Endotel hücreleri kullanarak 3D hücre kültürü ve sigara anticoagulated tam kan antikoagülan ve anti-enflamatuar özellikleri değerlendirilmesi

Özet

Biz bütün, anticoagulated kan çalışma ve koagülasyon analizini sağlayan bir vitro modeli mevcut. Anticoagulation sistemi sağlıklı endotel hücreleri doğal anticoagulation etkisi bağlıdır ve endotel hücre aktivasyonu pıhtılaşma içinde sonuçlanır.

Özet

Vivo, endotel hücreleri kan dolaşan doğal anticoagulation için büyük önem taşımaktadır. Sonuç olarak, endotel hücre aktivasyonu kan pıhtılaşması için yol açar. Bu olay xenotransplantation, dahil olmak üzere önceden biçimlendirilmiş Anti-donör antikorların varlığında organ nakli gibi birçok klinik durumlarda yanı sıra iskemi/reperfüzyon hasarı görülmektedir. Endotel hücre etkisini incelemeye 3R standartları (azaltma, değişim ve arıtma), vitro modellerine göre hayvan deney azaltmak için harekete geçirmek üstünde kan pıhtılaşması son derece cazip olurdu. Ancak, endotel hücre kültürünün ortak Kafesli döşeme sistemleri 1-5 cm² . endotel mL doğal, endotel aracılı anticoagulation için yeterli değil kan başına bir yüzey hacim oranı sağlar. Microcarrier boncuk endotel hücre kültürü çalışmalarının 40-160 cm²/mL için yüzey hacim oranı artabilir. Böylece antikoagülan kullanımı önlenebilir artan bu oran tam kan, "doğal" anticoagulation emin olmak yeterlidir. Burada vitro microcarrier tabanlı bir sistemin tüm, Sigara anticoagulated insan kan pıhtılaşması domuz endotel hücrelerinin genetik değişikliği etkilerini incelemek için tanımlanır. Açıklanan tahlil, birincil domuz aort endotel hücreleri, vahşi türlerinden (WT) veya transgenik insan CD46 ve thrombomodulin, microcarrier boncuk üzerinde yetiştirilen ve taze çekilmiş sigara anticoagulated insan kanı için maruz. Bu modeli ölçüm ve miktar sitokin yayın hem de harekete geçirmek için tamamlayıcı ve kan plazma koagülasyon işaretleri verir. Buna ek olarak, düşsel aktive endotel hücre ve immünglobulin birikimi, tamamlayıcı ve pıhtılaşma proteinleri endothelialized boncuk üzerinde confocal mikroskobu tarafından gerçekleştirilmiştir. Bu tahlil de endotel hücre aktivasyonu ve böylece, koagulasyon önlemek için gereken ilaçlar test etmek için kullanılabilir. Bu tür araştırmalar için kullanılan hayvan sayısını azaltmak için potansiyel üzerine, açıklanan tahlil gerçekleştirmek kolay ve tutarlı bir şekilde tekrarlanabilir.

Giriş

Vasküler endotel kan damarlarının Lümen satır endotel hücreleri (EC) monolayer oluşur. Fizyolojik bir durumda deneniyor EC bir antikoagülan ve anti-inflamatuar çevre bakımı için sorumludur. ¹ bu ifade antikoagülan ve EC yüzeyinde anti-inflamatuar proteinler tarafından aracılık ettiği. Örneğin, EC harekete geçirmek iskemi/reperfüzyon tarafından kaynaklanan yaralanma veya vasküler reddedilmesi (xeno-) nakledilen bir değişiklik endotel yüzeyinden bir antikoagülan ve anti-inflamatuar devlet yanlısı koagulant ve pro-inflamatuar sonuçlarında organları Devlet. ¹

