Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Grip Hemagglutinin özel antikorlar tarafından indüklenen Fc-aracılı efektör fonksiyonları değerlendirmek için bir yöntem

7.2K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/56256

⸱

23 Şubat 2018

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Graduate School of Biomedical Sciences, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 3Department of Infectious Disease, J. Craig Venter Institute

Bu makalede

Özet

Fc-aracılı efektör fonksiyonları aktivasyonu antikorlar tarafından hedefleyen grip virüsü hemagglutinin ölçmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu tahlil de Fc-aracılı bağışıklık ikna etmek için monoklonal antikorlar veya poliklonal sera diğer viral yüzey glikoproteinlerin hedefleme yeteneklerini değerlendirmek için adapte edilebilir.

Özet

Antikorlar karşı antijen bağlayıcı etki alanları ve Fc-bölgeler ile viral patojenler doğuştan gelen ve edinilmiş bağışıklık yanıtı kaplin çok önemli bir rol oynamaktadır. Burada, biz nasıl belgili tanımlık harekete geçirmek ölçmek için tarif Fc efektör fonksiyonları monoklonal antikorlar grip virüsü hemagglutinin bir etkinleştirme ifade genetiği Jurkat hücre kültürünü kullanımı ile hedefleme tarafından 1 Fc yazın-FcγR. bu yöntemi kullanarak katkı immünglobulin tarafından haiz belirli Fc-FcγR etkileşimlerin bir vitro tahlil kullanarak belirlenebilir.

Giriş

Mevsimsel grip aşısı tarafından sağlanan bağışıklık hemagglutinin reseptör bağlama sitenin hedef antikor varlığı ölçen hemaglütinasyon inhibisyon (hı) tahlil1ile, geleneksel olarak değerlendirildi. Bu HI-aktif antikorlar bağışıklık sterilize görüşmek ama genellikle onların genişliğini koruma, grip virüsü select bir kaç suşları için dokunulmazlık sağlayan dar. Yalıtım ve hemagglutinin (HA) tanımak geniş reaktif monoklonal antikorlar karakterizasyonu evrensel grip aşısı geliştirilmesi ulaşmak içinde2,3,4, önermek 5 , 6 , 7 , 8. bir evrensel grip aşısı önemli amaçlarından biri güçlü antikor yanıtı grip virüsü9,10,11,12 korunmuş bölgelerde doğru ikna etmek için , 13 , 14 , 15 , 16. geniş reaktif antikorları nötralize ve sigara nötralize antikorlar17,18, oluşan bu korunmuş epitopları tanımak için Fc-FcγR etkileşim gerektirecek şekilde gösterilmiş olan en uygun koruma vivo içinde ve vurgulamak Fc-aracılı bağışıklık grip virüsü19,20genel bağışıklık yanıtı için katkı.

Koruma ilişkilendirir enfeksiyon bağışıklık değerlendirirken açısından büyük önem taşıyor. Bu ölçümler bilim adamları ve klinisyenler aşı etkinliği, verilerin önemi ve tedavinin gidişatı tahmin etmek izin verir. Grip virüs bulaşmasına karşı koruma tek kurulan ilişkili hemaglütinasyon inhibisyon tahlil olduğunu. 1:40 titresi hastalık1,21 -riski % 50 azalma ile ilişkili ve küresel HA başında bulunan site Bağlayıcısı reseptör hedefleyerek Aglutinasyon inhibe antikor varlığını yansıtır. Ancak, ayrıca T-hücre yanıt-e doğru-ebilmek var olmak daha iyi ilişkili grip virüs hastalık Yaşlılarda karşı koruma dikkat edilmelidir. İlginçtir, bir rapora neuraminidase inhibisyon aktivitesi dokunulmazlık grip22daha iyi bir tahmin olabileceğini düşündürmektedir. Neyse ki, nötralizasyon veya neuraminidase inhibisyon deneyleri HA sapı veya neuraminidase özel antikorlar ölçebilirsiniz gibi tipik vitro deneyleri. Bu geleneksel vitro deneyleri çoğu ancak, sadece hesaba katmak antikor antijen bağlayıcı bölgenin fonksiyonu ve Fc bölge rolü ölçüyor musunuz. Ayrıca, Fc reseptör nişan vivo içinde yolu ile korumak sigara nötralize antikorlar katkısını değildir tespit edilen17,18. Fc-aracılı bağışıklık antikor aracılı hücre bağımlı sitotoksisite (CCDA) gibi neden antikorlar tarafından tanınan koruma ölçmek için sağlam vitro tahlil gereklidir.

