Yöntem makalesi

Antimikrobiyal peptidler kanonik olmayan Amino asitler ve seçici basınç eklenmesi tarafından üretilen

13.3K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/57551

⸱

4 Mayıs 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biocatalysis, Institute of Chemistry, Technische Universität Berlin, 2Department of Bioenergetics, Institute of Chemistry, Technische Universität Berlin, 3Molecular Genetics Group, Groningen Biomolecular Sciences and Biotechnology Institute, Department of Molecular Genetics, University of Groningen

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Protokol Escherichia colisunar-lactococcal antimikrobiyal peptid nisin içine seçici basınç birleşme kanonik olmayan amino asit (ncAAs) dayalı. Özelliklerini rekombinant ifade ile ikame ile tanımlanmış büyüme medya istenen ncAAs sırasında değiştirilebilir. Bioactivity ortaya çıkan değişimler büyüme inhibisyon deneyleri ve floresan mikroskopi tarafından eşleştirilir.

Özet

Doğa bireysel amino asit yapı taşları sırasını değiştirerek yeni protein işlevler oluşturmak için olanaklar bir çeşitlilik vardır. Ancak, tüm çeşitlerini 20 kurallı amino asitler üzerinde (cAAs) temel alır. Ek fizikokimyasal özellikleri polipeptitler tanıtmak için bir yol kanonik olmayan amino asitler (ncAAs) birleşme giderek protein mühendisliğinde kullanılır. Onların nispeten kısa uzunluğu nedeniyle, ncAAs tarafından ribosomally sentezlenmiş ve post-translationally modifiye peptidler değişiklik özellikle çekici olduğunu. Yeni işlevler ve kimyasal kolları tarafından belirli değişimleri arasında bireysel-ebilmek var olmak oluşturmak. Seçici basınç birleşme (SPI) yöntemi bir temel amino asit kimyasal olarak tanımlanan büyüme medya mahrum auxotrophic ana bilgisayar suşları kullanır. Çeşitli yapısal ve kimyasal olarak benzer amino asit analogları sonra karşılık gelen aminoasil tRNA sentetaz tarafından etkinleştirilebilir ve kalıntı özgü cAA(s) → ncAA(s) oyuncu değişikliği hedef peptid veya protein sırada sağlar. Her ne kadar SPI yöntemi bağlamında, ncAAs da ana bilgisayar Proteom rekombinant gen ekspresyonu aşamasında dahil edilmiştir, hücrenin kaynakları çoğunluğu hedef gen ifade için atanır. Bu kez değiştirilmiş hedef yüksek miktarda ile eşlik ncAAs verimli kalıntı özgü birleşme sağlar. Sunulan çalışma altı prolin analogları vivo içinde birleşme antimikrobiyal peptid nisin, doğal olarak Lactococcus lactistarafından üretilen bir lantibiotic içine anlatılmaktadır. Nisin Antimikrobiyal Özellikleri değişti ve daha fazla ifade auxotrophic Escherichia coli ve fermantasyon sırasında genişletilmiş suşları tanımlanmış büyüme medya. Böylece, etkileri ile ncAAs cAAs kalıntı özgü değiştirme değişiklik antimikrobiyal aktivite ve özgüllük teslim edebilirsiniz. Antimikrobiyal aktivite deneyleri ve floresan mikroskopi yeni nisin değişik bir gram-pozitif Lactococcus lactis göstergesi yük büyüme inhibisyonu için test etmek için kullanılır. Kütle spektroskopisi ncAA birleşme içinde biyoaktif nisin değişik doğrulamak için kullanılır.

Giriş

Hedef bakteriyel enfeksiyonların tedavisi antibiyotik yirminci yüzyılın keşfi ve patojen mikroorganizmaların etkin karşı yeni antimikrobiyal bileşiklerin paralel geliştirme. Ancak, metisiline dirençli Staphylococcusaureus (MRSA), Vankomisin dirençli enterokoklar (VRE), gibi kökenlerinin dirençli patojenler ortaya çıkması nedeniyle MDR (kökenlerinin dayanıklı) Salmonella typhimurium fajının yazın 10 (DT10 ), ve Klebsiella pneumoniae, acilen yeni antimikrobiyal ajanlar1oluşturmak gerekli. Antimikrobiyal peptidler (Amper) onların fizikokimyasal özellikleri, esneklik, boyutu, hydrophobicity ve eylem2modu sayesinde yeni ilaçların geliştirilmesi için umut verici aday olan çok yönlü, genellikle çok özel bileşiklerdir. Amper küçük peptidler genellikle oluşan 7-100 amino asitleri vardır. Çoğu zaman, onlar zengin etkileşim hedeflenen mikrobiyal hücre karşılıklı kullanılıyorsa3membran ile pozitif yüklü arginin ve lizin artıkları Katyonik bir yapıya sahip. Amper belirli bir alt grubu olan ribosomally sentezlenmiş ve posttranslationally modifiye peptidler (RiPPs)4. Bunlar mantar Krallığı ve alan'ın bakterilerin çoğu organizma tarafından üretilmektedir. İyi bilinen ve yaygın olarak kullanılan RiPPs biridir nisin, doğal laktik asit bakteri Lactococcus lactis (L. lactis) tarafından üretilen. Bir panel, gram pozitif bakterilerin karşı etkin, nisin olarak gıda sektöründe bir biopreservative Antimikrobiyal Özellikleri ve gelişmiş direnç hedeflenen mikrobiyal suşları5yokluğu nedeniyle 50 yıldan fazla için kullanılmıştır. Çalışmalar göstermiştir bu nisin oynattığını ve bakteriyel hücre zarlarında, antimikrobiyal aktivite6her iki gram pozitif ve gram-negatif patojenlere karşı önde gelen gözenekler oluşturur. Lipid II için bağlama tarafından bakteriyel hücre duvarı sentezi Inhibe7' dir. Nisin nisA tarafından bir lider ve bir çekirdek peptid bölgesi (şekil 1) oluşan bir doğrusal habercisi peptid kodlanır. Ribozomal sentez sonra prenisin ilk dehidrataz NisB tarafından değiştirilir. Burada, prepeptide çekirdek bölge serin ve treonin kalıntılarında dehydroalanine (Dha) ve dehydrobutyrine (Dhb)8için susuz kalmış. Daha sonra susuz artıkları formu lanthionine halkalara sistein ile birleştiğinde (Bu nedenle adı "lantibiotic" lanthionine yüzüğü içeren antibiyotikler için) bir enzim katalize Michael ek tarafından. Ardından bu değişiklik (PTM) cyclase NisC tarafından katalizlenir. L. lactis, değiştirilmiş prenisin sonra hücreden dışarı ışınlama NIST tarafından taşınır ve lider peptid İndinavir olgun ve aktif nisin formu9serbest bırakmak için NisP i ciddi. Sorumlu lider peptidaz NisP bir yüksek substrat özgüllüğü vardır, bu yana yalnızca işlemleri nisin verimli bir şekilde değiştiren10.