Endotel ve koagülasyon faktörleri, olarak taklit vitro modelleri arasında büyüleyici ve karmaşık etkileşim çalışmaya mümkün olduğunca vivo içinde durum son derece cazip. Geleneksel vitro koagülasyon testleri karakterize yaygın bir sınırlama koagülasyon-aracılı etkileri analiz zorlu kılan anticoagulated kan kullanılır ve citrated tam kan bile recalcification yeniden olamaz sonuçları taze sigara anticoagulated kan ile elde edilebilecek. ² Ayrıca, geleneksel Düz Yataklı hücre kültürü sistemlerinde bu yeterli bir endotel hücre yüzey kan birim başına ulaştı olarak endotel antikoagülan özelliklerini yararlanmak mümkün değildir. Burada sunulan model EC küresel microcarrier boncuk, yüzeyde kültür tarafından bu sınırlamalar üstesinden gelir böylece bir EC yüzey kan oranı > 16 cm²/mL ulaşılabilir, hangi küçük arteriyoller ya da damarlar, durumda benzer ve hangi kan "doğal" anticoagulation izin vermek yeterli olmak EC yüzey tarafından tanımlanmıştır. ^{3 , 4} tam kan olmadan eklenen antikoagülanlar bu ortamda kullanılabilir. Kan örnekleri toplanan deney ve sitokinler, koagülasyon faktörleri sırasında ve çözünür tamamlayıcı aktivasyon belirteçleri algılanır ve sayılabilir. Ayrıca, EC kaplı microcarrier boncuk ifade EC harekete geçirmek işaretleri yanı sıra tamamlayıcı ve immünglobulin ifade tarafından confocal mikroskobu analiz. Başka bir ilginç uygulama endotel hücre aktivasyonu ve böylece, koagulasyon önlemek gerekiyordu uyuşturucu testi içerir. ⁵ her ne kadar bu model tamamen hayvan deney yerini alamaz, belirli fonksiyonel hipotezler ex vivo hücre kullanarak test etmek ve böylece iskemi/reperfüzyon üzerinde temel araştırmalarda kullanılan hayvan sayısını azaltmak için bir yöntem sunar yaralanma ya da (xeno) nakli.

Açıklanan modeli domuz aort endotel hücreleri (PAEC) microcarrier boncuk büyüdü ve tüm, anticoagulated insan kanı ile inkübe ayarlama bir xenotransplantation taklit etmek için kullanıldı. Kompleman sistemi ve/veya thrombomodulin (hTBM) düzenleme koagülasyon sisteminin düzenlenmesi için CD46 gibi birçok insan genleri taşıyan farklı transgenik PAEC onların antikoagülan özelliklerini analiz. Endotel hücre harekete geçirmek, tamamlayıcı ve koagülasyon sistemleri sıkı kontrol ve birbirine bağlı. ⁶ bu nedenle nasıl adezyon molekül ifade ve sitokin yayın, insan kanı maruz kaldıktan sonra farklı transgenik hücreleri davrandığını anlamak önemlidir glycocalyx ve antikoagülan protein kaybı dökülme. ⁷

Protokol

(yabani türü yetiştirilen yerel bir çiftlik ve transgenik yetiştirilmiş Enstitüsü moleküler hayvan ıslahı ve biyoteknoloji, Ludwig Maximilian Üniversitesi, Münih, Almanya) Alman Landrace domuzlar arasında 40 kg, 30 kg ağırlığında, içinde kullanılmıştır Bu çalışmada. Bütün hayvanlar su ve yiyecek ad lib ile standart koşullar altında muhafaza. Tüm hayvan deneyleri İsviçre hayvanları Koruma Kanunu gibi bakım ve kullanım laboratuvar hayvanları için İngiltere'de hayvanları Yasası (bilimsel yordamlar) ve NIH Rehberi uygun olarak yapıldı. Tüm hayvan çalışmaları varış kurallarına uyulması. Kanton veteriner hizmet (Canton, Bern, İsviçre) hayvan deney Komitesi Hayır tüm hayvan yordamları, izin onayladı. BE70/14. Deneysel protokol 3R ilkelerine göre rafine ve state-of--art anestezi ve ağrı yönetimi hayvan sayısını en aza indirmek ve deneyler sırasında stres ve ağrı hayvanların maruz azaltmak için kullanıldı.

kan sağlıklı bireyler tarafından kapalı sistem iz Bern Üniversitesi Hastanesi İsviçre yargı ve etik kurallarına uygun olarak çizilmiş. Ifade " sigara anticoagulated kan " kan ile herhangi bir antikoagülan tedavi değil anlamına gelir.

steril koşullar altında aşağıdaki adımlar gerçekleştirilir. Temel hücre kültür steril tekniği ile aşinalık gereklidir.

1. PAEC yalıtım

Not: torasik aortada kesimleri 6-10 cm euthanized Almanca Landrace domuzlar 3-6 ay yaş (diğer in vivo deneyler için kullanılan) ve hemen elde ulaşım aracını (DMEM + %1 penisilin/streptomisin) içeren bir 500 mL cam şişe içine transfer.

