tedavi seçenekleri palyatif kalmıştır ise görülme sıklığı artmıştır olarak beyin metastazı acil karşılanmamış tıbbi ihtiyaç haline gelmiştir. Kanser hücrelerinin intracarotid arteriyel enjeksiyon yoluyla beyin metastazı deneysel hayvan modelleri oluşturma yeni müdahale rejimlerinin hastalığın biyolojisi ve değerlendirilmesi mekanik çalışmaları kolaylaştırır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Intracarotid Kanser Hücre Enjeksiyon Beyin metastaz Fare modelleri üretmek için
Bu makalede
Özet
Özet
Metastaz, hastanın vücudu içinde ikincil sitelerde, yayılması ve habis hücrelerin büyüme, kansere bağlı ölümlerin>% 90 oluşturmaktadır. Son zamanlarda, yeni tedavilere etkileyici gelişmeler dramatik birçok kanser hastaları için hayatta kalma ve yaşam kalitesinin düzeltilmesi uzamış var. Ne yazık ki, beyin metastatik nüks sıklığı hızla artmakta ve mevcut tüm tedaviler sadece palyatif vardır. Bu nedenle, iyi bir deneysel hayvan modelleri acil hastalığı biyoloji derinlemesine çalışmalar kolaylaştırmak ve klinik öncesi değerlendirilmesi için yeni tedavi rejimleri değerlendirmek için ihtiyaç vardır. Bununla birlikte, kanser hücrelerinin kuyruk damarından enjeksiyon yoluyla in vivo metastazı tahlilinde standart ağırlıklı akciğerdeki metastatik lezyonlar; hayvanlar genellikle beyin metastazı herhangi bir anlamlı akıbet önce akciğer tümör yükü yenik. Tümör hücrelerinin intrakardiyak enjeksiyon beyin dahil çoklu organ sitelerine metastatik lezyonlar oluşturur; Bununla birlikte, variabiBu model ile üretilen tümör büyümesinin vasıflı tedavi etkinliğini değerlendiren kendi programını nemlendirme, büyüktür. Beyin metastazı çalışma için güvenilir ve tutarlı hayvan modelleri oluşturmak için, burada tümör hücrelerinin intracarotid enjeksiyon yoluyla ev faresi (Mus musculus) deneysel beyin metastazı üretmek için bir prosedür açıklanmaktadır. Bu yaklaşım, böylece temel biyolojik mekanizmaları incelemek için ve yeni terapötik ajanlar değerlendirmek için araştırma çabalarını kolaylaştırıcı bir benzeri büyüme ve ölüm özellikleri ile beyin metastazı taşıyan farelerin çok sayıda üretmesini sağlar.
Giriş
merkezi sinir sistemi (MSS) için kanser metastazı yıkıcı bir hastalıktır ve beyin dokusundan ya da ( "beyin metastazı" Bu makalede hem anlamına gelir) leptomeningial ya içerebilir. 1 1, 2: Bu> 10 birincil gliomas outnumbering, baskın intrakranial kanseridir. Akciğer kanseri, meme kanseri ve melanom beyin metastazı 3, 4 yüksek incidences üreten ilk üç büyük neoplastik hastalıklar vardır. Son yıllarda, yeni kanser tedavilerinde etkileyici gelişmeler dramatik birçok kanser hastaları için hayatta kalma ve yaşam kalitesinin düzeltilmesi uzamış var. Ancak, nüks üzerine, beyin metastazı insidansı hızla artıyor. Örneğin, anti-HER2 antikoru trastuzumab (Herceptin) HER2 + meme kanserli hastalarda önemli klinik etkinlik göstermiştir; henüz rahatsız edici bir eğilim ortaya çıkmıştırBu hastalarda: kimin Ekstrakranial sistemik bir hastalık başlangıçta daha sonra beyin metastazı 5, 6, 7 geliştirmek trastuzumab tedavisinden fayda olanların 1/3 kadar. Ne yazık ki, beyin metastazı olan hastalar genellikle yaşam kalitesi travmatik bozulma yaşandığı, hemen hemen tüm güncel tedavilere dirençli olan ve tanı sonrası onların bir yıllık sağkalım sadece ~% 20 8'dir. Akım (steroidler, kranial radyoterapi ve seçilmiş hastalarda cerrahi rezeksiyon dahil) beyin metastazı için tedaviler sadece 9 küratif değil, palyatif. Bu nedenle, beyin metastazı yeni kanser tedavilerinin bu dönemde bir sonraki heybetli bir meydan okuma olarak ortaya çıkmaktadır. Hastalar klinikte her gün yüz karşılanmamış zorluğu gidermek için, biz acilen daha iyi beyin metastazı altında yatan mekanizmayı anlamak ve yeni tedaviler geliştirmek için bu bilgiyi kullanmak gerekir.
