Yöntem makalesi

3D Mekansal Hücre Kültürleri için hücre yapı iskeleleri olarak biyo-uyumlu sıvı kristal Elastomer Köpüklerin sentezi

DOI:

10.3791/55452

⸱

11 Nisan 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Liquid Crystal Institute, Kent State University, 2Chemical Physics Interdisciplinary Program, Liquid Crystal Institute, Kent State University, 3Department of Biological Sciences, Kent State University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, 3D, biyo-uyumlu yan zincir sıvı kristal elastomerler (LCEs) göre biyolojik olarak parçalanabilen, köpük-benzeri hücre iskeleleri hazırlanması için bir yöntem sunar. Konfokal mikroskopi deneyleri köpüğümsü LCEs hücre eki, proliferasyon ve C2C12s miyoblastların kendiliğinden uyum sağlamak olduğunu göstermektedir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, bir 3D, biyolojik olarak parçalanabilen, köpük-benzeri hücre iskelesi bir adım adım hazırlanmasını sunmaktadır. Bu iskeleleri Smektik-A (SmA), sıvı kristal elastomerler (LCEs) 'de elde edilen, yan zincire asılı gruplar halinde kolesterol birimleri içeren yıldız blok ko-polimerler çapraz bağlama ile hazırlanmıştır. Köpük gibi iskeleleri, 3D hücre kültür yapı iskeleti olarak kullanılmasını uygun hale metal şablonları kullanılarak hazırlandı birbirine mikrokanallar bulunmaktadır. Metal köpük ve geleneksel gözenekli şablonu filmler, ancak kitlesel taşıma aynı zamanda daha iyi yönetimi (örneğin, besin maddeleri, gaz, atık ile karşılaştırıldığında yalnızca yüksek hücre çoğalmasını teşvik eden bir 3D cep iskele elastomer sonuç normal yapının birleşik özellikleri vb.) Metal şablon doğası köpük şekillerde (örneğin, rulo veya film) kolayca müdahale edilebilmesini sağlar ve farklı hücre çalışmaları için farklı gözenek boyutlarının ıskelesının interconnec koruyarakşablonun ted gözenekli doğası. Dağlama işlemi, bunların biyolojik olarak uyumlu ve biyolojik olarak parçalanabilir doğa koruma, elastomerlerin kimyası etkilemez. Biz hücrelerin büyümesini ve çoğalmasını teşvik ederken bu smektik LCEs, geniş süreler boyunca büyüyünce klinik açıdan ve karmaşık doku yapıları çalışma sağlar göstermektedir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre çalışmalarında ve hücre bağlanması ve yayılması, 1, 2, 3, 4, 5 amaçlayan doku rejenerasyonu için bir uygulama için tasarlanmış biyolojik ve biyolojik olarak uyumlu sentetik malzemelerin çeşitli örnekler vardır. 6, 7 sipariş moleküler anizotropik harici uyaranlara yanıt olabilir sıvı kristal elastomerler (LCEs) olarak bilinen biyolojik olarak uyumlu malzemelerden birkaç örnek, olmuştur. LCEs optik özelliklerin ve sıvı kristal 8 moleküler sipariş, 9 elastomerlerin mekanik ve elastik özellikler kombine uyaranlara yanıt veren malzemelerdir. LCEs dış stimülasyonu yanıt olarak şekil değişiklikleri, mekanik deformasyon, elastik davranış ve optik özellikleri karşılaşabiliruli (yani., ısı, gerilim, ışık, vs.), 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16. Daha önce yapılan çalışmalar, sıvı kristaller (LCS) hücre 4, 17 büyümesini ve yönünü duyu göstermiştir. LCEs hücre iskele ve hizalama gibi biyolojik ve tıbbi açıdan alakalı uygulamalar için uygun olabileceğini varsaymak mümkündür. Daha önce, bir "Swiss-peynir türü" gözenekli morfolojiyi 6, 18 sahip smektik biyolojik olarak uyumlu, biyolojik olarak parçalanabilen, döküm kalıplı ve ince LCEs filmlerin hazırlanmasını bildirmektedir. Ayrıca, hücre büyümesi 19 , 20. Çalışmalarımız ilgi 21'in dokusunun içine alacak şekilde malzemelerin mekanik özelliklerinin ayar hedeflendi. Ayrıca, bu çalışmalar elastomer hücre etkileşimleri yanı sıra elastomerler dış uyaranlara maruz hücresel yanıtı anlamak odaklanır.

temel zorluklar elastomer matrisi yoluyla hücre bağlanması ve nüfuz imkan vermek için LCEs gözenekliliğini uygun hale kısmen ve daha iyi kütle transportuna yönelik idi. Bu ince filmler 6 gözenekliliği matrisin kütlesi boyunca hücre geçirgenliği için izin verilir, ancak tüm gözenekler tamamen birbirine bağlandığı veya gözenek (homojen) daha düzenli boyutu vardı. Sonra küresel morfolojileri ile biyouyumlu nematik LCE elastomerler bildirildi. Bu nematik elastomerler bağlanma ve hücre proliferasyonu için izin verilir, ancak gözenek boyutu önlenir 10-30 um, sadece değişmektedir veya bunların kullanımı sınırlıdırhücre çizgileri 19, 20 daha geniş bir çeşitliliği ile elastomerler.