Aşağıda açıklanan yöntemi fare monoklonal antikorlar Fc-aracılı işlevleri kullanılarak bir etkinleştirme ifade genetiği değiştirilmiş Jurkat hücre kültürünü ikna yeteneği değerlendiriyor antikorundan 1 FcR, FcγRIV yazın. FcγR antikor angajman Bu Tetikleyicileri nükleer faktör aktive T-Hücre-aracılı luciferase faaliyet hücre içi sinyal transduces. Tahlil yalıtım ve birincil efektör hücrelerin kültür ve harekete geçirmek-in Fc-aracılı efektör fonksiyonları19,23,24 algılamak için Akış Sitometresi kullanımını gerektiren geleneksel teknikleri üzerinde çeşitli avantajları vardır ,25,26. İlk olarak, burada açıklanan protokol kolayca farklı viral hedefler, FcγRs ve antikor (insan ve fare) farklı türlerden adapte edilebilir. İkinci olarak, değiştirilmiş bir Jurkat hücre kullanımı satır ışıldama ölçme bir plaka okuyucu kullanarak kolayca çözümlenebilir bir geniş format tahlil için bir FcγR bir luciferase muhabir gen aktive T-hücre (NFAT) nükleer faktör altında ile verir ifade. Burada, geleneksel harekete geçirmek birincil efektör hücrelerin NFAT-luciferase indüksiyon antikor angajman bir FcγR Jurkat hücre yüzeyi üzerine yerine kullanılır. Bu 96-şey plaka biçimi tahlil triplicates yedi dilutions-geleneksel yöntemlerle hantal olabilir örnekleri bir dizi ile en çok dört farklı örnekleri ölçümü için izin verir. Deney tasarımı ve veri yorumlanması etkileyebilir bu tahlil ile dikkate alınacak ek noktalar vardır. Viral hedef antikor tanıma amacıyla hücre yüzeyinde ifade gerekir. Bu etkisini azaltmak için hedef antijen (örneğin bir iç viral protein) doğrudan bir plaka yüzeyinde kaplı olması. Ancak, bu henüz ciddi bir şekilde test edilmemiştir. Ayrıca, değiştirilmiş Jurkat hücre kültürünü FcγR etkinleştirme yalnızca bir türü ifade eder ve tüm reseptörleri fizyolojik bir bağlamda birincil hücre satırlarını hızlı iken herhangi bir inhibitör FcγRs ifade değil.

Biz daha önce bu tahlil epitope özgüllük poliklonal bir bağlamda Fc-aracılı efektör fonksiyonları düzenlenmesinde önemli bir rol oynar ve antikor bağımlı Hücre-aracılı yanıt en iyi aktivasyonu iki noktası gerektirir göstermek için kullanılan 27,28başvurun. Burada, biz yeteneği meşgul ve FcγRIV aktive antikorundan etkinleştirmek için SAP özgü monoklonal antikorların değerlendiriyor bir yöntemi açıklanmaktadır. Özel durumlar29,30olmakla birlikte, çok sayıda geniş reaktif antikorlar hemagglutinin antigenically korunmuş sapı bölgenin hedef ve böylece evrensel bir grip gelişiminde önemli bir rol oynamaktadır aşı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu el yazması önceden oluşturulmuş deneyler aşağıdaki Icahn School of Medicine'nın kurumsal kodu etik ve düzenlemeler yapıldı.