metastatik kanser hücreleri tarafından beyin başarılı kolonizasyon, kan beyin bariyeri (BBB) bypass gibi birden fazla biyolojik oyuncuların karmaşık etkileşimi aracılık işlevler bir dizi performans gerektirir ve beyin intrinsik kaçmak bir ex vivo veya in vitro sistemde değinmeyecek hiçbiri bağışıklık savunma mekanizmaları 10,. Bu nedenle, in vivo modellerde doğru ve sadık beyin metastazı çalışmaları için kritik öneme sahiptir. In vivo metastazı tahlilinde geleneksel bir akciğer tıkayabilirler hücrelerin çoğunluğu gelen, kuyruk damarından enjeksiyon yoluyla kanser hücrelerinin getirmektedir. Hayvan ölüm akciğerlerde 11 tümör yükü nedeniyle önce beyin metastatik lezyonlar nadiren bu modellerde üretilmektedir. Kanser hücrelerinin doğrudan intraserebral enjeksiyonla CNS'de tutarlı bir tümör büyümesini üretir ve yaygın olarak primer gliomların çalışmalarında kullanılmaktadır. Ancak, Such enjeksiyonu bu modelin fizyolojik alaka olarak, ilgilendiren önemli noktaları hem BBB ödün ve enjeksiyon yerinde travmatik yaralanma neden olur. Başka sık kullanılan kanser hücre giriş yolu, intrakardiyak enjeksiyon, yönetmek ve merkezi sinir sistemine deneysel metastaz üretir kolaydır. Ancak, CNS dışında diğer organ sitelerine eşzamanlı metastazları her zaman üretilir ve hayvan ölümleri 11 neden olabilir; Bu nedenle, bu modele göre yüksek değişkenlik derecesi nedeniyle, biyolojik mekanizmalar ya da hayvanların sınırlı sayıda terapötik maddelerin kantitatif bir değerlendirme için, uygun hale getirir.Burada genel karotis arterinin içine kanser hücrelerinin enjeksiyonu ile deneysel beyin metastazı üretilmesi için işlemleri tarif eder. Biz beyin metastazı metastatik kaskad bireysel genlerin katkılarını incelemek ve terapötik müdahale etkinliğini değerlendirmek için bu yaklaşımı kullanmışs 12, 13. Bu yaklaşımın önemli avantajları tekrarlanabilirlik ve değişkenlik düşük derecesi yüksek derecede olduğu; büyük dezavantajı mikrocerrahi gerçekleştirmek için gerekli sofistike ve beceri olduğunu.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Etik deyimi: Tüm hayvan çalışmaları Texas MD Anderson Kanser Merkezinde Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
1. Enjeksiyon için Kanser Hücreleri hazırlayın
- enjeksiyondan önce kanser hücreleri bir veya iki gün Tohum. özel bir ortam, özel bir hücre hattı için literatürde belirtilmedikçe,% 10 FBS ile desteklenmiş DMEM / F12 ortamı kullanın.
- 37 ° C'de 2 dakika - 1 tripsinizasyonla (% 0.25) daha önce bir kez serumsuz ortam ile birinci yıkama ile% 80 izdiham - cerrahi operasyonun günde hasat hücreleri 70 ulaşır. DMEM / F12 ortamı FBS ihtiva eden,% 10,% 0.25 tripsin söndürmek için hücrelere ilave edin.
- 3 dakika 80 × g hücreleri santrifüj. Hücre hattına bağlı olarak, 5 x 10 6 hücre / ml -, bakiye serum kaldırma hemasitometre ile hücre sayımı, 1 Hank dengeli tuz çözeltisi (HBSS) içinde yeniden askıya almak için iki kez serumsuz ortam hücreleri yıkanır. buz üzerinde tutmakenjeksiyon zamanına kadar.
Not: MDA-MB-231 göğüs kanseri hücreleri ve K1735 melanom hücreleri bu çalışmada kullanılmıştır ve her ikisi de hücre çizgileri / ml konsantrasyonda 2 x 10 6 hücre kullanıldı. metastaz tahlillerin sonuçlarını etkileyebilecek akibetini mümkün olduğunca kısa trypsinization süresini tutun.