Kung ve arkadaşları tarafından önceki iş. Bir "gözden çıkarılabilir" Metal şablonu kullanılarak grafin köpüklerin oluşumuna ilişkin elde edilen grafin köpük seçilen metal şablon 22 tarafından dikte çok düzenli bir gözenekli morfolojiyi sahip olduğunu göstermiştir. Bu metodoloji gözeneklilik ve gözenek boyutu tam kontrol sunuyor. Farklı şablon oluşumu, köpük hazırlama öncesinde şekiller aynı zamanda, bir metal şablon yumuşaklık ve esneklik sağlar. Bu malzeme süzme 23, gaz çiftleşmiş 24 veya elektro-eğrilmiş elyaflar 25 gibi diğer teknikler, 26 aynı zamanda gözenekli malzemelerin hazırlanması için bir potansiyel sunmaktadır, ancak daha fazla zaman, bazı durumlarda, gözenek boyutu ile sınırlıdır, alıcı ve vardır sadece birkaç mikrometre. Köpük-benzeri 3D LCEs metal şablonları daha yüksek bir hücre yükü için izin kullanılarak hazırlandı; geliştirilmiş bir proliferasyon hızı; eş-kültürleme; ve, son olarak değil, daha iyi toplu taşıma yönetimi (yani besin, gazlar ve atık) tam doku gelişimini 27 sağlamak için. Köpük gibi 3B LCEs hücre uyumu geliştirmek için görünür; Bu hücre büyümesi ve hücre yönünü algılayacak LC kolye göre çok muhtemeldir. LCE içinde LC kısımların varlığı LCE iskele içinde hücre konumu ile ilgili olarak, hücre hizalama artırmaktadır. Dikmeler, birlikte (birleşme) 27 birleştiği yerde açık bir yönlendirme gözlenirken hücreler, LCE direklerinden içinde hizalamak.

Genel olarak, bir hücre destek ortamı olarak LCE hücre iskeleti platformu ayarlamak için bir elastomer morfolojisi ve elastik özellikleri ve özellikle de o sıralı, uzamsal düzenlemeleri oluşturmak için (bireysel) hücre tipleri hizalanmasını yönlendirmek için fırsatlar sunaryaşayan sistemlere benzer f hücreleri. Yanı sıra sürdürülmesi ve uzun süreli hücre büyümesini ve üremesini yönlendirebilen bir iskele sağlamasının, LCEs hücre yönlendirme ve etkileşimler anında değiştirilebilir dinamik deneyler, izin verir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Not: 3-kollu yıldız blok kopolimeri kullanılarak 3D LCE köpük benzeri hazırlanması için, aşağıdaki aşamaları, Şekil 1 'de gösterilmiştir. Nükleer manyetik rezonans (NMR) karakterizasyonu için, spektrumları bir Bruker DMX 400 MHz aleti üzerinde oda sıcaklığında dötoryumlanmış kloroform (CDCI3) kaydedilir ve içten 7.26 kalıntı tepeleri referans. Fourier zayıflatılmış toplam yansıma modu kullanılarak bir Bruker Vektör 33 FT-IR spektrometresi kullanılarak kaydedilmiştir enfraruj (FT-IR) spektrumları dönüşümü. Aşağıdaki protokolün her adım için, uygun kişisel koruyucu giysiler (PPE) giymek önemlidir.

Α-kloro-ε-kaprolakton 1. N- (monomer) (Jerome et al prosedüre göre. 28)

  1. aşağıdaki gibi sentez başlamadan önce, 3-kloroperbenzoik asit 27 g saflaştırmak:
    1. damıtılmış su, 800 mL'lik, sodyum 1.28 g eklemefosfat monobazik monohidrat ve sodyum fosfat dibazik heptahidrat 8.24 g. ve rezerv Bu çözeltiye 30 mL (sodyum hidroksit veya hidroklorik asit kullanarak) pH'ı 7.4'e ayarlayın; Bu tampon çözümdür.
    2. bir ayırma hunisi kullanılarak, dietil eter ve 35 ml 3-kloroperbenzoik asit çözülür. tampon çözeltisi 10 mL organik çözelti yıkayın (aşama 1.1.1 hazırlanmıştır.). yıkayınız üç kez tekrarlayın.
    3. Organik çözelti, doğrudan, sodyum sülfat, 3 g ekleyin; Bu kurutma maddesi, organik çözelti su emer.
    4. Kurutma maddesinin çıkarılması için solüsyon filtre. 850 mbar ve 40 ° C'da bir döner buharlaştırıcı kullanılarak düşük basınç altında filtratın konsantre edilir.
  2. bir ultrasonik banyo içinde karıştırıldı, kuru 150 mL diklorometan içinde saflaştırılmış 3-kloroperbenzoik asit 18.5 g çözündürülmesi; Bu işlem tipik olarak 20 dakika sürer. bir ayırma hunisine içinde çözelti yerleştirin.
  3. İki boyunlu içinde, yuvarlak dipli bir reaksiyon kabı,azot gazı altında, bir manyetik karıştırıcı kullanılarak, kuru diklorometan, 15 mL 2-klorosikloheksanon 13.1 g çözülür. karıştırmaya devam edin.
  4. Adım 1.3'te iki boyunlu bir şişeye (adım 1.2 den), 3-kloroperbenzoik asit çözeltisi ihtiva eden ayırıcı bir huni monte edin. Azot gazı ile sistem yıkayın. kloroperbenzoik asit çözeltisi 2-klorosikloheksanon çözeltisi (saniyede bir 1 damla) içine damla damla düşecek şekilde bir ayırma hunisine açılmasını ayarlamak ve 96 saat boyunca azot gazı altında karıştırmaya devam edin.
  5. M-klorobenzoik asit (m -CBA) yan ürünü çökeltmek için 1 saat boyunca -20 ° C'ye kadar, reaksiyon karışımı soğutulur.
  6. M-klorobenzoik asit (m -CBA) süzülür ve sodyum tiyosülfat, sodyum bikarbonat ve doymuş sodyum klorür çözeltileri ile kalan çözelti yıkayın.
  7. 850 mbar ve 40 ° C'da bir döner buharlaştırıcı kullanılarak düşük basınç altında çözücüyü çıkarın. Soluk sarı renkli, kıvamlı LIQU saflaştınlırindirgenmiş 2.3 Torr'da basınç ve 96 ° C altında damıtılarak kimliği.
  8. Aşağıdaki 1H NMR zirveleri kullanılarak sentez başarısını izleyin. 1H NMR (400 MHz, CDCI3, δ [ppm]): 4.75-4.68 (m, 1 H, CH CICO), 4,37-4,26 (m, 1 H, Cı-H2O), 4,18-4,05 (m, 1 H C H2O) ve 2,06-1,58 (m, 6H, C H2 -) 6, 27.