1. 6-şey plaka fibronektin 12,5 µg/mL PBS 1 ile önceden kat x ve 1 h için bir kuluçka-37 ° C'de yer
2. Önceden sıcak steril PBS 1 x ve hücre kültür orta (DMEM).
3. Domuz aort taşıma ortamdan çıkar.
4. Aort polistren bir tabağa yerleştirin.
5. Yavaşça önceden sıcak PBS ile flush.
6. Aort boyuna kesme ve iğnelerle düzeltebilirim.
7. Sıcak hücre kültür orta iç damar yüzeyinde ekleyin.
8. Aspire fibronektin-hücre kültür orta ve taze hücre kültür orta (%10 FBS, % 1 penisilin/streptomisin ve endotel hücre büyüme orta ek Mix % 0,4 ile desteklenmiş DMEM) ekleyin.
9. Hücre kültürü ortamında bir pamuklu çubukla soak. Pamuk yün bud en iç gemi yüzeyi Tarih nazikçe ve yavaşça aynı yönde çubukla.
10. 6-şey plaka bir kuyu hücrelerde yuvarlak yuvarlak tarafından RUB'dir.
11. Aynı şeyi kuyuları geri kalanı için.
12. Kontrol hücreleri mikroskop altında ve kuluçka 37 ° c, % 5 CO ₂ 6-şey tabak yerleştirin.
13. Orta ikinci gün değiştirin ve tekrar 2-3 günde değiştirin.
14. Hücreleri Konfluent olacak, hücreleri trypsinize ve onları T75 şişesi (PAEC P1) tohum.

2. PAEC karakterizasyonu

1. 8-şey chamberslide fibronektin 12,5 µg/mL PBS 1 ile önceden kat x ve 1 h için bir kuluçka-37 ° C'de yer
2. 5 x 10 ⁴ hücreleri/iyi tohum ve gecede 37 kuluçka kuluçkaya ° C.
3. PBS ⁺⁺ (PBS) CaCl ₂ ve MgCl ₂, iki kere hücrelerle yıkama 300 μL/iyi.
4. Tamir hücreleri % 3.7 paraformaldehyde 200 μL/iyi oda sıcaklığında 10 dakika ile.
5. Yıkama hücreleri 3 kez PBS ⁺⁺, 300 μL/iyi.
6. PBS 1 x-3_% BSA (engelleme arabellek) 300 μL eklenir ve oda sıcaklığında 30 dakika bırakılır.
7. Birincil antikorlar (anti-VE-cadherin, anti-CD31, anti-vWF) PBS 1x-1%BSA-0.05% deterjan 160 μL/iyi seyreltilmiş uygulamak ve oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya.
8. PBS ⁺⁺ (200 μL/de) ile 3 kez yıkayın.
9. İkincil antikorlar ve PBS 1x-1%BSA-0.05% deterjan 160 μL/iyi, seyreltilmiş DAPI uygulamak ve oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya.
10. PBS ⁺⁺ (200 μL/de) ile 3 kez yıkayın.
11. Dağ gliserol tabanlı montaj orta ile slaytlar ve endotel hücre işaretleri ifade bir floresan mikroskop altında doğrulayın.
    Not: Kültür domuz kadar % 90 izdiham bir T175 şişesi (DMEM düşük glikoz orta + %10 FBS, % 1 penisilin/streptomisin ve endotel hücre büyüme orta ek Mix % 0,4) aort endotel hücrelerinde ulaşıldığında. (yoğunluğu 1 x 10 ⁶ hücre tohum, % 90 izdiham karşılık yaklaşık 5 x 10 ⁶ hücrelere).

3. Microcarrier boncuk kaplama

1. microcarrier boncuk 7 mL 42 mL 50 mL tüp (100 μg / % 0,2 Asetik asit çözeltilerine seyreltilmiş mL,) kolajen çözeltisi ile karıştırıp oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya.
2. Yıkama boncuk PBS pH 7.4 25 mL ile iki kez (PBS 25 mL ekleyin, karıştırın ile de damlalıklı ve boncuk sonra atma süpernatant ve tekrar düzenlenmiştir kadar bekleyin) ve bir kez DMEM Orta 25 mL.
3. Kapak orta % 10 ile desteklenmiş 199 10mL ile 50 mL tüp boncuk FBS, % 1 penisilin/streptomisin, % 1'l-Glutamine, %0,4 endotel hücre büyüme orta ek mix ve heparin (5000 IU/mL) 25 μL ve denge 10 min için izin daha fazla kullanımdan önce.

4. Hücre toplama

1. hücre kültür orta PAEC içeren T175 balonun kaldır ve PBS pH 7.4 5 mL ekleyin.
2. T175 balonun üzerinden kaldırmak PBS.
3. 5 mL Trypsin-0.05% EDTA de ekleyip 3-4 dk 37 için kuluçkaya ° C.
4. Hücreleri hücre kültür orta 15 mL ile balonun durulama tarafından toplamak ve bir 50 mL tüp süspansiyon transfer.
5. Santrifüj kapasitesi 1200 x g 8 dakika oda sıcaklığında hücreleri, fazla orta kaldırmak ve Pelet hücre kültür orta 5 mL resuspend.