2. tümör hücre enjeksiyonu için fareler hazırlamak
- intraperitonal (İP) fareler ketamin enjekte / ksilazin kokteyli (ketamin 100 mg / kg, ksilazin 10 mg / kg) anestezi.
- hayvan ayak kısma tam anestezi onaylayın ve tepki eksikliği gözlemlemek.
- (Protein jeller dökümü için kullanılan) bir cam levha üzerinde fare yerleştirin ve lastik bantlar ile sabitleyin.
- Gerekirse, tıraş veya tüy dökücü ürünü küçük bir miktar uygulayarak ve kağıt havlu ile saçlarını kapalı silerek boyun tüylerden. NOT: çıplak fareler kullanılarak onlar vücut saç yok gibi, bu adımı atlayın.
- uygulayarak boyun cildi temizleyinpovidon-iyot ve% 70 alkol.
- Diseksiyon mikroskobu sahnede fare yerleştirin
- Uzun bir cerrahi neşter ile cilt ~ 1 cm bir kesi yapmak.
- Açık açık altında karotis arter ortaya çıkarmak için dişli forseps ile kas teşrih.
- cerrahi forseps ile bitişik vagus sinirinden karotis arter ayırın.
- Cerrahi forseps kullanarak, küçük bir pamuk içine bir pamuk bazı pamuk ayırmak nemlendirin ve moda. enjeksiyon amaçlanan sitenin karotis arter altında bu tampon-nemli pamuk yerleştirin.
- pamuk bir dikiş uzak ve yakın yerleştirin ve gevşek knot yapmak. enjeksiyon yerinde kan akışını engellemek için proksimal düğüm sıkın.
- pamuk karotid arter taze kırmızı kan ile tam basınçlı görünürse kanser hücre enjeksiyonu geçin.
Karotis Arter içine 3. Kanser Hücre Enjeksiyon
- Vortex ve 100 ul o çizmekşırıngaya F kanser hücreleri.
- Diseksiyon mikroskobu altında, yavaş yavaş pamuk üstünde oturan karotid arter lümenine (konik kadar) 31 G iğne takın.
- Yavaşça karotis arter içine şırınga hücreleri enjekte edilir. tamponlu kanser hücreleri dolaşıma itilir zaman başarılı enjeksiyon yakın kan damarlarının ve kasların değişen renk ile mikroskop altında görülebilir.
- Tüm birimin enjeksiyonu tamamlandıktan sonra, yetmezliği önlemek için hafifçe uzak karotid arter kaldırın.
- Hızla enjeksiyon işlemini tamamlamak için uzak düğüm sıkın.
- enjeksiyon tamamladıktan sonra, bitişik harfler sıkın ve mikroskop altında mikro-makas ile aşırı ipek sütür kırpın. yara kapatılmaması ayrılmış kas geri hareket ettirin. İki zımba ile cilt kapatın.
4. Cerrahi Kurtarma
- Bir ısıtma pedi üzerine çalışan hayvan taşımakkurtarma için. hayvanlar bilincini kazanmak için 60 dakika - 30 sürebilir. Bu süre içinde, ameliyat sonrası analjezi gibi deri altına enjeksiyon yoluyla buprenorfin (0.05 mg / kg) tatbik. Not: Analjezi yerel IACUC protokolü onayladı göre sağlanmalıdır.
- hayvanlar uyandırmak ve onların normal davranış devam sonra, onların konut konumuna fareler dönün. birkaç gün sonrası ameliyat için jel gıda ile fareler sağlamak. Cerrahi kaydını tutmak ve odaya tutun.
Vivo Görüntüleme 5. Non-invaziv
- Lusiferaz raportör yapıları ile etiketlenmiş hücreler için, in vivo görüntüleme sistemi 14 kullanılarak kanser hücre enjeksiyonu verimini ölçmek.
NOT: Görüntüleme araştırma hayvanlara aşırı stresten kaçınmak enjeksiyon gününde yapılmaz.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Enjeksiyon kalitesi değerlendirilebilir hangi iki nokta vardır. ilk şans enjeksiyon sırasında kan damarı renklerini değiştirme operatörün gözlem gereğidir. fakir enjeksiyonları Kaçak kolayca mikroskop altında görülebilir. Istikrarlı ve güvenli bir fare gövdesinin yerleştirilmesi (Şekil 1A) ve destekleyici pamuk üzerindeki karotid arter (Şekil 1B) karotid arter içine düzgün ve başarılı bir enjeksiyon için kritik faktörlerdir. enjeksiyon kalitesini değerle...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
kanser hücrelerinin başarılı karotis arter enjeksiyonu için en kritik adımlar şunlardır: cerrahi operasyon için hazırlık fare 1) derin anestezi; 2) Pamuk desteğinin üstünde karotis arter sürekli yerleştirme; Başarılı enjeksiyondan sonra karotid arter 3) sıkı ligasyon.
