Method Article

Multiplexed ayirt analizi ve Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8 miktar+ T hücreleri

DOI:

10.3791/56606

⸱

February 8th, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1PARCC-INSERM U970, Université Paris Descartes, 2INSERM U970, Université Paris Descartes, 3Equipe Labellisée Ligue Contre le Cancer, 4Department of Immunology, Hopital Européen Georges Pompidou, 5Department of Medical Urology, Hopital Européen Georges Pompidou, 6Department of Pathology, Hopital Européen Georges Pompidou, 7Université Paris Diderot Paris 7, 8Department of medical oncology, Hopital Européen Georges Pompidou

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tümör microenvironment eğitim klinik yanıt immünoterapi prognostik veya akýllý biyolojik tespit edebilir. Burada sunulan, bir yöntem situ Floresans spektral analiz ve CD8 otomatik olarak çeşitli altgrupları saymak için görüntüleme üzerinde dayanır+ T hücreleri. Bu tekrarlanabilir ve güvenilir teknik büyük kohort analizi için uygundur.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bağışıklık hücreleri tümör microenvironment önemli bileşenleridir ve karsinojenezis tüm aşamalarında tümör büyüme ve evrimi etkiler. Özellikle, bu şimdi de insan tümörler bağışıklık infiltrat prognoz ve tedaviye yanıt ile ilişkilendirmek kuruldu. Tümör microenvironment bağışıklık infiltrat analizini hastalar ve tedaviye yanıt sınıflandırılması için büyük bir sorun haline gelmiştir.

İnhibitör reseptörler Program hücre ölüm Protein 1 (PD1; olarak da bilinen CD279), sitotoksik T lenfosit ilişkili Protein 4 (CTLA-4), T-hücre immünglobulin ve müsin içeren Protein-3 (Tim-3; olarak da bilinen CD366) ve lenfosit gibi ortak ifade Harekete geçirmek gen 3 (Lag-3; CD223 olarak da bilinir), T hücre tükenme damgasını olduğunu. Tanımlamak ve hücresel düzeyde Bu inhibitör reseptörler ortak ifade ölçmek için boyama multiparametric in situ ayirt geliştirdik. Renal hücreli karsinom (RCC) dondurulmuş dokusunun retrospektif bir dizi üzerinde bir floresan spektral görüntüleme teknolojisi kullanarak bir görüntü analiz yazılımı ile birleştiğinde, CD8 infiltre tümörle PD-1 ve Tim-3 Co o ifade bulundu+ T hücreleri RCC içinde kötü prognoz ile ilişkilidir. Bu çok katmanlı içinde in situ teknoloji otomatik gösteren ilk çalışma bazı klinik önemi olabilir bizim bilgi için bu temsil eder.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Son birkaç yıl içinde immünoterapi kanserlerinin RCC dahil olmak üzere, birçok türleri için çok umut verici bir tedavi olarak ortaya çıkmıştır. Özellikle, inhibitör denetim noktaları inhibisyonu dayalı immünoterapi gibi PD-1 ve klinik olarak etkili1,2,3,4,5, olmak CTLA-4 bildirilmiştir 6. monoklonal antikorlar karşı CTLA-4, PD-1 veya Program ölüm Ligand 1 (PD-L1) zaten çeşitli kanserler içinde onaylanır ve hastalar%720'den fazla uzun süreli klinik yanıt yol açar. Sonuçta, tüm hastalar cevaplama, tedavi maliyeti yüksektir, ve bu tedaviler potansiyel ciddi otoimmün gibi yan etkileri için önde gelen zehirli. Bu nedenle, geçerli meydan bu yeni immunotherapies için akıllı işaretleri belirlemektir. Tümör, PD-L1 ifade veya intratumoral CD8+ T hücre infiltrasyonu ve düzeyde mutasyonların oranı ile klinik yanıt ilişkilendirmek için bildirilmiştir. Ancak, bu ilişki hala bu klinik biyolojik PD-L1 arkadaşı sınava daha önce küçük hücreli dışı akciğer kanseri (NSCLC) hastaların8 Pembrolizumab yönetiminde dışında klinik pratikte kullanılmasını tavsiye için çok zayıftır ,9,1011,12. PD-1, Tim-3, Lag-3 gibi birçok inhibitör reseptörlerinin ortak ifade ve CTLA-4, indükler bir hücre tükenme fenotip ve terapi13,14,15direnç kanıtlanmıştır. Periferik kan tümör microenvironment temsilcisi olmadığına göre bu hücreleri içinde in situfenotipik özellikleri analiz etmek için yüksek ilgi var. PD-1 ve Tim-3 ortak ifade T hücreleri çeşitli bağlamlarda13,16,17işlevsel olarak Engelli hücrelerde olduğu bilinmektedir. Bu çalışmada, iki inhibitör reseptörler PD-1 ortak ifade ve Tim-3 CD8 prognostik etkisini+ T hücreleri değerlendirildi.