1. grip virüsü Hemagglutinin yolu ile Transfection ya da enfeksiyon ifade

Transfection:

  1. Plaka insan embriyonik böbrek (HEK 293T) hücre yoğunluğu 2 x 104 hücreleri/iyi bir beyaz doku kültürü ', 96-şey plaka tedavi ve 37 °C kuluçka (%5 CO2ile) 4 h için oturmak izin.
  2. Transfect 100 içeren hücreleri ng DNA viral hemagglutinin ve transfection reaktif 50 μL toplam hacmi bir kuyu başına 0.2 μL için kodlama.
    Not: Her ikisi de 1 Opti-en az temel medya (MEM) indirimli Serum orta x seyreltilmiş Plazmid ve transfectant reaktif.
  3. Tabak 18 h için % 5 CO2 bir 37 °C kuluçka kuluçka sonra transfection medyayı çıkarın.

2. enfeksiyon

  1. 2 x 104 hücreleri/iyi bir beyaz doku kültürü'yoğunluğu plaka A549 veya Madin Darby köpek böbrek hücreleri 96-şey plaka tedavi ve en az 18 h 37 °C kuluçka %5 CO2için büyür.
  2. 1 seyreltik virüs MEM x ve hücreleri enfeksiyon 3, 1 veya 1 h 37 °C kuluçka %5 CO2için 0,33 çokluğu, bulaştırmak. Toplam hacim 100 μL eşit olmalıdır.
    Not: 10 x MEM MEM çalışma stok virüs seyreltme yukarıda belirtilen için x 1 yapmak için su ile seyreltilmiş.
  3. Enfeksiyon sonra inoculum kaldırın ve 1 100 μL ekleyin MEM tripsin yokluğunda plaka içine x.
  4. 18-24 h 37 °C kuluçka %5 CO2ile enfekte hücreleri büyümek.

3. FcRg/NFAT-aracılı etkinleştirme monoklonal antikorlar veya Sera Luciferase etkinliğinin değerlendirilmesi

  1. İlk olarak, transfected veya enfekte hücre büyüme ortamı tahlil medya (1 %4 (vol/vol) ile desteklenmiş x RPMI 1640 düşük IgG fetal sığır sera) 25 µL ile değiştirin.
  2. Ayrı bir 96-şey tabak içinde dört kat dilutions 30 μg/tahlil medya kullanarak mL başlayan ilgi antikorların gerçekleştirin. Dilutions triplicates içinde gerçekleştirmek ve bir örnek plaka düzen şekil 1A' gösterilmektedir. Bir arka plan kontrol (tahlil arabellek yalnız) yanı sıra antikor (antikor kontrol) dışlayan bir denetim eklemeyi unutmayın.
    Not: her iki 'yok antikor' için ve arka plan kontrolleri, tahlil arabelleği antikor yerine 25 µL ekleyin.
  3. Seri olarak seyreltilmiş antikorların 25 μL adım 3.2 için karşılık gelen kuyu transfected hücreleri veya enfekte hücreleri tabağa aktarın.
  4. Plaka (%5 CO2ile) bir 37 °C kuluçka 15dk için kuluçkaya.
  5. Fare FcgRIV veya insan FcgRIIIa (hücre/iyi 75.000) ifade uygun değiştirilmiş efektör Jurkat hücrenin 25 μL ekleyin. Her biri için Toplam hacim de 75 µL olmalı ve antikor başlangıç son konsantrasyonu 10 µg / (şekil 1B) mL'dir.
    Not: arka plan denetimi için tahlil arabelleği efektör hücreler yerine 25 µL ekleyin. Antikor-bağımlı Hücre-aracılı fagositoz incelemek için değiştirilmiş bir Jurkat hücre insan FcgRIIa ifade kullanılabilir.
  6. Plaka bir 37 ° C kuluçka %5 CO2 ile 6 h için kuluçkaya.
  7. Tezcan ve sıcak luciferase substrat arabellek 37 °C su kullanmadan önce yaklaşık 1 h için.
    Not: luciferase substrat tampon yapmak için liyofilize luciferase tahlil substrat sağlanan tahlil arabelleği yeniden oluşturma. Sulandırılan substrat arabellek-30 °C-10 °C ilâ altı hafta boyunca saklanabilir.
  8. 75 μL/iyi luciferase substrat arabelleği arka plan denetimi dışında bütün wells ekleyin.
  9. Bir luminometer üzerinde okuyun.
  10. Kat indüksiyon ile aşağıdaki denklemi hesaplamak: kat indüksiyon (Induced değeri arka plan değeri) = / (mAb değeri arka plan değeri).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Biz bu gösterdi bir sapı özgü mAb, 6F12, ama değil kafa özgü kafa özgü mAb, PY102, CD107a ve interferon γ19etkinleşmiş tarafından birincil doğal katil hücreler etkinleştirmek başardı. Bir SAP özgü antikor birincil insan NK hücreleri aktive yeteneği modellemek için bir SAP özgü mAb, 6F12, sağlam tarafından fare FcγRIV ifade değiştirilmiş Jurkat hücre etkinleştirebilirsiniz göstermek ~ 14-fold. Öte yandan, kafa özgü mAb, PY102 ve kontrol IgG değil (Şekil 2)

