Bu çalışmada Candida glabrataantifungal ilaç direnci veriyor genlerdeki mutasyonlar çözümlenmesi için tüm genom sıralama uygulanmaktadır. C. glabrata yalıtır echinocandins, azoles ve 5-flucytosine, dayanıklı metodoloji göstermek için sıralı. Duyarlılık profilleri varlığı ya da yokluğu genler belirli mutasyon desenleri ile ilişkili yalıtır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Tüm genom sıralama Candida glabrata algılama, işaretçileri, Antifungal ilaç direnci için
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Candida glabrata hızla ilaç direnci, özellikle azoles ve echinocandins neden mutasyonlar elde edebilirsiniz. Direnç vitro kez klinik başarısızlık ile ilişkili olduğu tespit gibi Genetik mutasyonlar tanımlanması önemlidir. Genom geniş analizi C. glabrataantifungal ilaç direnci için tüm genom sıralama (WGS) kullanarak fizibilite inceledi. Amaç torecognize yardımcı teknolojiler ve engelleri WGS uygulamasında ve onun etkinliğini ölçmek. Bu kağıt anahtar kalite kontrol kontrol noktaları ve genetik işaretler antifungal ajanları düşük duyarlılık ile ilgili araştırmaya WGS metodolojisi temel bileşenlerine önerilmektedir. Ayrıca veri analizi doğruluğunu ve dönüş çevresinde-test zamanı tahmin ediyor.
12 klinik fenotipik duyarlılık ve C. glabrata bir ATCC suşu antifungal duyarlılık testi ile tespit edilmiştir. Dahil bu üç çift, uyuşturucu minimum inhibitör konsantrasyonu artış geliştirilmiş üç hastalardan izole et. İki çift olarak ikinci izole echinocandins her çift geliştirilen direnç. Üçüncü çiftinin ikinci izole 5-flucytosine direnç geliştirmiştir. Kalan duyarlı ve azole dayanıklı yalıtır oluşur. Tek nükleotid polimorfizmleri (SNPs) echinocandin, azole ve 5-flucytosine direnç bağlantılı genlerdeki dayanıklı yalıtır WGS sonraki nesil sıralama kullanarak üzerinden teyit edildi. Sigara eşanlamlı SNPs antifungal direnç genleri FKS1, FKS2, CgPDR1, CgCDR1 ve FCY2 gibi tespit edildi. Genel olarak, ortalama % 98 oranında başvuru genom ile yaklaşık 75-fold okuma derinlik örtmek için eşlenen C. glabrata yalıtır WGS okur. Gerçekleştirme süresi ve maliyeti Sanger için karşılaştırılabilir sıralama.
Sonuç olarak, C. glabrata WGS klinik olarak anlamlı gen mutasyonlarının farklı antifungal ilaç sınıfları birden fazla PCR/DNA sıralama reaksiyonlar için gerek kalmadan direnç yer vermeden mümkün. Bu WGS yeteneklilik içinde eşzamanlı antifungal direnç saldırıyı oyuncu değişikliği algılanması için klinik laboratuvar kurulması yolunda olumlu bir adım temsil eder.
Giriş
Candida glabrata giderek karşılaşılan bir patojen azoles yanı sıra son zamanlarda, echinocandins1,2,3direnç sergileyen bir tür olarak öneme sahip olduğunu. Diploit C. albicans, C. glabrata haploit genom mutasyonlar elde etmek ve çoklu ilaç direnci daha kolay geliştirmek için izin verebilir. Co direnç için her iki ilaç sınıfları Ayrıca olmuştur4bildirdi. Bu nedenle, erken antifungal duyarlılık değerlendirilmesi ve C. glabrata ilaç direnci tespiti doğru hedeflenen tedavisi için Antimikrobiyal direnç1<....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Etik onay bu çalışma için gerekli oldu.
1. alt kültür ve inoculum hazırlık Candida glabrata için
- Hangi de en az bir C. glabrata Amerikan tipi kültür koleksiyonu (ATCC) bilinen duyarlılık desenli içermelidir belirlenmesi için C.glabrata yalıtır panelini seçin.
- Alt kültür bir koloni dokunarak bir izole bir steril tek kullanımlık plastik döngü kullanarak ve'nın bir Sabouraud dekstroz agar (SDA) çizgiler plaka8.
- 24-48 h izole iyi büyüme ile saf kültür için 35 ° C'de SDA plaka kuluçkaya.
2. Antifungal duyarlılık tespiti
- 4-....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Onüç C. glabrata C. glabrata ATCC 90030 ve 12 yalıtır (izole CMRL1 CMRL12 için) klinik Mikoloji başvuru laboratuvarından oluşan, Westmead hastane, Sydney inceledi (tablo 1). Bu CMRL-1/CMRL-2, CMRL-3/CMRL-4 ve CMRL-5/CMRL-6 elde önce ve sonra aralarında epidemiyolojik hiçbir bağlantıları ile antifungal tedavi yalıtır üç çift dahil 24 (tablo 1).