Akış Sitometresi Analizi, taze tümörler ve bu nedenle engelleyen retrospektif analizleri üzerinde çalışmak gerekli olduğunun tarafından ortak ifade birden çok işaretçilerinin tümör infiltre lenfositler (TILs) üzerinde çalışmaya kadar şimdiye kadar esas olarak yapıldı. Geleneksel in situ boyama, tek teker teker boyama gerçekleştirilebilir ve işbirliği işaretleyiciler ifade hücre tipi karakterizasyonu mümkün değildir. Örneğin, PD-L1 PD-L1 ifade hangi hücrelerin Bağdaşık çalışmalar için daha uygun olan geleneksel immünhistokimya analizi tarafından tanımlamak üzere birçok hücre türleri tumoral microenvironment tarafından ifade edilir. Bu çalışmada, geliştirdiğimiz bir yenilikçi in situ multiparametric ayirt yöntemi bilgisayar-PD-1 ve Tim-3 ortak ifade CD8 infiltre tümör tarafından ilişkilendirmek için sayma ile+ T-hücreleri RCC klinik sonuçlar ile. Bu teknik bir tek hücre düzeyi ve birden çok işaretçileri sınırlı aralıklarla yakalayabilir bir spektral kamera ile aynı anda analiz imkanı da dahil olmak üzere çeşitli yararları vardır > 10 nm sıvı kristal ile filtreler18. Ayrıca, bu işlem bir arası operatör tekrarlanabilirlik ve el teknikleri19' a göre kısaltılmış bir analiz sağlayan otomatik demek. Kanser alanında çeşitli çalışmalarda Merkel hücreli karsinom, akciğer kanseri ve baş ve boyun kanseri20,21,22, gibi PD-1, PD-L1 ve CD8 bağışıklık moleküllerin birden çok stainings inandırıcı bildirdi 23. otomatik hücre sayısı (fenotipleme adım) kullanıcı tarafından eğitim ile mümkündür. Floresans farklı hücre bölmeleri (nükleuslar, sitoplazma ve membran) ölçülür.

Burada, tümör infiltre-CD8, farklı alt kümelerini+ T hücreleri ifade PD-1 ve/veya Tim-3 RCC büyük bir kohort sayılır ve sonuçları klinik ağırlık puanları ve hayatta kalma parametreleri ile ilişkili. Membran floresan yoğunluğu gibi demek floresan yoğunluğu (MFI) verilerde sitometresi ile hücresel çözünürlükte analiz etmek mümkündü. Bildiğimiz gibi bu bu spektral görüntüleme tabanlı count tekniğin ilk çalışma raporlama prognostik sonuçları kullanarak temsil eder.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada Helsinki Bildirgesi uygun olarak yapılmıştır ve yerel Etik Komitesi tarafından (CPP Ile de France nr. 2012-05 / 04) kabul edildi. Aydınlatılmış onam olan kohort dahil katılımcıdan elde edildi.

1. doku malzeme

  1. RCC doku örnekleri ameliyat günü toplamak. Oda sıcaklığında (patoloji Bölümü) cerrahi numune baş.
  2. Yaklaşık 0.5 cm x 0.5 cm x 0.5 cm boyut kuru bir tüp tümör örnek toplamak. Ek sıvı azot donma ve-80 ° C'de depolayın
  3. En iyi kesim ısı bileşik örneklerinde kat. Örnekleri-20 ° C'de cryostat ile 4-6 µm kalınlığında bölümlere bölüm. 12 h için slaytlar üzerindeki kurutma ve doğrudan kuruma önlemek için-80 ° C'de saklamak örnekleri ver.
  4. Örnek kalitesini Hematoksilen ve Eozin bölüm lekeli görüntüleyerek denetleyin.

