Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Fare kemik iliği ve Periton makrofaj harekete geçirmek antikor bazlı ilaçlara etkileri değerlendirilmesi

7.8K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/56689

⸱

26 Aralık 2017

 , 
1British Columbia Children's Hospital Research Institute, University of British Columbia

Bu makalede

Özet

Antikor bazlı ilaçlara inflamatuar hastalıkları tedavisinde devrim. Belirli hedefleri üzerinde doğrudan etkileri sahip olmanın yanı sıra, antikorlar makrofajlar anti-inflamatuar olmak için etkinleştirebilirsiniz. Bu protokolü nasıl anti-inflamatuar makrofaj açıklar harekete geçirmek-ebilmek var olmak istimal fare kemik iliği makrofajlar ve Periton makrofajlar kullanarak içinde vivo biçilen in vitro .

Özet

Makrofajlar fagositik doğuştan gelen bağışıklık hücreleri, bağışıklık yanıtı patojenlere başlatmak ve şifa ve doku iadesi için katkıda bulunmaktadır. Makrofajlar inflamatuar yanıt dönüm eşit derecede önemlidir. Makrofajlar intravenöz immünglobulin (IVIG) ile uyarılan yüksek miktarda anti-inflamatuar sitokin, İnterlökin 10 (IL-10) ve yanıt olarak bakteriyel lipopolisakkaritler (pro-inflamatuar sitokinlerin seviyesinin düşük üretebilir göstermiştir LPS). IVIG polivalan antikor, öncelikle immünglobulin Gs (IgGs), 1.000'den fazla kan bağış plazma havuza alınmış olduğunu. Bu antikorlar bağışıklık eksikliği olan hastalarda ek olarak ya da otoimmün veya inflamatuar koşulları olan hastalarda immün yanıt-e doğru bastırmak için kullanılır. İnfliksimab, bir tedavi anti-tümör nekroz faktör alfa (TNFα) antikor, ayrıca IL-10 inflamatuar uyaranlara yanıt üretmek için makrofajlar etkinleştirmek için gösterilmiştir. IVIG ve diğer antikor tabanlı destekte makrofaj harekete geçirmek üzerindeki etkileri belirlemek için test edilecek. Bu kağıt türetme, stimülasyon ve değerlendirme fare kemik iliği makrofajlar tarafından antikorlar vitro aktif ve ile antikor içinde vivoaktif fare peritoneal makrofajlar yöntemleri açıklar. Son olarak, belirli hücre anti-inflamatuar makrofaj aktivitesi yolları sinyal katkısını belirlemek için western Blot kullanımını göstermektedir. Bu protokoller genetiği değiştirilmiş fare ile anti-inflamatuar makrofaj etkinleştirme belirli bir protein(s) etkisini belirlemek için kullanılabilir. Bu teknikler, belirli destekte inflamatuar yanıt içinde vivoazaltan bir IL 10 üreten anti-inflamatuar harekete geçirmek durum için makrofajlar değiştirerek hareket edebilir olup olmadığını değerlendirmek için de kullanılabilir. Bu etkinliği sırasında hastalık modelleri farelerde makrofaj etkinleştirme destekte, rolü hakkında bilgi vermek ve bir potansiyel yeni etki mekanizması kişilerde içgörü sağlamak. Özellikle makrofajlar bu enfeksiyona karşı konak savunmasında önemli bir rol oynamak Eğer tersine, bu belirli antikor tabanlı destekte kullanımına karşı bulaşıcı hastalığı tedavi etmek için dikkat.

Giriş

Enfeksiyon ya da yaralanma bağışıklık yanıtında birden çok rol oynamak doğuştan gelen bağışıklık hücreleri makrofajlar vardır. Makrofajlar, enfeksiyon veya doku hasarı bir bağışıklık yanıtı başlatmak, inflamatuar yanıt durdurma ve şifa yanıt1teşvik için sorumludur. Üç en iyi okudu makrofaj harekete geçirmek durum örnekleri şunlardır: 1) ile interferon gama (IFNγ) ve bakteriyel lipopolysaccharide (LPS), M (IFNγ + LPS), inflamatuar yanıt; katkıda belirlenmiş tedavi makrofajlar 2) şifa yanıtıyla ilişkili olan makrofajlar ile İnterlökin 4 (Il-4), M(IL-4), uyarılmış; 3) makrofajlar bağışıklık kompleksleri (IC) ile uyarılmış ve LPS, M (IC + LPS), inflamatuar yanıt2,3kapalı açmak seçeneğine sahipsiniz. M (IC + LPS) makrofajlar şifa M(IL-4) yaradan farklıdır ve enzim arginase (Arg-1) veya FIZZ14ifade değil. En iyi bu anti-enflamatuar makrofajlar için onların sitokin üretim5belirtecidir. Makrofajlar sağlığı korumak birden çok rol var, ama aynı zamanda inflamatuar hastalıkları ve kanser3katkıda. Bu nedenle, çok çeşitli hastalıkların tedavisi için anahtar bir terapötik hedef makrofajlar vardır. Makrofaj dayalı tedaviler hastalığı için geliştirmek için onların harekete geçirmek durum antikorlar etkilerini araştırmak önemlidir.