2. Sentez α-üç kollu yıldız Blok Kopolimer Halka Açma Kopolimerizasyonu ile (SBC-αCl) (Sharma ve diğ. 6 ve Amsden ve ark. 29)

  1. sentezi önce, toluen 1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyltriethoxysilane bir% 2 (v / v) solüsyonu ile doldurulması ve yaklaşık 24 saat boyunca karıştırma ile 20 ml ampul Silanize. izopropil alkol ile durulanır ve 30 dakika boyunca 140 ° C'de bir fırında yerleştirerek kurutun.
  2. 3 ekledamıtılmış ε-kaprolakton .64 gr, α-kloro-ε-kaprolakton 0.5 g, ve ampul gliserolün 0.25 mL. 1 dakika süre ile bir vorteks ile karıştırın.
  3. Ampule D 4.90 g L -lactide ekleyin ve nitrojen ile temizleyin. D, L -lactide eritmek için 120 ° C de bir fırında ampul yerleştirin; Bu işlem tipik olarak yaklaşık 2 saat sürer. Bütün içerikler iyice karışmış olduğundan emin olun ve kalay 66 mcL eklemek için bir girdap kullanarak tekrar karıştırın (II) 2-etilheksanoat (Sn (Ekim) 2) ampule.
    Not: D, L -lactide bu işlem sırasında soğuyacak ve erimeye fırında yeniden ısıtılması gerekmektedir.
  4. Şiddetle vorteks ile son bir kez karıştırın ve nitrojen ile yıkayın.
  5. Bir lastik tıpa ile ampulü kapatın. bir vakum borusuna bağlı bir iğne yerleştirin kauçuk tıpa ile (ev vakumu genellikle yeterlidir). g kadar yavaşça bükerek, vakum açın ve bir alev kullanılarak, uzun cam boyun erimelass kendi üzerine çöker. lastik tıpa eritmek için dikkatli olun. ampul alev sızdırmaz sonra, 48 saat boyunca 140 ° C'de, bir kum banyosu, bir fırın ya da uygun bir ısıtıcı eleman yerleştirin.
  6. ampul çıkarıp oda sıcaklığında soğumasını bekleyin.
  7. sızdırmaz gösterirken ampulü kırmak ve 10 mL diklorometan ilave edilerek son derece yapışkan bir likit çözülür. bir ayırma hunisi çözüm aktarın.
  8. Soğuk 100 mL metanol ihtiva eden bir şişe, hazırlama (bir sıcaklıkta, bir kuru buz / aseton banyosu ile soğutulmuş, yaklaşık -78 ° C). Şişenin üzerine ayırıcı bir huni (aşama 2,7) sabitleyin. iki damla saniyede bir (damla damla) kalacak şekilde ayrı bir huniye açılmasını ayarlayın.
  9. süzme ile beyaz bir çökelti (kağıt filtre kullanılarak) toplayın ve 50 ve 60 ° C arasında bir vakumlu fırın içinde kurutun.
  10. Aşağıdaki 1H NMR ve FT-IR zirveleri kullanılarak sentez başarısını izleyin. 1H NMR (400 MHz, CDCI3, Δ [ppm]): 5,29-5,03 (m, COC, H CH3), 4.43-4.25 (m, Cı-HCl), 4,24-4,12 (m, J, C H2O), 4,11-4,03 (t, = 4.6 Hz, CH 2 O), 3.80-3.68 (m, CH CH 2), 3,09-2,64 (geniş, 2.33), J = 4.5 Hz, α-, H, OH), 2.39 (t, s, (t, J = 5.1 Hz, α- H) ve 1,77-1,25 (m, Cı-H2, CH3); FT-IR (1 / λ [cm-1]): 2932 (s), 2.869 (m), 1.741 (s), 961 (s), 866, ve 735 (m), 6, 27.
    Not: Yukarıda tarif edilen halka açma kopolimerizasyon (ROP) prosedür takip edilerek, daha hidrofilik bir 3D LCE hazırlamak yerine SBC bir lineer blok kopolimer (LBC) hazırlanması.
    1. Silanize edilmiş şişe karışımına L-laktid, polietilen glikol (PEG), 3.15 gr ε-kaprolakton 0.3 g, α-kloro-ε-kaprolakton, 1.0 g, ve D'den 5.0 g, ekleyin.