2. Situ ayirt TILs boyama

  1. Usul kuralları
    1. Oda sıcaklığında tüm deneysel adımları gerçekleştirin.
    2. Tüm adımlar için Tris tampon tuzlu (TBS; bkz: Malzemeler tablo) ile dilutions gerçekleştirin.
    3. Yıkama TBS içinde sonra birincil antikor kuluçka için tüm adımları gerçekleştirin. İkincisi, Tris tampon tuzlu Tween20 kullanın (TBST, Tablo malzemelerigörmek). Arabellek oluşturma ve sulandırma için ek tablo 1bakın.
    4. Nem odası antikor incubations ve yıkama boyama bir kavanoz için kullanın.
    5. Bölüm işlem sırasında kurumasına izin vermeyin.
  2. Önarıtma
    1. Doku örneği içeren slayt çözülme ve dikkatle slayt örnek bir kağıt havlu ile çevresinde kuru. Doku hidrofobik bariyer kalemle içeren tepki alan sınırlandırmak ( Tablo malzemelerigörmek). Kuru 2 dk için.
    2. Örnekleri % 100 aseton 5 min, 2 dk için kuru için fix ve 10 dakikadır TBS ile yıkayın.
  3. Doygunluk ve abluka
    1. Avidin %0,1 10 min 3 damla ile slaytlarını pretreat, musluk ve/veya fiske avidin dağıtmak ve hava kabarcıkları kaldırıp için biotin %0.01 10 min 3 damla ile tedavi etmek için slayt (bkz. Tablo reçetesi) dokunun ve/veya hafifçe vur. TBS ile yıkayın
    2. Fc reseptörü abluka gerçekleştirin. 100 µL % 5 birim/birim normal serum etiketli ikincil veya üçüncül antikor olarak aynı ana bilgisayar türlerden TBS. kullanım Serumda seyreltilmiş uygulayın (bkz. Tablo reçetesi); Burada, eşek serum kullanıldı. 30 dk için kuluçkaya.
    3. Kuluçka sırasında kısaca anti-CD8, PD-1 ve Tim-3 antikorlar (Tablo reçetesi) spin. TBS birincil antikor karışımı ek tablo 2' de açıklandığı şekilde hazırlayın.
  4. IMMUNO-boyama için CD8, PD-1 ve Tim-3
    1. Birincil antikor karışımı hazırlayın. Malzemeler tablo ve ek tablo 2 kullanılan antikor için başvurun (anti-CD8, PD-1, Tim-3 ve onların karşılık gelen ikincil antikorlar) ve onların konsantrasyonları.
    2. Dokunun ve/veya (2.3.2 basamaktaki) kalan eşek serum hafifçe vur. 100 µL 1s oksijen odasında için olmayan etiketli birincil antikorlar karışımı ile slaytlar kuluçkaya.
    3. Kuluçka sırasında kısaca siyanür 5 Anti-tavşan, AF488-anti-keçi ve biotinylated Anti-fare antikorlar spin ve ek tablo 2' de açıklandığı gibi ikincil antikorlar karışımı hazırlar.
    4. 5 dk. kuru TBST içindeki slaytları slaytlar yıkayın.
    5. 30 dk içinde oksijen odası için ikincil antikorların 100 µL slaytlarla kuluçkaya.
    6. Tersiyer antikor içeren Cy3-streptavidin ek tablo 2' de açıklandığı gibi karışımı hazırlayın.
    7. TBS slaytları 10 dk. kuru için slaytları yıkayın.
    8. 30 dk için Tersiyer antikor karışımı 100 µL slaytlarla kuluçkaya.
    9. TBS slaytları 10 dk. kuru için slaytları yıkayın.
  5. Hücre montaj
    1. Slaytları 4' mount, 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride DAPI-içeren orta (1,5 µg/mL DAPI) ile bir coverslip floresan mikroskopi için uyumlu montaj ( Tablo malzemelerigörmek).
      Not: her deneme için bir negatif kontrol, karşılık gelen antikorlar olarak aynı konsantrasyonu izotip eşlemeli antikorlar ile bir slayt kullanıldı. Bu boyama için fare Igg1, tavşan IgG ve keçi IgG negatif kontrol antikorlar ( Tablo malzemelerigörmek) kullanılır. Pozitif kontrol, biz her deneme için test edilmiş işaretçileri için pozitif olarak bilinen insan hyperplasic bademcik kullanılır. Tipik bir boyama sonuçları (şekil 1) açıklanmıştır. Mono-CD8 boyama, PD-1 ve Tim-3 ayrı ayrı yapılmalıdır (bir slayt boyama) aynı ön arıtma ve DAPI olmadan. Bir slayt aynı deneysel koşullarda herhangi bir antikor ve sadece DAPI montaj orta da yapılmalıdır. Bir slayt aynı deneysel koşullar herhangi bir antikor ve DAPI olmadan kullanarak yansıma.