Bu kağıt fare kemik iliği türetilmiş makrofajlar (BMDMs) ve inflamatuar yanıt içinde in vitro ve in vivoantikor ilaçların etkisi test etmek için Periton makrofajlar kullanımı üzerinde odaklanmıştır. Son zamanlarda, makrofaj harekete geçirmek6,7,8antikorların etkilerini gösteren birden çok çalışma yapılmıştır. Makrofajlar harekete geçirmek antikorlar bir antijen ve LPS, normalde inflamatuar bir uyarıcı ile complexed olan bağışıklık kompleksleri ile birlikte çok yüksek düzeyde anti-inflamatuar sitokin, IL-10 ve pro-inflamatuar sitokin düzeyi çok düşük üretmek, İnterlökin 12 (IL-12)9. Ayrıca, infliksimab, Monoklonal antikor TNFα karşı iş, kısmen, ile onun parçası crystallizable (Fc) bölge7anti-inflamatuar makrofajlar inducing tarafından tespit edilmiştir. IVIG + LPS neyin ortak uyarılmış makrofajlar IL-10 büyük miktarda ve pro-inflamatuar sitokin alt birim İnterlökin 12 veya 23 p40 (düşük miktarda üretmek M (IC + LPS), için benzer anti-inflamatuar makrofaj harekete geçirmek neden bildirdin Il-12/23p40), İnterlökin-6 (Il-6) ve TNF8. IVIG poliklonal antikorlar oluşan bir havuza 1.000'den fazla bağış10kandan IgG öncelikle ilaçtır. Çok çeşitli idiyopatik trombositopenik purpura ve kronik demiyelinizan polinöropati, gibi immünolojik hastalıkların tedavisinde kullanılan ama onun etki mekanizmaları tamamen anlaşılır11değil. Antikor dayalı ilaçların etkileri makrofaj etkinleştirme hakkında burada açıklanan yöntemleri kullanarak tespit edilebilir.

Makrofaj etkinleştirme belirli destekte etkilerini BMDMs ve Periton makrofajlar içinde test edilebilir. Bu makrofaj kaynaklarını kullanarak Primer hücre değerlendirilmesi izin verir. Antikor kültürlü Primer hücre üzerinde ön test daha az zaman ve daha başka zaman alıcı ve pahalı hastalık modelleri parasal yatırım gerektirir. Sağlıklı fare vivo içindebir uyuşturucu enjekte etme ve hücreleri izole ve ex vivoanaliz, kimse çalışmalar destekte tedaviyle makrofaj harekete geçirmek içinde hastalık modelleri etkiler değerlendirmek için gerekip gerekmediğinin belirleyebilirsiniz.

Makrofaj harekete geçirmek içinde in vitro ve in vivo biyolojik tedaviler etkisi doğrudan test kaç çalışmalar ile bizim teknikleri alternatif teknikleri üzerinde bir avantaj sağlar. Güncel teknikler içeren karma hücre popülasyonları vitro, karışık lenfosit reaksiyon (MLR) veya IVIG infliksimab periferik kan mononükleer hücrelerinde insan makrofajlar üzerinde etkisi gibi üzerinde test biyolojik uyuşturucu etkileri nerede etkisi bir belirli hücre türü7,12' ye isnat edilemez. BMDMs ve Periton makrofajlar kullanarak avantajlı hücre hatları, pro-inflamatuar sitokin üretmek değil, RAW264.7 hücreleri gibi kullanarak üzerinden IL-12, LPS8,13yanıt olarak. Bir antikor tabanlı uyuşturucu etkisi makrofaj yanıt ex vivo test sitokin yanıtları makrofajlar doğrudan bağlanabilir çünkü avantajları vardır yerine serum sitokin düzeyleri14 ölçerek makrofaj yanıt çıkarım . BMDMs ve Periton makrofajlar türetilen ve anti-inflamatuar makrofaj harekete geçirmek bir proteinin belirli bir rolü belirlemek için genetik olarak değiştirilmiş fare gelen izole. Örneğin, biz-si olmak kullanılmış Il10 eksik(- / -) BMDMs IVIG kaynaklı azaltma pro-inflamatuar sitokin üretiminin IL-108tarihinde kısmen bağlı olduğunu göstermek için. Bir ilacın etki mekanizmaları western Blot, spesifik proteinlerin ve sinyal olaylar rolü belirlendiği yerde kullanarak soruşturma olmaktır. Nicel Polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) BMDMs ya da Periton makrofajlar antikor aktivasyon neden gen ekspresyonu kalıpları göstermek için gerçekleştirilebilir. Hastalık modelleri farelerde bilgi ilgili modelleri antikor tabanlı biyolojik tedaviler potansiyel etkinliğini inflamatuvar barsak hastalığı, romatoid artrit, kanser15,ve16, gibi hastalıklar için sağlar 17. ancak, burada açıklanan teknikler bilgi bu destekte eylem mekanizması anti-inflamatuar makrofaj aktivitesi neden olup olmadığını belirleyerek sağlayacaktır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) British Columbia Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.