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada açıklanan yöntemi bir HA özel Monoklonal antikor fare FcγRIV meşgul yeteneğini ölçmek kullanıcı sağlar. Hedef antijen, grip virüsü hemagglutinin, hücre yüzeyinde enfeksiyon sonra virüs veya plazmid DNA transfection tarafından ifade edilir. Tahlil daha fazla diğer FcγRs (insan veya fare) ile birlikte farklı yüzey-viral proteinlerin kullanmaya müsait. Ayrıca, biz sera örnekleri antikorlar poliklonal bir bağlamda Fc efektör fonksiyonları (veri) gösterilmez, ikna yeteneği değerlendirmek için adaptif immün yanıt eğitim...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar hiçbir çıkar çatışmaları bildirin.

Teşekkürler

Bu proje kısmen Ulusal Enstitüsü alerji ve enfeksiyon hastalıkları gelen federal fonları ile finanse edilmiştir, Ulusal Sağlık enstitüleri, bölümü sağlık ve insan Hizmetleri, CEIRS altında P01AI097092-04S1 (P.E.L.) sözleşme.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
A549 hücreleri ATCCCCL-185Adenokarsinomik insan alveolar bazal epitel hücreleri
HEK 293T hücreleriATCCCRL-3216İnsan embriyonik böbrek hücreleri
Lipofektamin 2000Yaşam Teknolojileri 11668019Transfeksiyon reaktifi
1X Opti-MEM Azaltılmış Serum OrtamıThermoFisher Scientific51985-034
Beyaz doku kültürü ile tedavi edilmiş 96 oyuklu plakaCorning, Inc. 3917Test plakaları
10X MEMGibco11430-030
Jurkat hücre ifade eden murin FcgRIVPromegaM1201Kit, hücreler, Bio-Glo Luciferaz test sistemi, 1X RPMI ve düşük IgG serumu
içerir İnsan FcgRIIIaPromegaG7010Kiti, hücreleri, Bio-Glo Luciferaz test sistemini, 1X RPMI ve düşük IgG serumunu içerir
İnsan FcgRIIaPromegaG9901hücreler, Bio-Glo Luciferaz test sistemi, 1X RPMI ve düşük IgG serum
Luminometreiçerir BioTekSynergy H1 Çok Modlu okuyucuLüminesans plaka okuyucu
Bio-Glo Luciferase Test SistemiPromegaG7940Luciferaz tahlil tamponu ve lusiferaz tahlil substratı içerir
Madin Darby köpek böbrek hücreleriATCCCCL-34Köpek böbrek hücreleri
Kiti eksprese eden Jurkat hücresi,