3. Floresans analizi ve otomatik hücre sayısı

  1. Resim alma otomatik mikroskop ile
    1. Bir iletişim kuralı oluşturun.
      1. Otomatik mikroskop bilgisayar yazılımı ve floresan ışığı açın.
      2. Menü çubuğunda tıklayın "dosya"protokolü, oluşturmak"," seçin "DAPI," "FITC" ve "TRITC."
      3. "İleri", "Doku bölümünde," düğmesini tıklatın ve ","İletişim kuralı adı"Next" A adı, örneğin, "CD8-PD-1-Tim-3," tıkırtı "İleri" ve "Kaydet" seçin
      4. El ile bir slayt sahne alanı üzerine yerleştirin.
      5. Menü çubuğunda tıklayın "Kur"ayarları."" "Ev Z" yeni pencerede'u tıklatın.
      6. Çekim hızı ayarlamak olumlu bir denetimle Yani bir CD8 slayt, PD-1 ve Tim-3 Kişilik lekeli DAPI örnek ile.
      7. Denetimde çubuğunu tıklatın "pozlama ayarlayın."
      8. Yeterli ama değil doyurarak sinyal elde edene kadar her filtre için çekim hızı ayarlayın.
      9. Tek renkli görüntüleme için aşağıdakileri gerçekleştirin:
      10. Satın alma ve 'altında otofokus' DAPI filtre seçin.
      11. "Tarama alanı sınırı içinde", objektif üst slaytın sol üst köşesinde hareket. "Mark"'ı tıklatın. Sağ alt köşede için aynı şeyi.
        Not: Bu adımı düşük güç (LP görüntüleme) 4 X görüntüleme alanının delimitates; dikkat edin de bu yüzden serisi tüm örnekleri çevreleyen olarak işaretleyin.
      12. Imaging yüksek güç (HP), aşağıdakileri gerçekleştirin:
      13. 'Altında otofokus', "DAPI" seçin.
      14. 'Satın alma' grup altında "DAPI", "FITC", "Cy3" ve "Cy5" seçin. "Tamam" düğmesini tıklatın. Menü çubuğunda "iletişim kuralı" tıklayın "Dosya", tıkırtı.
    2. Slaytları tarama.
      1. Protokol "dosya" "load Protokolü menü çubuğundan", tıklatarak yükleyin. "Başlat".
      2. 'Laboratuvar ID' (fotoğraf saklamak için klasör konumunu) girin. Slayt Slayt tanımlamak için kimlik girin. "İleri" yi tıklatın.
      3. "(Parlak alan ışığı altında tüm slayt tarama ve bir 4 x hedefi kullanarak sıralı görüntüleri elde etmek için) tek renkli görüntüleme"'ı tıklatın.
        Not: Bu slayt gri tonlamalı bakış üretir.
      4. "Numune bul" seçeneğini tıklatın. Doku düşük çözünürlükte (4 x) Taranacak alanı seçin: 'Ctrl' tuşunu basılı tutun ve seçmek veya alanları (şekil 2A) seçimini kaldırmak için imleci kullanarak bir alan'ı tıklatın.
      5. "LP Imaging" (4 x görüntüleme) her alan için floresan kırmızı mavi yeşil resim alma tıklatın.
      6. HP alan seçimi için 'Ctrl' tuşunu basılı tutun ve seçmek veya yüksek çözünürlükte (20 x) taranır dokuların alanına karşılık gelen alanların seçimini kaldırmak için imleci kullanarak bir alanı tıklatın. 5 alanları (şekil 2B) seçin.
      7. "HP Imaging" (20 x görüntüleme) her alan (şekil 2C) spektral görüntü alımı için'ı tıklatın.
      8. "Veri Lebid'in başlangıçta sırasında seçilen klasördeki görüntüleri depolamak için depolama"'ni tıklatın.
        Not: İşlemi özetlenen ve Şekil 2' de gösterilmiştir. (Doku algılama, alan seçimi) her adım için bir algoritma artar ve bütün otomatik tarama işlemi kullanıcı tarafından eğitilmiş.
  2. Floresan görüntü analizi ve otomatik hücre eşleşmiş analiz yazılımı ile sayma
    1. Spektral kütüphane oluşturmak.
      1. Görüntü analiz yazılımı açın.
      2. Sol panelde, "kütüphaneler derlenir" açın. 'Yük resmi', altında "Gözat" ı tıklatın ve mono-lekeli bir resim (örneğin, CD8/siyanür 5) seçin.