1. kemik iliği makrofaj türetme ve ile antikor etkinleştirme

  1. Ötenazi CO2 boğulma kullanarak gerçekleştirin.
    1. İndüksiyon odasında yerde fare. Derin ve yavaş hareketsiz ve nefes kadar fare ile 60-90 s, % 5 isoflurane anestezi ötenazi.
    2. İsoflurane anestezi açmak ve fare nefes durana kadar 6-8 L/dak CO2 yönetmek. Fare CO2 ile en az 5 dk. doğrula için orada olduğunu artık bir kalp atışı veya solunum çıkarma. Ölüm sağlamak için servikal yerindençıkmasına gerçekleştirin.
      Not: 8-12 hafta yaşlı fareler makrofajlar en yüksek verimi sağlamak.
  2. Sprey fare bacaklar % 70 etanol ve sırtüstü pozisyonda bir köpük tahta üzerinde onlarla kollar ve bacaklar gergin PIN ile. Makas ve cilt tutulacağı pensler, deri ve kürk her şiir yüzeyinden kaldırmak için sığ kesim (0.2 cm) olun.
    Not: Bu yordam ve tüm doku kültürü manipülasyonlar steril bir mahallede gerçekleştirin.
  3. Yırtılmalarıteşhis ve uyluk görünür kılmak için kas kırpın. Yırtılmalarıteşhis ve uyluk, kemik ve kas Kalça eklemi hemen altında ve ayak bilekleri üzerinde keserek çıkarın. Mümkün olduğu kadar kas döşeme.
  4. Kemikleri % 70 etanol ile sprey ve buharlaşmasına sonra kemik floş orta (Iscove'nın Dulbecco'nın orta (IMDM), % 10 fetal sığır serum (FBS) değiştirilmiş) 6 iyi tabağına koyup 1 dakika bekleyin.
  5. Kemikleri biter böylece kemik boşluğu maruz kemik ayak bileği ve femur üst kapalı 0.1 cm kesim tarafından kırpın. Kemik iliği görülür ve 26 gauge iğne-ebilmek var olmak konulmak kemik boşluğunda emin olun.
  6. Kemikler ve kaslar yırtılmalarıteşhis ve kalça diz eklemleri dan ayırmak için kesti. Bir 10 mL şırınga boşluğuna bağlı 26 gauge iğne yerleştirin. Kemik iliği kemiğin floş orta 5 mL ile 50 mL konik tüp içine sifonu çek. İki yırtılmalarıteşhis ve bir fareden iki uyluk her 50 mL tüp içine boşalt.
  7. Yukarı ve aşağı birkaç kez veya girdap yavaşça kümeleri dağıtmak için yavaş hızda iliği pipette. Dizeleri iliği kemik iliği küçük (daha az 0,5 mm) lekeler kırık. 50 ml konik tüp floş orta kemik ile doldurun. Konik tüp 75 cm2 doku kültürü içine içeriğini pipet şişesi tedavi ve 37 ° c, % 5 CO2 1 h için kuluçkaya.
    Not: Olgun makrofaj ve Mezenkimal hücreler olacak şişeye yapışık ve atılır, istenen hematopoetik ataları süspansiyon kalırken.
  8. Hematopoetik ataları ile orta 50 mL konik tüp içine pipette. 300 x g, oda sıcaklığında 5 dk. atmak için de tüp süpernatant santrifüj kapasitesi ve Pelet makrofaj koloni uyarıcı faktör (MCSF) kültür orta 5 mL resuspend (IMDM, %10 FBS, 5 ng/mL MCSF, 100 U/mL penisilin/streptomisin ve 150 mikron monothioglycerol (MTG)).
  9. Bir hemasitometre18kullanarak hücreleri saymak. 0.5 x 106 hücre/mL, 1.5 x 107 hücreler/şişeye 30 mL orta, bir konsantrasyon hücrelere resuspend ve yukarı ve aşağı yavaşça pipet için orta ekleyin. 30 mL süspansiyon yeni bir 75 cm2 doku kültürü tedavi şişe pipet.
