Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Tümör Büyüme ve metastaz Çalışmaları İzlenebilir Muhabirleri ile Meme Kanseri Hasta kaynaklı ksenogratflarının Etiketleme

11.4K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/54944

⸱

30 Kasım 2016

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, School of Medicine, University of Colorado Anschutz Medical Campus

Bu makalede

Özet

Yeşil floresan protein ve lusiferaz muhabir ifade lentiviral parçacıklar ile hasta edilen ksenograftlan (PDXs) sabit etiketlenmesi için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, birinci bölgede PDXs büyümesini izlemek, hem de in vivo görüntüleme sistemleri kullanarak kendiliğinden ve deney metastazları sağlar.

Özet

Tümör biyolojisini ve tedaviye yanıtı incelemek için klinik öncesi modellerin kullanılması, kanser araştırmalarının merkezinde yer alır. Uzun süredir bilinen insan hücre hatları ve birçok transgenik fare modeli, genellikle insan malignitelerinin temel yönlerini özetlemekte başarısız olur. Bu nedenle, hastaların tümörlerinin heterojenliğini ve metastazlarını daha iyi temsil eden alternatif modeller geliştirilmektedir. Cerrahi olarak rezeke edilen tümör örneklerinin immün sistemi baskılanmış farelere aşılandığı hasta kaynaklı ksenogreft (PDX) modelleri, birden fazla nesil boyunca nakledilebildikleri ve tümör heterojenliğini insan kanser hücre hatlarından türetilen ksenogreftlerden daha verimli bir şekilde yansıttıkları için çekici bir alternatif haline gelmiştir. PDX'lerin kullanımına ilişkin bir sınırlama, izlenebilir raportörleri tanıtmak veya gen ekspresyonunu manipüle etmek için transfekte etmenin veya transdüksiyonun zor olmasıdır. Mevcut protokol, ayrışmış tümör hücrelerini yüksek transdüksiyon verimliliğine sahip PDX'lerden transdüksiyon yöntemlerini ve meme kanseri metastazlarının deneysel modelleri için etiketli PDX'lerin kullanımını açıklamaktadır. Protokol ayrıca, metastatik kaskadının organ kolonizasyon sürecini incelemek için deneysel metastaz modellerinde etiketli PDX'lerin kullanımını da göstermektedir. Farklı organlara yapılan metastazlar, canlı hayvanlarda biyolüminesan görüntüleme veya diseksiyon sırasında ve eksize edilen organlarda GFP ekspresyonu kullanılarak kolayca görüntülenebilir ve ölçülebilir. Bu yöntemler, metastaz araştırmalarına birden fazla PDX türünün kullanımını genişletmek için güçlü bir araç sağlar.

Giriş

Cerrahi rezeksiyon tümör örnekleri doğrudan bağışıklık tehlikeye farelere aşılanan hasta kaynaklı tümör ksenograftlarının (PDXs), geliştirilmesi, standart hücre hattı ksenograft modelleri üzerinde çeşitli avantajlar sunuyor ve kanser araştırmalarına 1,2 büyük bir ilerlemeyi temsil etmektedir. PDXs muhafaza ve birinci geçit yetiştirilen tümörün genetik ve biyolojik özelliklerinin çok az bir değişiklik ile arka arkaya geçişlerinin genişletilebilir; ve daha doğru bir insan kanser hücre çizgileri 3-8 türetilen ksenograftlarının göre tümör heterojenliğini yansıtmaktadır. Bu modeller artık yaygın ilaç geliştirme 6,11 bir preklinik bir platform olarak ve kanser biyoloji 4,12 eğitimi için deneysel bir araç olarak, kanser terapötikler 9,10 kişiselleştirmek için bir platform olarak kullanılır.

Çoğu PDXs implante ve fizibil kumpas kullanılarak zamanla tümör büyümesinin ölçümü sağlayan, deri altına yayılır. ancakMetastatik hastalık PDXs kullanarak model daha zor olmuştur. Özellikle meme kanseri, farklı organlara metastatik kapasiteli xenografts 3,5,13 tarif edilmiştir, fakat, metastatik sitelere kendiliğinden yayılma sıklığı, son derece düşüktür. rapor halinde, metastatik yükünün tanımlanması ve ölçülmesi otopsi hedef organların zahmetli histolojik incelemesinde dayanır. biyolojik olarak ışık veren (lusiferaz Luc) ya da floresan eksprese eden kanser hücre çizgileri (yeşil floresan protein GFP) geni muhabir yaygın beyin, akciğer, kemik ve karaciğer intrakardiyak sonra kuyruk damarından, intrafemoral ve dalak enjeksiyon göğüs kanseri metastazlarının deneysel modellerde kullanılan 14-16. bu modeller primer tümörlerden yayılması atlamak olurken, organ tropizm ve metastatik kolonizasyon mekanizmaları incelemek için değerlidir. Bununla birlikte, birincil, hasta tümörleri ve PDXs türetilen hücreler düşük transfeksiyon ya da transdüksiyon oranları usin olabilirg standart prosedürler. Bir alternatif daha sonra geleneksel doku kültür protokolleri kullanılarak etiketlenebilir vitro 17'de PDX-türevi hücre hatlarının kurmaktır. Ancak bu yaklaşım, hücre hattı türetilmesi zordur ve hücrelerin fenotipini değişebilen en PDXs, etiketleme için uygun değildir. Burada, in vivo görüntüleme için uygun lentiviral vektörleri ile PDX-ayrışmış tümör hücrelerinin transdüksiyonu için bir protokol mevcut. Buna ek olarak, bağışıklık yetersizliği olan farelerde ayrışmış Luc-GFP etiketli PDX hücreleri intrakardiyak enjeksiyonu ile deneysel metastaz tarif eder.