      3. Fluorophore, (örneğin, siyanür 5) seçin. "Ayıkla"'yı tıklatın. "Kaydet" i tıklayın kütüphanede sakla. "Kaydet" i tıklayın.
      4. PD-1 için aynı işlemi tekrarlayın Tim-3 ve her fluorophore ilgi spektrum entegrasyon için DAPI mono lekeli slaytlar.
        Not: spektral Kütüphane Binası spektrum belirli doku (burada, böbrek) için kullanılan her fluorophore için entegre, ama zaten mevcut "sentetik" kütüphaneleri kullanılabilir. Autofluorescence spektrum kesinlikle göre doku olduğu için bir otomatik Floresans ve spektral Kütüphane her proje gerçekleştirmek önemlidir.
    2. Yeni bir proje oluşturun.
      1. Menü çubuğundan "Dosya", "Yeni projesi"'ı tıklatın. 'Bul özelliğini' sekmesinde "hücre segmentasyon" seçin. "Fenotipleme" 'Fenotipleme' sekmesini seçin. "Oluştur" u tıklayın.
      2. Proje temsilcisi Albümdeki entegre.
        1. 'Dosya' sekmesinde, "açık" resme. 10-30 dizi temsilcisi görüntülerini seçin. Autofluorescence kaldırmak için sigara lekeli slayt ekleyin. Sağ panosunda: select kitaplığı kaynak. Fluorophore seçin ve bu daha önce inşa spektral kitaplığına karşılık gelen seçin.
      3. Doku autofluorescence kaldırmak için "AF" düğmesini ve sonra autofluorescence boş slaytta alanı seçin.
      4. Görüntü tedavi ve kompozit görüntü üretimi.
        1. "Floresan Kütüphane ve kompozit görüntü (şekil 3) oluşturmak için autofluorescence spectra entegre hazırlayın bütün"'ı tıklatın. 'Görünüm Düzenleyicisi' paneli açmak ve görüntülenen verileri seçmek için 'göz' simgesini tıklatın: CD8 işaretleyicileri seçin, PD-1, Tim-3 ve DAPI. Autofluorescence kaldırın. Yazılım tarafından sunulan adımları izleyin.
      5. Hücreleri kesiminde.
        1. Hücrelerde 'Yuvası', segment için "Çekirdek" ve "Zar" seçin. "Çekirdek" sekmesinde, DAPI nükleer counterstain ayarlayın.
        2. 'En büyük ve en küçük boyutu (piksel)' sekmesinde "40" ve "176" minimum ve maksimum boyutları anılan sıraya göre girin. 'En az' sinyal için "0,13" ayarlayın. "Bölünmüş" sekmesinde, "2,60" ayarlayın. "Çekirdek" sekmesinde, "0,81" ayarlayın. "Segmentasyon yardım için membran sinyal kullan" ı seçin.
        3. "Hücreleri ekranın alt kısmında Segment"'ı tıklatın. Çekirdeklerin ayrılmasını ve hücrelerinin denetleyin ve hücrelerin DAPI ve membran Floresans eşleşmezse farklı parametrelerle yeniden deneyin.
          Not: Yazılım ile boyama ve hücre boyutuna göre nükleer DAPI hücreleri tanır. Projeye göre hücre parametreleri (boyut, split, piksel) ayarlayın.
      6. Fenotip hücreleri.
        1. 'Fenotip' sekmesinde "Ekle" seçeneğini tıklatın. Hücre fenotip kategoriler oluşturabilirsiniz: CD8 (mavi nokta) / CD8-PD-1 (kırmızı nokta) / CD8-PD-1-Tim-3 (yeşil nokta) / diğer (siyah nokta) (şekil 4).
        2. Hücreleri her kategorinin 5'ten fazla örnekleri seçin. "Sınıflandırıcısı tren"'ı tıklatın.
          Not: Bu yazılım tarafından istatistiksel sınıflandırma algoritması oluşturur.
        3. "Her hücrenin fenotip elde etmek için fenotip tüm"'ı tıklatın.
          Not: Yazılımın doğruluk güven aralığı (CI) ile bir hücre fenotip verir.
        4. Göz ve otomatik sayı arasındaki fark uyumlu olana yazılım eğitim algoritma geliştirmek (hata < %5). Faiz hücreler için kabul edilebilir bir CI seçin.
          Not: %55 CI kabul edilebilir olarak temelinde eğitim yapmayı tercih etti.
      7. Algoritma ve proje kaydedin.
