Yöntem makalesi

GABA beyin dilimleri içinde uygulanması Puff tarafından indüklenen bütün hücreli akımları

DOI:

10.3791/56387

⸱

12 Ekim 2017

 ,  ,  , 
1School of Psychology, South China Normal University, 2School of Life Sciences, South China Normal University, 3Brain Science Institute, South China Normal University, 4Center for Studies of Psychological Application, South China Normal University, 5Guangdong Key Laboratory of Mental Health and Cognitive Science, South China Normal University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz hangi tarafından farmakolojik reaktifler bütün hücreli yama-kelepçe kayıt sırasında yönetilemez duruma gelir ve başarısı için çok önemli özellikleri çeşitli yönlerini vurgulamak puf tekniğini tanımlamak.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Farmakolojik yönetim yaygın olarak bütün hücreli yama-kelepçe beyin dilimler halinde kayıt yürütmek için kullanılır. Elektrofizyolojik kayıt sırasında uyuşturucu uygulamasının en iyi yöntemlerden birini farmakolojik reaktifler beyin dilimleri nöronal faaliyetleri üzerindeki etkisini incelemek için kullanılan puf tekniğidir. Puff uygulama en büyük avantajı ilaç konsantrasyonu kayıt site çevresinde hızlı, böylece membran reseptörleri duyarsızlaştırma engelleyen artırır olmasıdır. Puff uygulama başarılı kullanımı dikkat için aşağıdaki öğeleri içerir: ilaç konsantrasyonu, puf micropipette, puf micropipette ve kaydedilen nöron ucu ve süresi arasındaki mesafe parametreleri ve puf sürüş basınç (inç kare başına pounds PSI). Bu makalede gama - aminobütirikasit (GABA) bir nöron prefrontal kortikal dilimin üzerine şişirme tarafından indüklenen bütün hücreli akımları kaydetmek için adım adım bir yordam açıklanır. Özellikle, aynı yordamı küçük değişiklikler oluşur ve striatum gibi diğer beyin bölgeleri ve hücre kültürleri gibi farklı ürünleri ile uygulanabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yama-klemp tekniği, nöronlar, elektrik sinyalleri soruşturma için birincil araç 1970'lerde1,2geliştirilmiştir. O nasıl spesifik tedaviler üzerinde bilgi sağlamak bu tekniği önemli bir avantajı olduğunu (örneğin, farmakolojik) nöronal işlevleri veya gerçek zamanlı3kanalları değiştirebilir. Nöronal fonksiyon farmakolojik değerlendirme bütün hücreli bir beyin dilimi kayıt sırasında kaydedilen nöronlar agonistler veya belirli reseptörlerinin antagonistleri gibi ilaçlar uygulamaya gerektirir. Bu yöntem uygulama böylece daha iyi nöronlar4fizyolojik ve patolojik özelliklerini anlamak için önde gelen özel bir ilaç takip meydana gelen nöronal değişiklikler tanımlamasını sağlar. Farmakolojik yönetim ya da perfüzyon5 veya puf6yapılabilir rağmen ikinci üstün bir tekniktir. Özellikle: (i) uygulama hızla puf artar ilaç konsantrasyonu bir seviyeye kaydedilen nöron etrafında öyle ki membran reseptörleri duyarsızlaştırma engellenir; (II) böylece bu nedenle yönetilen kimyasallar beyin dilimleri üzerinde herhangi bir istenmeyen etkileri azaltır banyo çözüm üzerinde küçük etkisi şişirilmiş uyuşturucu hacmi son derece düşüktür; (iii) puf Protokolü olabilir ayarlamak ve kaydedilmiş, deneme çok hassas tekrarlanabilir; yapma (iv) puf uygulama agonistler/antagonistleri, özellikle bu tür reaktifler pahalı veya elde etmek zor olduğu ekonomik kullanımını gösterir.