30 dakika ~ Derin anestezi mikroskop altında istikrarlı cerrahi performans için genellikle gereklidir. Biz fare anestezi için ticari hazır kullanımlı ketamin / ksilizin kokteyl kullanın. Anestezi için kullanılan ses ayarlama da...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.
Teşekkürler
Yazarların teşekkür hakkı yok.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Ketamin hidroklorür/ksilazin hidroklorür çözeltisi | Sigma-Aldrich | K113 | |
| Rutin Stereomikroskop Leica M50 | Leica | M50 | Mikroskop modülerdir ve belirli alan gereksinimlerine uyacak şekilde son derece yapılandırılabilir. |
| Cilt kesileri yapmak için | cerrahi tek kullanımlık scapel | Integra Miltex | 4-410 |
| Doku Forsepsleri - 1 x 2 Diş | Güzel Bilim Araçları | 11021-12 | mucles'ı künt bir şekilde incelemek için |
| Dumont #5 - Ayna Kaplama Forseps | Güzel Bilim Araçları | 11252-23 | karotis arteri enjeksiyona ayırmak ve hazırlamak için |
| Yaylı | Makas Güzel Bilim Araçları | 15025-10 | dikişleri kesmek için |
| Yara karanlığı için | EZ Klips Kiti | Stoelting | 59020 |
| BD İnsülin Şırıngası | Becton Dickinson | 328438 | hücre enjeksiyonu için |
| IVIS Spectrum In Vivo< / em> Görüntüleme Sistemi | PerkinElmer | 124262 |
Kaynaklar
- Gavrilovic, I. T., Posner, J. B. Brain metastases: epidemiology and pathophysiology. J Neurooncol. 75 (1), 5-14 (2005).
- Patchell, R. A. The management of brain metastases. Cancer Treat Rev. 29 (6), 533-540 (2003).
- Barnholtz-Sloan, J. S., et al. Incidence proportions of brain metastases in patients diagnosed (1973 to 2001) in the Metropolitan Detroit Cancer Surveillance System. J Clin Oncol. 22 (14), 2865-2872 (2004).
- Schouten, L. J., Rutten, J., Huveneers, H. A., Twijnstra, A. Incidence of brain metastases in a cohort of patients with carcinoma of the breast, colon, kidney, and lung and melanoma. Cancer. 94 (10), 2698-2705 (2002).
- Bendell, J. C., et al. Central nervous system metastases in women who receive trastuzumab-based therapy for metastatic breast carcinoma. Cancer. 97 (12), 2972-2977 (2003).
- Clayton, A. J., et al. Incidence of cerebral metastases in patients treated with trastuzumab for metastatic breast cancer. Br J Cancer. 91 (4), 639-643 (2004).
- Romond, E. H., et al. Trastuzumab plus adjuvant chemotherapy for operable HER2-positive breast cancer. N Engl J Med. 353 (16), 1673-1684 (2005).
- Mayer, M. A patient perspective on brain metastases in breast cancer. Clin Cancer Res. 13 (6), 1623-1624 (2007).
- Lin, N. U., Bellon, J. R., Winer, E. P. CNS metastases in breast cancer. J Clin Oncol. 22 (17), 3608-3617 (2004).
- Zhang, C., Yu, D. Microenvironment determinants of brain metastasis of brain metastasis. Cell Biosci. 1 (1), 8(2011).
- Fidler, I. J., Nicolson, G. L. Organ selectivity for implantation survival and growth of B16 melanoma variant tumor lines. J Natl Cancer Inst. 57 (5), 1199-1202 (1976).
- Zhang, L., et al. Microenvironment-induced PTEN loss by exosomal microRNA primes brain metastasis outgrowth. Nature. 527 (7576), 100-104 (2015).
- Zhang, S., et al. SRC family kinases as novel therapeutic targets to treat breast cancer brain metastases. Cancer Res. 73 (18), 5764-5774 (2013).
- Lim, E., Modi, K. D., Kim, J. In vivo bioluminescent imaging of mammary tumors using IVIS spectrum. J Vis Exp. (26), (2009).
- Zhang, C., Zhang, F., Tsan, R., Fidler, I. J. Transforming growth factor-beta2 is a molecular determinant for site-specific melanoma metastasis in the brain. Cancer Res. 69 (3), 828-835 (2009).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
