Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Larva Zebra balığı Gonadal Doku Diseksiyon

10.2K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/55294

⸱

26 Nisan 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institutes of Brain Science, State Key Laboratory of Medical Neurobiology and Collaborative Innovation Center for Brain Science, Fudan University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Burada, Zebra balığı seks farklılaşması ve bakım soruşturmaları kolaylaştıracaktır larva zebrabalıkları, gonadal doku izole etmek için bir protokol mevcut.

Özet

vahşi Zebra balığı ZZ / ZW cinsiyet belirleme sistemine sahip olmasına rağmen, evcil Zebra balığı seks kromozomuna kaybetti. Bunlar genom topluca bireysel balık seks kimliklerini belirlemek boyunca çeşitli genler dağıtılan polıgenık eşey tayini sistemi kullanmaktadır. Şu anda, genler gonad gelişimini düzenleyen katılır ve nasıl çalışır zor kalır. Normal olarak, gonadal doku izole seks gelişim süreçleri incelemek için ilk adımdır. Burada, zebra balığı dpf larvaları 17 dpf (gün sonra döllenme) ve 25 ile gonadal doku izole etmek için bir prosedürdür. İzole gonadal doku daha sonra morfoloji ve gen ekspresyon profili ile incelenebilir.

Giriş

Vahşi Zebra balığı kromozomu 4'te önemli kadın seks belirleyici 1 (yani ortak laboratuar suşları) kaybolması veya evcil zebrabalıkları değiştirilir. Bunun yerine, sıcaklık, hipoksi, gıda temini ve nüfus yoğunluğu gibi çevresel faktörlerin eşliğinde polıgenık eşey tayini sistemi var. zebra balığı seks gelişme ayrıntılı mekanizması tam olarak anlaşılmış değildir. Birincil cinsiyet tespiti sinyal (ler) i / ne tür zebra balığı cinsiyet tespiti oluştuğunda gibi temel soru vardır ve genler gonad dönüşümün ilk adım, 3 2 cevaplanması gereken kalır düzenleyen.

Zebra balığı seks gelişim sürecinde, birçok önemli aşamalar kabul edilmiştir. gelişiminin erken safhasında, 4 HPF (saat sonra döllenme) primordiyal üreme hücreleri (PGC) özellikleri tabi başlanarak genital s göç veçoğalma. PGC sayıları ve germ hücreleri ve somatik hücreler arasındaki karşılıklı etkileşimler gonad farklılaşma 4 için çok önemlidir. 13 dpf (gün sonra döllenme) 'de, gonadlar farklılaşmamış aşamasındadır. 17 dpf'e olarak, gonadlar gelecek hem kadın hem erkeklerin de iki potansiyel yumurtalıkların içine gelişir. yumurtalık apoptozise bağımlı bir geçiş testise 21 ila 25 dpf başlar ve birçok hafta boyunca devam edebilir. 35 dpf ile, gonadal cinsiyet tespit edilmiştir ve cinsiyete spesifik gamet üretimi, 7 her iki yumurtalıkta devam etmektedir ve 6, 5 testisler.

Bugüne kadar, çeşitli aday genleri ve cinsiyet tespiti mekanizmaları önerilmiştir. Proteomik ve transkriptomik analizi, dimorfik ifade bulunan pek çok gen izole ettik ve bu genler zebrabalıkları 8 seks farklılaşma çalışma kullanılmıştır 9, 10. Örneğin, larva zebrabalıkları, cyp19a1a gen özel olarak fakat testis 11, 12 yumurtalık olarak ifade edilir. Buna ek olarak, AMH geni zayıf yumurtalık folikül granüloza hücrelerinde eksprese edilir, ancak güçlü bir testis Sertoli hücreleri 13 edilmektedir. Bunun aksine, vasa geni sürekli olarak uygun bir gonad işaretleyici 14, 15 yaparak, dişi ve erkek zebrabalıkları germ hücrelerinde ifade edilir.