Genel olarak, etkin RiPPs büyük ölçüde kısa peptidler, Örneğin, üzerinden asetilasyon, glikozilasyon, metilasyon veya fosforilasyon kimyasal alanını artırmak PTM enzimler (örneğin NisBC), eylemden neden. Bu karmaşıklık düzeyini daha da ncAAs doğrudan birleşme tarafından genişletilebilir. Sık sık mümkün iken, amper kimyasal sentez onların yapısal karmaşıklık nedeniyle büyük ölçekli üretim için bir mücadeledir. Örneğin, 71 tepki adımda lantibiotic lactosin S toplam kimyasal sentez bir son verim % 10 ve bu nisin sadece %0,00311,12ham bir verim ile sağlanır. Bu nedenle, biyolojik üretimi üretimi yüksek ürün toplama ve doğru stereocenters nedeniyle bir alternatif sunuyor.

Bugün kadar 150'den fazla ncAAs, Fonksiyonel grupların Flor veya azides, içeren sahip Örneğin, rekombinant proteinlerin dahil olması ve ncAA-modified amper çeşitli örnekler bildirilen13,14olmuştur, 15,16. NcAAs giriş ile roman fizikokimyasal özellikleri için konvansiyonel mutagenesis göre oluşturulur. Muhtemelen roman antibiyotiklere önde gelen varolan peptidler çeşitliliği artırılabilir.

NcAAs birleşme rekombinant peptidler içine bir yöntem auxotrophic bakteri suşları17kullan seçeneğine göre seçici basınç birleşme (SPI) olduğunu. Bu suşların ncAA karşılık gelen cAA analog sentezleme yeteneği olmayan. Metodoloji sık gözlenen rahat substrat özgüllüğü, birçok doğal aminoasil tRNA sentetaz (aaRSs)18bir özellik kullanır. Onların doğal cAA yüzeylerde dışında bu enzimler kez tanımak ve istenen ncAA etkinleştirmek ve soydaş onların tRNA(s) şarj etmek için yeteneğine sahiptir. Bu ncAA ribozomal birleşme için hedef gen ürünü bir kalıntı özgü şekilde (Yani, cAA → ncAA ikame) yol açar. Bu istenen ncAA kurallı amino asit yapısal ve kimyasal olarak benzer olduğunda elbette mümkündür ve hücre fizyolojisi, çeviri makine ve hedef sıra peptid veya protein tarafından tolere. Deneysel kurulumunuza içinde auxotrophic konak hücreleri tanımlanmış orta yerine kullanılacak yerel amino asit sınırlayan bir konsantrasyon ile sağlanan kültürlü. Hücresel büyüme veya exchange tarafından hücre içi cAA tükenmesi cAA-Alerjik orta yol açar. Sonraki adımda, ncAA eklenir ve hedef gen ekspresyonu indüklenen. Kaçınılmaz olarak, ncAAs şimdi de birçok diğer proteinler arasında konak hücre içinde hedef gen ekspresyonu bu evre sırasında dahil edilmiştir. Escherichia coli (e.coli) zorlanma ile güçlü bir düzenleyici denetimi altında hedef gen taşıyan bir plazmid dönüştürülür beri her şeye rağmen SPI Kur toksisitesi düşük bir seviyede tutulur (genellikle son derece rekabetçi T7 organizatörü / RNA polimeraz sistemi)19. Hemen sonra (genellikle cAA yetersiz kaldığında) indüksiyon, hücreleri büyümek için ateşkes ana bilgisayar ve sitoplazmik onların enzimatik makineleri esas olarak plazmid dayalı hedef gen ifade için kullanılır. Site yönettiği mutagenesis site (ler) kalıntı özgü ncAA yüklemesinin hedef gen20dakikaya tanımlamak için kullanılabilir.

NcAAs birleşme için bir model peptid pentacyclic AMP nisin A seçildi. 34 amino asit uzunluğunda ve sadece bir tek prolin kalıntı çekirdek peptid sırayla (şekil 1) vardır. Subtilisin, ericin A ve S ve epidermin de olduğu gibi nisin Z ve nisin Q olduğu gibi korunmuş prolin etkinlik9,21için gerekli gibi görünüyor. CAA prolin peptit-prolyl Amid döndürme ve ikincil yapı istikrar özellikle önemli bir rol oynar. Onun yan zinciri halka biçimler (exo / endo puckers) Amid bağı bir termodinamik stabilization için sorumludur. Hedeflenen kimyasal değişiklikler (örneğin, hydroxylations, fluorinations, methylations) prolyl puckers kez eleştirel katlama istikrar, iskele sertlik ve birçok biyolojik yapıları22fonksiyonlarını etkiler. Böylece, Pro→ prolin analog oyuncu değişikliği roman ve sıradışı özellikleri ile B, nisin, ikinci halka halka bağışlamak beklemek akla yatkın.

Burada, prolin auxotrophic e.coli suşu rekombinant nisin üretimi için kullanıldı. Bu değişiklik enzim genlerini nisBCyanı sıra prepeptide gen nisA ifade gerektirir. Genetik olarak kodlanmış peptid ürün bir N-ölümcül O'nun öğesini lideri arıtma yoluyla benzeşme Kromatografi için taşıyor. Aktivite tayini için ifade ve NisPT salgılayan L. lactis rekombinant nisin türevleri E. coli hücre lysates veya saf peptid örnekleri (şekil 1) etkinleştirmek için kullanılır. Olgun AMP lideri bölünme sonra NisP tarafından yayımlanır. Bu agar Difüzyon yönteminde AMP örnek katı büyüme orta dağılır ve gram-pozitif mikroorganizma büyümesini inhibe. Kuluçka sonra bu görsel olarak büyüme inhibisyon haleler tarafından görülebilir. L. lactis ek olarak bir göstergesi olarak, antimikrobiyal aktivite Enterococcus faecalistir, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus ve Lactobacillus johnsonii karşı gösterdi nisin türevleri modifiye 21,23.

NcAAs RiPPs içinde birleştirmek için bir alternatif ve deneysel olarak farklı24stop kodonu bastırma (SCS) yöntemidir. Bunun için dik bir tRNA / aminoasil tRNA sentetaz (aaRS) çifti için karşılık gelen ncAA gereklidir. İdeal olarak, tüm bu üç bioorthogonal, endojen tRNA ve aaRSs kurduklarını değil Yani, bileşenleridir. Bir ncAA özgü aaRS enzim etkin site modifikasyonu ve genetik mutasyona uğramış sentetaz25kütüphanelerin tarama tarafından oluşturulabilir. Ayrıca, bir ncAA giriş hangi atanır ve hangi cAA için kodlamak değil bir kodon gerektirir. Genellikle, kehribar kodonu kullanılan24,26yaşında.

