Fare Kan Gemilerinin Yüz Yüzey Hazırlığı

Işık mikroskopisi ile yapılan histopatolojik çalışmalar için biyolojik dokuların üç boyutlu parçaları düzenli olarak parafin yerleştirilmesi için işlenir ve bunu bölümleme ve boyama izler. Parafinle gömülmüş olan bir doku örneği üç boyutta da birkaç milimetre olabilir. Bununla birlikte, ışık mikroskopisi amacıyla, ışığın geçebileceği ve daha sonra ince bölümün görüntüleme için yeterli kontrast sağlayacak şekilde lekelenmesi için ilk kesit verilmelidir. Kesit örnekleri genelde kalınlığı 5-10 μm olduğundan, her seferinde iki boyutta tüm numunenin çok küçük bir fraksiyonu görülebilir. Sıralı bölümler toplamak ve her bölümü tek tek görüntülemenin ardından 3D görüntülerin bilgisayar destekli yeniden yapılandırılması yapmak mümkündür, ancak bu gerçekten sıkıcı bir iştir. Kan damarlarının histopatolojisi, özellikle ateroskleroz patogenezinin incelenmesi için benzersiz problemler bulunmaktadır. Ateroskleroz gelişen fokalize bir hastalıktırKan akımının bozulduğu yerlerde lokal olarak. Dahası, hastalık, intima içinde, endotel hücrelerinin tek katmanı ve hücre artı matrisinden oluşan ince bir dokuda, büyük arterlerde başlatılır. Bu nedenlerden dolayı, lezyonun kesilmesini kolaylıkla kaçırabileceği için, kesit kan damarları kullanarak erken lezyonları bulmak ve incelemek bir zorluktur. Bir bölüm hastalıklı bir alanı içerse bile, medyada ve adventitide endotel hücreleri ve diğer vasküler duvar hücreleri içeren sadece 5-10 μm'lik bir bölüm göreceksiniz.

Bütün yüzeye monte edilmiş preparatlar (fäs olarak telaffuz edilir) hazırlıkları, aort kökünden genel iliyak arterlere kadar tüm aort gibi kan damarı yüzeyinin geniş bir alanını araştırmamızı sağlar. Spesifik antikorlarla ve diğer spesifik problarla lekelenen böyle bir örneği kullanarak, lezyonların yerini ve aynı zamanda endotel hücrelerinde çeşitli moleküler olayların meydana geldiği noktaları kesin olarak belirleyebilirLokalizasyonu ve proteinlerin post-translasyonel modifikasyonlarındaki değişiklikler gibi aterogenezis. Aterojenezi incelemenin yanı sıra, yüz yüze yapılan preparatlarda gözlemlenen endotel hücre şekli, bölgesel zaman ortalamalı kan akış modelinin bir göstergesi olarak kullanılır. Bu veriler, in situ endotel hücrelerinin mekanik işaretlenmesinin incelenmesi için önemlidir. Bu amaçla, rutin histolojik kesitsel kan damarları yararlı değildir. Dolayısıyla, damar tıbbı ve biyolojisi için, damar yüzeyinin geniş bir alanının yanı sıra teknenin daha derin yüzey altı alanlarını gözlemlemenize olanak sağlayan, kan damarlarının yüz yüze hazırlıkları yapmak için bir teknik edinmek için özellikle önemlidir.

Jelev ve Surchev ¹ tarafından gözden geçirildiğinde, vasküler biyologlar, kan damarlarının yüzeyi gözlemlemek için çeşitli yöntemler geliştirmiştir. Bazı ustaca yöntemler 1940'larda ve 1950'lerde geliştirildi. Bu yöntemleri kullanarak, Kan damarlarının iç yüzeyini çizen endotel hücrelerinin temel organizasyonunu inceleyebilme yeteneği. Bununla birlikte, bu yüzey preparatlarının hazırlanma şekli (Hautchen yöntemi ^{2 , 3 , 4} olarak adlandırılan veya kap yüzeyinden 5 soyulması) ve numunenin lekelenme şekli nedeniyle kesintisiz morfolojik Damar yüzeyinden kan damarı duvarının daha derin bölgelerine bilgi. İmmünofloresan boyayla birleştirilen tüm yüzeye bakan gemi hazırlığı sadece endotel hücresi morfolojisi ve protein ekspresyonu ve lokalizasyonu bu hücrelerde değil, aynı zamanda bu tür çalışmaları damar duvarının subendotel bölgesine de genişletmemizi sağladı. Erken yapılan çalışmalar, immünfüzesensif olarak lekelenmiş kan damarı yüzey preparatlarını kullanarak 1980'li yıllarda ortaya çıkmaya başladı ^{6 ,}F "> 7. Lazer tarama konfokal mikroskobu ve son zamanlarda çok ışıklı mikroskopi ile birlikte, canlı fotosentez lekeli yüz gemi örneklerinde kan damarı duvar yapısının net görüntüleri ve canlı hayvanlardaki vasküler ağ görüntüleri elde edilebilir ^{8 , 9 , 10 , 11.} Bu bilgisayar tabanlı görüntüleme teknikleri odak içi optik kesitli görüntüler oluşturur ve bu görüntüleri bir araya getirerek damar duvarının ve dokulardaki vasküler ağın yeniden yapılandırılmış 3D görüntüsünü elde edebilirsiniz. Yeniden yapılandırılmış görüntünün ^{12 , 13} Z-ekseni boyunca yapılmış bir bölüm görüntüleri üretebilir.