Gen-haberci ifade lentivirüs PDX-ayrışmış organoids transdüksiyonu için temel protokol daha önce 18 tarif edilmiştir. Mevcut protokolde, insan tümör hücreleri zenginleştirmek ve% 100 transdüksiyon verimliliği yakınındaki elde yanı sıra deney göğüs kanserinin tespit edilmesi için etiketli PDXs kullanımı için ek yöntemler tarifmetastaz. Bu protokol, birden fazla kanser, çeşitli ışık saçan ve flüoresan işaretler ile PDXs türleri yanı sıra, gen ekspresyonu (ilgi genlerinin yani shRNA demonte) modülasyonunu etiketlenmesi için uyarlanabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu protokolde hayvanların kullanımını gerektiren tüm adımlar Colorado hayvan araştırma etik komitesi Üniversitesi (IACUC) kuralları takip eder.

Araçların, Kültür Medya ve Diğer Reaktiflerin hazırlanması 1.

  1. (1: 1), temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF, 20 ng / ml), epidermal büyüme faktörü (EGF, 10 ng / ml Hazırlama 100 mi Dulbecco Modifiye Eagle ortamı ve Han, F-12 ortamı (DMEM / F12) ihtiva eden ortam mammosphere ), heparin (4 ug / ml), 1 x B27, penisilin (100 U / ml), streptomisin (100 ug / ml). 3 aya kadar, 4 ° C'de steril koşullar altında ortam ve mağaza sağlayın.
  2. PBS pH 7.2,% 0.5 Sığır Serum Albumin (BSA), 2 mM EDTA ihtiva eden epitelyal zenginleştirme tamponu (EEB) hazırlayın. en fazla 6 ay için 4 ° C'de filitre ile steril edilmiş ve saklayın.
  3. ay için -20 ° C'de steril 15 ml konik tüp ve mağaza sindirim tamponu 5 mi alikotları sağlayın. Tümör sindirim, çözülme sindirim tampon gece önce (500 mg başına 5 ml4 ° C 'de buz üzerinde tümörü). Kullanmadan önce 1x antibiyotik antimikotik karışımı ekleyin.
  4. Otoklav (121 ° C 30 dakika boyunca) PDXs diseksiyonu için en az iki forseps, neşter ve makas.
  5. F12 ve% 5 cenin sığır serumu (FBS): DMEM ihtiva eden 500 ml yıkama tamponu sağlayın. ay 4 ° C'de saklayın. Kısım tümörün başına 10 ml tümör diseksiyonu gün.
  6. steril su ile 4 mg / ul bir polybrene stok hazırlayın. -20 ° C'de 100 ul her biri deposu ihtiva eden bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri içine filtre ve kısım.

İzlenebilir İşaretleyiciler Taşıma Yüksek Titre lentiviral Parçacıkların 2. Nesil

  1. 18,19 (tümör büyümesinin in vivo takibi için yani., GFP ve Luc) satın veya bir raportör genini taşıyan yüksek titre lentiviral parçacıkları üretmek.
    Not: bir lentiviral titre> 10 8 TU / ml (mililitre başına transdüksiyon birimi) PDXs başarılı iletimi için tavsiye edilir. lentiviral phaberler memeli hücrelerinin geniş bir yelpazede transdüksiyonunu sağlayan Vesicular Stomatitis Virüsü (VSV-G), bir kaplama G glikoproteinin psödotiplendirilmiş olmalıdır.
    NOT: yüksek titre lentiviral parçacıkların üretimi ve titrasyon için burada kullanılan protokol mevcuttur www.kottonlab.com . Bu protokolde kullanılan vektörler pSIH1-H1-copGFP-T2A-puro ve çift promotör faj EF1aL-lusiferaz-UBC-GFP-W vardır. Bu vektör, faj EF1aL-DsRed-UBC-GFP B vektöründe EF1aL promotörün aşağı lusiferaz geni, Darrell KOTTON, Boston Üniversitesi bir tür hediye DsRed değiştirerek elde edilmiştir.

