAND Siyah Örgülü İpek Sütürler, ETHICON LIGAPAK Dağıtım Makarası Boyutu 2-0VWR95056-992Dize
Sıvı Süper Yapıştırıcı, Şeffaf, 0.14 ozHendel Corp.LOC1647358Siyano-akrilat Tutkal
Tetrametilrodamin izotiyosiyanat – DextranSigma-AldrichT1287-500MG155 kD Dextran
Laboratuvar Şeffaf Tygon PVC Boru, 1/16 "ID, 1/8" OD, 1/32 "Duvar Kalınlığı, 25 ft. UzunlukMcMaster Carr5155T12İnce Boru ve Luer
Çatlamaya Dayanıklı Polietilen Boru için Boru, 1/8 "ID, 1/4" OD, 1/16 "Duvar Kalınlığı, Beyaz, 50 ft. Uzunluk McMaster Carr5181K24 Kalın Boru
Tüy Dökücü LosyonNair-Mikro
Tıbbi Boru 95 Durometre LDPEBilimsel Emtialar A.Ş.BB31695-PE/1Kuyruk ven kateteri için boru
30 G x 1 inç. BD PrecisionGlide İğneBD305128Kuyruk ven kateteri için iğneler
Püriten Steril Olmayan Pamuk Uçlu Swablar Fisher Scientific867WCNOGLUE
Şeffaf Polikarbonat Dikenli Boru Bağlantısı, 3/32 "x 1/16" Tüp KimliğiMcMaster Carr5117k51Tüpler arasındaki konektörler
Tek Delikli Kauçuk Tıpalar FisherScientific14-135FVakum Şişesi için Durdurucu
SHARP Hassas Bariyer Uçları, P-100, 100 ve mikro için; lDenville Bilimsel A.Ş.P1125Pipet Ucu
Laboratuvar bandıFisher Scientific159015R
PuralubeHenry Schein Hayvan Sağlığı008897Oftalmik Merhem
İkizler Koter KitiHarvard Aparatı726067Koter Kalemi
Graefe Mikro Diseksiyon Forsepsleri; Dişli; hafif eğri; 0,8 mm Uç Genişliği; 4" UzunlukRoboz CerrahiRS-5135 Forseps
Ekstra İnce Mikro Diseksiyon Makası 4" Düz Keskin/Keskin 24 mmRoboz CerrahiRS-5912Keskin Makas
Mikro Diseksiyon Makası 4" Düz Künt/KütRoboz CerrahiRS-5980Künt Makas
MendilFisher Scientific06-666-A koşum
PhysioSuite SystemKent ScientificPhysioSuiteVitals Monitor
1 ml Şırınga, Tüberkülin Kayma UcuBD309659Şırınga
Cyano akrilatZımbaLOC1647358Kapak Slip Yapıştırıcı
Petrol JeliFisher Scientific19-086291Su Bariyeri
Adaptörü Luer Cannulla 1.5 - 2.2 mmHarvard Aparatı734118Kateter Konektörü
PhysioSuite MouseSTAT nabız oksimetresiKent ScientificNabız Oksimetresi
İzoetezi (izofluran)Henry Schein Hayvan Sağlığı50033250 ml
OksijenTechAirOX TM
1x PBSLife Technologies10010-023
PVC Küresel Vana, Bağlamak için İtme, 1/4In Grainger3CGJ7Vakum Vanası
Küçük Hayvan VantilatörüHarvard Aparatı683Alternatifi Kent Scientific'ten temin edilebilir: MouseVent
OptiMEM Azaltılmış Serum OrtamıThermoFisher Scientific31985062 
Lipofektamin 2000 Transfeksiyon ReaktifiThermoFisher Scientific11668019
MacBlue Tg(Csf1r*-GAL4/VP16,UAS-ECFP)1Hume/J FarelerJackson Laboratuvarı026051 
Çoklu Foton MikroskobuOlympusFluoview FV1000Özel yapım kapsam Çevre Muhafazasına alternatif
FV1000 için HassasPlastikÖzel yapım muhafazaya alternatif
Fosfat Tamponlu TuzluSerum Fizyolojik ThermoFisher Scientific14190136
Lazer Güç ÖlçerTutarlıAlanMaxIITOP
Lazer Güç Ölçer KafasıTutarlıPM10
pcDNA3-Yonca Floresan Protein VektörAddgene40259
G418 Sülfat Seçici AntibiyotikThermoFisher Scientific10131027
MoFlo Floresan-Aktive Hücre Sıralayıcı Beckman CoulterXDP
Tripsin EDTA 1xCorning25-052-Cl
40 ve mikro; m MeshFalcon352235
96 Kuyulu PlakaCostar3599
60 mm Kültür KabıCorning430196
10 cm Kültür KabıCorning353003
Sığır Serumu AlbüminSigma-AldrichA4503
Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Tuzlu Suyu 1xCorning21-031-CV
C57BL/6J FareJackson Laboratuvarı000664 
Kim MendilFisher Scientific06-666-A 
Hazne

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mehlen, P., Puisieux, A. Metastasis: a question of life or death. Nat Rev Cancer. 6 (6), 449-458 (2006).