Bu yazıda, immünofloresan boyama için fare aortu ve karotis arterinin yüz preparatlarının hazırlanması için bir yöntem gösterilecektir. Yüzü hazırlıklarBu kaplar deneysel olarak manipüle edildikten sonra bile yapılabilir. Örneğin, bir karotis arteri kısmen bağlanabilir ve daha sonra böyle bir ameliyattan sonra bir yüz hazırlığı yapılabilir. Bu nedenle, bu makalede karotis atardamarında kısmi ligasyon yapmayı da anlatacağız. Sıçanlar, tavşanlar ve insanlar gibi daha büyük hayvanlardan benzer preparatlar yapmakla karşılaştırıldığında, fare kapları boyutları küçüktür ve daha kırılgandır, bu nedenle damarların cerrahi yalıtımı sırasında ele alınması ve antikor boyama ve mikroskopisi için hazırlanması için ek bakım gerektirir. Genetik modifikasyon için en yaygın kullanılan hayvan modeli fare olduğundan, birçok araştırmacı için fare damarlarına zarar vermeksizin onları ele alması kritik hale gelir. Bu yazıda, fare aortu ve karotis atardamarının yüz hazırlıkları yaparken fare kan damarlarının nasıl işleneceğini anlatacağız. Gösterim amacıyla, vahşi tip C57 / b6 fareler kullanacağız.

Fare parsiyel karotid arter ligasyonu ve fare aortu ve karotid arteri izolasyon için izole etme protokolleri, Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi (IBT 2014-9231) tarafından onaylanmıştır.