Hasta türetilmiş ksenograftlarının 3. Nesil

  1. Immün sistemi baskılanmış farelerin 3,4 meme yağ yastığı primer veya metastatik meme tümörleri implante meme kanseri hasta türetilen xenografts (PDX) oluşturun. Büyük tümörler l olarak 1 cm çapında bir tavsiye edilen maksimum boyutta tümörler oluşturmakikely nekrotik çekirdeği içeren.
    Not:. Xenografts oluşturulması ve nakli için ayrıntılı yöntemler DeRose diğ 18 tarif edilmiştir. > 1 cm çaplı tümörler içine kurulan-transplante PDXs Büyüme immün sistemi baskılanmış NOD implantasyon sonrası 4 ve 24 hafta arasında sürer / SCID / ILIIrg - / - (NTG), içsel tümör büyüme oranlarına bağlı olarak. Bu protokol, meme kanseri PDXs transdüksiyonunu açıklanmış olsa da, bu in vitro geçiş kısa vadeli uygun olan herhangi bir tümörün viral transdüksiyon için kullanılabilir. Kısa vadeli PDXs duyarlılığı - nitro sağkalım (24 96 saat) her tümör için esas olan ve deneysel olarak tespit edilmelidir.

PDX-türevli Tümör Hücreleri 4. Tümör Diseksiyon ve ayrışma

  1. CO servikal dislokasyon tarafından takip 2 inhalasyon kullanarak PDX taşıyan Euthanize fareler (hayvan araştırma etik komitesinin kurumsal yönergeleri izleyin). Bir% 0.2 Ch fareler daldırın1 dakika için lorhexidine çözeltisi. Bir diseksiyon kurulu üstünde sırtüstü pozisyonda fare ayarlayın ve yönetim kuruluna genişletilmiş üst ve alt ekstremite düzeltmek için işaretçilerine kullanın.
  2. Aseptik teknik kullanarak, tümör çevresindeki deri kesmek için bir neşter kullanabilirsiniz. forseps bir set ile cildi çekin ve tümör tamamen açığa çıkana kadar temiz bir neşter kullanılarak tümör ayırın. forseps ve neşter temiz bir dizi kullanarak, tümörün çıkarılması ve buz üzerinde medya yıkayın 5 ml yerleştirin.
  3. daha sonraki işlemler için bir BLS2 kabin parçalandığı tümör al. iki kez Ortamı çıkarın ve 10 mM Hepes (HBSS / HEPES) Modifiye Hank'in dengeli tuz sodyum 10 ml tümör yıkayın.
  4. steril önceden tartılmış 60 cm doku kültür plakasına tümör bırakın. Tümör kütlesi tahmin etmek tümörü içeren plaka tartılır.
  5. Bir neşter kullanılarak, daha sonra, yarım tümör kesilmiş bir yarısından itibaren 3 mm disk kesilmiş ve 24 saat süreyle% 10 formalin ile bir kaba koyun. heterojen doğrulamak için bu doku kullanınTümör örneği (ebeveyn PDX). ve forseps ve temiz bir neşter kullanılarak mümkün olan en küçük parçalar halinde kalan tümör kıyma (kurumasına doku önlemek için yeterli) HBSS / Hepes 200 ul ekleyin.
  6. Bir steril 50 ml konik bir tüp içine kıyılmış tümör aktarın. tümör, 100 mg başına 1 x antimikotik antibiyotik ihtiva eden sindirim tamponu, en az 1 ml ilave edilir.
    Not: antibiyotik / antimikotik eklenmesi, in vitro olarak tümör hücreleri kirlenmesini önler.
  7. 200 rpm - 125 çalkalama, 30 ° C'de 3 saat tümör Digest.
    Not: 37 ° C 'ye kadar sıcaklığı arttıkça (zaman içinde daha fazla tek hücreler) sindirim verimini artırır ancak genelde artan hücre ölümü ile eşlik eder. Birçok tümör için, yaşayabilir ayrışmış hücrelerin yeterli sayıda 3 saat sonuçlar için 30 ° C'de sindirim etiketleme adımla devam etmek.
  8. 35 ml (% 5 FBS içeren DMEM / F12) ortam yıkama ilave sindirim durdurun. Temiz 50 mi C içine gözlü 70 um naylon filtre vasıtasıylaonical tüp sindirilmemiş doku kaldırmak için. 5 dakika boyunca 400 xg'de sindirilmiş hücreleri içeren süzülmüş medyayı santrifüj.
  9. 1 ml Kırmızı kan hücre parçalama tamponu aspire supernatant ve tekrar süspansiyon pelet. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir.
  10. lizis durdurmak için: 10 ml yıkama tamponu (F12,% 5 FBS DMEM) ekleyin. 40 uM naylon yoluyla hücreler kümeleri kaldırmak için Mesh geçirin. 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüj ve buz üzerinde, yer süpernatant kaldırmak.
  11. Süspanse tampon ve tripan mavisi dışlama kullanarak canlı ve cansız her iki hücreleri saymak yıkamak 5 ml hücreleri sindirilir. Kısaca, hücrelerin 50 ul ve tripan mavisi 50 ul karıştırın ve bir hemasitometre kullanarak-tripan mavisi hariç hücreleri saymak.
    NOT: Bu ham sindirim ürününün, insan PDX türetilen tümör hücrelerini, hem de fare stromal hücreler içerir (fibroblastlar, kan hücreleri, vb.). Sindirilen Hücreler artık etiketleme (aşama 6) için işlenebilir veya insan kanser hücreleri anlatılan prosedürlerin biri kullanılarak zenginleştirilebilirReferans 5.