Son zamanlarda, SPI α chloroacetamide içeren ve tıklama kimya uyumlu ncAAs birleşme NisA27içine kurulmuştur. Örneğin, Nε- ayırma-lizin Kement peptid captistruin siteye özgü (SCS) ve kalıntı özgü (SPI) birleşme yöntem ve daha sonra değiştirilmiş içinde vitro içine rutenyum katalize sentezde28 tarafından kurulmuştur . SPI, ile karşılaştırıldığında SCS yöntemi bir dik tRNA beri daha karmaşıktır / aaRS çifti birlikte ifade olması gerekir. Bugüne kadar o-çiftleri prolin birleşme için gelişmiş29olmuştur, ama bizim bilgi en iyi şekilde, hiçbir örnek prolin analog şirketleşme bildirilmiştir.

Bu tüm ncAAs SPI metodoloji kullanarak eklenebilir olması gerekmektedir. İlk olarak, sitoplazma içine ncAAs alımını çok sayıda gram-negatif bakteriler E.coli için iç membran sitoplazmik membran katıştırılır taşıma proteinler tarafından düzenlenmiştir. Normalde, E. coli yapısal olarak çok çeşitli amino asit analogları yan zincirleri ile hücre içine taşıma kapasitesine sahip ve kimyasal olarak kanonik amino asitler benzer. İkinci,30hücre metabolizması ve Fizyoloji Host için toksik olduğu gibi birçok kimyasal olarak reaktif ya da kararsız ncAAs hücre büyümesinde doğru bir inhibitörü olarak hareket. Böylece, alımı ve toksisitesi ncAA üretim ana bilgisayar için önceden test edilmelidir. Bir yan etki olarak PTM makinelerin inactivation önlemek için bir kesinlikle kontrollü ifade Kur sorumlu genlerin doğal amino asit modifikasyon enzimleri (Örneğin, nisBC) dahil etmek için kullanılabilir ve ncAA hedef gen ( içine Örneğin, nisA). Bu iki farklı rehberleri ve hedef gen ekspresyonu, indüksiyon özel olarak tasarlanmış SPI protokolleri31' de gösterildiği gibi kullanarak gerçekleştirilebilir. Yukarıda belirtildiği gibi ncAA harekete geçirmek ve soydaş tRNA şarj sağlar aaRS rahat substrat özgüllüğü SPI yöntemi kullanır. Daha sonra tRNA Amid bağı oluşumu tarafından takip ve hedef (poli) peptid katlama ribozom teslim edilir. Bu işlemlerde proofreading ve mekanizmaları düzenleme ilgili32olabilir. Bu nedenlerden dolayı bir hedef için büyük önem taşıyor cAA için yapısal ve kimyasal olarak benzer ncAA. Diğer önemli noktaları yeterli kararlılık vardır (hem büyüme medya ve hücresel metabolizma maruz) ve ncAA çözünürlük. Ayrıca, ticari olarak kullanılabilir veya kimyasal sentez kolay olmalıdır.

Burada, SPI, rekombinant RiPPs içine ncAAs ve kalıntı özgü eklenmesi izin için bir protokol açıklayın. Özellikle, farklı prolin analogları antimikrobiyal peptid nisin A birleştirilir basili ana bilgisayar organizma olarak kullanarak. Kütle spektrometresi amino asit yerine doğrulamak için kullanılır ve peptid ürünleri büyüme inhibisyon deneyleri ve mikrobiyal göstergesi suşları kullanarak Floresans mikroskobu kullanılarak bioactivity için analiz edilir.

Başarılı rekombinant nisin ifade ile tanımlanmış ncAAs için temel gereksinimi uygun prolin auxotrophic gerektirir e.coli suşu. Bunun için auxotrophy, proA işlevsel olmayan, örneğin genomik nakavtla elde olmalı. Hücreleri tamamen yoksun hücre içi Pro biyosentezi (Yani, silmek-in proABC) reversion için olasılığı vardır olmadan istikrarlı auxotrophs. Yaygın olarak kullanılan gen nakavt fajının iletim veya tek gen nakavt Datsenko & Wanner33göre yöntemlerdir. Ayrıca, proA nakavt suşları Addgene, CGSC veya Keio koleksiyonu gibi kamu depoları elde edilebilir. Burada gösterilen rekombinant nisABC ifade T7 rehberleri kullanımına dayanıyor beri ifade ana bilgisayar zorlanma indüklenebilir bir gen T7 RNA polimeraz için taşımak zorunda. Bu λDE3 prophage giriş içine örneğin ticari seti kullanarak ana bilgisayar genom tarafından gerçekleştirilebilir. Alternatif olarak, soy BL21(DE3) gibi yukarıda açıklandığı gibi auxotrophic yapılabilir.

Protokol

1. klonlama ifade vektörel çizimler ve dönüştürme bir auxotrophic üretim baskı

Burada, genler için nisin biyosentezi, yani nisABC, L. lactis alınan edilmiş ve T7 tabanlı plazmid ifade vektörel çizimler transfer. NisABC tam DNA dizileri GenBank giriş X6830734bulunabilir. Öncü peptid (nisA) için gen Ampisilin direnç confers bir evde beslenen hayvan-3a vektör yerleştirildi. Genler dehidrataz (nisB) ve cyclase (nisC) için hangi sefaloridin direnç confers bildirilen önceki35, pRSFDuet-1 vektör soktuk.

Not: nisAiçin VSLR36 prolin kalıntı çekirdek peptid içinde benzersiz işlemek için ve NisP tarafından işleme uygun prepeptide emin olmak için kodlamak için lider dizisinin son dört amino asitler (ASPR) kodon mutasyona. N-terminus adlı bağlayıcı artıkları tarafından çevrili bir hexa-histidin etiketi (bkz. şekil 1) arıtma amaçları için eklendi.