1. Sol Kısmi Karotid Arter Ligasyonu

1. Masaya 12 inç x 14 inçlik bir ısıtma yastığı yerleştirerek cerrahi alanı hazırlayın ve ped ve masa üstünü büyük, temiz bir cerrahi örtüyle örtün. Bom standının kolunu, stereomikroskopun görüş alanının ısıtma pedinin orta alanında olacak şekilde ayarlayın.
2. Masadaki ısıtma pedini açın ve 3 ayar kontrol düğmesini orta dereceli ısı seviyesine ayarlayın. Bu sıcaklık ayarında, cerrahi yüzeyin yüzeyi (bkz 1.6.1) 38-40 ° C olacaktır.
   1. Temiz bir kafesi başka bir ısıtma yastığı üzerine yerleştirin. Isıtma pedini yukarıdaki gibi açın. Bu kafes ameliyattan sonra iyileşme için kullanılır (bkz. 1.16) ve mahfaza.
   Ameliyat masasında iris makası (1 çifti), doku forsepsi (1 çifti), süper kavrama forsepsi (2 çift), yaylı makas (1 çifti), künt retraktör (1 çift, 2.5 mm genişliğinde) içeren otoklavlanmış bir sterilizasyon kese yerleştirin. , Iğne tutacağı (1), sterilize 6-0 ipek dikiş, pamuk uçlu aplikatörler, mini pamuk uçlu aplikatörler, cerrahi örtüler ve 2 "x 2" gazlı bez süngerleri. Ayrıca,% 70 etanol içeren bir sıkıştırma şişesi yerleştirin ve diğeri cerrahi masaya chlorhexidine cerrahi scrubon yerleştirin.
3. Bir fare tartın. Vücut ağırlığı ameliyattan hemen önce verilecek uygun analjezi miktarını belirlemek için gereklidir.
4. İndüksiyon odasına bir fare yerleştirin.
5. İndüksiyon odasında fare anestezisi için oksijen tankı ve anestetik vaporizer açın. İzofluran seviyesini% 2'de muhafaza edin. Fare hareket etmeden önce 3-5 dakika sürer.
   1. Fare aneste ikenCerrahi bir yüzey oluşturmak için stereomikroskopun altına steril cerrahi örtüyü (24 inç x 24 inç) daha küçük bir parça yerleştirin. Ardından, draje yüzeyinde bir akrilik cerrahi tahtası (% 70 alkol ile temizlenmiş) yerleştirin. Cerrahi kurul, bu nedenle ısıtma yastığı üzerinde olmalı, ancak iki kat cerrahi örtü ile ayrılmalıdır.
6. Fare indüksiyon hücresinde hareket etmeyi bıraktığında fareyi cerrahi öncesi hazırlık alanına aktarın ve burnunu buharlaştırıcıya (% 2 izofluran) bağlı olan burun konisine yerleştirin. Elektrikli düzeltici veya saç temizleyici losyon kullanarak servikal bölge çevresindeki saçları alın. Saç kaldırma losyonunu öneriyoruz çünkü bu yöntem cerrahi alanın tamamen çıkarılması zor gevşek saç parçaları üretmeyecektir.
7. Burun konisi yerinde olduğunda fareyi cerrahi tahtaya getirin.
   1. Sağ ve sol ayak pedallarını cerrahi masaya bantlayın. Her iki arka ayakları da sıkıştırınOrada fare sağ tarafında. Bu, fare gövdesinin hafif bir şekilde dönmesine ve böylece farenin boyun bölgesinin sol tarafının ameliyat için daha iyi konumlandırılmasına neden olur.
8. İnsizyon alanını% 70 alkol, klorheksidin cerrahi fırçalamayla ve tekrar% 70 alkol ile dezenfekte edin. Fare, servikal insizyon bölgesi haricinde sterilize cerrahi bir örtüyle örtün.
9. Fare tamamen parlatılmış olduğunu doğrulayın ve intraperitoneal veya subkütan enjeksiyon yoluyla analjezi (Caprofen 3-5 mg / kg) verin.
10. Diseksiyon mikroskopu altında, neşter veya iris makası kullanarak servikal bölge çevresinde ventral orta hat kesisi yapın.
    NOT: Makas kullanıyoruz, çünkü stereomikroskopun çalışma mesafesi sınırlıdır, bu da bir neşterin kullanılmasını zorlaştırır.
11. Sol karotis arterini (LCCA) bir kenara iterek ve kan damarlarını örten tükürük bezlerini a'nın sol tarafına yerleştirerek maruz bırakınNimal.
12. Cerrahi sahadaki tüm kan damarlarını tanımlayın ( Şekil 1 ). LCCA, sol internal karotid artere (ICA) ve sol harici karotid artere (ECA) bifurkat oluşturur. Yüzeysel tiroid arteri (STA) medialde ECA'dan kaynaklanır. Oksipital arter (OA) genellikle ECA'dan kaynaklanır, ancak bazı farelerde ICA'dan kaynaklanır.
13. Sterilize edilmiş 6-0 ipek dikiş kullanarak OA haricindeki tüm arter dallarını ligate edin. Bunu başarmak için, aşağıdaki iki bağlantıyı yapın.
    1. Sol internal karotid arterin (ICA) çevresindeki ve altındaki bağ dokusunu hafifçe çıkarın. Forseplerle önceden kesilmiş 6-0 ipek sütürden (~ 2.5 cm) bir parça alın ve atardamarın altına geçirin. Başka bir forseps kullanarak, dikişin kabaca 1/3 boyunu çekin ve arteri bağlayın.
    2. Sol dış karotis atardamarının (ECA) çevresindeki bağ dokusunu yukarıda açıklanan şekilde çıkarın ve sol üst tiroya yakın bir ligasyon yapınD arteri (STA) ( Şekil 1 ). Cerrahi alan içerisinde sinir liflerine zarar vermemek için dikkatli olun.
14. Bu ligasyon yapıldığında tükürük bezlerini orijinal pozisyonuna getirin ve 2-3 damla steril salin yerleştirerek cerrahi alanı hidratlayın. 6-0 kaplamalı vicry sütürleri kullanarak cildi kapatın.
15. Ameliyattan sonra, fareyi önceden ısıtılmış kafese yerleştirin (1.2.1'e bakın). Fare 5 dakika içinde uyanmalı ve dolaşmaya başlanmalıdır. Farenin normal bir şekilde davrandığını teyit ettikten sonra kafes hayvan barınak odasına getirilir.
16. Kurtarmanın ilk 3 günü boyunca her gün fare takın. Deney, deney protokolünün gerektirdiği çeşitli koşullar altında gerektirdiği sürece fare tutulabilir. En yüz hazırlıkları ameliyattan sonra herhangi bir zamanda yapılabilir.