Gonadal gen ekspresyon düzeyleri incelenmesi, özellikle iki potansiyel yumurtalık aşama 3, 9, cinsiyet tespiti ve diferansiyasyonuna ait moleküler mekanizmanın anlaşılması önemlidir. Bununla birlikte, larva zebrabalıkları ve mukabil ölçüde küçük gonad küçük boyutu gonada izolasyonunu karmaşıkDaha fazla moleküler analiz l dokusu. Kullanılan önceki çalışmalar opercula ve anal gözenek 16 arasındaki bütün gövde bölgesini disseke. Bu preparat içeren gonadlar, ancak birden fazla doku ve organların oluşur. Seçenek olarak ise, bu tür vas olarak gonad-spesifik GFP ekspresyonu ile transgenik hayvanları: EGFP flüoresan aktif hücre ayrıştırma (FACS) ve lazer yakalama mikro diseksiyon 17, 18 üzerinden gonadal doku izolasyonu için kullanılmıştır. Ama onların yaygın uygulama sınırlıdır. Burada, 17 dpf ve 25 dpf'e larva zebrafish gonadal doku izole etmek için basit bir prosedür açıklanmaktadır. Diğer organlarda göre gonad konumunu göstermekte ve çevre dokulardan morfolojik olarak bozulmamış gonadlar izole eder. Biz daha yüksek kantitatif PCR ile gövde dokusu (karşılaştırıldığında izole gonadlar olarak ifade edilmiştir, örneğin vaz ve cyp19a1a olarak gonad-spesifik genleri göstermektedirqPCR) analizi. Bu protokol, böylece gonad doku 19 daha sonra moleküler analiz sağlayarak, tanımlanmasını, izolasyonunu RNA saflaştırma ve larva zebrafish gonadal spesifik genlerin amplifikasyonuna olanak tanır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Zebra balığı deneyler Fudan Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı. Balığı, standart prosedürlere 20'ye göre yükseltilmiş ve yetiştirildi.

1. hazırlıklar

  1. larva zebrabalıkları dpf 17 dpf ve 25 yetiştirmek
    1. geçiş gününden önce geç öğleden sonra bir geçiş tankına Transferi 2 erkek ve 2 dişi yetişkin zebra balığı (sağlıklı, eski 3 ila 6 ay, laboratuvar AB strain). Bir bariyer kadın ve erkeklerden ayırın. Ertesi sabah, tank suyu yenilemek ve onları çiftleşmeye izin engeli kaldırın. 100 mm Petri tabaklarda döllenmeden sonra 1 ila 2 saat içerisinde yumurta toplayın.
    2. Erken gelişim döneminde (4 gün) boyunca 28.5 ° C'de 40 ml embriyo ortamı (EM) ile bir 100 mm'lik plaka 40 embriyolar tutun ve günde iki kez EM yenileyin. 1 L tankları (300 ml sistem suyuna 40 larva) Larvalar aktarın ve 5 dpf sonra canlı rotifer (tam temini, günde iki kez) ile beslenirler.10 dpf'e sonra yerine rotiferin diyetin canlı tuzlu su karidesi besleyin. 21 dpf 14 yaşında yeniden dolaşan su sistemi içine balık aktarın.
    3. 17 dpf veya 25 dpf kadar yeniden dolaşan su sistemindeki larva zebrafish kaldırın. aydınlık / karanlık döngüsü sağlamak sistem su 14/10 saat ve pH değeri yaklaşık 7.2 olan. 17 dpf (5.5 mm 6.8) ve 25 dpf larvaları 22 (8 mm ila 11) arasında vücut uzunluğu ölçülür.
  2. diseksiyon için% 2 agar hazırlayın.
    1. 200 ml steril su 4 g agar ekleyin. saydam olana kadar bir mikrodalga fırınında karışım ısıtılır.
    2. daha sonra, 60 mm çapında Petri tabağı (plakanın yaklaşık 1/3 hacim) içine dökün, yaklaşık 15 dakika boyunca agar soğutun. 4 ° C'de katılaşmış Agar plakaları saklayın.