figure-protocol-1
Resim 1 . PTM NisA E. coli içinde biyosentezi ve şematik gösterim yanı sıra lider bölünme L. lactis göstergesi zorlanma bir sonraki etkinliği tahlil tarafından. İlk adımda, etkin olmayan lineer prenisin (benzersiz prolin (pembe) içeren bir çekirdek peptid bölgesi ve bir lider konumda 9 oluşan) kodlanmış tarafından nisA ribosomally sentez. Daha sonra prenisin posttranslationally tarafından dehydroalanine (Dha) ve dehydrobutyrine (Dhb) serin ve treonin kalıntıları susuzluktan NisB tarafından katalize olarak değiştirilir. Cyclase NisC thioether köprüler üzerinden sistein sulfhydryl gruplarıyla Dha veya Dhb ilavesi Michael oluşturur. Etkin olmayan değiştirilmiş prenisin E. coli saflaştırılmış ve antimikrobiyal aktivite için test edilmiştir. Burada, gram-pozitif L. lactis göstergesi zorlanma hücre taşınır. Lider proteaz (ok ucu tarafından belirtildiği gibi) NisP tarafından tam etkin nisin serbest bırakmak için i ciddi. Kaldırılan vitro tripsin (*) ile tedavi tarafından da olabilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

  1. Standart ısı-şok protokolü37 ya da elektroporasyon38 prolin auxotrophic dönüştürmek için kullanmak plazmid evde beslenen hayvan-3a nisA(VSLR) ve pRSFDuet-1 nisBC E. coli türe (yukarıya bakın).
  2. 25-100 µL dönüştürülmüş hücre süspansiyon üzerine Ağar kaplamalar Ampisilin, sefaloridin ve %1 (w/v) glikoz içeren pipette. Plakası açıcı veya cam boncuk çözüm plakaları üzerinde eşit şekilde yaymak için kullanın.
  3. Tabak gecede 37 ° C'de kuluçkaya
  4. Aşağıdaki öğleden sonra bir koloni Ampisilin, sefaloridin ve 50 mL şişe %1 (w/v) glikoz içeren 10 mL LB orta aşılamak için kullanın.
  5. Kültür gecede (12-16 h) 37 ° C ve 200 devir/dakika salla.
  6. 250 µL steril % 80 gliserol ve 550 µL kültür, bir 2 mL tüp içinde karıştırın ve 80 ° C'de donmuş hücre hisse senedi olarak saklamak

2. yeni en az orta (NMM) hazırlık

Not: Bu protokol NMM20 kimyasal olarak tanımlanmış sıvı Bakteriyel büyüme aracı olarak kullanır. Aynı zamanda, bu kesinlikle hazırlık sırasını takip için tavsiye edilir. Aksi takdirde, yağış meydana gelebilir. Malzemeler tablo (Örneğin, hydrochlorides) listelenenlerden farklı amino asit formlar için çözünürlük kontrol edin. NMM19 değiştirilmesi cAA dışında 19 amino asitler içerir (burada, prolin) ncAA analog tarafından. Son bileşen konsantrasyonları için bkz: Tablo 1. Bakteriyel gerginliği üretim için kullanılan bağlı olarak, biotin ve tiamin isteğe bağlı olabilir.

  1. Amino asit karışımı hazırlanması
    1. 0.5 g Phe, Trp ve 100 mL GKD2O dağılmasına kadar birkaç damla konsantre HCL eklenmesiyle Tyr geçiyoruz.
    2. Her kalan 16 amino asitlerin 0.5 g ağırlığında. 22 mL 1 M KH2PO4 ve 1 M K2HPO448 mL ile karıştırın. GKD2O ~ 800 mL için ekleyin. Çözüm açık hale gelinceye kadar karıştırın.
    3. Çözünmüş Phe, Trp ve Tyr ekleyin ve 1 L çözümü GKD2O. seviyesini ayarlamak
    4. Bir şişe en iyi filtre ünitesi ile vakum filtrasyon sayesinde amino asit karışımı sterilize.
  2. NMM19 hisse senedi çözümleri
    1. İlk olarak, hisse senedi çözümleri aşağıdaki bileşenlerden 1 M hazırlamak:4, KH2PO4, K2HPO4, MgSO4 ve 5 M NaCl çözeltisi stok bu yüzden (NH4)2. Tarafından ısıyla sterilize.
    2. D-glikoz (1 M), CaCl2 (1 g/L), FeCl2 (1 g/L), tiamin (10 g/L), biotin (10 g/L) ve eser elementler (CuSO4, ZnCl2, MnCl2, (NH4)2MoO4; 1 mg/L 50 mL stokları hazırlamak ). Her filtrasyon tarafından olan bir şırınga filtre sterilize.
  3. NMM19 hazırlık
    1. Son bir konsantrasyon 7.5 mM (NH4)2elde etmek için tüm hisse senedi çözümler mix SO4, 1.7 mM NaCl, 22 mM KH2PO4, 50 mM K2HPO4, 1 mM MgSO4 ve 20 mM D-glikoz, 50 mg/L amino asit karıştırın, 1 µg/L CaCl2, 1 µg/L FeCl2, 10 µg/L Tiamin, 10 mg/L biotin ve 0,01 µg/mL eser elementler.

3. ifade rekombinant Nisin prolin analogları SPI tarafından eklenmesi ile

Bu bölümde, rekombinant ifade prepeptide (burada: nisA) ve PTM genler (burada: nisBC) gerçekleştirilir. İlk olarak, LB karmaşık orta kullanıldığı için hücreleri tüm cAAs huzurunda yetişir. Glikoz hedef gen ekspresyonu aksi takdirde vahşi tipi peptid üretim için neden olabilir arka plan düzeyinde bastırmak için eklenir (burada: nisin) leakiness rehberleri nedeniyle. Hedef sonra cAA (burada: prolin) olduğunu tükenmiş, ncAA eklenir ve hedef gen ekspresyonu kimyasal olarak tanımlanmış ortamda indüklenen. Kuluçka sıvı kültürlerin havalandırma (Örneğin, bir 2 L Erlenmeyer şişesi 200 RPM 500 mL) ile uygun şişeler içinde gerçekleştirilmelidir.

  1. Steril pipet ucu kullanarak başlangıç taze bir gecede kültür donmuş hücre hisse senedi veya taze kolonisi (bkz. Adım 1). Ampisilin, sefaloridin ve %1 (w/v) glikoz içeren 25 mL LB orta kullanın ve geceleme (12-16 h) 37 ° C'de ve 200 rpm kuluçkaya.
  2. 10 mL gecede kültür (% 1 v/v) ile steril taze orta 1 L aşılamak ve 37 ° C ve 200 rpm OD600 kadar kuluçkaya 0,5 =.
  3. 4 ° C'de santrifüj 4500 x g de 15 dakika.
  4. Süpernatant dökün ve Pelet 20 mL NMM19 (2.3 adımda hazırlanan) içeren antibiyotikler ve %1 (w/v) glikoz ile resuspend. 4 ° C'de santrifüj 4500 x g de 10 dakika.
  5. Hücre Pelet 500 mL aynı orta resuspend ve 30 ° C ve 1 h için 200 d/d kuluçkaya.
    Not: Bu adımda cAA tükenmesi (burada, prolin) yer alır.
  6. Kültür eşit parçaya (bir her ncAA) bölün. Her kültür ile 1 mM izopropil β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) teşvik ve tedarik 1 mM prolin analogları (4S/R- fluoroproline, 4S/R- hidroksiprolin veya 4S/R- methanoproline).
    Not: denetimi gibi bir kültür 1 mM prolin, vahşi tipi peptid üretimde ortaya çıkan ile sağlanabilir.
  7. 28 ° c gece (12-16 h) ve 200 rpm kuluçkaya.
  8. 50 mL tüpler için 5000 x g., 20 dk 4 ° C'de kültürlerde süpernatant dökün ve granül-80 ° C'de arıtma kadar saklamak hücre santrifüj kapasitesi.