Kaynaklar

  1. Hobson, D., Curry, R. L., Beare, A. S., Ward-Gardner, A. The role of serum haemagglutination-inhibiting antibody in protection against challenge infection with influenza A2 and B viruses. J Hygiene. 70 (04), 767-777 (1972).
  2. Throsby, M., et al. Heterosubtypic neutralizing monoclonal antibodies cross-protective against H5N1 and H1N1 recovered from human IgM+ memory B cells. PloS One. 3 (12), e3942(2008).
  3. Ekiert, D. C., et al. Antibody recognition of a highly conserved influenza virus epitope. Science. 324 (5924), 246-251 (2009).
  4. Ekiert, D. C., et al. A Highly Conserved Neutralizing Epitope on Group 2 Influenza A Viruses. Science. 333 (6044), 843-850 (2011).
  5. Tan, G. S., et al. A pan-H1 anti-hemagglutinin monoclonal antibody with potent broad-spectrum efficacy in vivo. J Virol. 86 (11), 6179-6188 (2012).
  6. Tan, G. S., et al. Characterization of a Broadly Neutralizing Monoclonal Antibody That Targets the Fusion Domain of Group 2 Influenza A Virus Hemagglutinin. J Virol. 88 (23), 13580-13592 (2014).
  7. Friesen, R. H. E., et al. A common solution to group 2 influenza virus neutralization. PNAS. 111 (1), 445-450 (2014).
  8. Dreyfus, C., et al. Highly Conserved Protective Epitopes on Influenza B Viruses. Science. 337 (6100), 1343-1348 (2012).
  9. Krammer, F., Palese, P., Steel, J. Advances in Universal Influenza Virus Vaccine Design and Antibody Mediated Therapies Based on Conserved Regions of the Hemagglutinin. Curr Top Microb and Immunol. , Chapter 408 (2014).
  10. Impagliazzo, A., et al. A stable trimeric influenza hemagglutinin stem as a broadly protective immunogen. Science. , (2015).
  11. Nachbagauer, R., Krammer, F. Clinical Microbiology and Infection. Clin Microb Infect. , 1-7 (2017).
  12. Krammer, F. Novel universal influenza virus vaccine approaches. Current opinion in virology. 17, 95(2016).
  13. Steel, J., et al. Influenza virus vaccine based on the conserved hemagglutinin stalk domain. mBio. 1 (1), (2010).
  14. Krammer, F., Pica, N., Hai, R., Margine, I., Palese, P. Chimeric hemagglutinin influenza virus vaccine constructs elicit broadly protective stalk-specific antibodies. J Virol. 87 (12), 6542-6550 (2013).
  15. Krammer, F., Pica, N., Hai, R., Tan, G. S., Palese, P. Hemagglutinin Stalk-Reactive Antibodies Are Boosted following Sequential Infection with Seasonal and Pandemic H1N1 Influenza Virus in Mice. J Virol. 86 (19), 10302-10307 (2012).
  16. Hai, R., et al. Influenza viruses expressing chimeric hemagglutinins: globular head and stalk domains derived from different subtypes. J Virol. 86 (10), 5774-5781 (2012).
  17. Dunand, C. J. H., et al. Both Neutralizing and Non-Neutralizing Human H7N9 Influenza Vaccine-Induced Monoclonal Antibodies Confer Protection. Cell Host and Microbe. 19 (6), 800-813 (2016).
  18. Tan, G. S., et al. Broadly-Reactive Neutralizing and Non-neutralizing Antibodies Directed against the H7 Influenza Virus Hemagglutinin Reveal Divergent Mechanisms of Protection. PLoS Path. 12 (4), e1005578(2016).
  19. DiLillo, D. J., Tan, G. S., Palese, P., Ravetch, J. V. Broadly neutralizing hemagglutinin stalk-specific antibodies require FcγR interactions for protection against influenza virus in vivo. Nat Med. 20 (2), 143-151 (2014).
  20. DiLillo, D. J., Palese, P., Wilson, P. C., Ravetch, J. V. Broadly neutralizing anti-influenza antibodies require Fc receptor engagement for in vivo protection. J Clin Invest. 126 (2), 605-610 (2016).
