Yöntem makalesi

Buharlaşma azaltıcı Kültür Durumu Mikrotiter Tabaklar Multisellüler Sfero Oluşumunun Tekrarlanabilirlik artırır

DOI:

10.3791/55403

⸱

7 Mart 2017

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Molecular and Translational Medicine, Palacky University in Olomouc

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

mikrotiter plakaları orta düzensiz kaybı üniforma çok hücreli tümör sfero oluşumu tekrarlanabilirlik etkiler. Kültür şartlarının iyileştirilmesi küremsi oluşumu tekrarlanabilirlik ve sıvı üst tabaka tekniği ile küremsi bazlı deneylerin sonuçları geliştirmek önemli bir orta kaybını azaltmak.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yakından in vivo koşullarda taklit Tümör modelleri potansiyel anti-kanser ilaçların taranması için ilaç keşfi ve geliştirilmesi giderek daha popüler hale gelmektedir. Çok hücreli tümör sferoidler (MCTSes) etkili bir talebi optimizasyonu ve hedef doğrulama için in vitro bir model bunları uygun hale getirir, katı tümörlerin fizyolojik koşulları taklit eder. MCTS kültürü için çeşitli tekniklerin dışında, agaroz üzerinde sıvı bindirme yöntemi MCTS üretimi için en ucuz yöntemlerden biridir. Bununla birlikte, yüksek verimli tarama için sıvı kaplama kullanarak MCTS kültürleri güvenilir aktarım agaroz ile mikrotiter plakaları (MAS) kaplanması ve kuyu boyunca tek MCTS formasyonunun irreproducibility dahil kısıtlamaları bir dizi tarafından tehlikeye. Milletvekilleri ilaç için tüm plaka kullanımını engelleyen, plaka dış ortamdaki aşırı buharlaşma sonucu etkileri kenar önemli yatkındırtestleri. Bu el yazması üniforma MCTS formasyonu ölçeklenebilirlik ve tekrarlanabilirlik arttırmak için sıvı bindirme tekniği detaylı teknik geliştirmeler sağlar. ilaç tedavisi sunulmuştur sonra Ayrıca, MCTS değerlendirilmesi için basit, yarı otomatik ve evrensel olarak uygulanabilir yazılım aracı ile ilgili detaylar sunuyor.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

tümörlerde kanser hücreleri fizyolojik hücre dışı matris ve etkileşim hücreleri ile çevrili bir kompleks 3 boyutlu (3D) bir yapı içerisinde düzenlenir. Yaklaşık dokularda bütün hücreler 3 boyutlu bir ortamda bulunan tümör özellikleri taklit nitro tümör modellerinde daha fazla fizyolojik olarak uygun olan ihtiyaç çok 3D kültür teknikleri, 1, 2, 3 geliştirilmesi ile sonuçlanmıştır. Bu modeller artık 3D 2 terapötik metastazı ve hücre yanıtına tümör mikro rolü çalışmak için temel araştırma araçları haline gelmektedir. Ayrıca, 2-boyutlu (2B) hücre kültürleri 4 ile karşılaştırıldığında, 3 boyutlu modeller hücre içi sinyal yollar etkileyen tümör stromanın etkileşimleri, daha iyi anlaşılması için izin verir.

kanser hücre hatlarının çok hücreli tümör sferoidler (MCTSes) sık sık 3D cep c kullanılanin vivo tümörlerin göreli yakınlığı nedeniyle ulture modelleri. Kullanılan çeşitli teknikler dışında, agaroz ile kaplanmış plakalar MCTS nesil sıvı katlamalı tekniği (lot) talebi optimizasyonu ve hedef doğrulama 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 için büyük ilgi görmüştür. Bu LOT 6, 7 kullanılarak MCTS kültürlerde bileşik kütüphaneler pilot ekranları çalıştırmak için başarılı başardık son çalışmalar bellidir. Ancak, orta buharlaşma kaynaklı düzensiz kaybına MCTS morfolojisi ve büyüme iyi-to-kuyu değişkenlik mikrotitre levhaları kullanılarak LOT (milletvekilleri) eşlik ortak engelli bulunmaktadır. Sonuç olarak, üniform olmayan MCTSes oluşumu önemini ve alaka ödünFarmakolojik Testler 8, 12, 13 veri. birimleri dağıtma otomatik sıvı kullanırken uyarlık konularına ek olarak, LOT-tabanlı yüksek verimli deneyleri etkileyen başka pratik bir sorun milletvekilleri kaplama agaroz ile. Besleme ünitesi agaroz jelleşmenin önlenmesi için ısıtıldı tutulabilir, ancak tevzi kaset ve boru tıkanma robotik sistemler 6 için potansiyel bir husustur.