4. izolasyon ve O'nun öğesini Nisin analogları arıtma

Peptidler koşullarla guanidin hidroklorür (GuHCl)39, güçlü bir denaturant denaturing altında saf.

Dikkat: GuHCl yuttu veya inhale ve cilt ve ciddi göz tahrişine neden olursa zararlıdır. Göz koruması ve eldiven giymek.

  1. Arabellek (5 M GuHCl, 300 mM NaCl, 25 mM Tris, pH 7,4), yıkama tampon (300 mM NaCl, 25 mM Tris, 25 mM imidazole, pH 7,4) ve elüsyon tampon (300 mM NaCl, 25 mM Tris, 250 mM imidazole, pH 7,4) bağlama 250 mL hazırlayın. Bunlar için katı bir 250 mL şişe içine aktarmak ve ilâ 200 mL GKD2ile O. Mix dolduracağım ve pH 7.4 1 M NaOH veya HCl ile için ayarlayın. Daha sonra 250 mL şişe ilk filtre birimini kullanan tüm tampon çözeltiler GKD2ile O. filtre doldurun.
  2. Hücre lizis
    Burada, bir sonicator (200 W maksimum yüksek frekans (HF) çıkış) birlikte kullanılır; Not hücre bozulması için gerekli güç ayarlarını diğer enstrümanlar için farklı olabilir. Tüm adımlar buz üzerinde gerçekleştirilir. Alternatif olarak, kimyasal hücre lizis, sıvı homogenizer veya bir kahve makinesi kullanılabilir.
    1. 12 mL bağlama arabellek her santrifüj tüpü (adımından 3.8) ekleyin ve vortexing tarafından resuspend.
    2. Sonicator sonda ucu hücre süspansiyon daldırın. Nabız 1 ile % 40 genlik ayarla sonicator s / 5 kapalı s 15 dakika.
      Not: sonicator ucunu ertelenmiş önlemek için örnek arasında temiz. Sonicator sonda % 70 etanol ile silin.
    3. 15.000 x g hücre artıkları cips de 40 dk 4 ° C'de lysed hücre süspansiyon santrifüj kapasitesi. Supernatants yeni bir tepki tüp aktarın.
  3. Benzeşme Kromatografi
    İmmobilize metal iyon benzeşme Kromatografi (IMAC)40için Peristaltik pompa veya bir FPLC sistemi (burada Ni-NTA reçine ile dolu) 1 mL kartuş ile kullanılabilir. Arabellekleri hazırlanması için bkz: adım 4.1.
    Not: üretilen rekombinant peptid 6. adımda lideri peptidaz olgun nisin serbest NisP, tarafından kaldırılır bir N-ölümcül O'nun öğesini lideri, taşıyor bu yana IMAC arıtma mümkün olabilir. Arıtma, oda sıcaklığında veya 4 ° C'de gerçekleştirmek Bir akış hızı dakikada 1 ml varsa IMAC kartuş için kullanın.
    1. İlk olarak, 5 sütun cilt (cv) depolama arabellek kaldırmak için GKD2O kartuşla yıkayın.
    2. 10 ile equilibrate cv bağlama arabellek.
    3. İşlem hücre bir şırınga parçacıkları kaldırmak için filtre sonra kartuş ile uygulayın lysate (Adım 4.2) kullanıyor.
    4. Yıkama 15 ile cv spesifik olmayan ve ilişkisiz malzeme çıkarmak için yıkama arabelleği.
    5. 10 ile elute cv elüsyon arabellek ve toplamak 1 mL kesirler 1,5 mL tüpler. Kesirler için kısa vadeli (3 gün) 4 ° C'de veya uzun dönem için-20 ° C'de depolayın.
    6. İçin depolama, 10 kartuşla yıkama GKD2O cv takip 5 tarafından cv % 20 etanol.

5. LC-ESI-TOF kütle spektrometrik analizi Nisin analogları

Not: Bkz: belgeleri tablo araçları için sıvı Kromatografi electrospray iyonlaşma uçuş zaman kütle spektrometresi ile (LC-ESI-TOF-MS) birleştiğinde örneğin.





Sonuçlar

Bu iletişim kuralı SPI yöntemi ile ncAA-modified nisin türevleri üretimi prolin analogları ve kalıntı özgü eklenmesi ile sağlamak için tasarlanmıştır. Daha önce fizibilite ve 24 mg/L verimi tam olarak değiştirilmiş vahşi tipi nisin39rekombinant üretimi için rapor edilmiştir. SPI yöntemini kullanarak, hedef peptit/protein verimleri sık iyi ve miktarları vahşi tipi üretim48yakın ulaşabilirsiniz. İlk deneyler rekombinant vahşi tipi RiPP üretim seçilmiş auxotrophic ana test edilmelidir. Burada, prolin auxotrophic E. coli MG1655 Δçizersek:: frt Δyordam:: frt (DE3) ana bilgisayar zorlanma kullanıldı. NcAAs, yetiştirme ve indüksiyon birleşme için zamanlama yanı sıra orta kompozisyon ve sıcaklık maksimum peptid verim doğru optimize edilebilir.