      8. 'Altında File' "Proje" seçin. Adını koy ve "Kaydet" i tıklayın.
    3. Serisinin toplu iş çözümlemesi gerçekleştirin.
      1. "Analiz toplu" seçin. Projeyi seçin. Analiz için görüntüleri ekleme. Depolama veriler için bir klasör seçin. "Çalıştır" ı tıklatın. Bileşik görüntü kalitesini kontrol edin. Fenotipleme serisi tüm görüntüler için doğrulayın.
        Not: Tüm hücre bölmeleri (membran/sitoplazma/çekirdek) sinyalleri birleştiğinde görüntü analiz yazılımı entegre. Algoritma eğitim-ebilmek var olmak zaman alıcı bir adım de olsa fenotipleme çok önemli adımdır. Her görüntünün tüm verileri bir .txt dosya mısınız. Bir hücre (özellikle onun CI ile verilen onun fenotip) tüm verileri tek bir satır vardır. Her slayt için resim alma ve sonraki sayıları 5 alanların yapıldı.
  3. Ham veri ve otomatik hücre sayısı nesil entegrasyon
    1. Bir istatistik programı ile verileri hesaplamak.
      1. 1 hasta için analiz 5 alanlara karşılık gelen 5 resim tüm verileri hesaplamak için. İstatistiksel bir platformu kullanmak ve deneyimli istatistikçi, veri yöneticisi veya veri bilim adamı Çözümlemeyi gerçekleştirmek. Otomatik olarak bağlı olarak onların fenotip, CI > %55 seçerek hücreleri sayar bir komut dosyası oluşturmak.
      2. Serinin tüm .txt dosyalarını aynı klasöre koyun.
    2. Veri ayıklamak.
      1. Tüm .txt dosyalarını bir klasöre koyun. Adımda 3.3.1 otomatik komut dosyasını çalıştırın. R komut dosyası tarafından oluşturulan çıktı .csv dosyası açın. .XL formatında kaydedebilirsiniz. Çıkış hücreleri her fenotip (Yani, CD8 yalnız, CD8-PD-1, CD8-PD-1-Tim-3) için her bir hasta için toplar.
      2. Her alanı için her hasta için hücrelerin ortalama sayısını hesaplayın: alanların sayısı her alanı için her hasta için hücre sayısı normale (Yani, 5) başına hücre sayısına bölün.
      3. PD-1+ hücreler arasında toplam CD8 yüzdesini hesaplamak+ T hücreleri ve PD-1+ Tim-3+ hücreler arasında toplam CD8+ T hücreleri. Şekil 5 bu adımı Özeti için bkz.
        Not: R dil (veya diğer programlama yazılım) doğru bir şekilde oluşturma ve komutları çalıştırmak için gerekli değildir ve bu yüzden bir deneyimli kullanıcı veya istatistikçi/veri bilim adamı esastır. R programı aynı hastanın verileri hesaplayabilir ancak bir hastanın 5 .txt dosya adı benzersiz bir hasta tanıtıcısını ilgili özdeş bir başlangıç olmalıdır.
  4. İstatistiksel analiz
    1. İstatistiksel yazılım sonuçları istatistiksel analizi için kullanın.
    2. Bir istatistikçi yardımı ile uygun istatistiksel analizleri gerçekleştirmek.
      1. İmzalı kullanma non-parametrik Wilcoxon'ın rütbe testleri, PD-1 MFI karşılaştırma arasında iki hücre fenotipleri (şekil 6). Covariate ve histolojik özellikleri bir Pearson ki-kare testi ile aralarındaki ilişkileri belirlemektir.
      2. Kaplan-Meier yöntemi ilerleme ücretsiz hayatta kalma ve Cox regresyon modelleri genel sağkalım ve hastalıksız sağkalım gibi zaman olay sonuçlar üzerine covariate etkilerini tahmin etmek için tahmin etmek için kullanın.
      3. Pdüşünün-değerleri daha düşük daha önemli olarak 0,05.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yukarıda açıklanan genel iletişim kuralını kullanarak, intratumoral CD8 ölçmek amaçlanmıştır+ T hücreleri hastaların RCC ile sonuçları klinik sonuçlar25ile ilişkilendirmek için dondurulmuş dokularda inhibitör reseptörler PD-1 ve Tim-3 ortak ifade.