Bu zorlukların bazılarının üstesinden gelmek için, biz son zamanlarda MCTS kültürü 8 LOT birkaç değişiklik geliştirmişlerdir. Bu modifikasyonlar özellikle yaygın yüksek verimli tarama laboratuvarlarında bulunan araçları kullanarak milletvekilleri gelen düzensiz orta kaybını önlemek için olası yolları dayanmaktadır. 3 arasında muntazam boyutlu ve tekrarlanabilir MCTSes üretilmesi için modifiye edilmiş çok bir ayrıntılı işlem84-kuyu plakaları (İP) sunulmuştur. Eser özellikle, enine kesit alanının ölçümü için net bir şekilde tanımlanmış bir sınır yoktur, kısmen parçalanmış, ilaçla işleme tabi tutulmuş MCTSes olarak, MCTS boyutunun değerlendirilmesi için bir yarı-otomatik rutin sunulur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agaroz kaplı plakalar hazırlanması 1.

  1. düşük erime noktalı agaroz 0.75 g tartılır ve serumsuz ml McCoy'un 5A ortamı (ya da fenol kırmızısı olmadan) 100 ekleyin. Bir mikrodalga çözüm ısıtın ve tamamen agaroz çözmek için her 1-2 dakikada bir girdap. sterilize çözüm Otoklav.
  2. yaklaşık 70 ° C'ye kadar agaroz otoklava soğutun ve bir laminer akış kutusu, vakumla süzülerek 500 mL, 0.22 um'lik bir filtre üst yoluyla filtre. bir kerede tüm çözüm kullanarak değilse küçük hacimlere% 0.75 filtrelenmiş agaroz çözeltisi (FAS) alikotu. soğuk oda ya da 4 hafta boyunca 4 ° C'de buzdolabında Bu hazır kullanım agaroz çözelti aseptik saklayın.
  3. bir akış kutusu steril fosfat-tamponlu tuzlu su (PBS) ile daha sonra% 70 etanol (EtOH) ile, bir Combi reaktifi dağıtıcı ve birinci kaset plastikli veya metal uçlu dağıtma kaseti ile küçük bir tüp takın.
  4. Kullanımdan önce, FAS I depolanmış bir kısım ısı n mikrodalga bunu eritmek için. Başbakan Agaroz çözüm ve ceket 384 gözlü, doku kültürü (TC) ile dağıtım kaset FAS 15 uL mikropleytin "özel" ile tedavi edilen. plaka agaroz hücrelerin ekim önce 15-20 dakika soğumasını bekleyin. Soğuk bir odada ya da 4 ° C'de ve doğrudan ışıktan bir polietilen torbaya sarılmış aseptik agaroz kaplı plakalar, saklayın.
    Not: Stok solüsyonu agaroz konsantrasyonunda bir değişikliği önlemek için% 0.75 FAS tekrarlanan ısıtma kaçının. Yukarıda sözü edilen koşullar altında depolandığında Agaroz kaplı plakalar 2 haftaya kadar saklanabilir. FAS plakalarının kaplanması esnasında ısıtma gerektirmez.
  5. kaset ipuçları ve tüplerde kalan agaroz kaldırmak için 70-80 ° C steril su ile macun ile dağıtım kaset temizleyin.