2. En Yüz İmmünolojik Boyama

1. Solunum aşırı doz ile CO ₂ ile bir fare Euthanize.
2. Fare, sırtüstü (karın tarafındaki yukarı) bir diseksiyon tahtasına bantlayın.
3. Karın boşluğunu, iris makas kullanarak orta hat insizyonu yaparak maruz bırakın.
4. Kaburgaları göğüs kafesine lateral olarak keserek göğüs boşluğunu açın.
5. Kan boşaltmak için vena kava içine bir leke sokun veya femoral arterden birini kesin.
6. Sol ventrikülün tepesine bir yerçekimi perfüzyon düzeneğine (120 cm su basıncı) tutturulmuş bir 26 G iğne takın ve kan dolaşım sistemini, heparin (40 U / mL) ihtiva eden salin solüsyonu ile saflaştırın. Kesikten akan salin temizleninceye kadar perfüzyona devam edin.
7. PBS (fosfat tamponlu salin) içinde% 4 paraformaldehit içeren fiksasyon solüsyonundan perfüzyon sistemini tuzlu sudan değiştirin ve 5 dakika daha perfüzyona devam edin.
8. Künt uçlu makas ve forseps kullanarak aorta ve sol ve sağ karotis arterlerini toplayın ve buz üzerinde fiksatif içeren 50 mL'lik bir konik tüp içine yerleştirin.
Şekil 2 ).
9. Her gemi, ayrı ayrı 0.5 mL permeabilize edici bir solüsyon (PBS içerisinde% 0.1 Triton X-100) ihtiva eden 12 oyuklu bir plakanın bir oyuğuna ayrı ayrı aktarın. Oda sıcaklığında (RT) sallanarak kan damarlarını 10 dakika boyunca geçirir.
10. PBS ile kısa bir yıkayın.
11. Özgül olmayan antikor bağlanma bölgelerini bloke etmek için, ikincil antikorların yapıldığı hayvan türlerinden% 10 normal serumda kan damarlarını TTBS'de (% 2.5 Tween 20 ile Tris tamponlu salin (TBS)) 30 dakika boyunca RT'de sallanır.
12. Gemileri, bir gece boyunca 4 ° C'de sallanan,% 10 normal serum ile TTBS'de uygun şekilde seyreltilmiş birincil antikorlarla inkübe edin. SeviyeHer bir antikor için seyreltme miktarı belirlenmelidir.
13. Aşağıdaki kontrol lekelerini uygulayın.
    1. Gemileri birincil bir antikor yerine TTBS ile kuluçkalayın ve bunu takiben ikincil bir antikor ile inkübe edin.
    2. Gemileri, birincil antikorların yapıldığı aynı hayvanın (bağışık olmayan) (veya immün öncesi olmadan) serum veya Ig içeren TTBS ile inkübe edin, bunu takiben ikincil bir antikor ile kuluçkalayın.
    3. İkincil bir antikor ile inkubasyonu atlayın. Bu kontrol numuneleri, spesifik antikorlarla boyama yapıldığında aynı şekilde ve aynı zamanda ele alınmalıdır.
14. Kan damarlarını 3 kez TTBS ile 10 dakika boyunca oda sıcaklığında sallanırken yıkayın.
15. Oda sıcaklığında sallanan 1 saat süreyle% 10 normal serum (yukarıda açıklandığı gibi) ile TTBS içinde uygun şekilde seyreltilmiş flüoresan etiketli sekonder antikorlar ile inkübe edin. DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol) ile nükleer boyama, aynı andaBu aşamada, H20 içinde 5 mg / mL DAPI içeren bir DAPI stok solüsyonunun hacimce 1 / 5,000 oranında ilave edilmesi.
16. RT'de sallanan her biri için 3 kez TTBS ile 10 dakika yıkayın.
17. PBS'de kısaca durulayın.
18. Bir damla anti-solma reaktifini bir kapak camına (22 mm x 50 mm) yerleştirin ve endotelin aşağı bakacak şekilde kapak camının üzerine bir kan damlası yerleştirin.
19. Kabarcıkları yakalamaktan kaçınırken, kan damlasına bir slayt camı (22 mm x 75 mm) yerleştirin.
20. Slayt, temiz bir laboratuar silin ( örneğin Kimwipe) üzerine yerleştirin ve slayt laboratuar silin iki parça ile örtün. Yüz kan damarı örneğini düzleştirmek için hafifçe 3.5 kg ağırlığa ( örn . Kalın bir kitapta bir şişe su kullanın) en fazla 5 dakika slayt üzerine koyun.
21. Ağırlığı alın ve lamelin etrafından gelen aşırı çözümü silin.
22. Lambadanın dört köşesine tırnak cilası uygulayın, slaytları bir slayt kutusuna yerleştirin, lamel yüzü yukarı gelecek ve RT'de karanlıkta saklayın.(Veya 4 ° C) gece boyunca. Bu işlem dokuyu daha da düzleştirir ve yüksek büyütmede mikroskopi yapmayı kolaylaştırır.
23. Lamel tamamen oje ile mühürleyin.
24. Tırnak cilası kuruduktan sonra mikroskopla inceleme yapın.
25. Gerekirse, slaytları -20 ° C'de saklayın.