İnsan Epitelyal Kanser Hücreleri 5. zenginleştirilmesi

  1. Bir soy (Lin +) hücre tükenmesi kiti 20 kullanarak fare stromal hücreler tüketmek.
    NOT: EpCAM ifade bilinmeyen veya kayıp olan yüksek stromal içeriği) ile son derece vaskülarize tümörlerin ve / veya tümörler için önerilir.
    1. Temiz bir 5 mi polipropilen tüp içinde 10 7 canlı hücrelere alın 5 dakika boyunca 300 x g'de 2 mi EEB ve santrifüj ekleyin. tamamen süpernatant Pipet.
    2. 10 7 hücre başına buz EEB 40 ul tekrar süspansiyon hücre pelet.
    3. 10 7 hücre başına biyotin-antikor kokteyli 10 ul ekle, hafifçe pipetleme karıştırın ve 10 dakika boyunca 4 ° C (kokteyli Lin + fare hücreleri antikorları içerir) inkübe edilir.
    4. 10 7 hücre başına soğuk EEB 30 ul ekleyin, hafifçe pipetleme karıştırın.
    5. Hafifçe pipetleme 10 7 hücre başına anti-biyotin microbeads 20 ul mix ekleyin ve 4 & # inkübe176, 15 dakika bekletilmiştir.
    6. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de 3 ml soğuk EEB, santrifüj ile hücreler yıkanır. Dikkatle süpernatant aspire. Buz üzerinde EEB ve yerine 500 ul içinde süspanse pelet.
    7. Bir manyetik ayırıcı manyetik alan sütun. 0.5 ml epitel zenginleştirme tamponu ile sütun yıkayın ve içinden akmasına izin. sütun kurumasına izin vermeyin.
    8. sütununun altında yeni bir polipropilen toplama tüpü yerleştirin. Yavaş yavaş kolonu üzerinde etiketlenmiş hücreler ihtiva eden 500 ul (Lin + hücreleri manyetik sütun korunur etiketli). Zenginleştirilmiş soy negatif (tümör) hücre fraksiyonu temsil etiketsiz hücreleri ile bir kesir olarak atık toplamak.
    9. EBB 500 ul ile sütun 3 kez durulayın ve adım 5.1.8 atık aynı tüp içinde atık toplamak. buz üzerinde atık tutmak ve etiketleme adım (6) geçin.
    10. İsteğe bağlı: Manyetik alanın dışında sütun alın. altında yeni bir polipropilen tüp yerive EEB 500 ul, üç kez ilave edilmesi ve temin edilen bir piston ile Lin + fraksiyonu elüte.
  2. İnsan EpCAM + epitel kanser hücrelerinin zenginleştirilmesi (CD326 + ekspres ve yüksek fare stromal içerik barındırdığı bilinen tümörler için önerilir).
    1. Temiz bir 5 mi polipropilen tüp içinde 10 7 canlı hücrelere alın 5 dakika boyunca 300 x g'de 2 ml soğuk EEB ve santrifüj ekleyin. tamamen süpernatant Pipet.
    2. 10 7 hücre başına buz EBB 60 ul tekrar süspansiyon hücre pelet.
    3. 10 7 hücre başına EpCAM mikro boncuklar 20 ul ekle, hafifçe pipetleme karıştırın ve 30 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
    4. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de 3 ml soğuk EEB, santrifüj ile hücreler yıkanır. Dikkatle süpernatant aspire. Süspanse EEB 500 ul pelet ve buz koymak.
    5. mini ayırıcının manyetik alan sütun yerleştirin. 0.5 ml EEB ile sütun yıkayın ve içinden akmasına izin. sütun kurumasına izin vermeyindışarı.
    6. sütununun altında yeni bir polipropilen toplama tüpü yerleştirin. Yavaşça, (EpCAM + etiketli hücreler manyetik sütunda muhafaza edilecektir) kolonu üzerinde etiketli hücreleri içeren 500 ul ekleyin. Fare stromal hücreler temsil etiketsiz hücreleri ile bir kesir olarak atık toplamak.
    7. ME Buffer 500 ul sütun 4 kez durulayın ve adım 5.1.8 atık aynı tüp içinde atık toplamak.
    8. manyetik alanın dışında sütun alın. altında yeni bir polipropilen tüp yerleştirin ve ME 500 ul tampon, üç kez ekleyerek EpCAM + fraksiyonu Zehir. sıkıca sütuna pistonu iterek manyetik etiketli hücreleri yıkayın. atık zenginleştirilmiş EpCAM + tümör hücre fraksiyonu içeren toplayın ve buz üzerinde tutmak. 6. adıma geçin.