2. Protokol 1: Larva dpf Gonadal 17 Doku ve 25 teşrih

  1. 17 dpf larvaları uyutmak için tanka kırılmış buz ekleyin. Transferi30 ml soğuk Ringer solüsyonu ile Petri kabı soğutulmuş 100 mm anestezi larva. Tamamen larvaları uyutmak için en az 15 dakika boyunca soğutulmuş Ringer çözeltisinde kuluçkaya balık tutun.
  2. Küçük bir plastik kaşıkla önceden soğutulmuş bir agar plaka larvalarını aktarın. Ringer çözeltisi soğutulmuş 10 mL tüm balık vücut daldırın ve yavaşça yan koyun.
  3. 25X Stereo mikroskop görüş alanının altında aşağıdaki işlemleri yapın. stabilizasyon cımbız ile balık sandığı Kelepçe. cımbız bir çift kalp anusdan uzunlamasına karın Rip. Yavaşça iç organları açığa çıkarmak için vücudun bir tarafında cilt ve kasların kaldırın.
  4. dikkatle yüzmek mesaneye ventral organlarının kütlesini çıkarın. yüzme mesaneye bağlı gonad zarar kaçının.
  5. yüzmek mesane ve ön vücut arasındaki bağlantıyı kesin. Tüm yüzmek mesane ve yavaşça gonadal doku çekin.
    NOT: En durumdas, 17 dpf gonadal doku epitel doku ve protonephridium çevreleyen içerir. Bunlar kolayca birbirinden ayrıldı değildir, ancak 25 ° C'de kolayca ayrılabilir dpf. erbezi ayrıca anüs bağlanır. anüs birbirine bağlı sol ve sağ gonad olan bir bağlantı açıkça görülebilir.
  6. dikkatli bir şekilde yüzme mesaneden gonadal doku ayırmak ve çevresindeki yağ dokuları temizlemek için cımbız kullanarak.
  7. Hemen 200 uL Ringer çözeltisi ihtiva eden önceden soğutulmuş bir 1.5 mL santrifüj tüpüne izole gonadal doku aktarın. Tüm gonadal dokular larva ayrılır kadar buz üzerinde tüp tutun.
  8. 2.7 - adımlarda 2.1 anlatıldığı gibi dpf larvaları 25 gonadlar parçalara ayır.