5. Hücreleri karıştırıcı şişesi tohum

1. hücre süspansiyon hücre kültür orta 20 mL ekleyin ve resuspend.
2. 20 mL hücre kültür orta (w/o hücreleri) 500 mL manyetik karıştırıcı şişesi eklemek.
3. Hücreleri yıkanmış microcarrier boncuk 3.3 adımından ekleyip karıştırın dikkatle 25 mL serolojik pipet ile.
4. Boncuk/hücre karışımı manyetik spinner şişeye transfer.
5. 50 mL tüp 10 mL kalan hücreleri toplamak için hücre kültür ortamının ile durulayın.
6. Hücre kültür orta bir ek 85 mL spinner şişesi ekleyin ve kuluçka gecede 37 ° C'de üzerinde bir shaker içine yerleştirin (100 x g, karıştırma aralığı: 3 dk her 45 min).
7. Hücre kültür orta 50 mL ekleyin (Toplam birim 200 mL) ve bir shaker olarak 37 ° C'de ek 24 h için karıştırmaya devam (100 x g, karıştırma aralığı: 3 dk her 45 min).
8. Ekle renksiz RPMI orta (% 10 ile desteklenmiş FBS, % 1 penisilin/streptomisin, % 1'l-Glutamine, %0,4 endotel hücre büyüme orta ek mix ve Heparin 25 μL) toplam hacminin 320 mL ulaşılana kadar.
9. Eski orta her 48 h: kaldırmak 100 mL orta yerine ve taze desteklenmiştir renksiz RPMI 100 mL ekleyin.
10. Hücreleri 5-7 gün boyunca kültür. Zaman cep kaplı boncuk izdiham durumuna bağlıdır.

< p sınıf "jo =ve_title "> 6. İzdiham doğrulama

1. bir pipet kullanarak cep kaplı boncuk 200 μL toplamak ve polipropilen tüp içine aktarmak.
2. 3 kez ile PBS 1 600 μL boncuk yıkama x (PBS, eklemek tüp ve karışımı yavaşça dekolmanı hücrelerin önlemek, boncuk beklemek için sakin, PBS atıp tekrar için eğimli).
3. Parapicric asit 200 μL ekleyerek 10 min için boncuk düzeltmek.
4. Yıkama 3 kez ile PBS 1 600 μL
5. PBS 1 seyreltilmiş DAPI eklemek x ve 10 dk. için kuluçkaya
6. Boncuk cam slayt üzerinde transfer ve gliserol dayalı montaj orta kullanarak bir coverslip uygulamak.
7. Boncuk confocal mikroskop altında görselleştirmek.

7. Deneysel bir işlem

1. 10 mL serolojik pipet ile cep kaplı boncuk (yordamlar steril koşullarda yapılması zorunda değilsiniz) manyetik karıştırıcı balonun üzerinden Kaldır ve 12 mL yuvarlak alt polipropilen tüpler içine aktarmak.
2. Boncuk (yaklaşık 1-2 dk) yerleşmek ve aşırı orta kaldırmak edelim.
3. Tam olarak 2 mL boncuk her tüp içerir kadar tüpler için daha fazla boncuk ekleyin.
4. 5 mL açık RPMI her tüp ve dikkatli bir 10 mL serolojik pipet kullanarak karıştırın.
5. Boncuk yerleşmek ve aşırı orta kaldırmak edelim.
6. RPMI ile bir kez daha çamaşır yordamı yineleyin ve tüm aşırı orta kaldırın.