  10. 4. gün ve 7 gün sonra ilk adım 1.9 kültüründe, hücreleri yapışık ve biraz dallı bir ters faz kontrast parlak alan mikroskop kullanarak olduğundan emin olun. Yapışık olmayan hücreleri içeren orta atın. IMDM hücrelerle bir kez yıkama ve MCSF kültür orta 30 mL ekleyin.
  11. Ne zaman hücreleri olgun 10 gün (> % 95'i F4/80 ve Mac-1 için pozitif), tekrar hücreleri olduğunu doğrulayın yapışık ve biraz.
  12. Hücreler elektrodlar için plaka, kültür orta balonun kaldır ve enzim ücretsiz, EDTA tabanlı cep ayrılma arabelleği (Tablo reçetesi) 8 mL eklemek için. 37 ° c, % 5 CO25 min için hücreleri kuluçkaya.
  13. Hücreleri nazikçe, basınç, steril hücre kazıyıcı kullanarak küçük bir miktar ile kazı. Hücreleri şişesi yüzeyden ayırdıktan mikroskop iade edin. Disosiye hücreleri 50 mL konik tüp içine pipet. Şişesi 3 kez 5 mL IMDM de ile durulayın ve durulama çözüm hasat edildi hücreleri ile havuz. 300 x g 5 min için oda sıcaklığında hücreleri santrifüj kapasitesi.
  14. Hücre Pelet MCSF kültür orta 50 mL konik tüp başına 3 mL resuspend. Bir hemasitometre18kullanarak canlı hücreleri hesaplama. 1 x 106 hücre/mL ve plaka 100 μL hücre süspansiyon (1 x 105 hücreleri/de) bir konsantrasyon hücreleri bir 96-iyi doku kültürü düz alt plaka tedavi, kuyu resuspend.
    Not: Bir fare kemiklerinden 100 kuyuları için yeterince hücre üretir. İstenirse, hücre 1 mL 6-şey plaka (doku kültürü tedavi, düz alt) kaplama. Hücreler (1 x 106 hücreleri) daha çok sayıda Batı Leke analizleri için yararlı olabilir.
  15. Yapisan bir kez yinelenen veya onaylatılacak Wells'le her 10 ng/mL IMDM, 30 mg/mL IVIG, veya IVIG + LPS LPS teşvik. LPS veya IVIG dozlarda yanıt optimize etmek için titre. Yinelenen veya onaylatılacak kuyu unstimulated denetimi olarak bırakın. Onları 24 saat (37 ° C, % 5 CO2) kuluçkaya.
    Not: Yeniden kaplama hücre doku kültürü wells 1s içinde uygun olmalıdır.
  16. Hücre supernatants her kuyudan bireysel 1.7 mL microcentrifuge tüpler içine toplamak ve Partiküler madde herhangi bir iplik 10.000 x g 5 min için de çıkarın.
  17. Hücre süpernatant kaldırmak ve Pelet rahatsız edici kaçının. Açıklanan bir steril microcentrifuge tüp süpernatant yerleştirin.
    Not: Cep supernatants sitokinler, IL-10 ve sitokin alt birimi, IL-12/23 p 40, enzim bağlı immunosorbent assay tarafından (ELISA) hemen denetlesinler, veya-80 ° C uzun vadeli saklı. ELISA Protokolü piyasada bulunan Seti'nden (Tablo reçetesi) izleyin. Diğer pro-inflamatuar sitokinlerin, Il-6 ve TNF, gibi denetlesinler gibi onlar da IVIG ile ortak tedavi tarafından azaltılır + LPS stimülasyon ile karşılaştırıldığında stimülasyon ile LPS yalnız. Stimülasyon sonra yapışık hücreleri western Blot veya nicel Polimeraz zincir reaksiyonu (Q-PCR) 19,20gibi teknikleri için hazırlanabilir.