3 -Üç Kol SBC (SBC-aN 3) aN için α-Cı-üç kol SBC 3. Sentetik modifikasyonu (Sharma ve diğ göre. 6)

  1. Yuvarlak tabanlı bir şişe içinde, azot altında, kuru N, N' -dimetilformamid 30 mL SBC-αCl 5 g çözülür.
  2. sodyum azid 0.22 g ilave edilir ve oda sıcaklığında gece boyunca reaksiyona girmesine izin verir.
    Dikkat: sodyum azid zehirlidir; uygun kişisel koruyucu giysiler giymelidir (PPE).
  3. N, 11 mbar ve 40 ° C'de döner bir buharlaştırıcı kullanılarak düşük basınç altında N'-dimetilformamid çıkarın. 30 mL toluen içinde bir karışım içinde çözündürülür. oluşan tuzun ayrılması için 15 dakika boyunca 2,800 x g'de üç kere çözelti santrifüjleyin. 77 mbar ve 40 ° C'da bir döner buharlaştırıcı kullanılarak düşük basınç altında toluen buharlaşır.
  4. 1H NMR ve FT-IR zirveleri kullanılarak azid ikame başarısını izleyin.
    NOT: 1H NMR spektrumu, azid grubuna ilişkin 3.90 ppm'de bir zirvenin görünüşü dışında, ana SBC-αCl benzerdir; FT-IR (1 / λ [cm-1]): 2.928, 2.108 (s, azid), 1.754 (s), 1450 (s), 960 (m), 865 (s), 733 (s) ve 696 (m).

4. Kolesteril sentezi 5-Hexynoate (LC Yarımı) (Sharma ve diğ. 6 ve Donaldson ve arkadaşlarına göre. 30)

  1. yuvarlak tabanlı bir şişe içinde, 5-heksinoik asit, 3 g ve 130 ml diklorometan karıştırılır. 0 ° C'ye soğutun, bir buz banyosu kullanılarak.
  2. Başka bir yuvarlak dipli bir şişeye, N, N'-disikloheksilkarbodiimid ve 8,28 g, kolesterol 10.3 g, ve 4-dimetilaminopiridin, 0.2 g karıştırın.
  3. 1 saat boyunca 0 ° C 'de nihai karışımın kolesterol karışımı içeren bir şişeye 5-heksinoik asit çözeltisi damla damla aktarın ve bakımı.
  4. Karışım, gece boyunca oda sıcaklığına kadar ısınmasına izin verin.
  5. Bir sınıf 415 kağıt filtre kullanılarak filtreleme ile elde edilen disikloheksilüre çökelti çıkarın ve atın.
  6. 850 mbar ve 40 ° C'da bir döner buharlaştırıcı kullanılarak düşük basınç altında filtratın konsantre edilir. 150 mL heksan içinde toplanan tortu çözülür.
  7. 335 mbar ve 40 ° C'da bir döner buharlaştırıcı kullanılarak düşük basınç altında çözücü buharlaştırılır. Nihai ürün toplamak için yağlı tortuya, 350 ml etanol ekleyin. Yıkayın, tam beyaz olmayan etanol ile oluşturulur ve 50 ° C'de vakum altında bir katı ürün kuru katı madde.
  8. Aşağıdaki 1H NMR ve FT-IR zirveleri kullanılarak sentez izleyin. 1H NMR (400 MHz, CDCI3, δ [ppm]): 5.39 (d, J = 4.7 Hz, 1 H, CH = C), 4,70-4,58 (m, 1 H, CH CHOCO), 2.44 (t, J = 2,5 Hz, 2H, CH 2CO), 2.34 (m, 2H, CH 2-C H =), 2.31 (m, 2H, CH 2 CH 2-COO), 2.28 (s, 1 H, 'HC = C), 2.27 (d, J = 2.3 Hz, 2H, ≡CC H2), 2,07-1,06 (m, 2H, CH 2, CH), 0.94 (s, 3H, CH3), 0.89 (d, J = 1.8 Hz, 3H, CH3 CH) ve 0.88 (d, J = 1.8 Hz, 6H, CH3-C, H), 0.67 (s, 3H, CH3). FT-IR (1 / λ [cm-1]): 2,830-2,990 (geniş ve güçlü bir zirve), 2.104 (m), 1.695 (s), 1.428 (m), 1.135 (m), 999 (s), 798 (s) ve 667 (ler).

5. Sentetik modifikasyonu a-N3 -Üç Kol SBC a-Kolesteril-üç kol SBC bir Azid-Alkin Huisgen Siklo-eklenmesi Reaksiyonu ile (SBC-αCLC) ( "Klik" Reaksiyon) göre (SBC-Chol elde etmek Sharma ve diğ. 6)

  1. Yuvarlak tabanlı bir şişe içinde, henüz distile edilmiş tetrahidrofuran, 100 mL (THF) içerisinde SBC-aN 3 (1.5 g), 1 molar eşdeğer çözülür. 1.2 mol equivalen eklemekolesteril 5-hexynoate (1.94 g), bakır (I) 'in 0.1 mol eşdeğer iyodür (0.06 g) t, ve 0.1 trietilamin molar eşdeğer (0.03 g) verdi. gece boyunca azot altında 35 ° C'de karıştırın.
  2. 357 mbar ve 40 ° C'da bir döner buharlaştırıcı kullanılarak düşük basınç altında çözücü buharlaştırılır.
  3. gibi tepkimeye girmemiş malzemenin ve yan ürünleri uzaklaştırmak için oda sıcaklığında 2,800 x g'de 5 dakika için bir diklorometan ve santrifüj 80 mL kalıntı karışımı içinde çözülür.
  4. Aşağıdaki 1H NMR ve FT-IR zirveleri kullanılarak sentez izleyin. 1H NMR (400 MHz, CDCI3, δ [ppm]): 7.54 (s, CH = C-triazol), 5,43-5,34 (m, C = CH kolesterol), 5,10-5,06 (m, COCHCH 3), 4.68 -4.55 (m, O-CH, kolesterol), 4,24-4,19 (m, CH2 O), 4.18-4.13 (t, J = 5.0 Hz, CH2 O), 4,11-4,05 (t, J = 4.4 Hz, CH 2 O), 2,47-2,41 (t, J = 4.9 Hz, COCH2), 2,31-2,25 (m, COCH2), 2,07-1,02 (m, CH2 , CH3), 1,05-1,03 (s, CH2, CH3), 0.96-0.92 (d, J = 3.3 Hz, CH2, CH3), 0,91-0,87 (dd, J = 1.9 Hz, = 1.8 Hz, CH3), ve 0,71-0,68 (s, CH3). FT-IR (1 / λ [cm-1]): 3.260 (s), 2.920 (s), 1.710 (s), 1.460 (s), 1.370 (s), 1.240 (m), 1.190 (s), 733 (s) ve 668 (ler).