Antimikrobiyal aktivite tahlil
Vahşi-türü rekombinant nisin üretim ve arıtma protokol yukarıdaki sonrası yapıldı. Bu durumda, prolin ncAA türevleri adımda 3.6 yerine kullanılmıştır. Bir antimikrobiyal aktivite tahlil RiPP üretim doğrulamak ve antimikrobiyal aktivite öncesi ve sonrası arıtma karşılaştırmak için kullanıldı. Faaliyet tahlil için elüsyon kesirler ve IMAC akışı aracılığıyla doğrudan kullanılan ve gram-pozitif L. lactis göstergesi zorlanma (Şekil 2) karşı test edilmiştir. Bu zorlanma NisP, E. coli hücre lysates içinde yer alan nisin türevleri ifade eder veya saf peptid örnekleri, sırasıyla, lider peptid proteolitik bölünme tarafından aktif hale gibi. Belli ki, akış yoluyla büyüme inhibitör faaliyet gösterdi. Bu biyoaktif malzeme IMAC sütunu bağlama değil tarafından açıklanabilir. Tüm test edilen elüsyon kesirler artmış aktivite IMAC tarafından O'nun öğesini peptid bir konsantrasyon gösteren unpurified örnek göre gösterdi. Not elüsyon tampon (olarak negatif kontrol) L. lactis büyüme bu tahlil etkisi değil.

figure-results-1
Resim 2 . IMAC arıtma recombinantly vahşi tipi nisin üretilen sonra test antimikrobiyal etkinliği. Elüsyon kesirler 5 ila 15 ve aracılığıyla akış IMAC arınma test edildi unpurified hücre lysate (OD600 normalleştirme için seyreltilmiş) ile karşılaştırıldığında L. lactis göstergesi zorlanma karşı. Büyüme inhibisyon haleler boyutunu antimikrobiyal aktivite gösterir. Kloramfenikol 400 µg/mL bir konsantrasyon, olumlu bir denetim ve IMAC elüsyon tampon negatif kontrol kullanıldı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Recombinantly antimikrobiyal aktivitesini kanıtlamak için altı farklı prolin analogları içeren türevleri, L. lactis göstergesi zorlanma inhibisyonu test etmek için bir faaliyet tahlil gerçekleştirildi nisin üretti. Şekil 3 büyüme inhibisyon beş prolin analogları kullanılarak üretilen altı örnekleri gösterir. En iyi sonuçları (değerlendirilecektir halo boyutları gibi) birleşme deneyleri analog (4R) için - fluoroproline, (4R) - gözlendi hidroksiprolin ve (4S)-methanoproline. Büyüme inhibisyon halo boyutu yaban tipi nisin için karşılaştırma üretilen ve buna paralel olarak, tüm üç nisin değişik benzer inhibisyon gücü gösterdi test. Ancak, halo boyutu tek başına olamaz AMP konsantrasyonu belirlenmemiştir belirli bir aktiviteyi kıçlarını kullanılır. Bu nedenle, deneyleri sadece niteliksel olup elde edilen nisin versiyonlarının antimikrobiyal aktivite korunmuş kaybolması veya test etmek için hizmet vermektedir. Belirli etkinliğini belirlemek için konsantrasyon nisin versiyonlarının quantified (bkz: tartışma) olması gerekir.

figure-results-2
Şekil 3 . Antimikrobiyal aktivite tahlil nisin türevlerini içeren hücre lysates üretilen yolu ile SPI prolin analogları ile. Nisin türevleri rekombinant vahşi-türü örnekleri ile karşılaştırılması. Tüm örneklerinin OD600olduğu-hücre lizis hasat hücre kültür yoğunluğu göreli olarak sonra normalleştirilmiş. Haleler bioactivity göstergesi zorlanma büyüme inhibisyonu şeklinde gösterir. İlk sıra soldan sağa: (4R)-fluoroproline, (4R) - hidroksiprolin, (4R) - methanoproline ve kloramfenikol (400 µg/mL; antimikrobiyal olumlu denetim). İkinci satır: (4S)-fluoroproline, (4S) - hidroksiprolin, (4S) - methanoproline ve prolin (vahşi tipi kontrol). Not kimyasal adlandırma; Örneğin, (4R) - fluoroproline da adlandırılır trans-4 - fluoroproline. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

LC-ESI-TOF kütle spektrometresi
IMAC arıtma sonraki ncAAs birleşme haline nisin LC-ESI-TOF kütle spektrometresi tarafından analiz edildi. Şekil 4 gösterir (4R) içeren bir nisin değişken deconvoluted kitle spectra-fluoroproline. Bu varyant yukarıda açıklandığı gibi saflaştırılmış ve hala lider taşınan LC-ESI-TOF kütle spektrometresi tarafından daha sonra analiz IMAC yapıldı. Şekil 4A ana tepe (4R) içeren değiştirilmiş nisin karşılık gelen-fluoroproline 6883.18 Da deconvoluted bir kitle ile (hesaplanan kütle 6882.05 Da, hesaplanan prolin ile karşılık gelen vahşi tipi peptid kütlesi 9 6864.06 Da konumdur). Alt bereket ve daha yüksek kütle ile iki doruklarına karşılık sodyum adducts belirtildiği gibi. Şekil 4 B ana farklı ücret tür deconvolution algoritması tarafından bulunan bileşik gösterir. Örneğin, 1148.11 m/z zirve six-fold şarj edilmiş türlere karşılık gelir ([M + 6H]6 +).

figure-results-3
Şekil 4 . LC-ESI-TOF kütle spektrometresi (4R) içeren IMAC saflaştırılmış rekombinant nisin versiyonlarının-fluoroproline. (A) (iç metin içinde dışarı Yakınlaştırılmış) kütle spektrometresi Kromatografik (hala lider taşıyan) nisin varyant (4R) için Deconvoluted-fluoroproline (beklenen kitleler (Da): [M + H]+ 6882.05, [M + Na]+ = 6904.03, = [M + 2Na]2 + 6926.02 =). (B) spectra türler [M + H]+için bileşik. Beklenen kitleler (Da): [M + 5H]5 + 1377.41, = [M + 6 H]6 + 1148.01, = [M + 7 H]7 + 984.15, = [M + 8 H]8 + 861.26, = [M + 9 H]9 + 765.67, = [M + 10 H]10 + 689.21, = [M + 11 H]11 + 626.64, = [M + 12 H] 12 + 574.50 =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Floresans mikroskobu
Rekombinant nisin ve ncAA içeren türevleri antimikrobiyal aktivite Floresans mikroskobu ile L. lactis göstergesi zorlanma doğrudan gözlem tarafından da gösterilebilir. Nil kırmızı, son derece hidrofobik bir floresan boya bakteriyel hücre zarı leke için kullanıldı. Şekil 5 hücre kültürü ve tek hücre morfolojisi toplama durumundan nitel değişimi gösterir. Hücreleri Nil kırmızı lekeli ve mikroskopi kapak slaytta yatırılır. Üst satır başında doğrudan hücreleri gösterir ne zaman tampon, rekombinant vahşi tipi nisin nisin (4R) içeren veya -fluoroproline, ya da (4R)-hidroksiprolin olduklarını da sözlerine ekledi. Alt paneli kuluçka 20 dakika sonra karşılık gelen görüntüleri gösterir.