2. fare Vivo içinde IVIG ile zorlu ve Periton makrofajlar hasat

  1. Her fare tartın.
Son doz 2,5 g/kg vücut ağırlığı için her fare sağlamak için gerekli IVIG (100 mg/mL hisse senedi toplama) hacmi hesaplamak.
Not: Örneğin, bir 20 g fare için IVIG 500 µL gereklidir.
  • Beraberlik IVIG gerekli miktarda içine steril 1 mL şırınga steril 26 ile donatılmış iğne ölçmek. IVIG almazsınız kontrol fareler için steril fosfat tamponlu tuz (PBS), pH 7.4 IVIG yerine eşit dozu hacmi yönetmek.
  • Scruff fare derisi başparmağınız ve işaret parmağı ile boyun arkasında kapma ve onun kuyruk ve kalan parmaklarınızla arka ayakları tutan tek elle. Yere doğru onun beden eğ.
  • Fare karın, sağ alt kadranda göre 30-40 ° açıyla iğne yer kadar yükseltin, eğin ve 1,5 cm iğne yerleştirin. IVIG veya PBS intraperitoneally enjekte. 1 saat bekleyin.
  • 6-8 L/dak CO2 boğulma tarafından takip %5 isoflurane anestezi ile fareler ötenazi (bkz. Adım 1.1.1 - 1.1.2) veya kurumun etik kurallarına göre.
  • PIN bir köpük tahta, bacaklarda fare dağılın. Parçalar % 70 etanol ile sprey.
    Not: steril bir mahallede yordamı gerçekleştirin.
  • Periton boşluğuna kesme önlemek için fare, orta çizgi boyunca makasla cilde (0,2 cm) sığ bir kesim yapmak. Böylece sağlam Periton duvar astar görülebilir forseps, kullanarak fare göbek karın derisini çek.
  • 5 mL şırınga steril PBS (pH 7,4) 5 mL ile doldurulması. Bir 25 eklemek veya 27 kadar iğne sol veya sağ tarafına iğne eğimi ile fareyi merkezden boşluğundan üstündeki ölçer.
    Not: organları içine, ama yerine, Periton uzaya PBS enjekte değil iğne dikkatle fare yerleştirin.
  • Sıvı Periton boşluğuna itin. İğne kavite dışarı çekin ve karın zarını 10 için masaj s herhangi bir hücre çıkarmak için. İğne kavite ekleyebilir ve organları kaçının. Toplamak ve buz üzerinde 15 mL konik tüp içine kurtarıldı lavaj sıvı yerleştirin.
    Not: sıvı enjekte her 5 mL için yaklaşık 3.75 mL elde edilebilir.
  • Enjeksiyon ve kurtarma (Adım 2.8-2,9) tekrar 3 (20 mL toplam enjeksiyon hacmi), kez daha lavaj sıvı toplam 15 mL kurtarmak için. Lavaj her fare--dan bir ayrı 15 mL konik tüp içine toplamak.
    Not: son enjeksiyon sonra sıvı nerede sıvı birikmiş fare kadar sol ve sağ taraftan ayıklamak daha kolay olabilir. Organları bu konumda iğne ile daha az girişim neden olur.
  • Hücreleri aşağı 300 x g 4 ° C'de 5 min için de spin Kaplama orta 500 μL hücrelerde resuspend (IMDM, %10 FBS ve 100 U/mL penisilin/streptomisin) temizlenen fare başına. Bir hemasitometre18kullanarak uygun makrofajlar saymak.
    Not: Makrofajlar daha diğer Periton hücre biraz daha büyük olacaktır. 5 x 105 - 1 x 106 makrofajlar/fare vahşi türü C57BL/6 fare kullanma tipik verimidir.
    İsteğe bağlı: kırmızı kan hücreleri, çok sayıda hücre Pelet varsa, bunları, 1 x kırmızı kan hücre lizis tampon üreticinin yönergelerine uygun kullanarak kaldırmak için lizis adımı gerçekleştirin.
  • 1 x 106 makrofajlar/mL orta kaplama hücreler resuspend ve iyi bir 96-şey düz dipli doku kültürü tedavi plaka başına 100 μL plakası.
    Not: Bu havuzu için gerekli olabilir ineklemek kullanıyorsanız bir deney için birden fazla fare hücrelerden kuyu veya titrating uyarıcı. Örneğin, tek bir fare 5 x 105 makrofajlar olsaydı, kaplama orta 500 μL gerekli olacaktır. 5 kuyu veya yinelenen bir LPS doz ile 1 deneyde için yeterince hücre olur.
  • Hücreler 37 ° c, % 5 CO2 makrofajlar olmak izin vermek için 1 h için kuluçkaya yapışık. Periton makrofajlar yapisan hücrelerdir. Hücre supernatants ve yapışık olmayan hücreleri kaldırın. Wells iki kez 200 μL (37 ° C için önceden ısındı) IMDM ile durulayın, 10 bekle s ve yavaş yavaş plaka tilt. Kaplama orta yerine. Hücreleri 37 ° c, % 5 CO2 30 dk önce uyarılması için kuluçkaya.
  • LPS IMDM içinde 10 ng/mL ile makrofajlar teşvik veya bir denetim olarak unstimulated bırakın. 24 saat kuluçkaya, toplamak ve (1.16-1.17 adımlara bakın) hücre supernatants IL-10 sitokin analiz tarafından ELISA için açıklamak. ELISA Protokolü piyasada bulunan Seti'nden (Tablo reçetesi) izleyin.
    Not: stimülasyon sonra yapışık hücreleri gibi Batı leke veya PCR teknikleri için hazırlanabilir.