2. Hücre Kültürü ve MCTS oluşumu

  1. Kültür, insan kolorektal karsinoma HCT116 hücreleri, daha önce tarif edildiği gibilass = "xref"> 8.
  2. agaroz kaplı, 384 gözlü, soğuk depolama mikro TC ile muamele edilmiş ve istenen sayıda çıkarın ve 15 dakika süre ile oda sıcaklığında (RT) kadar dengeye getirin.
  3. % 70 EtOH ve steril PBS ile bir standart tüp dağıtım kaseti emişli hücre tohumlama için Kombi reaktif dağıtıcı hazırlayın. Gerekli mcL tohumlama hacmi ve dağıtıcı manuel ayar düğmelerini kullanarak ortama dağıtım hızını ayarlayın.
    Not: tüm hücre ekim işlemi, steril koşullar altında, bir laminar akış kutusunda gerçekleştirilmektedir.
  4. bir rekombinant hücre ayrışma enzim kullanılarak doku kültürü şişesi yapışkan hücreleri ayırmak. Tam büyüme ortamında 50 ul oyuk başına 2.5 x 10 4 hücre / mL'lik bir yoğunlukta, tohum hücreleri ile steril bir beherde bir hücre süspansiyonu stok yapmak. Birden fazla 384 WP tohum zaman, kabın dibine yerleşmesini önlemek için, bir manyetik karıştırıcı kullanılarak hücrelerin karıştırın.
  5. izin vermekPlakalar oda sıcaklığında 30 dakika dinlendirilir ve daha sonra 4 x g'de 15 dakika boyunca santrifüj.
  6. Bu arada, bir buharlaştırma düşürücü çevresel kapak alır ve onu kısa kenarlara steril H 8 mL 2, O ya da% 5 dimetil sülfoksit (DMSO) ile doldurun 5 ml pipet (Şekil 1A) ile (sol ve sağ). İlk olarak, yavaş yavaş yukarı ve aşağı pipet süpürülerek sol taraftaki çukur içine sıvı dolum 4 mL dağıtmak. Sağ taraftaki çukur ile bu adımı yineleyin.
    NOT: Sıvı kapağının merkezinde birleştirme ve gaz değişimi (Şekil 1A) için bir boşluk bırakmaz yan olukları eklenen emin olun. Kapağın dış ve daha sonra 384 gözlü TC levhaları dış kuyu içine H H2O sızma 2 O sonuçlar aşırı miktarda eklenmesi.
  7. (Şekil 2A, steril H2O ile 384 gözlü TC levhaları sıvı haznesini ve sıvı dolgulu çevresel kapak düzenli levha kapaklar yerine).
  8. % 95 nem,% 5 CO2 ve% 20 O2 ile 37 ° C, döner bir inkübatörde tabak yerleştirin ve hücreler, 4 gün boyunca MCTSes halinde toplamak için izin verir. aniden düşmesini nem seviyesini önlemek için sonraki günlerde çok uzun süre inkübatör kapıyı açmaktan kaçının.

Bir Robotik Sistemi Kullanılarak 3. Orta Değişim

  1. MCTS oluşumundan sonra 4. günde, otomatik bir mikro yıkama dağıtıcı kullanılarak göz başına önceden ısıtılmış ortam 30 uL ekleyin. MCTSes ek olarak 3 gün boyunca büyümeye izin verin. onlar deney için istediğiniz boyutu ulaşmak kadar, düzenli olarak her 3 günde bir orta yerine.
  2. Her bir ortamdaki bir tanımlanan hacmi aspire ampirik yıkama manifoldunun Z -height ayarlayın. Aspire 30 kuyu başına orta ul taze, önceden ısıtılmış orta 30 uL ile değiştirin.
    NOT: yıkama manifoldu aşağı hareket hangi dağıtım hızı ve hız ayarlamaen düşük oranda kuyuların içine kuyularda türbülans en aza indirmek için.