CD8/PD-1/Tim-3 boyama en iyileştirme:

Antikorlar (fare, tavşan ve keçi,...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Değişiklikler ve sorun giderme:

Doku kalitesi önemli bir parametre. kolayca Hematoksilen ve Eozin renklendirme tarafından denetlenebilir.

Çoğaltılmış stainings imkanı teknik bir avantajı vardır, ancak fluorophore yayılma önlemek için emisyon boyları 10 nm asgari delta ile seçmek için öneririz. Çünkü biz 4 stainings DAPI dahil olmak üzere, burada, dalga boylarında yayılan seçtiniz (DAPI: 460 nm, AF488: 519 nm, siyanür 3:570 nm, siyanür 5:670 nm). Çeş...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm yazarlar hiçbir bildirmek için çıkar çatışması var.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu eser hibe Institut National du kanser (Inca) (ET), Ligue contre le kanser (ET), Université Sorbonne Paris Cité (ET), ANR (Selectimmunco) (ET), Labex IMMUNO-Onkoloji (ET), SIRIC CARPEM (CG, ET) tarafından desteklenmiştir. EdG Fondation ARC Kardeşliği tarafından finanse edildi. EV ve CD APHP (bourse année recherche) Kardeşliği tarafından finanse edilmiştir. Will Université Sorbonne Paris Cité (Kervansaray'a doktora) Kardeşliği tarafından finanse edilmektedir. Yazarlar Bristol Myers Squibb kendi bu projede finansman için teşekkür ederiz. Yazarlar bölümü patoloji nörölojisi Européen Georges Pompidou ve Necker (Laurianne Chambolle, Elodie Michel ve Gisèle Legall) teşekkür ederim. Yazar PARCC, nörölojisi Européen Georges Pompidou (Corinne Lesaffre) Histoloji platformunun teşekkür ederiz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Vectra 3 Otomatik Kantitatif Patoloji Görüntüleme Perkin ElmerCLS142338
inForm hücre analizi 2.1.Perkin ElmerCLS135781
Dakopen sınırlayıcı kalemDakoS2002
Tris Tampon Salin TBS TabletleriTakara, Bio Inc.TAKT9141ZpH7.6 100 tablet
Tris Tampon Salin Tween 20 TBS (+Tween20)Takara, Bio Inc.TAKT9142ZpH 7.6 100 tablet
Biotin bloke sistemiDakoX0590Avidin %0.1 ve Biotin %0.01normal
eşek serumuJackson Immunoresearch017-000-001%5 hacim/hacim
DAPISigma-aldrichF60571.5 & mikro ile konsantrasyon Fluoroshield; g / mL konsantrasyon
Knittel cam lamelKnittel Gl & auml; ser,10003924x60 mm 100 kapak fişi
Tavşan anti-CD8 Klon P17-VnovusNBP1-790554 & mikro'da kullanım; g / mL
Fare anti-PD-1 Klon NATabcamab525872 & mikro'da kullanın; g/mL
Keçi anti-Tim-3R& DAF23653 & mikro'da kullanın; g / mL
Tavşan anti-PD-L1 Klon SP142Roche73094570011 ve mikroda kullanım; g / mL
Fare AF647 etiketli pan-Keratin Klonu C11Hücre Sinyali45280.5 & mikro'da kullanım; g/mL
Keçi anti-insan gal9R& DAF20450.3 & mikroda kullanın; g / mL
Camgöbeği 5 konjuge eşek anti-tavşanJackson Immunoresearch711-175-1525 & mikro'da kullanım; g/mL
Biyotinile F(ab' 2) eşek anti-fare IgGJackson Immunoresearch715-066-1503 & mikro'da kullanın; g / mL
Alexa Fluor488 konjuge eşek anti-keçi IgGabcamab1501335 & mikro'da kullanım; g / mL
Cy3 etiketli streptavidinAmershamPA430013 & mikro'da kullanılır; g / mL
negatif kontrol faresi IgG1DakoX09312 & mikro'da kullanın; keçi
serumuSigma-aldrichI5256'dan, 3 & mikro'da kullanın; tavşan
serumuSigma-aldrichI5006'dan, 4 & mikro'da kullanılır; g/mL
R yazılımı https://www.r-project.org , g / mL IgG g / mL IgG