PDX-türevi Tümör Hücreleri 6. İletimi

  1. Santrifüj 2 ml mammosphere medi 300 gx 5 dakika ve tekrar süspansiyon de tümör hücrelerini ayrışmışa. 4.11 gibi tripan mavisi dışlama kullanarak canlı hücreleri saymak.
  2. Hazırlama 8 ug / ml polibren (ortam ml'si başına hazır polibren 2 ul) ihtiva eden mammosphere ortam, 10 ml.
  3. 2 x 10 5 canlı tümör hücreleri için gerekli hacmi belirlemek. 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj hücreleri ve polibren ihtiva eden ortam, 2 ml içinde süspanse pelet. 6-çukurlu, ultra düşük yapışkan bir doku kültürü plakasında çukur başına Plaka 2 x 10 5 canlı tümör hücreleri.
    Not: Bu, bir lentiviral vektör ile transdüksiyonu için gerekli olan hücrelerin optimal bir sayıdır.
    DİKKAT! Lentiviral parçacıklar ve lentiviral parçacıklar ile kullanılan tüm sarf rekombinant DNA biyolojik tehlikeler için kurumsal prosedürler izlenerek ele alınmalıdır.
    NOT: primer meme hücrelerinin lentiviral transdüksiyon kuvvetle 21 etiketleme sırasında luminal hücreler ve tümör hücrelerinin alt popülasyonlarının seçimi kötü etiketleme neden olabilir myoepitelyal hücreleri yanadır.
  4. Bu potansiyel önyargı 21 için farklı primer hücre alt viral parçacıklar bağlanmasını ve doğru geliştirmek için transdüksiyon önce 1 saat boyunca 37 ° C'de 200 mU / mL, nöraminidaz ile virüs inkübe edin.
  5. PDX-ayrışmış hücreler Lin + fare hücrelerinden tükenmiş veya EpCam + hücreler zenginleştirilmiş ise 10 İçişleri Bakanlığı (2 x 10 5 canlı hücreler için 2 x 10 6 TU) de lentiviral parçacıkları ekleyin. Olmayan zenginleştirilmiş PDX-ayrışmış hücreleri kullanarak eğer 30 İçişleri Bakanlığı (2 x 10 5 canlı hücreler için 6 x 10 6 TU) de lentiviral parçacıkları ekleyin.
    NOT: artmış MOI da moloz büyük miktarda ham ekstrelerinde ölü hücrelerin mevcudiyetinde verimli transdüksiyonu sağlar. canlılık ve transdüksiyon verimliliği için kontrol olarak hizmet etiketsiz hücreleri ile bir kuyu tutun.
  6. hücrelerle virüsü karıştırmak için çalkalanır. 37 ° C, en fazla 96 saat boyunca% 5 CO2 inkübe edin. 24 saat transfeksiyon sonrası taze mammosphere medya 500 ul ekleyin. Hücreler ATTAC olmazplakalara h medya aspire yok.

Değerlendirme İmmün Farelerde İletimi Verimliliği ve etiketli Hücreler Yeniden implantasyon 7.