2,2-Bis (1-kaprolakton-4-il) propan (Çapraz Bağlayıcı BCP) 6. sentezi (Gao ve ark., 27 ve Albertsson ve arkadaşlarına göre. 31)

  1. yuvarlak tabanlı bir şişe içinde, 2-bis (4-hidroksi-sikloheksil) propan ve asetik asit 52 mL, 10.8 g ihtiva eden bir solüsyon hazırlanır.
  2. asetik asit ve 50 mL damıtılmış su 8 mL krom trioksit 11 g ihtiva eden bir çözelti hazırlayın. A, örneğin 17 ve 20 ° C arasında (karışım sıcaklığı muhafaza ederken, aşama 6.1'de hazırlanan çözeltiye Bu çözeltiye damla damla ilave edilirsu banyosu); Bu damla damla işlemi 2 saat sürer. İşlem tamamlandıktan sonra, çözelti, yaklaşık 30 dakika boyunca karışmaya bırakın.
  3. 2-propanol, 50 mL ekleyin. Gece boyunca oda sıcaklığında çözelti karıştırılır.
  4. 137 mbar ve 40 ° C'da bir döner buharlaştırıcı kullanılarak düşük basınç altında koyu mor bir çözelti konsantre edilir. çökeltilmesi için damıtılmış su 300 mL; çökelti mor ışık olmalıdır.
  5. Bir sınıf 415 kağıt filtre kullanılarak ham ürün filtre. damıtılmış su ~ 250 mL 'si ile veya beyaz katı hale gelene kadar katı madde yıkanır.
  6. 40 ° C'de 15 mL benzen, katı maddeyi çözündürülür ve 25 ° C'de yeniden kristalize sağlar.
  7. kuru diklorometan ve şişeye 75 mL diklorometan içinde 3-kloroperbenzoik asit 6.0 g ihtiva eden bir çözelti içerisinde çözündürüldü, kuru diketon 8.34 g ekleyin.
  8. 24 saat boyunca 40 ° C'de çözelti, geri akış.
  9. M çökeltmek için 10 dakika boyunca -20 ° C'ye Reaksiyon karışımını soğutun -klorobenzoik asit yan ürünü.
  10. (Bir kağıt filtre kullanılarak) süzme ile m-klorobenzoik asidin çıkarılması ve indirgenmiş basınç altında çözelti konsantre edilir.
  11. 2-heptanon, 200 mL 'si ile viskoz ham ürün yıkanır ve gece boyunca 50 ° C'de vakum altında bir çökelti kurutulur.
  12. Aşağıdaki 1H NMR ve FT-IR zirveleri kullanılarak sentez izleyin. 1H NMR (400 MHz, CDCI3, δ [ppm]): 4,42-4,37 (dd, J = 14.2, 7.4 Hz, 2H, CH 2 OC = O), 4,21-4,15 (t, 2 H, J = 11.3 Hz, CH 2 OC = O), 2,80-2,75 (ddt, J = 14.3, 6.5, 1.6 Hz, 2H, CH CH2COO), 2,63-2,57 (tt, J = 13.3, 2.1 Hz, 2H, CH CH2COO), 2,04-1,93 (m, 4H, C H2 CH2OC = O), 1,70-1,56 (m, 4H, C H2 CH CH2COO), 1,48-1,38 (m, 2H, - Cı, H, C (CH3) 2), ve 0.84 (s, 6H, CH3 = C-).

Heksametilen diizosiyanat (HDI), ya da 2,2-bis (1-kaprolakton-4-il) propan (BCP) 27 birini kullanarak gözenekli 3D Elastomer yapı iskelesinin 7. oluşturulması çapraz bağlayıcılar (Gao göre ve ark. 27) olarak