3. Protokol 2: İzole Gonadal Dokuların Gen İfade analiz

  1. larva gonadal dokulardan toplam RNA ekstrakte edilir.
    1. Yeni RNazsız 1'e izole gonadal dokuları aktarın.5 ml tüp Ringer çözeltisi kaldırıp. 100 uL lizis çözeltisi ilave edin. dokuların kadar Vorteks tamamen parçalanır.
    2. üreticinin talimatlarına göre toplam RNA ekstraksiyon prosedürü uygulayın.
    3. I tampon 10x DNase 1/10 hacmi ve RNA çözeltisine DNase I 1 uL ekleyin ve yavaşça karıştırın. 37 ° C'de 20 dakika süreyle inkübe edilir.
    4. RNA çözeltisine 1/10 hacim DNaz inaktivasyon reaktif ekleyin. 70 ° C'de 10 dakika süreyle inkübe edilir. bir spektrofotometre kullanılarak toplam RNA konsantrasyonu ölçümü. -20 ° C'de saklayın.
  2. Birinci-şerit cDNA sentezi gerçekleştirme
    1. üreticinin protokolünü birinci tür cDNA sentezi gerçekleştirmek için bir oligo (dT) -bağlayıcı primeri kullanarak. 20 uL bir toplam reaksiyon hacmi 1 RNA ug 2 ekle.
    2. 45 ° C'de 90 dakika boyunca reaksiyon çözeltisi inkübe edin. 5 dakika boyunca 70 ° C'de ısıtma ile reaksiyonu bitirin.
    3. cDNA 1 mL RNaz H ekleme yüzdenDevriminin kalıntı RNA'nın çıkması için. ~ 13,000 x g'de 10 saniye boyunca hafifçe ve santrifüj karıştırın. 37 ° C'de 20 dakika süreyle inkübe edilir. 20 ul nükleaz ücretsiz su ekleyin. -70 ° C'de saklayın.
  3. Floresan kantitatif PCR gerçekleştirme
    1. bir floresan boya ile bir döngü sisteminde qPCR gerçekleştirin. 15 s, 30 s için 68 ° C, 15 sn için 95 ° C 'de Tm-5 ° C ile 35 döngü: Aşağıdaki PCR döngü koşulları kullanarak. (: GTCCTGTTGTCTCCTACTGTCG; REV: fwd CATTTGAGTTGAATATGATGCCCTG), cyp19a1a:;: AMH (GCGGAGAGGTGGAAGAGAGAATG fwd: rev GTGGATGGCAGCAGTACGAC) aşağıdaki gibi primer dizileri kullanarak, nanos3 (FWD: GCTCGGTGTACGCCAAATCAACAT; REV: CCAAGTGAAAACACAACACCAGTGC), vasa (FWD: ATCGCATAGGAAGAACTGGACGCT; REV: CCAAGTGAAAACACAACACCAGTGC) ve β-aktin (FWD: AGTGCGACGTGGACATCCGTA; rEV: GCACTTCCTGTGGACGATGGA) 19.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Gonadların Diseksiyonlar AB strain larva zebrabalıkları uygulandı. Şekil 1, 17 dpf ve 25 dpf larva zebrabalıkları tipik gonadal doku gösterir. Birincisi, deri ve karın bir tarafında kaslarının iç organları açığa çıkarmak için kesilir. iç organların kütlesi çıkardıktan sonra, birlikte gonad ile yüzme kesesi gövde kalır. Yumurtalık ( 'Şekil 1 B' de ok) kesesi ventral tarafında bağlanmıştır. 17 dpf'e, g...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Zebra balığı güçlü bir model haline gelmiştir ve yoğun gelişme ve hastalıkla ilgili araştırmalarda kullanılır. Örneğin beyin, kalp, gonad ve böbrek gibi yetişkin zebrabalıkları organların izole edilmesi için yöntemler, iyi 23, 24, 25 belgelenmiştir. Nedeniyle küçük boyutu ve larva zebrabalıkları gonadal dokuların dinamik yeniden yapılanmasına bağlı gonadal dokuların izolasyonu zor bir iştir. Larva gonadlar 26<...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.