  1. izlenebilir işaretleyici (GFP) 10X büyütme floresan mikroskop kullanılarak her 24 saat ifadesini izleyin.
    Not: GFP ifade, enfeksiyondan sonra kadar erken fazla 24 saat gözlenebilir ama en PDXs GFP ekspresyon 72 saat (Şekil 1) sonra, açık bir şekilde görülebilir.
  2. Toplam oyuk içindeki GFP + hücrelerin yüzdesi değerlendirerek transdüksiyonun verimi tahmin.
    Not: kültürleri çeşitli derecelerde tümör hücrelerini, rezidüel stromal hücreleri ve ölü hücreleri ihtiva ettiğinden, 10'u kadar düşük bir% GFP + hücreleri ile kuyu bir konakçı fare implante edilebilir.
  3. 15 ml konik bir tüp içine 6 oyuklu plakalar ile kalıt aktarılan hücrelerin aktarın. geride kalan tüm hücreleri toplamak için kuyuya mammosphere medya 1 ml ekleyin. buz üzerine yerleştirin.
  4. dönüştürülmüş hücreler ve C HBSS / HEPES 10 ml5 dakika, 4 ° C, 300 xg'de entrifuge. Dikkatle buz üzerinde 50 ul bodrum matris ekstresi (BME) supernatant ve tekrar süspansiyon aspirat.
    Not: BME alikotları 1, buz üzerinde eritildi olmalıdır - kullanmak 2 saat önce. BME oda sıcaklığında pekiştireceğiz; her zaman buz üzerinde tutmak.
  5. , 0.5 ml insülin şırınga içine BME-gömülü hücreleri Yük buz üzerinde tutmak ve NSG farelere reimplantasyon için hayvan tesisine getirmek.
  6. % 2 izofluran /% 98 oksijen veya protokolü onayladı onaylı hayvan araştırma etiği göre takip 5 dakika için% 5 izofluran /% 95 oksijen kullanarak, 8 haftalık NSG fareler - kadın 4 uyutmak.
  7. Hayvan ağrı uyaranlara (ayak tutam) tepkisiz olduğunda, etanol mendil ardından betadin enjeksiyon alanını temizlemek ve 4. meme yağ yastığı hücrelerin 50 ul enjekte edilir. onaylanan protokolde belirtildiği gibi enjeksiyon rahatsızlığı hafifletmek için analjezi ile fareler sağlamak.
  8. Hücreler tümörler oluşturmak için izin verir (2-12 hafta) ve GFP'yi izlemek ve / veyaayarlanabilir bir ışık sistemi ve / veya in vivo lusiferaz görüntüleme sisteminde (Şekil 2) kullanılarak lusiferaz aktivitesi.
    NOT: Kurumsal hayvan araştırma etik komitesi tarafından onaylanmış olarak anestezi, analjezi, tümör yükü ölçümleri ve ötenazi kriterleri için yönergeleri izleyin.

Etiketli PDXs 8. Kalite Kontrolü

  1. etiketli tümörlerde lusiferaz ve GFP değerlendirerek etiketleme etkinliğini belirlemek.
    NOT: Takip kurumsal hayvan araştırma etik komitesi, in vivo biyoparlaklık görüntüleme prosedürlerini (Şekil 2, 3) onayladı.
    1. tümör büyüklüğü 1.0 ulaştığında Öldürülen farelerin tümörleri teşrih - 1,5 cm çapa (ya da 4'te tarif edildiği gibi, onaylanmış protokollere göre önce). Diseksiyon ayarlanabilir bir ışık sistemi (veya GFP floresans değerlendirme sağlar eşdeğer sistem) altında yapılmalıdır.
    2. Her tümörden, niteliksel pe tahminGFP + tümör mikroskobu kullanarak rcentage. % 100'den daha az ise, GFP + kısmını sadece teşrih. 3 mm diski inceleyin ve parafine ve histolojik analiz için% 10 formalin içinde çözmek, RNA veya diğer istenen analizler için küçük bir parça kaydetmek ve% 90 FBS /% 10 ihtiva eden ayrı ayrı 1.5 mi kriyotüplerde mümkün olduğu tümör kadar tasarruf dondurulması için DMSO.
  2. Yeni alıcı NSG fareler 18 içine etiketli tümörün yeniden implant parçaları genişletmek ve deneysel metastaz çalışmalarında kullanmak üzere.
  3. önce iletimi ve her nesil tümörlerden elde edilen parafine gömülü doku standart immünohistokimyasal boyama gerçekleştirmek sonra doğrulayın etiketli PDXs orijinal PDXs için histolojik benzer kalması.
    NOT: Kalite kontrolü için kullanılan belirteçler her PDXs değişir. meme kanseri PDXs, estrojen reseptörü ifadesi, progesteron reseptörü, epidermal büyüme faktörü reseptörü 2 (HER2), epidermal büyüme faktörü reseptörü 1 (HER1 veya EGFR), paketn-sitokeratin (pan-CK) ilk taraması için tavsiye edilir.