Mikrofonlar CLSI yorumsal kesme noktası dok.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu çalışmada, fizibilite, yaklaşık zaman çizelgeleri ve hassas WGS-güdümlü algılama C. glabratailaç direnci belirledi. Kütüphane hazırlık ve sıralama gerçekleştirme süresi (TAT) dört gün ve raporlama analiz sonuçları iki gün oldu. Bu kültür plakaları ve Sanger duyarlılık deneyleri için benzer en az bir miktar TAT ile karşılaştırır anlamlı olarak daha yüksek sayıda örnekleri sıralama. Yaklaşık 30-90 C. glabrata genleri hücre içi akış kapasitesi, 80-%100 sıralama kapsamı ile sıralama göre sıralı. Nasıl ya.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının ve hiçbir çıkar çatışması ifşa etmek hakkına sahiptir.
Teşekkürler
Bu eser enfeksiyon hastalıkları ve Mikrobiyoloji, halk sağlığı Merkezi tarafından desteklenmiştir. Yazarlar bu çalışma için diğer bir fon almadım. Yazarlar Drs Alicia Arnott, Nathan Bachmann ve Ranjeeta Menon onların uzman tavsiyesi ve tüm genom sıralama deney ile yardım için teşekkür ederiz.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| DensiCHECK Plus | BioMé rieux Inc | K083536 | McFarland okumaları için kullanılan densitometre |
| Sensititre YeastOne | TREK Teşhis Sistemleri, Thermo Scientific | YO10 | Standart antifungal ilaçlar ile ticari duyarlılık test plakası. |
| Fisherbrand Tek Kullanımlık Aşılama Halkaları ve İğneleri | Fisher Scientific, Thermo Fisher Scientific | 22-363-605 | Tek kullanımlık plastik halkalar doğrudan paketten kullanılabilir. Alev almaya gerek yok. |
| Eppendorf Safe-Lock mikrosantrifüj tüpleri | Sigma Aldrich, Merck | T2795 | Hacim 2.0 mL, doğal |
| MP Biomedicals, | LLC'den ZYMOLYASE 20T | 8320921 | DNA ekstraksiyonu öncesi mantar izolatının hücre duvarı lizisi için kullanılır |
| Sihirbaz Genomik DNA Saflaştırma Kiti (nbsp); | Promega | A1120 | 100 DNA ekstraksiyonu yapar |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Test Kiti | Thermo Fisher Scientific | P7589 | Protokolde floresan boya olarak adlandırılan Picogreen reaktifi. Test için Lambda DNA standardı ve pikogreen reaktifi içerir. |
| Nextera XT DNA Örnek Hazırlama Kiti | Illumina | FC-131-1096 | 96 örnek için Kutu 1 ve Kutu 2 reaktifleri içerir |
| Nextera XT Dizin Kiti v2 | Illumina | FC-131-2001, FC-131-2002, FC-131-2003, FC-131-2004 | Dizin seti A Dizin seti B İndeks seti C İndeks seti D |
| NextSeq 500/550 Yüksek Çıkış Kiti v2 | Illumina | FC-404-2004 | 300 döngü, kit başına 250'den fazla numune |
| NextSeq 500 Orta Çıkış v2 Kiti | Illumina | FC-404-2003 | 300 döngü, kit başına 130'dan fazla numune |
| PhiX Kontrol Kiti | Illumina | FC-110-3001 | İndeks kitinden indeksleri sırayla düzenlemek için |
| TruSeq İndeks Plakası Fikstür Kiti | FC-130-1005 | 2 Fikstür | |
| KAPA Kütüphanesi Yeni Nesil Dizileme için <> | KAPA Biyosistemleri | KK4824 | Önceden hazırlanmış standartları, astarları ve MasterMix'i içerir |
| Janus NGS Express Sıvı işleme sistemi | PerkinElmer | YJS4NGS | Dizileme sırasında DNA dilüsyonları için kullanılır |
| 0,8 mL Depolama Plakası | Thermo Scientific | AB0765B | DNA Kütüphanesi temizleme ve normalizasyonu için MIDI Plakası |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | Kütüphane saflaştırması için çözelti içinde manyetik boncuklar |
| Manyetik Stand-96 | Thermo Fisher Scientific | AM10027 | Manyetik boncuk bazlı DNA saflaştırması için kullanılır |
| OrbiShaker MP | Benchmark Scientific | BT1502 | 4 platformlu 96 kuyulu plaka çalkalayıcı |
| Sert Kabuklu PCR Plakası | BioRad | HSP9601 | İnce Duvar, 96 Kuyulu |
| LightCycler 480 Enstrüman II | Roche | 5015278001 | 96 kuyulu plaka |
| Microseal 'B' PCR Plaka Sızdırmazlık Filmi, yapışkanlı, optik ve nbsp; | BioRad | MSB1001 | Şeffaf 96 kuyulu plaka kapatıcılar |
| CLC Genomics Workbench | Qiagen | CLCBio | Yazılımı, Sürüm 8 |
| NextSeq500 cihazı | Illumina | Illumina | Yeni nesil dizileme için kullanılan Tezgah Üstü Sıralayıcı |
Kaynaklar
- Beyda, N. D., et al. FKS mutant Candida glabrata: risk factors and outcomes in patients with candidemia. Clin Infect Dis. 59 (6), 819-825 (2014).
- Chapeland-Leclerc, F., et al.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