Teşekkürler

Biz balık bakımı için C Zhang teşekkür ederim. Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilim Vakfı (GP için 31.171.074, 31.371.099 ve 31.571.067) tarafından ve Pujiang Talent Projesi (GP için 09PJ1401900) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Hücre kültürü kabı 100 mmCorning430167Embriyo inkübasyonu için
20x EM1 L için gerekli: 17.5 g NaCl, 0.75 g KCl ve 2.9 g CaCl· ekleyin; 2H2O; daha sonra 0.41 g KH2< / sub>PO4, 0.412 g Na2< / sub>HPO4 susuz ve 4.9 g MgSO4< / sub>· 7H2O.
1x EM20x EM'yi damıtılmış suda seyreltin
AGAROSE G-10Gen121985%2 agar plakalarını hazırlamak için
Trizol ReaktifiInvitrogen15596-026RNA izolasyonu için
Metre camıShen Bo250 ml%2 agar plakalarını hazırlamak için
Mikrodalga FırınMideaM1-211AAGAR'ı
ısıtmak içinCımbız DUMONT # 5INOXDünya Hassas Alet500341Diseksiyon için
StereomikroskopMoticSMZ168Diseksiyon için
Saf su ekipmanlarıMillipore
Ringer ' s çözeltisi1 L için gerekli: 6.78 g NaCl, 0.22 g KCl, 0.26 g CaCl2< / sub> ve 1.19 g Hepes ekleyin; sonra 1 L'ye kadar doldurun; PH'ı 7.2'ye ayarlayın. Süzülerek sterilize edin ve otoklavlanmış şeffaf polikarbonat bir kapta saklayın.
Transfer pipetiSamco202, 204
Metal banyosuQiLinbeierModel GL-150
MikroskopLeica FotomikrografM205 FA
Eppendorf5417R
Mikro Ölçekli RNA İzolasyon KitiAmbionAM1931Gonad dokularından RNA izolasyonu için
Dnase ISigmaAMPD1-1KTRNA çözeltisinde DNA sindirimi için
RevertAid First Strand cDNA Sentez KitiThermo Scientific#K1631Birinci iplikli cDNA sentezi için
Rnase HThermo Scientific#EN0202cDNA çözeltisindeki artık RNA'yı sindirmek için.
SYBR Green Realtime PCR Master MixTOYOBOQPK-201Bu ürün, gerçek zamanlı PCR için Taq DNA polimeraz bazlı 2x ana karışımdır ve  SYBR Green I ile interkalasyon testi için geçerlidir.
SpektrofotometreNe DropOD-2000+Toplam RNA konsantrasyonunun ölçülmesi
MastercyclerEppendorfAG 22331 Hamburggen ekspresyon profili oluşturma
Santrifüjü için