Etiketli PDXs 9. Deneysel metastaz Modelleri

  1. etiketli PDX tümör hücreleri ayırmak, 4. bölümde açıklanan adımları izleyerek. Tümör oldukça vaskülarize veya fare stromada zengin ise 4.5 veya 4.6 de tarif edildiği gibi, kanser hücrelerinin çoğalmasını, yapar.
  2. Farelerde başına (Ca 2+, Mg 2+ ücretsiz) tripan mavisi dışlama kullanarak canlı hücreleri saymak ve 100 ul PBS içinde 250.000 hücreleri sulandırmak. hücreleri buz üzerinde tutun. Birden fareler enjeksiyon için, buna uygun olarak numaraları ayarlayın (ve pipetleme hataları hesaba katmak için, en az bir ilave enjeksiyonu bir fazlalığı hazırlama).
  3. Uygun hayvan prosedürü odasına buz üzerinde hücreleri getirmek ve onaylı IACUC protokole göre intra-kardiyak enjeksiyon geçin.
    Not: kanser hücrelerinin intrakardiyak enjeksiyonu ayrıntılı protokolleri, başka 22,23 tarif edilmiştir.
  4. Parça ve metastatik ölçmekbioluminescent görüntüleme kullanılarak zamana yayılmış. Işıldaması ve / veya otopsi 24 izole organların GFP görüntüleme (Şekil 6) kullanılarak farklı organlarda makroskopik metastazı gözünüzde canlandırın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu yöntem, yüksek titre lentiviral vektörler pSIH1-H1 copGFP-T2A-Puro ve faj-EF1aL-lusiferaz UBC-GFP-W kullanılarak PDX-ayrışmış meme kanseri hücrelerinin transdüksiyonunu açıklanmaktadır. Bu vektörler, enfeksiyon (Şekil 1a) sonra en erken 24 olarak hr in vitro transdüksiyon etkinliğini tahmin sağlayan bir floresan işaretleyici ifade eder. En PDXs için, GFP ifade hücre agrega oluşumu sık gözlenen bu anda, enfeksiyon (Şekil 1b) 72 saat sonra kada...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Protokolü içinde kritik adımlar:

In vitro transdüksiyon sırasında medya kompozisyonu dikkatli kontrol sağlar kadar yüksek titre lentiviral parçacıkların kullanımı (> 10 8 TU / ml), bu protokolün başarısında kritik bir adımdır. Yüksek titreli viral parçacıkların üretimi için birden fazla yöntem de 18,19 anlatılmış olmasına rağmen, Bu protokol, ayrıntılı olarak tarif edildiği gibi üretilen lentiviral parçacıkları kullanır

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Yazarlar, bu çalışmalarda kullanılan yüksek titre lentiviral üretimi için faj EF1aL-DsRed-UBC-GFP-B vektör ve protokolleri temin Boston Üniversitesi'nde Dr. Darrel KOTTON ederiz. Bu çalışma .NCI P30CA046934 Merkezi hibe in vivo görüntüleme desteklenen DOD BCRP W81XWH-11-1-0101 (DMC), ACS IRG # 57-001-53 (DMC), NCI K22CA181250 (DMC) ve R01 CA140985 (CAS) tarafından finanse edildi ve doku kültürü Colorado AMC Üniversitesi çekirdekler.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
DMEM / F12 (1: 1)HycloneSH30023.01
bFGFBD Biosciences354060
EGFBD Biosciences354001
HeparinSigmaH4784
B27Gibco / Thermo Fisher17504-44
Anti-mantar-antibiyotiklerHycloneSV30010
AccumaxYenilikçi Hücre Teknolojileri-105-500Sindirim Tamponu
FBSAtlanta BiologicalsS11550
HBSS Kırmızı Ca2 + < / sup> / Mg 2 + < / sup> ücretsizHycloneSH30031.02
Hepes
10x PBSHycloneSH30258.01
CultrexCultrex3433-005-01Bodrum Matrisi Özü (BME)
30 &# 176; C çalkalayıcıNewBrunswick Scientific CO. INCSerisi 25 İnkübatör, Çalkalayıcı
70 & # 956; m filtrelerFalcon7352350
neşterlerFisher22079690
Clorhexidine dezenfektanDurvet NDC # 30798-624-35
Kırmızı kan ve nbsp; hücre lizis reaktifiSigmaR7757
NöraminidazSigmaN7885-1UN
EpCAM (CD326+) mikro boncuklar*Miltenyil Biotec130-061-101
Soy hücresi tükenme Kiti, fare*Miltenyil Biotec130-090-858
MiniMACS Ayırıcı Miltenyil Biotec130-042-102
Mini MACS Manyetik StandMiltenyil Biotec130-042-303
MS SütunlarıMiltenyil Biotec130-042-201MS veya LS sütunları kullanılabilir, hücre sayısına göre ayarlanabilir.
Illumatool Ayarlanabilir ışık sistemiLightools araştırmasıÇeşitliİn vivo floresan görüntüleme için
Ksenojen IVIS200 görüntüleme cihazıKsenojenÇeşitliİn vivo parlaklık görüntüleme için
İnsan Sitokeratin Klonu MNF116 Monoklonal antikorDAKOM0821Pan-sitokeratin ve nbsp;
Epidermal Büyüme faktörü reseptörü antikoruHücre sinyalizasyonu4267SEGFR