Burada, Bütün hücreli akımları GABA akut hazırlanan beyin dilimleri, nispeten iyi korunmuş beyin devreleri avantajına sahip bir hazırlık şişirme tarafından indüklenen kayıt üzerinde durulacak. Bu makalede nasıl inhibitör akımları puf kaynaklı7 kuralları açıklanacaktır. Sezyum (Cs+) kullanarak-tabanlı iç çözümler ve nöronlar 0 tutan mV, GABA-puf uyarılmış tanıtacak inhibitör postsinaptik akımları (eIPSCs) uygun teknik ayrıntılarla. Biz gösteriyor ki eIPSC lipopolysaccharide (LPS) enjeksiyon8tarafından indüklenen depresyon bir fare modeli kullanarak GABA puff tarafından uyarılmış genlik, LPS-Injected fareler araç kontrollere göre dilim içinde önemli ölçüde azalır. Bu makalede nasıl nefes tekniği yaygın olarak uygulanabilir herhangi bir kimyasal madde, bileşikleri veya uyuşturucu beyin dilimleri nöronal faaliyetleri üzerindeki etkisini değerlendirmek yönelik çalışmalar için göstermelidir bizim niyeti olduğunu.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hayvan barınma ve tüm hayvan deneyleri Etik Komitesi tarafından Ulusal Enstitüsü kurulan hayvan bakımı için yönergelere göre Güney Çin Normal Üniversitesi'nde hayvan araştırma tarafından onaylanmış prosedürler uyarınca yapılmıştır Sağlık.

1. hazırlık çözümler

  1. hazırlamak 500 mL standart yapay serebrospinal Tablo 1 ' de listelenen gibi bizim eseri 7 ' açıklanan bileşenleri içeren sıvı (ACSF). Taze bir ACSF çözüm hazırlamak için deiyonize su ile
    1. kullanımı temiz cam şişeler. NaCl, KCl, NaH eklemek için kullanmadan önce kuru ve temiz spatula deiyonize su ile 2 PO 4, NaHCO 3, MgSO 4, D-glikoz ve çözüm / % 5 ile % 95'i O 2 bubbled sonra CaCl 2 ekleyin CO 2 ~ 20 dk (olarak ayrıntılı olarak açıklandığı tablo 1) 500 mL deiyonize su karışımı. Tamamen eriyene kadar karıştırın.
    2. Tamamen ACSF olduğunu emin olun herhangi bir yağış temizleyin. Sonra pH 7.2 7.4 için ayarlayın. Kabarcık % 95'i O 2 ve %5 CO 2 ~ 20 dakika süreyle oluşan bir gaz karışımı ile
  2. 250 mL içeren Tablo 2 ' de açıklanan kimyasallar 7 dilim kesme çözeltisi hazırlamak.
    1. KCl, MgCl 2, NaH 2 PO 4, NaHCO 3, choline·Cl, D-glikoz Ekle ve CaCl 2 son 1.1.1, 250 ml deiyonize su gösterildiği gibi ekleyin ve 1.1.1 ve 1.1.2 anlatılan geçiyoruz.
      2. Köpüren sonra % 95'i O 2 / %5
    2. CO 2, kesme çözüm olur, böylece çözüm için 15-20 dk bir dondurucu buz gibi ve kısmen donmuş yerleştirin.
      Not: Biz ne zaman dilimleri 1-2 ay yapım bu kesme çözüm kullanın-eski fareler; formül 2 aydan daha büyük fareler için farklı olabilir.
    3. Steril endotoksin-Alerjik izotonik salin eriterek tarafından hazırlamak LPS çözüm (% 0.9 NaCl). LPS intraperitoneally yönetilen (0.5 mg/kg) ve 2 h sonra kaydını başlatmak.

2. Prefrontal korteks dilim hazırlanması

  1. kesme çözüm dondurucudan almak ve bir rüşvet almak için lunaparkçı. Çözüm buz koyun ve sürekli kabarcık / % 5 ile % 95'i O 2 CO 2.
  2. Büyük, keskin makas kullanarak, hızlı bir fare olarak açıklanan 9 başını kesmek ve hemen kafa ile dolu bir ölçek buz gibi koymak içine (0-4 ° C) kesme çözüm.
  3. Orta çizgi boyunca kafatası tepesine bir burun Kaudal yönde iyi makasla kesme ve yanal kafatası kısımları kaldırmak. Buz gibi soğuk kesme çözüm bir güzel spatula ve damla ile beyin kaldırın.
    Not: Adım 2.2 2.3 hızla yapılmalıdır (ideal olarak < 1dk).
  4. Beyin buz dolu bir 9 cm Petri kapağını yerleştirin. Buz gibi soğuk kesme çözüm beyinle durulayın. Serebellum ve olfaktör ampul bir tıraş bıçağı ile kesti.
  5. Uygula cyanoacrylate tutkal numune için sahibi bir vibratome. Dikkatle tutkal, rostral tarafı yukarı, damla üzerinde beyin blok yer ve hemen buz gibi kesme çözümde bırakın.
  6. Vibratome 15 ° yatay düzlemde referansla açısı için bıçak sahibi ayarlamak ve koronal beyin dilimleri 350 µm hazırlamak (bıçak titreşim frekansı 85 Hz, hız = 0.1 mm/s =).
  7. Bir pipet kullanarak, kurtarma odası dilimlere dolu ACSF ile transfer kuluçkaya 1 sürekli köpüren % 95'i O 2 / %5 ile h (RT) için CO 2.