  2. Entenberg, D., et al. Subcellular resolution optical imaging in the lung reveals early metastatic proliferation and motility. Intravital. 4 (3), 1-11 (2015).
  3. Krahl, V. E. A method of studying the living lung in the closed thorax, and some preliminary observations. Angiology. 14, 149-159 (1963).
  4. Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat Methods. 8 (1), 91-96 (2011).
  5. Presson, R. G. Jr, et al. Two-photon imaging within the murine thorax without respiratory and cardiac motion artifact. Am J Pathol. 179 (1), 75-82 (2011).
  6. Gligorijevic, B., Bergman, A., Condeelis, J. Multiparametric classification links tumor microenvironments with tumor cell phenotype. PLoS Biol. 12 (11), e1001995(2014).
  7. Harney, A. S., et al. Real-Time Imaging Reveals Local, Transient Vascular Permeability, and Tumor Cell Intravasation Stimulated by TIE2hi Macrophage-Derived VEGFA. Cancer Discov. 5 (9), 932-943 (2015).
  8. Tozluoglu, M., et al. Matrix geometry determines optimal cancer cell migration strategy and modulates response to interventions. Nat Cell Biol. 15 (7), 751-762 (2013).
  9. Suetsugu, A., et al. Imaging the recruitment of cancer-associated fibroblasts by liver-metastatic colon cancer. J Cell Biochem. 112 (3), 949-953 (2011).
  10. Nakasone, E. S., et al. Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance. Cancer Cell. 21 (4), 488-503 (2012).
  11. Kim, M. Y., et al. Tumor self-seeding by circulating cancer cells. Cell. 139 (7), 1315-1326 (2009).
  12. Robinson, B. D., et al. Tumor microenvironment of metastasis in human breast carcinoma: a potential prognostic marker linked to hematogenous dissemination. Clin Cancer Res. 15 (7), 2433-2441 (2009).
  13. Rohan, T. E., et al. Tumor microenvironment of metastasis and risk of distant metastasis of breast cancer. J Natl Cancer Inst. 106 (8), (2014).
  14. Agarwal, S., et al. Quantitative assessment of invasive mena isoforms (Menacalc) as an independent prognostic marker in breast cancer. Breast Cancer Res. 14 (5), R124(2012).
  15. Forse, C. L., et al. Menacalc, a quantitative method of metastasis assessment, as a prognostic marker for axillary node-negative breast cancer. BMC Cancer. 15, 483(2015).
  16. Pignatelli, J., et al. Invasive breast carcinoma cells from patients exhibit MenaINV- and macrophage-dependent transendothelial migration. Sci Signal. 7 (353), ra112(2014).
  17. Cameron, M. D., et al. Temporal progression of metastasis in lung: cell survival, dormancy, and location dependence of metastatic inefficiency. Cancer Res. 60 (9), 2541-2546 (2000).
  18. Bragado, P., Sosa, M. S., Keely, P., Condeelis, J., Aguirre-Ghiso, J. A. Microenvironments dictating tumor cell dormancy. Recent Results Cancer Res. 195, 25-39 (2012).
  19. Husemann, Y., et al. Systemic spread is an early step in breast cancer. Cancer Cell. 13 (1), 58-68 (2008).
  20. St Croix, C. M., Leelavanichkul, K., Watkins, S. C. Intravital fluorescence microscopy in pulmonary research. Adv Drug Del Rev. 58 (7), 834-840 (2006).
  21. Al-Mehdi, A. B., et al. Intravascular origin of metastasis from the proliferation of endothelium-attached tumor cells: a new model for metastasis. Nat Med. 6 (1), 100-102 (2000).
  22. Qian, B., et al. A distinct macrophage population mediates metastatic breast cancer cell extravasation, establishment and growth. PLoS One. 4 (8), e6562(2009).
  23. Qian, B. Z., et al. CCL2 recruits inflammatory monocytes to facilitate breast-tumour metastasis. Nature. 475 (7355), 222-225 (2011).
  24. Wearn, J. T., Barr, J., German, W. The Behavior of the Arterioles and Capillaries of the Lung. Exp Biol Med. 24 (2), 114-115 (1926).