Kaynaklar

  1. Jin, K., et al. Patient-derived human tumour tissue xenografts in immunodeficient mice: a systematic review. Clin Transl Oncol. 12 (7), 473-480 (2010).
  2. Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. Cancer Res. 73 (17), 5315-5319 (2013).
  3. DeRose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nat Med. 17 (11), 1514-1520 (2011).
  4. Kabos, P., et al. Patient-derived luminal breast cancer xenografts retain hormone receptor heterogeneity and help define unique estrogen-dependent gene signatures. Breast cancer research and treatment. 135 (2), 415-432 (2012).
  5. Zhang, X., et al. A renewable tissue resource of phenotypically stable, biologically and ethnically diverse, patient-derived human breast cancer xenograft models. Cancer Res. 73 (15), 4885-4897 (2013).
  6. Lum, D. H., Matsen, C., Welm, A. L., Welm, B. E. Overview of human primary tumorgraft models: comparisons with traditional oncology preclinical models and the clinical relevance and utility of primary tumorgrafts in basic and translational oncology research. Curr Protoc Pharmacol. , (2012).
  7. Marangoni, E., et al. A new model of patient tumor-derived breast cancer xenografts for preclinical assays. Clin Cancer Res. 13 (13), 3989-3998 (2007).
  8. Garrido-Laguna, I., et al. Tumor engraftment in nude mice and enrichment in stroma- related gene pathways predict poor survival and resistance to gemcitabine in patients with pancreatic cancer. Clin Cancer Res. 17 (17), 5793-5800 (2011).
  9. Landis, M. D., Lehmann, B. D., Pietenpol, J. A., Chang, J. C. Patient-derived breast tumor xenografts facilitating personalized cancer therapy. Breast Cancer Res. 15 (1), 201(2013).
  10. Norum, J. H., Andersen, K., Sorlie, T. Lessons learned from the intrinsic subtypes of breast cancer in the quest for precision therapy. Br J Surg. 101 (8), 925-938 (2014).
  11. Tentler, J. J., et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nat Rev Clin Oncol. 9 (6), 338-350 (2012).
  12. Zhang, H., et al. Patient-derived xenografts of triple-negative breast cancer reproduce molecular features of patient tumors and respond to mTOR inhibition. Breast Cancer Res. 16 (2), R36(2014).
  13. Liu, H., et al. Cancer stem cells from human breast tumors are involved in spontaneous metastases in orthotopic mouse models. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (42), 18115-18120 (2010).
  14. Kang, Y. Analysis of cancer stem cell metastasis in xenograft animal models. Methods Mol Biol. 568, 7-19 (2009).
  15. Thibaudeau, L., et al. Mimicking breast cancer-induced bone metastasis in vivo: current transplantation models and advanced humanized strategies. Cancer Metastasis Rev. 33 (2-3), 721-735 (2014).
  16. Francia, G., Cruz-Munoz, W., Man, S., Xu, P., Kerbel, R. S. Mouse models of advanced spontaneous metastasis for experimental therapeutics. Nat Rev Cancer. 11 (2), 135-141 (2011).
  17. Powell, E., et al. p53 deficiency linked to B cell translocation gene 2 (BTG2) loss enhances metastatic potential by promoting tumor growth in primary and metastatic sites in patient-derived xenograft (PDX) models of triple-negative breast cancer. Breast Cancer Res. 18 (1), (2016).
  18. DeRose, Y. S., et al. Patient-derived models of human breast cancer: protocols for in vitro and in vivo applications in tumor biology and translational medicine. Curr Protoc Pharmacol. , (2013).
  19. Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. J Vis Exp. (32), (2009).
  20. Indumathi, S., et al. Lineage depletion of stromal vascular fractions isolated from human adipose tissue: a novel approach towards cell enrichment technology. Cytotechnology. 66 (2), 219-228 (2014).
  21. Hines, W. C., Yaswen, P., Bissell, M. J. Modelling breast cancer requires identification and correction of a critical cell lineage-dependent transduction bias. Nat Commun. 6, 6927(2015).
  22. Campbell, J. P., Merkel, A. R., Masood-Campbell, S. K., Elefteriou, F., Sterling, J. A. Models of bone metastasis. J Vis Exp. (67), e4260(2012).
  23. Kang, Y. Imaging TGFbeta Signaling in Mouse Models of Cancer Metastasis. Methods Mol Biol. 1344, 219-232 (2016).
  24. Jenkins, D. E., Hornig, Y. S., Oei, Y., Dusich, J., Purchio, T. Bioluminescent human breast cancer cell lines that permit rapid and sensitive in vivo detection of mammary tumors and multiple metastases in immune deficient mice. Breast Cancer Res. 7 (4), R444-R454 (2005).
  25. Lawson, D. A., et al. Single-cell analysis reveals a stem-cell program in human metastatic breast cancer cells. Nature. 526 (7571), 131-135 (2015).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Meme Kanseri PDXLentiviral TransdüksiyonTümör Hücresi İşaretlemeBiyolüminesan GörüntülemeGFP EkspresyonuTümör DisosyasyonuEpitelyal ZenginleştirmeIn Vivo Görüntüleme
Tümör Büyüme ve metastaz Çalışmaları İzlenebilir Muhabirleri ile Meme Kanseri Hasta kaynaklı ksenogratflarının Etiketleme
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.