3. Bütün hücre yama kayıt

  1. yapmak cam borosilikat MİKROPİPETLER için elektrotlar kayıt olarak kullanın veya çektirme işlemi el kitabında MİKROPİPETLER belirli esaslarına göre puf. Elektrotlar kayıt için ipucu Dirençleri aralığında 4-6 M olan Ω, puf MİKROPİPETLER aralığında 2-5 µm uç çapı varken.
  2. Blok hızlı Na + kanal ve böylece aksiyon potansiyelleri, ACSF Na + kanal engelleyici (TTX, 1 µM), ekleme ve Peristaltik Pompa Odası ile 2-3 mL/dk kayıt odasında bu çözümün bir sabit akış hızı sürdürmek ve bunun dışında aspirasyon. ACSF % 95'i O 2 / %5 kabarcık sürekli ve yaşayabilirliği dilimleri sağlamak için CO 2.
  3. Bir beyin dilim kimin iyi ipucu dilim boyutuna sığacak şekilde kesildi değiştirilmiş bir Pasteur pipet kullanarak kayıt odasına aktar. Dilim bir platin dilim çapa ile aralıklı paralel naylon konu ile kapak ≥ dilimi platform üzerinde tutmak için 2 mm ayrı.
  4. Kayıt micropipette iç çözüm 7 ile (Tablo 3) doldurun ve puf MİKROPİPETLER 10 µM, 50 µM ve 100 µM (ACSF içinde çözünmüş) veya araç kontrol olarak ACSF GABA ile doldurmak.
    5. Enkaz ile tıkanma önlemek için
  5. ACSF kayıt elektrot çeker önce 1 mL şırınga kullanarak ışık pozitif basınç uygulayın. Bir micromanipulator (4 x objektif lens), mikroskop altında kullanarak kayıt elektrot ve puf micropipette ipuçları monitör ( şekil 1 A) video görüntüsündeki ortasına görünmesini sağlayacak şekilde getirin.
  6. Yavaş yavaş puf micropipette düşürürken mikroskop odak (40 x objektif lens) ayarlamak ve 45 ° açılı kayıt nöron yukarıda yerleştirin. Puf micropipette ucu ve 20-40 µm ( şekil 1 B) arasında kaydedilen nöron arasındaki mesafe tutun. Yavaş yavaş ve dikkatli bir şekilde kayıt elektrot ile nöron yaklaşım ve pozitif basınç düğmesini bırakın. Zayıf ve kısa emme giga-ohm mühür oluşturmak için elektrot tutucu bağlı boru aracılığıyla uygulamak.
  7. Koru gerilim 0, mV. Giga-ohm mühür oluşumu sonra hızlı için telafi etmek ve kapasite el ile veya otomatik olarak yavaş. Yukarıda belirtilen bütün hücreli moduna almak için boru aracılığıyla kısa ve güçlü bir emici uygulamak.
  8. Kayıt eIPSC gerilim tipi kelepçe içinde modu. Düşük gaz basıncı (azot, 4-6 PSI) tek veya eşleştirilmiş GABA puffs ( Şekil 2) sunmak için bir Master 8 gerilim adım jeneratör tarafından kontrollü bir Picospritzer kullanarak puf micropipette uygulamak.
  9. En iyi eIPSC sonuçları ( şekil 3) elde etmek ve LPS kaynaklı depresyon modeli ( şekil 4) eIPSC ölçmek için puf süresini değiştirmek.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Puff tekniği araştırmacılar uyuşturucu etkisi belirli bir neuron yüzeyinde belirli reseptörleri üzerinde çalışmaya izin verir. Bu makalede, GABA reseptörleri tarafından aracılı akımları odaklanmak. Şekil 1 üfle ve kayıt MİKROPİPETLER gösterir. Fiziksel baskı kaydedilen nöronlar üzerinde herhangi bir etkisi ortadan kaldırmak için puf, ACSF tarafından üretilen ve sukroz puffs (Şekil 2A) denetimleri kullanılır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Puf uygulama postsinaptik reseptör işlevi3,4,7değerlendirmek için yaygın olarak kullanılır, ancak her deney da hassas doğrulukta denetim gerektirir. Biz burada GABA-puf prefrontal kortikal beyin dilimler halinde IPSCs (yani eIPSCs) indüklenen gösteren bütün hücreli yama sıkma, içeren bir açıklayınız. Kayıt elektrot dayanıklılığını yaklaşık 5 MΩ, puf MİKROPİPETLER uç çapı hakkında ise 2-5 µm. Puff arasında 4-6 psi basınçtır: daha...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar aşağıdaki kuruluşlar teşekkür etmek istiyorum: Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Çin (31171018, 31171355), bilim ve teknoloji bölümü, Guangdong (2013KJCX0054), Guangdong Eyaleti, Doğa Bilimleri Vakfı ( 2014A030313418, 2014A030313440) ve Guangzhou bilim ve teknoloji Bürosu (201607010320).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Cam Borosilikat mikropipetlerKepenk AletleriBF150-86-101,50 mm dış çap; 0,86 mm iç çap
MikropipetÇektirme Kepenk AletleriMODEL P-97 Alevli/Kaş Mikropipet Çektirme
MikromanipülatörlerDeklanşör AletleriMP-285
Bilgisayar kontrollü Amplifikatör    Moleküler CihazlarMulticlamp 700B
Dijital Toplama sistemi Moleküler CihazlarDigidata 1440A
Görüntüleme KamerasıNikon 2115001Muayene ekipmanı
Mikroskopi Nikon Tutulma FN1 
Usta 8AMPIMaster-8 Nabız stimülatörü
Vibratom DilimleyiciLeicaVT 1000S
Tıraş bıçağıGillette74-SFLYING EAGLE
Video monitörüPanasonicWV-BM 1410
502 TutkalŞarküteri7146Siyanoakrilat Tutkal
Peristaltik pompaŞangay JIA PENG CorporationBT100-1F
Video KameraOlympus America MedicalOLY-150
Transfer PipetleriBiologix30-0138A1