MCTS 4. Yüksek içerik Görüntüleme ve Yarı-otomatik Görüntü Analizi

  1. Resim 4X hava objektif kullanarak bir yüksek içeriği otomatik görüntüleme sisteminde MCTS (NA 16).
  2. Numarası ve aralık z -stacks ve oyuk başına bütün bir MCTS yakalamak için deney için istediğiniz gibi piksel binning ayarlayın 11 ms maruz kalma süresi ve 4 x 4'e binning ayarlayın.
  3. programlama dilinde yazılmış bir in-house yordamını kullanarak ", benioku" bölümünde açıklandığı gibi, resim kademeli olarak işleyin.
    NOT: .m kodu ve .txt benioku dosyaları ek kod dosyaları (Şekil 1B) olarak mevcuttur. Rutin tedbirler 2D görüntüleri MCTS alanı, majör ve minör eksenler, çevre ve sağlamlık.

figure-protocol-1
Şekil 1:Çevresel kapak hazırlanması ve yarı otomatik rutin bir akış şemasıdır. Doğru (sol) ve fazla miktarda sıvı dolgu (sağ) bir miktarda (burada,% 5 DMSO) ile dolu bir buharlaştırma düşürücü çevresel kapağın (A) görüntü. ok sıvı eklemek için kısa kenar çukur gösterir. Yıldız işareti DMSO doğru hacminin eklenmesinden sonra kapağın ortasında boşluk gösterir. (B) yarı otomatik görüntü analizi rutin yer alan adımları gösteren bir iş akışı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Özellikle periferik kuyulardan orta düzensiz kaybı, küçük kültür hacimleri ile milletvekilleri sık karşılaşılan bir sorundur. Bu tür iyi kontrol sıcaklık / nemlendirme sistemleri ve buharlaştırma azaltıcı MP'lerin ve plaka kapaklı kuluçka esas olarak geliştirilmiş kültür koşulları, kuyu 8 boyunca ortam önemli kaybını azaltır. nispi bir buharlaşma ölçmek için, Orange G (RG) eşit hacimleri her bir kuyucuğa ilave edildi ve 3 gün boyunca RG absorbans değişikliği, stan...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Filtreli Agaroz ile 384 Kuyu TC Plakaları Kaplama

LOT standart bir uygulama kaplamak için agaroz ve / veya dağıtma birimi gerekir plakaları, agaroz 6 jelleşmenin önlenmesi için ısıtıldı tutulması için% 1-1.5, düşük-erime noktalı agarozda kullanmaktır. çapı 0.2 ila 0.4 mm arasında değişen küçük bir boru delikler sıvı dağıtma kasetleri kullanılarak birden fazla tabak hazırlarken agaroz jel potansiyel bir sorun değildir. Bu dağıtma sırasında ek ısıtma gerektirir dağıtma kas...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma Eğitim, Gençlik ve Spor (LO1304) Çek Bakanlığı ve Çek Cumhuriyeti Teknolojik Ajansı (TE01020028) hibe tarafından desteklenmiştir. Yazarlar çevresel kapak fotoğraf çekerken Dr. Lakshman Varanasi teşekkür etmek istiyorum.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
AgaroseSigma-AldrichA9414Düşük erime
noktalı McCOY'un 5A OrtaSigma-AldrichM8403
" hızlı" Filtermax filtresiTPP995050.22 & m, 500 mL
Multidrop ve ticaret; Kombi Reaktif Dispenseri Thermo Fisher Scientific5840300
Küçük Tüp Dağıtım kaseti Thermo Fisher Scientific24073295Metal uç 
384 kuyulu TC plakası PerkinElmer6057308Plaka tipi- CellCarrier
Standart Tüp Dağıtım KasetiThermo Fisher Scientific24072670
MicroClime Çevresel KapakLabcyteLLS-0310
DMSOSigmaD4540
Döner İnkübatör (SteriStore)HighRes Biosolutions23641Seri No.: D00384
Mikroplaka Yıkama Dispenseri BioTekBelirtilmemişModel: EL406 
Yüksek İçerikli Görüntüleme Sistemi (CellVoyager)Yokogawa Electric Corporation BelirtilmemişModel: CV7000
Orange GNew England BiolabsB7022S
TrypLE ve ticaret; Ekspres rekombinant hücre ayrışma reaktifiThermo Fisher Scientific12604021Fenol kırmızı içermez