Kaynaklar

  1. Wilson, C. A., et al. Wild sex in zebrafish: loss of the natural sex determinant in domesticated strains. Genetics. 198 (3), 1291-1308 (2014).
  2. Liew, W. C., Orban, L. Zebrafish sex: a complicated affair. Genomics. 13 (2), 172-187 (2014).
  3. Orban, L., Sreenivasan, R., Olsson, P. Long and winding roads: Testis differentiation in zebrafish. Mol. Cell. Endocrinol. 312 (1-2), 35-41 (2009).
  4. Blaser, H., et al. Transition from non-motile behaviour to directed migration during early PGC development in zebrafish. J. Cell Sci. 118, 4027-4038 (2005).
  5. Wang, X. G., Orban, L. Anti-Müllerian hormone and 11 β-hydroxylase show reciprocal expression to that of aromatase in the transforming gonad of zebrafish males. Dev. Dynam. 236 (5), 1329-1338 (2007).
  6. Siegfried, K. R., Nüsslein-Volhard, C. Germ line control of female sex determination in zebrafish. Dev. Biol. 324 (2), 277-287 (2008).
  7. Uchida, D., Yamashita, M., Kitano, T., Iguchi, T. Oocyte apoptosis during the transition from ovary-like tissue to testes during sex differentiation of juvenile zebrafish. J. Exp. Biol. 205 (Pt 6), 711-718 (2002).
  8. Groh, K. J., Schönenberger, R., Eggen, R. I. L., Segner, H., Suter, M. J. F. Analysis of protein expression in zebrafish during gonad differentiation by targeted proteomics. Gen. Comp. Endocr. 193, 210-220 (2013).
  9. Siegfried, K. R. In search of determinants: gene expression during gonadal sex differentiation. J. Fish Biol. 76 (8), 1879-1902 (2010).
  10. Small, C. M., Carney, G. E., Mo, Q., Vannucci, M., Jones, A. G. A microarray analysis of sex- and gonad-biased gene expression in the zebrafish: evidence for masculinization of the transcriptome. BMC Genomics. 10, 579(2009).
  11. Chiang, E. F., Yan, Y. L., Guiguen, Y., Postlethwait, J., Chung, B. Two Cyp19 (P450 aromatase) genes on duplicated zebrafish chromosomes are expressed in ovary or brain. Mol. Biol. Evol. 18 (4), 542-550 (2001).
  12. Kishida, M., Callard, G. V. Distinct cytochrome P450 aromatase isoforms in zebrafish (Danio rerio) brain and ovary are differentially programmed and estrogen regulated during early development. Endocrinology. 142 (2), 740-750 (2001).
  13. Rodríguez-Marí, A., et al. Characterization and expression pattern of zebrafish anti-Müllerian hormone (amh) relative to sox9a, sox9b, and cyp19a1a, during gonad development. Gene Expr.Patterns. 5 (5), 655-667 (2005).
  14. Krovel, A. V., Olsen, L. C. Expression of a vas::EGFP transgene in primordial germ cells of the zebrafish. Mech Dev. 116 (1-2), 141-150 (2002).
  15. Krovel, A. V., Olsen, L. C. Sexual dimorphic expression pattern of a splice variant of zebrafish vasa during gonadal development. Dev. Biol. 271 (1), 190-197 (2004).
  16. Tzung, K. W., et al. Early depletion of primordial germ cells in zebrafish promotes testis formation. Stem Cell Reports. 4 (1), 61-73 (2015).
  17. Hsiao, C., Tsai, H. Transgenic zebrafish with fluorescent germ cell: a useful tool to visualize germ cell proliferation and juvenile hermaphroditism in vivo. Dev. Biol. 262 (2), 313-323 (2003).
  18. Jorgensen, A., Nielsen, J. E., Morthorst, J. E., Bjerregaard, P., Leffers, H. Laser capture microdissection of gonads from juvenile zebrafish. Reprod Biol Endocrinol. 7, 97(2009).
  19. Chen, S., Zhang, H., Wang, F., Zhang, W., Peng, G. nr0b1 (DAX1) mutation in zebrafish causes female-to-male sex reversal through abnormal gonadal proliferation and differentiation. Mol. Cell. Endocrinol. 433, 105-116 (2016).
  20. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for The Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , Eugene: University of Oregon Press. University of Oregon. (2000).
  21. Liew, W. C., et al. Polygenic sex determination system in zebrafish. PLoS One. 7 (4), e34397(2012).
  22. Parichy, D. M., Elizondo, M. R., Mills, M. G., Gordon, T. N., Engeszer, R. E. Normal table of postembryonic zebrafish development: staging by externally visible anatomy of the living fish. Dev Dyn. 238 (12), 2975-3015 (2009).
  23. Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of Organs from the Adult Zebrafish. J. Vis Exp. (37), (2010).
  24. Arnaout, R., Reischauer, S., Stainier, D. Y. R. Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications. J. Vis Exp. (94), (2014).
  25. Gerlach, G. F., Schrader, L. N., Wingert, R. A. Dissection of the Adult Zebrafish Kidney. J. Vis Exp. (54), (2011).
  26. Yoon, C., Kawakami, K., Hopkins, N. Zebrafish vasa homologue RNA is localized to the cleavage planes of 2- and 4-cell-stage embryos and is expressed in the primordial germ cells. Development. 124 (16), 3157-3165 (1997).
  27. Braat, A. K., Speksnijder, J. E., Zivkovic, D. Germ line development in fishes. Int. J. Dev. Biol. 43 (7), 745-760 (1999).
  28. Huang, H. Y., Ketting, R. F. Isolation of zebrafish gonads for RNA isolation. Methods Mol Biol. 1093, 183-194 (2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Larva Zebrafish DiseksiyonuGonadal Doku zolasyonuZebrafish Cinsiyet Geli imiGonad Mark r AnaliziRNA Ekstraksiyon ProtokolQPCR Gen EkspresyonuStereomikroskop DiseksiyonuAgar Plak Haz rlamaRinger zeltisi
Larva Zebra balığı Gonadal Doku Diseksiyon
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.