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Borghaei, H., et al. Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Nonsquamous Non-Small-Cell Lung Cancer. N Engl J Med. 373 (17), 1627-1639 (2015).
  2. Granier, C., et al. Cancer immunotherapy: Rational and recent breakthroughs. Rev Med Interne. 37 (10), 694-700 (2016).
  3. Motzer, R. J., et al. Nivolumab for Metastatic Renal Cell Carcinoma: Results of a Randomized Phase II Trial. J Clin Oncol. 33 (13), 1430-1437 (2015).
  4. Robert, C., et al. Nivolumab in previously untreated melanoma without BRAF mutation. N Engl J Med. 372 (4), 320-330 (2015).
  5. Robert, C., et al. Ipilimumab plus dacarbazine for previously untreated metastatic melanoma. N Engl J Med. 364 (26), 2517-2526 (2011).
  6. Rosenberg, J. E., et al. Atezolizumab in patients with locally advanced and metastatic urothelial carcinoma who have progressed following treatment with platinum-based chemotherapy: a single-arm, multicentre, phase 2 trial. Lancet. 387 (10031), 1909-1920 (2016).
  7. Schadendorf, D., et al. Pooled Analysis of Long-Term Survival Data From Phase II and Phase III Trials of Ipilimumab in Unresectable or Metastatic Melanoma. J Clin Oncol. 33 (17), 1889-1894 (2015).
  8. Ribas, A., Hu-Lieskovan, S. What does PD-L1 positive or negative mean? J Exp Med. 213 (13), 2835-2840 (2016).
  9. Rizvi, N. A., et al. Cancer immunology. Mutational landscape determines sensitivity to PD-1 blockade in non-small cell lung cancer. Science. 348 (6230), 124-128 (2015).
  10. Roussel, H., et al. Composite biomarkers defined by multiparametric immunofluorescence analysis identify ALK-positive adenocarcinoma as a potential target for immunotherapy. OncoImmunology. 6 (4), e1286437(2017).
  11. Pages, F., Granier, C., Kirilovsky, A., Elsissy, C., Tartour, E. Biomarqueurs prédictifs de réponse aux traitements bloquant les voies de costimulation inhibitrices. Bull Cancer. 103, Suppl 1. S151-S159 (2016).
  12. Tumeh, P. C., et al. PD-1 blockade induces responses by inhibiting adaptive immune resistance. Nature. 515 (7528), 568-571 (2014).
  13. Fourcade, J., et al. Upregulation of Tim-3 and PD-1 expression is associated with tumor antigen-specific CD8+ T cell dysfunction in melanoma patients. J Exp Med. 207 (10), 2175-2186 (2010).
  14. Koyama, S., et al. Adaptive resistance to therapeutic PD-1 blockade is associated with upregulation of alternative immune checkpoints. Nat Commun. 7, 10501(2016).
  15. Wherry, E. J., Kurachi, M. Molecular and cellular insights into T cell exhaustion. Nat Rev Immunol. 15 (8), 486-499 (2015).
  16. Cai, C., et al. Tim-3 expression represents dysfunctional tumor infiltrating T cells in renal cell carcinoma. World J Urol. 34 (4), 561-567 (2016).
  17. Sakuishi, K., et al. Targeting Tim-3 and PD-1 pathways to reverse T cell exhaustion and restore anti-tumor immunity. J Exp Med. 207 (10), 2187-2194 (2010).
  18. Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
  19. Bethmann, D., Feng, Z., Fox, B. A. Immunoprofiling as a predictor of patient's response to cancer therapy-promises and challenges. Curr Opin Immunol. 45, 60-72 (2017).
  20. Badoual, C., et al. PD-1-expressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in HPV-associated head and neck cancer. Cancer Res. 73 (1), 128-138 (2013).
  21. Nizard, M., et al. Induction of resident memory T cells enhances the efficacy of cancer vaccine. Nat Commun. 8, 15221(2017).
  22. Nghiem, P. T., et al. PD-1 Blockade with Pembrolizumab in Advanced Merkel-Cell Carcinoma. N Engl J Med. 374 (26), 2542-2552 (2016).
  23. Roussel, H., et al. Composite biomarkers defined by multiparametric immunofluorescence analysis identify ALK-positive adenocarcinoma as a potential target for immunotherapy. Oncoimmunology. (4), (2017).
  24. Woods, K., et al. Mismatch in epitope specificities between IFNgamma inflamed and uninflamed conditions leads to escape from T lymphocyte killing in melanoma. J Immunother Cancer. 4, 10(2016).
  25. Granier, C., et al. Tim-3 Expression on Tumor-Infiltrating PD-1+CD8+ T Cells Correlates with Poor Clinical Outcome in Renal Cell Carcinoma. Cancer Res. 77 (5), 1075-1082 (2017).
  26. Feng, Z., et al. Multispectral Imaging of T and B Cells in Murine Spleen and Tumor. J Immunol. 196 (9), 3943-3950 (2016).
  27. Feng, Z., et al. Multispectral imaging of formalin-fixed tissue predicts ability to generate tumor-infiltrating lymphocytes from melanoma. J Immunother Cancer. 3, 47(2015).
  28. Fridman, W. H., Pages, F., Sautes-Fridman, C., Galon, J. The immune contexture in human tumours: impact on clinical outcome. Nat Rev Cancer. 12 (4), 298-306 (2012).
  29. Nizard, M., Roussel, H., Tartour, E. Resident Memory T Cells as Surrogate Markers of the Efficacy of Cancer Vaccines. Clin Cancer Res. 22 (3), 530-532 (2016).
  30. Sandoval, F., et al. Mucosal imprinting of vaccine-induced CD8(+) T cells is crucial to inhibit the growth of mucosal tumors. Sci Transl Med. 5 (172), 172ra120(2013).
  31. Carstens, J. L., et al. Spatial computation of intratumoral T cells correlates with survival of patients with pancreatic cancer. Nat Commun. 8, 15095(2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Multiplexed ImmunofluorescencePD 1 Tim 3 Co expressionTumor Infiltrating CD8 T CellsFluorescence Multispectral ImagingCell Segmentation AnalysisPhenotyping AlgorithmAutofluorescence RemovalRenal Cell CarcinomaImmune Checkpoint MarkersClinical Prognosis Correlation

Related Articles