  1. üç kollu bir elastomer HDI 0.25 mL (veya BCP 0.45 mL) ilave edilerek SBC-αCLC 0.75 g kullanılarak karışımını ve damıtılmış ε-kaprolakton monomer 0.24 mL hazırlayın. Sn (Ekim) 2 60 mcL ekleyin. (Bu adım 2 saat kadar sürebilir) kullanılarak HDI BCP kullanılıyorsa, bir vorteks ile SBC-αCLC ve BCP karıştırmak ve BCP tamamen erir ve çözülene kadar 140 ° C'de bir fırında yerleştirin. BCP çözülmüş edildikten sonra, Sn (Ekim) 2 ve girdap fırının dışına çıkarmak ve.
  2. 1 x 4 cm bir metal parça kesilerek bir "gözden çıkarılabilir" nikel köpüğü şablonu hazırla. Son rulo 1 x 1 sm metal parça civarında olduğu kadar kısa bir ucundan rulo (bakınız Şekil 4).
  3. tamamen 2 dakika için köpük kapsayacak şekilde aşama 7.1 'da hazırlanan karışımın, bir cam şişe ya da alüminyum folyo paketi nikel köpüğü koyun ve dökün. Pasteur pipetiyle fazla karışım çıkarın. 80 ° C de bir gece boyunca fırında bırakın.
  4. alüminyum folyo soyun ya da cam kırmak. Bir traş makinesi bıçak kullanarak, nikel metali ortaya çıkarmak için, metal köpük çevresinde elastomer tıraş.
  5. 1 M, demir (III) klorit (FeCl3) 100 mL su içinde bir çözelti hazırlayın. Bir şişe içinde bir köpük yerleştirin ve FeCl3 çözeltisi 70 ml. Oda sıcaklığında üç gün karıştırınız ve her gün FeCl3 çözeltisi değiştirin. Her bir değişiklikten önce, 0.5 saat boyunca iyonize su ile köpük karıştırın.
    NOT: Aşındırma işlemi üç gün sonra tamamlanır. köpükler yumuşak hissedene kadar dağlama işlemi tamamlandıktan emin olmak için, dokunsal sıkıştırma testleri. dokunsal sıkıştırma testlerine Köpük direnci artık metal şablon varlığını gösterir.
  6. ELAST durulayınfırını içinde gece boyunca 40 ° C'da bir vakum içinde etanol ve yer ile omer köpük.
  7. Tarama elektron mikroskobu (SEM), diferansiyel tarama kalorimetrisi (DSC), mekanik sıkıştırma testi ve termal gravimetrik analiz (TGA) 27 kullanılarak malzeme karakterize eder.
    Not: daha hidrofilik bir 3D LCE hazırlamak için, YİM aşama 7.5'de tarif edilen adımları aşağıdaki gibidir (LBC de LC parçasını ihtiva eden emin) ile SBC değiştirin.

Steril Teknikleri Kullanarak 8. SH-SY5Y Nöroblastom Hücreleri ile Elastomer Scaffold tohumlama ve Kültür

  1. % 70, 1 mL etanol ile iki kere yıkayarak elastomer sterilize edin. 10 dakika boyunca UV-ışını gerçekleştirin ve% 70 etanolün 1 mL'si ile yıkayın. steril su, 1 mL ve fosfat tamponlu tuzlu su, 1 mL (PBS) ile iki kere yıkayın. 24 oyuklu kültür plakaları içinde elastomerleri yerleştirin.
  2. % 90 Dulbecco Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı (DMEM) bağlı ek içeren SH-SY5Y hücre büyüme ortamı hazırlamak% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 Penisilin-Streptomisin (LTR yükseltici) durumunda ile şubenin kiralama işlemi.
  3. Bir hematositometre kullanılarak hücrelerin sayılmasından sonra büyüme ortamı 100 uL (tohum çözelti) içinde süspansiyon haline getirilmiş, 1.5 x 10 5 SH-SY5Y hücreleri hazırlamak. Bir damla oluşturmak için emin olun, elastomerler üstünde çözümünü ekleyin.
  4. Hücre yapışmasını desteklemek için 2 saat boyunca 37 ° C'de ve% 5 CO2 tohumlanmış elastomerleri inkübe edin. Büyüme ortamı, 0.5 mL ekleyin. % 5 CO2 ile 37 ° C 'de daha inkübe edin.
  5. 1 mL PBS ile yıkandıktan sonra ortam her iki günde bir değiştirin.