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. In vitro three-dimensional (3D) models in cancer research: An update. Mol Carcinog. 52 (3), 167-182 (2013).
  2. Das, V., Bruzzese, F., Konečný, P., Iannelli, F., Budillon, A., Hajdúch, M. Pathophysiologically relevant in vitro tumor models for drug screening. Drug Discov. Today. 20 (7), 848-855 (2015).
  3. Weigelt, B., Ghajar, C. M., Bissell, M. J. The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer. Adv. Drug Deliv. Rev. , 69-70 (2014).
  4. Fischbach, C., Kong, H. J., Hsiong, S. X., Evangelista, M. B., Yuen, W., Mooney, D. J. Cancer cell angiogenic capability is regulated by 3D culture and integrin engagement. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (2), 399-404 (2009).
  5. Lao, Z., et al. Improved Methods to Generate Spheroid Cultures from Tumor Cells, Tumor Cells & Fibroblasts or Tumor-Fragments: Microenvironment, Microvesicles and MiRNA. PLoS ONE. 10 (7), e0133895(2015).
  6. Wenzel, C., et al. 3D high-content screening for the identification of compounds that target cells in dormant tumor spheroid regions. Exp. Cell Res. 323 (1), 131-143 (2014).
  7. Li, Q., et al. 3D Models of Epithelial-Mesenchymal Transition in Breast Cancer Metastasis: High-Throughput Screening Assay Development, Validation, and Pilot Screen. J. Biomol. Screen. 16 (2), 141-154 (2011).
  8. Das, V., Fürst, T., Gurská, S., Džubák, P., Hajdúch, M. Reproducibility of Uniform Spheroid Formation in 384-Well Plates: The Effect of Medium Evaporation. J. Biomol. Screen. , (2016).
  9. Celli, J. P., et al. An imaging-based platform for high-content, quantitative evaluation of therapeutic response in 3D tumour models. Sci. Rep. 17 (4), 3751(2014).
  10. Solomon, M. A., Lemera, J., D'Souza, G. G. M. Development of an in vitro tumor spheroid culture model amenable to high-throughput testing of potential anticancer nanotherapeutics. J. Liposome Res. 26 (3), 246-260 (2016).
  11. Costa, E. C., Gaspar, V. M., Coutinho, P., Correia, I. J. Optimization of liquid overlay technique to formulate heterogenic 3D co-cultures models. Biotechnol. Bioeng. 111 (8), 1672-1685 (2014).
  12. Walzl, A., et al. A Simple and Cost Efficient Method to Avoid Unequal Evaporation in Cellular Screening Assays, Which Restores Cellular Metabolic Activity. Int. J. Appl. Sci. Technol. 2 (6), 17-25 (2012).
  13. Berthier, E., Warrick, J., Yu, H., Beebe, D. J. Managing evaporation for more robust microscale assays. Part 1. Volume loss in high throughput assays. Lab Chip. 8 (6), 852-859 (2008).
  14. Zanoni, M., et al. 3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Sci. Rep. 6, 19103(2016).
  15. Zimmermann, H. F., John, G. T., Trauthwein, H., Dingerdissen, U., Huthmacher, K. Rapid Evaluation of Oxygen and Water Permeation through Microplate Sealing Tapes. Biotechnol. Prog. 19 (3), 1061-1063 (2003).
  16. Sirenko, O., Mitlo, T., Hesley, J., Luke, S., Owens, W., Cromwell, E. F. High-Content Assays for Characterizing the Viability and Morphology of 3D Cancer Spheroid Cultures. Assay Drug Dev. Technol. 13 (7), 402-414 (2015).
  17. Chen, W., Wong, C., Vosburgh, E., Levine, A. J., Foran, D. J., Xu, E. Y. High-throughput Image Analysis of Tumor Spheroids: A User-friendly Software Application to Measure the Size of Spheroids Automatically. J. Vis. Exp. (89), e51639(2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

S v st Kaplama Tekni iBuharla man n Azalt lmasMikrotitre Plak KaplamaAgaroz zeltisi Haz rlamaH cre Ekimi ProtokolSferoid B y me Ko ullarOtomatik G r nt leme Analizila Tedavisi De erlendirmesiKenar Etkisinin Azalt lmas

İlgili makaleler