    • 3. fareler içinde Vivo IVIG + LPS ve Periton makrofajlar hasat ile zorlu

    1. Her fare tartın. Son doz 2,5 g/kg vücut ağırlığı sağlamak için gerekli IVIG (100 mg/mL hisse senedi toplama) hacmi hesaplamak. LPS (IMDM 100 μg/mL hisse senedi toplama) 0.2 μg/g vücut ağırlığı son bir doz sağlamak için gereken miktarını hesaplamak.
      Not: Örneğin, bir 20 g fare için 500 µL IVIG hisse senedi çözüm ve LPS, 100 μg/mL solüsyon 40 μL gereklidir.
    2. IVIG gerekli miktarı çekmek ve LPS steril 26 ile donatılmış bir steril 1 mL şırınga içine iğne ölçmek. IVIG almazsınız kontrol fareler için IVIG eşdeğer hacmi steril PBS pH 7.4 ile değiştirin.
    3. Scruff fare derisi başparmağınız ve işaret parmağı ile boyun arkasında kapma ve onun kuyruk ve kalan parmaklarınızla arka ayakları tutan tek elle. Yere doğru onun beden eğ.
    4. İğne fare karın, alt sağ bölümündeki göre 30-40 ° açıyla, eğim ve eklemek 1,5 cm. ekleme IVIG + LPS, ya da PBS + LPS, intraperitoneally 2.4 adım'olarak yer.
    5. 1 saat sonra adımları 2.5-2,10 gerçekleştirerek Periton makrofajlar hasat.
    6. Hücreleri aşağı 300 x g 4 ° C'de 5 min için de spin 1 mL kurtarılan lavaj sıvı kaldırmak ve IL-10 ve ELISA tarafından IL-12/23 p 40 analizleri için üreticinin talimatlarına uyarak kullanmak veya gelecekteki analizleri için-80 ° C'de dondurmak.
      Not: lavaj sıvı sitokin analiz için Tedaviler arasında doğru karşılaştırma sağlamak için 5 mL flushs Periton boşluğu ve 4 kez 15 mL son bir hacim için gerçekleştirin. Tüm sıvı her floş elde edilebilir.
    7. Adım 2,11, olduğu gibi resuspend ve uygun makrofajlar saymak.
      Not: Makrofajlar daha diğer Periton hücre biraz daha büyük olacaktır.
    5 x 105 - 1 x 106 makrofajlar/fare vahşi türü C57BL/6 fare kullanma tipik verimidir.
    İsteğe bağlı: kırmızı kan hücreleri, çok sayıda hücre Pelet varsa, bunları, adım 2.11 olduğu gibi kaldırmak için üreticinin yönergelerine uygun lizis adımı gerçekleştirin.
  • Adım 2.12 olduğu gibi orta kaplama hücreler yeniden askıya alma.
    Not: Bir deney için birden fazla fare havuzu hücrelere gerekli olabilir. Örneğin, tek bir fare 5 x 105 makrofajlar olsaydı, kaplama orta 500 μL gerekli olacaktır.
  • 2.13 olduğu gibi hücreleri makrofajlar olmak izin vermek için 37 ° C % 5 CO2 1 h için kuluçkaya yapışık.
  • Toplamak ve adımları 1,14-1.15, tüm Periton hücrelerden göre şartına orta açıklık.
    Not: Örnekleri hemen kullanılabilir veya dondurulmuş ve sitokin analiz için-80 ° C'de ELISA tarafından saklanır.
  • Adım 2.11 yerine hücreleri 24 h unstimulated için kuluçkaya Toplamak ve hücre supernatants, sitokin analiz tarafından ELISA için adım 1.16-1.17, aynı derecede açıklamak.
    Not: Hücreleri adımları 1.16-1.17 ve 2.14 olduğu gibi Batı leke veya PCR, gibi teknikleri için hazır olun.

    • Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

    Sonuçlar

    Fare kemik iliği türetilmiş makrofajlar hematopoietik hücre kemik iliği boğulmadan Kara filmin tarih öncesi gelen kültürlü. Kalça ve yırtılmalarıteşhis bir C57BL/6 fare genellikle havuza alınmış kemik iliği örnekleri 107 kemik iliği türetilmiş makrofajlar onları makrofajlar deneyleri için uygun bir kaynak yapma, verim. BMDMs ne zaman ile inflamatuar uyarıcı vitromeydan dayalı antikor uyuşturucu yanıt test etmek için kullanılabilir. Şekil 1...

    Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

    Tartışma

    Makrofaj harekete geçirmek Birleşik her iki doku homeostazı ve hastalık22içinde önemli bir rol oynamaktadır. Makrofajlar bağlı olarak kendi microenvironment3ipuçlarını etkinleştirme Birleşik örtüşen yanı sıra farklı olabilir. İnflamatuar yanıt tüm aşamalarında farklı rollere sahip: savunma patojenlere karşı yara iyileşmesi ve doku restitüsyon ve da inflamatuar yanıt2 dönüm için önemli bir farklı anti-inflamatuar etkinleştirme durumları vardır . Anti-...

    Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

    Açıklamalar

    Yazarlar hiçbir ifşa etmek çıkar çatışması var.

    Teşekkürler

    L.K. British Columbia Üniversitesi 4 yıllık arkadaş grubu (4YF) lisansüstü öğrencilik Ödülü alıcı olduğunu. L.M.S. olduğunu Kanadalı bir Gastroenteroloji Derneği alıcı / Crohn ve kolit Kanada / CIHR yeni araştırmacı maaş Ödülü ve biyomedikal bilim adamı Michael Smith Vakfı Sağlık Araştırma için. Bu eser Kanada Enstitüleri Sağlık (# CIHR2016-LS vermek) araştırma ile işbirliği içinde Kanada kan Hizmetleri, bir proje hibe tarafından desteklenmiştir.

    Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

    Malzemeler

    Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
    AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
    Iscove' s modifiye Dulbecco' s medium (IMDM)Yaşam teknolojileri12440053
    Fetal Sığır Serumu (FBS)Yaşam teknolojileri12483-020
    Rekombinant murin makrofaj koloni uyarıcı faktör (MCSF)Kök hücre teknolojileri78059
    Penisilin-streptomisinYaşam teknolojileri15140148
    Monotiogliserol (MTG)Sigma88640
    1X kırmızı kan hücresi lizis tamponueBioscience
    Hücre ayrışma tamponuYaşam teknolojileri13150016Enzim İçermeyen, Hanks bazlı, EDTA
    Lipopolisakkarit (LPS)Sigma aldrichL 4516E. coli 0127:B8
    IVIg (Gammunex)BC Çocuk Hastanesi, Transfüzyon Tıbbından
    Alınan GrifollarIVIg (Gammagard sıvısı)Baxter Healthcare Corporation, BC Çocuk Hastanesi'nden Alındı, Transfüzyon Tıbbı
    IVIg (Octagam)BC Çocuk Hastanesi'nden Alınan Octapharma, Transfüzyon Tıbbı
    Fosfat tamponlu salin (PBS) (steril), pH 7.4Fare10010023
    IL-10 ELISABD biosciences555252
    fare IL-12/23p40 ELISABD biosciences555165
    anti-Erk1/2 antikoruHücre sinyal teknolojisi9101
    anti-pp38 antikoruHücre sinyal teknolojisi9211
    anti-GAPDH antikoruFitzgerald endüstrileri10R-G109A
    26 g iğneBD biyolojik bilimler305110
    1 mL şırıngaBD biosciences309659
    10 mL şırıngaBD biosciences309604
    15 mL konik tüpBD biosciences352096
    50 mL konik tüpBD biosciences352070
    mikrosantrifüj tüpü (1.7 mL)DiamedSPE155-N
    75 cm2 doku kültürü uygulanmış şişeBD biosciences353136
    Hücre sıyırıcıBD biosciences353085
    ForceptsVWR82027-386ince uç, diseksiyon 
    MakasVWR82027-582Hassas, 4 1/2"
    Parlak alan mikroskobuMoticAE31Ters faz kontrast
    Ölçeği Mettler PE 3000
    yaşam teknolojileri Serisi