Elastomer Construct 9. Mikroskopik Görüntüleme

  1. 15 dakika boyunca PBS içinde% 4 paraformaldehid (PFA) ile elastomerler üzerinde büyütülmüş hücreler sabitleyin. Her biri 5 dakika boyunca PBS üç kez 3 mL ile yıkayın ve ekli bir lamel ile bir kültür kabı içinde sabit hücreleri ile elastomer yerleştirin.
    Dikkat: PFA toksiktir. uygun kişisel koruyucu giysiler (KKE) giyin.
  2. Stave 10 dakika boyunca 500 ul PBS içinde 4' , 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI),% 0.1 ile sabit örnekleri 5 dakika boyunca iki kez 1 mL PBS ile yıkayın.
  3. örnek kapsayan görüntü yığınları elde DAPI floresan ile konfokal mikroskopi kullanılarak hemen görüntü elastomerler.
    NOT: Burada görüntü yığınları bir 20X objektif ve 60X objektif kullanılarak elde edildi.
  4. ImageJ 32 kullanan optik konfokal görüntü yığınları analiz edin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu rapor, bir nikel şablonu kullanılarak hücre kültürü için bir iskele olarak gözenekli bir 3D LCE hazırlanması yöntemini göstermektedir. Elde edilen 3D LCE kolay bir hücre infiltrasyonu sağlar kompleks birbirine kanal ağı, hem de daha uygun bir kütle transferini 27 göstermektedir. Bu hücreler, tam olarak birbirine bağlanmış kanal ağ nüfuz edebilmek ve aynı zamanda LCE içinde hizalamak için mümkün olduğu bulunmuştur. Burada, bir metal, nikel bir köpük (% 99 Ni, 86...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sıvı kristal elastomerler son zamanlarda nedeniyle uyaranlar tepki için biyouyumlu hücre yapı iskeleti olarak incelenmiştir. Bunlar hücre yapı iskeleti olarak ideal bir platform olduğu kanıtlanmıştır. Ancak, hazırlama ve yeni bir LCE iskele tasarlarken akılda tutulması gereken önemli bir faktördür gözeneklilik olduğunu. Sızabilir katı 23 ya da gazların dahil, her zaman homojen gözenekli ya da tamamen birbirine gözenekler ile sonuçlanmaz. kazınmış edilebilir bir metal şablonun kullanılması, hem da...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu projenin mali destek için - Yazarlar Kent State University (ReMedIKS Kent State Rejeneratif Tıp Girişimi ortak araştırma hibe ve destek) teşekkür etmek istiyorum.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1H, 1H, 2H, 2H-perflorooktiltrietoksisilanAlfa AesarL16606Silanize edici ajan
2-bis (4-hidroksi-sikloheksil) propanTCIB0928Reaktif
2-kloroheksanon ve nbsp;Alfa AesarA18613Reaktif
2-heptanon Sigma AldrichW254401Solvent
2-propanol Sigma Aldrich278475Çözücü
3-kloroperbenzoik asit, m-CPBASigma Aldrich273031Reaktif
4-dimetilaminopiridinAlfa AesarA13016Reaktif
4 ', 6-diamidino-2-fenilindol, DAPI ve nbsp;InvitrogenD1306Nükleer Leke
5-heksinoik asit & nbsp;Alfa AesarB25132-06Reaktif
Asetik asitVWR36289Solvent
AsetonSigma Aldrich34850Solvent
Alkol 200 geçirmez ACS Sınıfı VWR71001-866Reaktif
BenzenAlfa AesarAA33290Çözücü
ve epsilon; -kaprolakton ve nbsp;Alfa AesarA10299-0EReaktif
KloroformVWRBDH1109Çözücü
KolesterolSigma AldrichC8503Reaktif
Krom(VI) oksitSigma Aldrich232653Reaktif
Bakır(I) iyodürStrem Kimyasalları100211-060Reaktif
D, L-Laktid Alfa AesarL09026Reaktif
DiklorometanSigma Aldrich320269Çözücü
Dietil eter ve nbsp;Emd MilliporeEX0190Çözücü
N, N-DimetilformamidSigma Aldrich270547Çözücü
Dulbecco' s modifiye edilmiş Eagle medium, DEME CORNING Cellgo10-013Hücre
Ortamı EtanolAlfa Aesar33361Solvent
Formaldehit SIGMA Life ScienceF8775Fiksatif
Fetal sığır serumu, FBS HyCloneSH30071.01Medya Bileşeni
Filtre kağıdı, Sınıf 415, kalitatif, krepVWR28320Filtrasyon
GliserolSigma AldrichG5516Merkezi düğüm (3 kollu)
Heksametilen diizosiyanat, HDISigma Aldrich52649Çapraz Bağlayıcı
Demir (III) klorür ve nbsp;Alfa Aesar12357Aşındırma maddesi
İzopropil alkolVWRBDH1133Çözücü
MetanolAlfa AesarL13255Çözücü
N, N'< / em>-disikloheksilkarbodiimidAldrichD80002Çözücü
N, N< / em>-DimetilformamidSigma Aldrich270547Çözücü
Nikel metal şablonAmerikan ElemanlarıNi-860Köpük şablonu
Nöroblastom hücreleri (SH-SY5Y)ATCCCRL-2266Hücre hattı
Penisilin streptomisin ve nbsp;Thermo SCIENTIFIC15140122Antibiyotikler
Polietilen glikol 2000, PEGAlfa AesarB22181Reaktif
Sodyum azid ve nbsp;VWR97064-646Reaktif
Sodyum bikarbonatAMRESCO865Kurutma tuzu
Sodyum klorürBDHBDH9286Kurutma tuzu
Sodyum fosfat dibazik heptahidratFisher ScientificS-374Kurutma tuzu
Sodyum fosfat monobazik monohidratSigma AldrichS9638Kurutma tuzu
Sodyum sülfatSigma Aldrich239313Kurutma tuzu
TetrahidrofuranAlfa Aesar41819Çözücü
Tiyosülfat de sodyumAMRESCO393Kurutma tuzu
Kalay(II) 2-etilheksanoatAldrichS3252Reaktif
ToluenAlfa Aesar22903Çözücü
TrietilaminSigma Aldrich471283Reaktif
TripsinHyCloneSH30042.01Hücre Ayrılması
Olympus FV1000