8. Kuluçka sigara-anticoagulated kan

1. dikkatli ve yavaş bir sağlıklı gönüllü kan ve 9 mL tarafsız polipropilen borular içinde (pıhtı önleyici) toplamak (ne jet ne de vacutainers kullanma).
2. 10 mL serolojik pipet ile kan 8 mL her hücre kaplı boncuk (Toplam birim-ecek var olmak 10 mL) 2 mL içeren polipropilen borular içine yavaş yavaş aktarın. Her zaman kan veya boncuk erken EC etkinleştirme önlemek için kaba işleme kaçının. 1-2 dk. yordamı alır
3. Dikkatli bir şekilde kan/boncuk karışımı eşit karıştırma sağlamak ve parafin film kapaklı mühür eğimli.
4. (Sadece nazik devirme ayarları ile) yatay devirme tablo iç 37 ° C kuluçka ve kayıt kez pıhtılaşma tüpler yerleştirin.
   1. Saati ayarla aralıklarla, örneğin 10, 20, 30, 50, 70, 90 dk, sonra en az 1.5-2 mL serum veya plazma analiz için kan-boncuk karışımı kaldırmak.
      Not: aynı derecede kan örnekleme farklı tüplerde bitmiş 6 saat puan için 3'ten fazla çoğaltır hücreleri, bir grup içinde sahip öneririz.
   2. Koagüle kan serumu koleksiyonu için bırakın. Plazma toplamak için EDTA veya sitrat 2 mL tüpler için kan örnekleri eklemeden önce ekleyin.
   3. Tüpler buza depolamak, santrifüj kapasitesi 2500 x g 4 ° C'de 10 dakika ve serum/plazma 80 ° C'de kullanmak kadar saklamak.
      Not: Tablo malzemeler malzemeler hakkında ayrıntılı bilgi sağlanır

Sonuçlar

Kültür spinner şişeye (şekil 1) 7-10 gün sonra hücreleri microcarrier boncuk (Resim 2) tüm yüzeyini örten Konfluent. Doğrulama confluency devletin önemli bir adım çünkü EC lastikteki üzerinde bir sigara birleşmesi monolayer Pıhtılaşma zamanı kadar belirgin bir azalma götürecek, microcarrier boncuk yüzey şiddetle yanlısı koagulant (pıhtılaşma Zamanı: 4 ± 1 dk) ( Şekil 3).

Tartışma

Burada sunulan model koagülasyon için uygundur ile ilgili çalışmalar koagülasyon ve EC ile etkileşimi farklı yönlerini analiz izin ⁸ xenotransplantation araştırma, insan kanı ⁹kuluçka sonra farklı genetik olarak değiştirilmiş domuz ECs antikoagülan özelliklerini sınamak için kullanışlı bir sistem olduğunu.

Bu deney başlamadan önce tam hücre kapsama (confluency) lastikteki sağlanması ve bu dikkatli koleksiyonuna ait ve sigara anticoagulated tam ka...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Laboratuvarımızda domuz aortundan izole	PAEC
Mikro taşıyıcı boncuklar (Biosilon)	Thermo Fisher Scientific	160-250
Kollajen I, Sığır	Gibco	A10644-01
DMEM	Gibco	21885-025
Orta 199	Sigma	M7528
RPMI	Gibco	32404-014
Nötr tüpler	Sarstedt	02.1726.001
Polipropilen tüpler	Simport	T406-2A
Karıştırıcı şişeleri	Tecnomara
Biyolojik karıştırıcı	Brouwer	MCS-104S
Sıçan anti CD31	R& D Sistemleri	MAB33871	Seyreltme 1:100
Keçi anti-sıçan IgG-Cy3	Jackson İmmüno Araştırması	112-166-003	Seyreltme 1:500
Keçi anti VE-cadherin	Santa Cruz	sc-6458	Seyreltme 1:100
Tavşan anti vWF	DAKO	A0082	Seyreltme 1:100
Dk anti Gt IgG – Alexa 488	Moleküler Problar	A11055	Seyreltme 1:500
Keçi anti Tavşan - FITC	Southern Biotech	4050-02	Seyreltme 1:500
DAPI	Sigma	32670-25MG-F	Seyreltme 1 ve mikro; g/mL
%0,05 Tripsin-EDTA	Gibco	25300-054
FBS	Gibco	10270-106	Konsantrasyon: Hücre kültürü ortamında %10
Adaptör	Sarstedt	14.1205
Konfokal mikroskop	Carl Zeiss	LSM 710
Görüntü analiz yazılımı	Image J		Ücretsiz olarak şu adresten edinilebilir: https://imagej.net
Endotel Hücre Büyüme Ortamı Takviyesi Mix	PromoCell	C-39216	500 mL DMEM
Penisilin Streptomisin	Gibco	15140-122	Konsantrasyon: hücre kültürü ortamında% 1
L-Glutamin	Gibco	25030-024	Konsantrasyon: Hücre kültürü ortamında% 1
Heparinun natricum	Drossa Pharm AG		Stok konsantrasyonu: 5000 U.I./ mL
Oda kaydırakları	Bioswisstec AG	30108
CaCl2 x 2H2O	Merck	2382.0500
MgCl2 x6 H2O	Merck	1.5833.1000
Tween 20 Axon	Lab AG	9005-64-5
Sığır Serum Albümini (BSA)	Sigma	A7030
Glisejel montaj ortamı	Dako	C0563

edilen içinde 2 mL