  21. Potter, C. W., Oxford, J. S. Determinants of immunity to influenza infection in man. Brit Med Bull. 35 (1), 69-75 (1979).
  22. Memoli, M. J., et al. Evaluation of Antihemagglutinin and Antineuraminidase Antibodies as Correlates of Protection in an Influenza A/H1N1 Virus Healthy Human Challenge Model. mBio. 7 (2), e00417(2016).
  23. Jegaskanda, S., et al. Age-associated cross-reactive antibody-dependent cellular cytotoxicity toward 2009 pandemic influenza A virus subtype H1N1. J Infect Dis. 208 (7), 1051-1061 (2013).
  24. Jegaskanda, S., et al. Cross-Reactive Influenza-Specific Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity Antibodies in the Absence of Neutralizing Antibodies. J Immunol. 190 (4), 1837-1848 (2013).
  25. Jegaskanda, S., Wheatley, A. K., Kent, S. J. ScienceDirectAntibody-dependent cellular cytotoxicity and influenza virus. Curr Opin Virol. 22 (C), 89-96 (2017).
  26. Srivastava, V., et al. Identification of Dominant Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity Epitopes on the Hemagglutinin Antigen of Pandemic H1N1 Influenza Virus. J Virol. 87 (10), 5831-5840 (2013).
  27. He, W., et al. Epitope specificity plays a critical role in regulating antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity against influenza A virus. PNAS. 113 (42), 11931-11936 (2016).
  28. Leon, P. E., et al. Optimal activation of Fc-mediated effector functions by influenza virus hemagglutinin antibodies requires two points of contact. PNAS. , 201613225(2016).
  29. Benjamin, E., et al. A Broadly Neutralizing Human Monoclonal Antibody Directed against a Novel Conserved Epitope on the Influenza Virus H3 Hemagglutinin Globular Head. J Virol. 88 (12), 6743-6750 (2014).
  30. Ekiert, D. C., Kashyap, A. K., et al. Cross-neutralization of influenza A viruses mediated by a single antibody loop. Nature. 488 (7417), 526-532 (2013).
  31. He, W., et al. Broadly Neutralizing Anti-Influenza Virus Antibodies: Enhancement of Neutralizing Potency in Polyclonal Mixtures and IgA Backbones. J Virol. 89 (7), 3610(2015).
  32. Kristensen, A. B., et al. Antibody Responses with Fc-Mediated Functions after Vaccination of HIV-Infected Subjects with Trivalent Influenza Vaccine. J Virol. 90 (12), 5724-5734 (2016).
  33. Greenberg, S. B., Criswell, B. S., Six, H. R., Couch, R. B. Lymphocyte cytotoxicity to influenza virus-infected cells. II. Requirement for antibody and non-T lymphocytes. J Immunol (Baltimore, Md. : 1950). 119 (6), 2100-2106 (1977).
  34. Corrales-Aguilar, E., Trilling, M., et al. A novel assay for detecting virus-specific antibodies triggering activation of Fcγ receptors. J Immunol Meth. 387 (1-2), 21-35 (2013).
  35. de Vries, R. D., et al. Influenza virus-specific antibody dependent cellular cytoxicity induced by vaccination or natural infection. Vaccine. 35 (2), 238-247 (2017).
  36. Cheng, Z., et al. Development of a robust reporter-based ADCC assay with frozen, thaw-and-use cells to measure Fc effector function of therapeutic antibodies. J Immunol Meth. 414 (1), 69-81 (2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

nfluenza Hemagl tinin AntikorlarADCC Analiz Y ntemiJurkat Fc Resept r H creleriHemagl tinin Ekspresyon TransfeksiyonuL siferaz Substrat TespitiAntikor Ba ml SitotoksisiteFc Gamma Resept r Aktivasyonun Vitro Ba kl k AnaliziEfekt r H cre Aktivasyonu
Grip Hemagglutinin özel antikorlar tarafından indüklenen Fc-aracılı efektör fonksiyonları değerlendirmek için bir yöntem
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.