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).
  2. Sakmann, B., Edwards, F., Konnerth, A., Takahashi, T. Patch clamp techniques used for studying synaptic transmission in slices of mammalian brain. Q J Exp Physiol. 74 (7), 1107-1118 (1989).
  3. Eyo, U. B., et al. Neuronal hyperactivity recruits microglial processes via neuronal NMDA receptors and microglial P2Y12 receptors after status epilepticus. J Neurosci. 34 (32), 10528-10540 (2014).
  4. Dickinson, G. D., Parker, I. Factors determining the recruitment of inositol trisphosphate receptor channels during calcium puffs. Biophys J. 105 (11), 2474-2484 (2013).
  5. Lee, J., et al. Columnar distribution of activity dependent gabaergic depolarization in sensorimotor cortical neurons. Mol Brain. 5, 33(2012).
  6. Glykys, J., Mody, I. The main source of ambient GABA responsible for tonic inhibition in the mouse hippocampus. J Physiol. 582, (Pt 3) 1163-1178 (2007).
  7. Chen, M., et al. APP modulates KCC2 expression and function in hippocampal GABAergic inhibition. Elife. 6, (2017).
  8. Dunn, A. J., Swiergiel, A. H. Effects of interleukin-1 and endotoxin in the forced swim and tail suspension tests in mice. Pharmacol Biochem Behav. 81 (3), 688-693 (2005).
  9. Engel, D. Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons. J Vis Exp. (117), (2016).
  10. Wondolowski, J., Frerking, M. Subunit-dependent postsynaptic expression of kainate receptors on hippocampal interneurons in area CA1. J Neurosci. 29 (2), 563-574 (2009).
  11. Yang, L., Wang, Z., Wang, B., Justice, N. J., Zheng, H. Amyloid precursor protein regulates Cav1.2 L-type calcium channel levels and function to influence GABAergic short-term plasticity. J Neurosci. 29 (50), 15660-15668 (2009).
  12. Huo, Q., et al. Prefrontal Cortical GABAergic Dysfunction Contributes to Aberrant UP-State Duration in APP Knockout Mice. Cereb Cortex. , (2016).
  13. Zhou, W. L., Gao, X. B., Picciotto, M. R. Acetylcholine Acts through Nicotinic Receptors to Enhance the Firing Rate of a Subset of Hypocretin Neurons in the Mouse Hypothalamus through Distinct Presynaptic and Postsynaptic Mechanisms. eNeuro. 2 (1), (2015).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

T m H cre Yama KenetlemeGABA ElektrofizyolojisiBeyin Dilimi Haz rlamaMikropipet Tekni iVoltaj Kenetleme KaydIPSC Ak m l mPrefrontal Korteks DilimiFarmakolojik UygulamaElektrofizyolojik Kay t

İlgili makaleler