figure-results-4
Şekil 5 . Gram-pozitif hücreler rekombinant nisin efektleri Floresans mikroskobu. 30 µL L. lactis göstergesi zorlanma mikroskobik görüntülerini (OD600 = 1) kırmızı (önce üst paneli) alınmıştır Nil ile işaretlenmiş ve (alt paneli) sonra 20 dk kuluçka 1 µL arabelleği(a)0.3 µL rekombinant vahşi tipi nisin (B) ile ve (4R) içeren 0.6 µL nisin türevleri-fluoroproline (C) ve (4R)-hidroksiprolin (D). Mavi daireler toplanmış veya deforme hücre, mavi oklar noktası nerede Difüzyon floresan membran parçalarının gözlenen bölgelere bölgeleriyle işaretleyin. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 5 A gösterir hücrelerinin genel görünümü gözlem 20 dakika içinde değişmedi. Sadece zaman gül sırasında yatırılır hücre sayısı ve bu nedenle, hücreleri daha büyük bir miktarda gözlenen bölge 80 µm x 80 µm içinde görünür. Şekil 5 B yabani türü nisin maruz 20 dakika sonra gram-pozitif hücreleri toplanan ortaya çıktı ve bulanık (mavi daireler ile işaretli) gösterir, düz ne zaman düşük miktarlarda (burada, 0.3 µL IMAC elüsyon) eklenmiştir. Buna ek olarak, hafif malzeme hücrelerden Nil ile kırmızı işaretli membran parçaları (mavi oklarla işaretlenmiş) süre sırasında seferber edildi gösteren arabellek içine yayılmış. Nisin6,49ile tedavi üzerine gerçekleşmesini gösterildiği bu bulgular hücre lizis göstermektedir. Benzer etkileri nisin varyant (4R) içeren ile kuluçka sonra - fluoroproline (şekil 5C) ve (4R) içeren nisin - gözlendi hidroksiprolin (şekil 5D) her iki gösterilen büyük tutarları çarpık ve toplanan hücre denetimi örneğini (şekil 5A) işaretli tersine 20 dakika sonra.

BileşenKonsantrasyon
(NH4) 2 Yani4 7.5 mM
NaCl8.5 mM
KH2PO4 22 mM
K2HPO4 50 mM
MgSO4 1 mM
D-glikoz20 mM
Tüm kanonik amino asitler
(eski yerine koymak için bir hariç)		50 mg/L
CA2 + 1 µg/mL
Fe2 + 1 µg/mL
Eser elementler
(Cu2 +, Zn2 +, Mn2 +, MoOH2 +)		0,01 µg/mL
Tiamin10 µg/mL
Biotin10 µg/mL

Tablo 1. Adım 2 göre hazırlık sonra kompozisyon NMM19 kimyasal olarak tanımlanmış Bakteriyel büyüme orta.

Tartışma

SPI prolin analogları sokmak için kullanarak, hedeflenen nisin yapıları önemli ölçüde, roman peptid türevleri oluşturma benzersiz sıra kombinasyonları ve kimyasal özellikleri ile değiştirilebilir. Bu şekilde, klasik gen teknolojisinin temel sınırı, hangi 20 cAAs yan zinciri kimyaları için sınırlıdır atlatılabilir. İn vivo olarak yukarıda nisin kimyasal çeşitlendirilmesi doğal PTMs tamamlayacak ve önemli ölçüde RiPPs kimyasal alanı artırmak için genel bir yaklaşım gösterir. Bizce doğal amino asitler repertuarı genişletmek özellikle amper için büyük söz sahibidir. Proteinler, işlevleri muazzam bir dizi üç boyutlu yapılarda 20 cAAs tanımlanmış bir düzenleme ile gerçekleştirilebilir. 7-100 aa uzunluğu3sadece, gibi yapısal özellikleri cAAs yoluyla ulaşmak için yolu amper için sınırlı olacaktır. Böylece doğal amper RiPPs şeklinde genellikle yoğun olarak post-translationally tarihinde4olan şaşırtıcı değildir. Aynı şekilde ncAAs alternatif yapı taşları olarak onların farmakokinetik ve Farmakodinamik parametreleri (orada Baumann vd 201735 ve referanslar bakın) geliştirmek için büyük sözü tutun.

Bu iş faydaları bir deneysel nispeten kolay kurulum, kolay yürütme ve yüksek tekrarlanabilirlik kullanılan SPI metodolojisi. Küresel ikame nedeniyle hedef peptidler içine birden fazla site ncAA birleşme de mümkün olduğunu. Öte yandan, yöntem amino asitlerin sık sık hedef gen ürünü içinde meydana gelen değişimi için yeterli olmayabilir. Prensip olarak, istenmeyen pozisyonlar site yönettiği mutagenesis tarafından değiştirilebilir, ancak bu ek değişiklikler de yapısı ve bioactivity de dahil olmak üzere çeşitli AMP özellikler etkileyebilir. Üretim için bir auxotrophic zor kullanıma hazır olduğunda, birkaç ncAAs genetik düzeyde kapsamlı değişiklikler gerektirmeden test edilebilir. Ayrıca, yöntem auxotrophic E. coli için sınırlı değildir suşları, ama doğal üretim ana bilgisayar kullanılarak da gerçekleştirilebilir. Örneğin, Zhou ve ark. SPI roman RiPPs üretiminin da inşaat olduğunu gösterdi doğal olarak Trp-auxotroph L. lactis: kullanarak tanımlanan medya, üç triptofan analogları nisin50dört pozisyonlarda dahil.

SPI yöntemi için küresel değiştirme-in belgili tanımlık seçilmek yol açar bu yana cAA ncAA tarafından genellikle geniş bir hedef peptidler ve proteinler için uygulanabilir. Bir aralığı auxotrophic E. coli suşları mevcuttur (bkz. Adım 1), birkaç cAAs yerine ncAAs tarafından test edilecek her izin. Analogları metAkullanarak dahil bir araya geldi-eksik suşları (Örneğin, B834(DE3)) en çok istihdam edilmektedir. Azidohomoalanine (Aha) ve homopropargylglycine (Hpg), verimli bir şekilde birleştirilebilen piyasada bulunan ncAAs isostructural Met analogları örnekleridir. Her ikisi de ek bir uyumlu ALKİN ya da azid işlevleri, anılan sıraya göre taşıyan moleküller izin bioorthogonal kolları tanıtmak. Örneğin, floresan boyalar veya polietilen glikol (PEG) moieties (I) bakır tarafından eklenebilir-katalize azid ALKİN cycloaddition (CuAAC)51.