    Kaynaklar

    1. Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nat Rev Immunol. 11 (11), 723-737 (2011).
    2. Martinez, F. O., Gordon, S. The M1 and M2 paradigm of macrophage activation: time for reassessment. F1000Prime Rep. 6, 13(2014).
    3. Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).
    4. Edwards, J. P., Zhang, X., Frauwirth, K. A., Mosser, D. M. Biochemical and functional characterization of three activated macrophage populations. J Leukoc Biol. 80 (6), 1298-1307 (2006).
    5. Mosser, D. M., Zhang, X. Activation of murine macrophages. Curr Protoc Immunol. , Chapter 14 Unit 14.12 (2008).
    6. Gallo, P., Gonçalves, R., Mosser, D. M. The influence of IgG density and macrophage Fc (gamma) receptor cross-linking on phagocytosis and IL-10 production. Immunol Lett. 133 (2), 70-77 (2010).
    7. Vos, A. C., et al. Anti-tumor necrosis factor-α antibodies induce regulatory macrophages in an Fc region-dependent manner. Gastroenterology. 140 (1), 221-230 (2011).
    8. Kozicky, L. K., et al. Intravenous immunoglobulin skews macrophages to an anti-inflammatory, IL-10-producing activation state. J Leukoc Biol. 98 (6), 983-994 (2015).
    9. Sutterwala, F. S., Noel, G. J., Salgame, P., Mosser, D. M. Reversal of proinflammatory responses by ligating the macrophage Fcgamma receptor type I. J Exp Med. 188 (1), 217-222 (1998).
    10. Nimmerjahn, F., Ravetch, J. V. The antiinflammatory activity of IgG: the intravenous IgG paradox. J Exp Med. 204 (1), 11-15 (2007).
    11. Gelfand, E. W. Intravenous immune globulin in autoimmune and inflammatory diseases. N Engl J Med. 368 (8), 777(2013).
    12. Andersson, J., Skansén-Saphir, U., Sparrelid, E., Andersson, U. Intravenous immune globulin affects cytokine production in T lymphocytes and monocytes/macrophages. Clin Exp Immunol. 104, Suppl 1 10-20 (1996).
    13. Saito, S., Matsuura, M., Hirai, Y. Regulation of lipopolysaccharide-induced interleukin-12 production by activation of repressor element GA-12 through hyperactivation of the ERK pathway. Clin Vaccine Immunol. 13 (8), 876-883 (2006).
    14. Cao, S., Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. NF-kappaB1 (p50) homodimers differentially regulate pro- and anti-inflammatory cytokines in macrophages. J Biol Chem. 281 (36), 26041-26050 (2006).
    15. Neurath, M. F. New targets for mucosal healing and therapy in inflammatory bowel diseases. Mucosal Immunol. 7 (1), 6-19 (2014).
    16. Bryant, A., Moore, J. Rituximab and its potential for the treatment of rheumatoid arthritis. Ther Clin Risk Manag. 2 (2), 207-212 (2006).
    17. Weiner, L. M., Surana, R., Wang, S. Monoclonal antibodies: versatile platforms for cancer immunotherapy. Nat Rev Immunol. 10 (5), 317-327 (2010).
    18. Louis, K. S., Siegel, A. C. Cell viability analysis using trypan blue: manual and automated methods. Methods Mol Biol. 740, 7-12 (2011).
    19. Liu, Z. Q., Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory and trouble shooting. N Am J Med Sci. 6 (3), 160(2014).
    20. Nolan, T., Hands, R. E., Bustin, S. A. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nat Protoc. 1 (3), 1559-1582 (2006).
    21. Lucas, M., Zhang, X., Prasanna, V., Mosser, D. M. ERK activation following macrophage FcgammaR ligation leads to chromatin modifications at the IL-10 locus. J Immunol. 175 (1), 469-477 (2005).
    22. Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).
    23. Anderson, C. F., Gerber, J. S., Mosser, D. M. Modulating macrophage function with IgG immune complexes. J Endotoxin Res. 8 (6), 477-481 (2002).
    24. Sutterwala, F. S., Noel, G. J., Clynes, R., Mosser, D. M. Selective suppression of interleukin-12 induction after macrophage receptor ligation. J Exp Med. 185 (11), 1977-1985 (1997).
    25. Riquelme, P., et al. IFN-γ-induced iNOS expression in mouse regulatory macrophages prolongs allograft survival in fully immunocompetent recipients. Mol Ther. 21 (2), 409-422 (2013).
    26. Vos, A. C., et al. Regulatory macrophages induced by infliximab are involved in healing in vivo and in vitro. Inflamm Bowel Dis. 18 (3), 401-408 (2012).
    27. Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. The isolation and characterization of murine macrophages. Curr Protoc Immunol. , Chapter 14 Unit 14.11 (2008).
    28. Gerber, J. S., Mosser, D. M. Reversing lipopolysaccharide toxicity by ligating the macrophage Fc gamma receptors. J Immunol. 166 (11), 6861-6868 (2001).
    29. Durandy, A., et al. Intravenous immunoglobulins--understanding properties and mechanisms. Clin Exp Immunol. 158, Suppl 1 2-13 (2009).
    30. Jolles, S., Sewell, W. A., Misbah, S. A. Clinical uses of intravenous immunoglobulin. Clin Exp Immunol. 142 (1), 1-11 (2005).
    31. Murakami, K., et al. Intravenous immunoglobulin preparation prevents the production of pro-inflammatory cytokines by modulating NFκB and MAPKs pathways in the human monocytic THP-1 cells stimulated with procalcitonin. Inflamm Res. 63 (9), 711-718 (2014).

    Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

    Yeniden basım ve izinler

    Etiketler

    Kemik li i MakrofajlarPeritoneal Makrofajlarntraven z mm noglob linIL 10 retimiWestern BlotlamaH cre Stim lasyonuSitokin AnaliziFare Modelleri
    Fare kemik iliği ve Periton makrofaj harekete geçirmek antikor bazlı ilaçlara etkileri değerlendirilmesi
    Bize ulaşın
    Kütüphaneye tavsiye et

    Gizlilik

    Kullanım Şartları

    İlkeler

    Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.