Endotelin tipik bir yüz yüze immünofloresans görüntüsü Şekil 3'te gösterilmektedir. Bu görüntü, interkostal arterin (büyük koyu yumurta biçimli alanın) açılması yakınında alınan fare aortunun tek bir optik bölümünü göstermektedir. Aorta, anti-VE-kadherin (yeşil) ve anti-VCAM-1 (vasküler hücre adezyon molekülü-1) (kırmızı) ile çift boyandı. Her endotel hücre, adherens kavşağında yeşil bir çizgisel lekelenme ile özetlenir. Numunenin ufak düzgünsüzlüğü nedeniyle, bazı adherens kavşakları bu optik bölümün dışındadır. Anti-VCAM-1 boyaması rahatsız edici kan akışının olduğu bilinmeyen interkostal arterin açılmasında daha kuvvetlidir. Şekil 4, anti-VE-kadherin (yeşil), anti-VCAM-1 (kırmızı) ve DAPI (mor) ile karotid arterlerin yüz boyanmasını göstermektedir. Sağ karotis arteri (RCA) dokunulmazken sol karotid arter (LCA) kısmen lige edildi. Gemi örnekleri 1 gün sonra yapıldı. Ameliyat ve lekeli. Bağlanmış damarda artmış anti-VCAM-1 boyanmasına dikkat edin. İmmünofloresan olarak lekelenmiş örnekler çeşitli antikorlarla ilgilenilen proteinlerin ekspresyon seviyelerini, hedef proteinlerin posttranslasyonel modifikasyonlarının derecesini ve tabii ki endotel hücreleri içerisindeki çeşitli proteinlerin ve diğer hücrelerdeki lokalizasyon modellerini araştırmak için kullanılabilir. Damar çeperi 10 , 11 .

Şekil 1 : Fare Servikal Bölgesindeki Ayrıntılı Gem Anatomisi. Solda, disseksiyon öncesi ve sonrası vasküler ağ gösterilmektedir. Tüm arterler sağdaki diyagramda tanımlanmaktadır. Siyah çizgiler bağlamaları belirtmektedir. Ölçek: 1 bölme = 1 mm.Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Şekil 2: Karotid Arterler ve Aortların Yüz Yüzeyindeki Preparatlarına Nasıl Üretildiğini Gösteren Diyagram. Damar duvarı boyunca noktalı çizgiler damarları açmak için yapılacak kesiklikleri göstermektedir. Renkli mikrograflar gerçek yüz hazırlıklarını gösterir. Ölçek: 1 bölme = 1 mm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Şekil 3: Anti-VE-kaderin (Yeşil) ve Anti-VCAM-1 (Kırmızı) ile boyanan endotelin en yüz görüntüsü. Bir interkostal açıklığa yakın endotel hücrelerinin konfokal tek bir optik bölümügösterilen. VCAM-1 ekspresyonunun, kan akışının laminar olmayan damar dallanma noktasında yer alan endotel hücrelerinde arttığını unutmayın. Görüntü 60X (NA 1.4, yağ) objektif lens kullanılarak kaydedildi. Ölçek çubuğu = 20 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Şekil 4: Anti-VE-cadherin (Yeşil), Anti-VCAM-1 (Kırmızı) ve DAPI (Mor) ile Boyanan Sol ve Sağ Karotis Arterlerin En Yüz Görüntüleri. Sol karotis arteri kısmen bağlandı ve sağ karotid bozulmadı. Bu yüz yüze hazırlıklar ameliyattan 24 saat sonra yapılmıştır. Sağlam damarla karşılaştırıldığında bağlanmış tarafta VCAM-1'in artmış ifadesi belirgindir. Bu görüntüler, genel karotid arterlerin çatallanma yakınına çekilmiştir.60X (NA 1.4, yağ) objektif lensli bir lazer tarayıcı konfokal mikroskop kullanarak. Ölçek çubukları = 20 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Yok