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Khor, E., Lim, L. Y. Implantable applications of chitin and chitosan. Biomaterials. 24 (13), 2339-2349 (2003).
  2. Chung, H. J., Park, T. G. Surface engineered and drug releasing pre-fabricated scaffolds for tissue engineering. Adv. Drug Deliv. Rev. 59 (4-5), 249-262 (2007).
  3. Yakacki, C. M., Gall, K. Shape-Memory Polymers for Biomedical Applications. Shape-Memory Polymers. 226, 147-175 (2010).
  4. Agrawal, A., et al. Stimuli-responsive liquid crystal elastomers for dynamic cell culture. J. of Mat. Res. 30 (4), 453-462 (2015).
  5. Agrawal, A., Yun, T. H., Pesek, S. L., Chapman, W. G., Verduzco, R. Shape-responsive liquid crystal elastomer bilayers. Soft Matter. 10 (9), 1411-1415 (2014).
  6. Sharma, A., et al. Biodegradable and Porous Liquid Crystal Elastomer Scaffolds for Spatial Cell Cultures. Macromol. Biosci. 15 (2), 200-214 (2015).
  7. Yakacki, C. M., et al. Tailorable and programmable liquid-crystalline elastomers using a two-stage thiol-acrylate reaction. RSC Adv. 5 (25), 18997-19001 (2015).
  8. deGennes, P. G., Hebert, M., Kant, R. Artificial muscles based on nematic gels. Macromolecular Symposia. 113, 39-49 (1997).
  9. Fleischmann, E. -K., Zentel, R. Liquid-Crystalline Ordering as a Concept in Materials Science: From Semiconductors to Stimuli-Responsive Devices. Angew. Chem. Int. Ed. 52 (34), 8810-8827 (2013).
  10. Finkelmann, H., Kim, S. T., Munoz, A., Palffy-Muhoray, P., Taheri, B. Tunable mirrorless lasing in cholesteric liquid crystalline elastomers. Adv. Mater. 13 (14), 1069-1072 (2001).
  11. Artal, C., et al. SHG characterization of different polar materials obtained by in situ photopolymerization. Macromolecules. 34 (12), 4244-4255 (2001).
  12. Camacho-Lopez, M., Finkelmann, H., Palffy-Muhoray, P., Shelley, M. Fast liquid-crystal elastomer swims into the dark. Nat. Mater. 3 (5), 307-310 (2004).
  13. Yamada, M., et al. Photomobile polymer materials: Towards light-driven plastic motors. Angew. Chem. Int. Ed. 47 (27), 4986-4988 (2008).
  14. Ohm, C., Brehmer, M., Zentel, R. Liquid Crystalline Elastomers as Actuators and Sensors. Adv. Mater. 22 (31), 3366-3387 (2010).
  15. Fleischmann, E. -K., et al. One-piece micropumps from liquid crystalline core-shell particles. Nat. Commun. 3, (2012).
  16. Herzer, N., et al. Printable Optical Sensors Based on H-Bonded Supramolecular Cholesteric Liquid Crystal Networks. J. Am. Chem. Soc. 134 (18), 7608-7611 (2012).
  17. Lockwood, N. A., et al. Thermotropic liquid crystals as substrates for imaging the reorganization of matrigel by human embryonic stem cells. Adv. Funct. Mater. 16 (5), 618-624 (2006).
  18. Sharma, A., et al. Effects of structural variations on the cellular response and mechanical properties of biocompatible, biodegradable, and porous smectic liquid crystal elastomers. Macromol. Biosci. , In press (2016).
  19. Bera, T., et al. Liquid Crystal Elastomer Microspheres as Three-Dimensional Cell Scaffolds Supporting the Attachment and Proliferation of Myoblasts. ACS Appl. Mater. Interfaces. 7 (26), 14528-14535 (2015).
  20. Bera, T., Malcuit, C., Clements, R. J., Hegmann, E. Role of Surfactant during Microemulsion Photopolymerization for the Creation of Three-Dimensional Liquid Crystal Elastomer Microsphere Spatial Cell Scaffolds. Front. Mater. 3 (31), (2016).
  21. McKee, C. T., Last, J. A., Russell, P., Murphy, C. J. Indentation Versus Tensile Measurements of Young's Modulus for Soft Biological Tissues. Tissue Eng. Part B Rev. 17 (3), 155-164 (2011).
  22. Kung, C. -C., et al. Preparation and characterization of three dimensional graphene foam supported platinum-ruthenium bimetallic nanocatalysts for hydrogen peroxide based electrochemical biosensors. Biosens. Bioelectron. 52, 1-7 (2014).
  23. Amsden, B. Curable, biodegradable elastomers: emerging biomaterials for drug delivery and tissue engineering. Soft Matter. 3 (11), 1335-1348 (2007).
  24. Sinturel, C., Vayer, M., Morris, M., Hillmyer, M. A. Solvent Vapor Annealing of Block Polymer Thin Films. Macromolecules. 46 (14), 5399-5415 (2013).
  25. Riboldi, S. A., et al. Skeletal myogenesis on highly orientated microfibrous polyesterurethane scaffolds. J. Biomed. Mater. Res. A. 84 (4), 1094-1101 (2008).
  26. Chung, S., Moghe, A. K., Montero, G. A., Kim, S. H., King, M. W. Nanofibrous scaffolds electrospun from elastomeric biodegradable poly(L-lactide-co-epsilon-caprolactone) copolymer. Biomed. Mater. 4 (1), 9(2009).
  27. Gao, Y. X., et al. Biocompatible 3D Liquid Crystal Elastomer Cell Scaffolds and Foams with Primary and Secondary Porous Architecture. ACS Macro Lett. 5 (1), 14-19 (2016).
  28. Lenoir, S., et al. Ring-opening polymerization of alpha-chloro-is an element of-caprolactone and chemical modification of poly(alpha-chloro-is an element of-caprolactone) by atom transfer radical processes. Macromolecules. 37 (11), 4055-4061 (2004).
  29. Younes, H. M., Bravo-Grimaldo, E., Amsden, B. G. Synthesis, characterization and in vitro degradation of a biodegradable elastomer. Biomaterials. 25 (22), 5261-5269 (2004).
  30. Donaldson, T., Henderson, P. A., Achard, M. F., Imrie, C. T. Chiral liquid crystal tetramers. J. Mater. Chem. 21 (29), 10935-10941 (2011).
  31. Palmgren, R., Karlsson, S., Albertsson, A. C. Synthesis of degradable crosslinked polymers based on 1,5-dioxepan-2-one and crosslinker of bis-epsilon-caprolactone type. J. Pol. Sci. A Polym. Chem. 35 (9), 1635-1649 (1997).
  32. Rasband, W. S. ImageJ. , National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, USA. Available from: http://imagej.nih.gov/ij/ (2015).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Biyouyumlu skele3B H cre K lt rMetal K p k ablonKolesterol Yan ZinciriSmetik A FazK p k benzeri skeleH cre ProliferasyonuKonfokal MikroskopiTaktil S k t rma Testi

İlgili makaleler