  25. Terry, R. J. A Thoracic Window for Observation of the Lung in a Living Animal. Science. 90 (2324), 43-44 (1939).
  26. De Alva, W. E., Rainer, W. G. A method of high speed in vivo pulmonary microcinematography under physiologic conditions. Angiology. 14, 160-164 (1963).
  27. Wagner, W. W. Jr, Filley, G. F. Microscopic observation of the lung in vivo. Vasc Dis. 2 (5), 229-241 (1965).
  28. Wagner, W. W. Jr Pulmonary microcirculatory observations in vivo under physiological conditions. J Appl Physiol. 26 (3), 375-377 (1969).
  29. Groh, J., Kuhnle, G. E., Kuebler, W. M., Goetz, A. E. An experimental model for simultaneous quantitative analysis of pulmonary micro- and macrocirculation during unilateral hypoxia in vivo. Res Exp Med. 192 (6), 431-441 (1992).
  30. Fingar, V. H., Taber, S. W., Wieman, T. J. A new model for the study of pulmonary microcirculation: determination of pulmonary edema in rats. J Surg Res. 57 (3), 385-393 (1994).
  31. Lamm, W. J., Bernard, S. L., Wagner, W. W., Glenny, R. W. Intravital microscopic observations of 15-micron microspheres lodging in the pulmonary microcirculation. J Appl Physiol. 98 (6), 2242-2248 (2005).
  32. Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation. J Appl Physiol. 104 (2), 338-346 (2008).
  33. Funakoshi, N., et al. A new model of lung metastasis for intravital studies. Microvasc Res. 59 (3), 361-367 (2000).
  34. Fiole, D., Tournier, J. N. Intravital microscopy of the lung: minimizing invasiveness. J Biophotonics. , (2016).
  35. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  36. Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).
  37. Ewens, A., Mihich, E., Ehrke, M. J. Distant metastasis from subcutaneously grown E0771 medullary breast adenocarcinoma. Anticancer Res. 25 (6B), 3905-3915 (2005).
  38. Kitamura, T., et al. CCL2-induced chemokine cascade promotes breast cancer metastasis by enhancing retention of metastasis-associated macrophages. J Exp Med. 212 (7), 1043-1059 (2015).
  39. Gross, A., et al. Technologies for Single-Cell Isolation. Int J Mol Sci. 16 (8), 16897-16919 (2015).
  40. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J Vis Exp. (41), (2010).
  41. Mammalian cell biotechnology in protein production. Hauser, H., Wagner, R. , Walter de Gruyter. Berlin, New York. (1997).
  42. Lim, U. M., Yap, M. G., Lim, Y. P., Goh, L. T., Ng, S. K. Identification of autocrine growth factors secreted by CHO cells for applications in single-cell cloning media. J Proteome Res. 12 (7), 3496-3510 (2013).
  43. Nielsen, B. S., et al. A precise and efficient stereological method for determining murine lung metastasis volumes. Am J Pathol. 158 (6), 1997-2003 (2001).
  44. Ovchinnikov, D. A., et al. Expression of Gal4-dependent transgenes in cells of the mononuclear phagocyte system labeled with enhanced cyan fluorescent protein using Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP double-transgenic mice. J Leukoc Biol. 83 (2), 430-433 (2008).
  45. Entenberg, D., et al. Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging. Nat Protoc. 6 (10), 1500-1520 (2011).
  46. Harney, A. S., Condeelis, J., Entenberg, D. Extended time-lapse intravital imaging of real-time multicellular dynamics in the tumor microenvironment. J Vis Exp. (112), e54042(2016).
  47. Das, S., MacDonald, K., Chang, H. Y., Mitzner, W. A simple method of mouse lung intubation. J Vis Exp. (73), e50318(2013).
  48. DuPage, M., Dooley, A. L., Jacks, T. Conditional mouse lung cancer models using adenoviral or lentiviral delivery of Cre recombinase. Nat Protoc. 4 (7), 1064-1072 (2009).
  49. Entenberg, D., et al. Imaging tumor cell movement in vivo. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 19, Unit 19.7(2013).
  50. Patsialou, A., et al. Intravital multiphoton imaging reveals multicellular streaming as a crucial component of in vivo cell migration in human breast tumors. Intravital. 2 (2), e25294(2013).
  51. Rao, S., Verkman, A. S. Analysis of organ physiology in transgenic mice. Am J Physiol Cell Physiol. 279 (1), C1-C18 (2000).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Akci er G r nt lemeVakumla Stabilize PencereTek H cre z n rlT m r H cresi EkimlemeZaman Atlamal G r nt lemeVask ler Perf zyonZ Y n Rekonstr ksiyonuFloresan Dekstran aretlemeMetastatik Lezyon Analizi

İlgili makaleler