Her ne kadar her iki rekombinant ncAA birleşme yöntemi (SPI ve SCS) genellikle yeterli hedef miktarda elde etmek, verimleri kez göre karşılık gelen peptidler ve proteinler vahşi tipi üretim azalır. Eroine kez üretim verimliliği ile ilişkilendirmek gibi ek arıtma adımlar, özellikle düşük bol türler için gerekli olabilir. Rekombinant nisin üretim bu özel durumda, O'nun öğesini lideri sıra büyük ölçüde RiPP arıtma hücre lysates üzerinden seçici zenginleştirme basitleştirir. Bu protokol için gösterilen arıtma saflık ve nisin konsantrasyonu artırır, ancak genellikle AMP eroine verim ve belirli etkinliğini belirlemek için yeterli verim. IMAC yanı sıra sık kullanılan AMP arıtma yöntemleri HPLC, iyon Kromatografi (IEC) ve yağış içerir (örneğin. aseton veya trichloroacetic asit (TCA) kullanarak) veya bir multistep arıtma düzeni52 ortaya çıkan kombinasyon bunların - . Bu unutulmamalıdır ki onların yaygın olarak polycationic doğa IEC arıtma kolaylaştırabilir. Dağılması sık arıtılmış amper depolamak için kullanılır.

İdeal olarak, birleşme için amper içine ncAAs uygun fiyatlarla piyasada bulunan ya da olmalıdır kolayca basit ve tekrarlanabilir kimyasal sentez iletişim kuralları tarafından üretilen. SPI yöntemi için eşit derecede önemli bir önkoşul ncAA tanınan, aktif ve soydaş tRNA endojen veya ortak ifade aaRS tarafından tahsil olmasıdır. Bu amino asit harekete geçirmek ya da tRNA aminoacylation tahlil53tarafından test edilmiş vitro olabilir. Kolay bir alternatif olarak SPI test ifadeler gibi yeşil flüoresan protein (GFP) modeli proteinlerin varlığı hem de yürütülen ve ncAA takviyesi olmaması durumunda gerçekleştirilebilir. Ayrıca, çözünürlük büyüme orta ve hücre geçirgenliği hem de kimyasal istikrar önemli faktörler oluşturmaktadır.

Bu örnekte, antimikrobiyal aktivite bir gram-pozitif göstergesi yük kullanarak gösterildi. Lider peptidaz NisP ifade eder gibi son adım nisin olgunlaşma katalizlenir. Lider sıra kaldırılması da saf NisP50 veya tripsin54ile tedavi tarafından gerçekleştirilen vitro (O'nun-arıtma amaçlar için öğesini) olabilir. Bu eser kapsamı dışındadır, patojen organizmalar ve kökenlerinin dirençli suşların bakteriyostatik veya bakteri yok edici inhibisyonu için benzer bir metodoloji kullanarak amper tarafından sınanabilir. Klinik hedef türler arasında MRSA, MDR Mycobacterium tüberküloz, VRE, Acinetobacter baumannii, Streptococcus pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa ve Klebsiella pneumoniaebulunur. Agar plaka Difüzyon yanı sıra tahlil burada anlatılan büyüme inhibisyon da bakteriyel türler ile aşılanmış ve AMP ile desteklenmiş uygun sıvı medya kullanarak gerçekleştirilebilir. Suyu seyreltme yöntemleri kullanarak, minimum inhibitör konsantrasyonu (MIC) saf peptidler55kullanarak belirlenebilir. Burada sunulan faaliyet tahlil de bioactivity ve AMP içeren çözümler göreli başvuru bileşenleri, örneğin ticari olarak mevcut nisin potens tahmin etmek için kullanılabilir.

Rekombinant RiPPs sık sık sık PTM genlerin eş ifade içeren uygun39, yapımıdır. En kısa zamanda üretim zorlanma uygun bir ncAA içeren bir kimyasal olarak tanımlanmış veya sentetik en az orta aktarılır, karşılık gelen cAA kalıntı özgü değiştirilmesi yer alır. Böylece, diğer RiPPs rekombinant üretim mümkün olduğunu ve koşullar nerede hedef ürün yeterli miktarda ncAA birleşme ve PTM verim-ebilmek bulunmak koşuluyla aynı metodoloji tarafından üretilebilir. Konak hücre Proteom yanı sıra, peptid PTM makine Ayrıca SPI sırasında ncAA değiştirilmiş olabileceğini unutmayın. Sonuç olarak, hedef ifade indüksiyon zamanlaması ve aşağıdaki kuluçka süresinin uzunluğu optimizasyonu gerektirebilir. NcAA birleşme PTM enzimler içine onların istikrar ve etkinlik etkileyebilir beri işlenmiş RiPP üretimi ilke olarak etkilenebilir. Yeterli PTM enzim etkinliği işlenmiş prepeptide oluşumu ile MS ve bioactivity deneyleri tarafından tespit olarak belirtilir. Yukarıda tanıtılan gibi farklı indüklenebilir rehberleri PTM üretmek için istihdam olabilir genlerinde ilk (ncAA yokluğu) takip habercisi peptid gen indüksiyon tarafından ncAA huzurunda. Genel olarak, hedef peptid cAA içeren üretim habercisi gen sıkı bir baskı gerekli bu yüzden ncAA toplamadan önce bastırılmış gerekir. Bu protokolde, bu katabolik baskı, glikoz büyüme orta aracılığıyla elde edilir. Özellikle prepeptide işleme için gerekli PTM enzimler genellikle genetik olarak uzak ana bilgisayardan kaynaklanan beri rekombinant üretim henüz olmamıştır eğer ilgili genlerin ifade sıcaklık ve kodon kullanımı en iyi duruma getirme gerektirebilir kurulan. Prensip olarak, prepeptide içinde ncAAs varlığı tanıma ve işleme PTM enzimlerin nisin durumunda NisBC ve NisP engelleyebilir. NcAA kuruluşunun amper içine, böylece ilk uygun ifade koşulları ve AMP etkinliği tahlil güvenilirliğini belirlemek için küçük ölçekli ifade deneyler gerçekleştirmek için önerilir.

Açıklamalar

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Teşekkürler

J.H.N., tüberküloz ve M.B. kabul AB FW7 program (SYNPEPTIDE) tarafından fon. F.-js ve T.F. Federal MEB ve bilim (BMBF Program "HSP 2020", TU-WIMIplus proje SynTUBio) ve Alman Araştırma Vakfı (küme of Excellence "Kataliz Unifying kavramlar") tarafından fon kabul edersiniz.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
sodyum klorürCarl Roth, AlmanyaP029
guanidin hidroklorürCarl Roth, Almanya0035.2
dipotasyum hidrojen fosfatCarl Roth, AlmanyaP749.3
potasyum dihidrojen fosfatCarl Roth, Almanya3904.3
sodyum dihidrojen fosfat monohidratCarl Roth, AlmanyaK300.2
disodyum hidrojen fosfatCarl Roth, AlmanyaP030.2
L-alaninCarl Roth, Almanya3076.2
L-argininCarl Roth, Almanya3144.3
L-asparagin monohidratCarl Roth, AlmanyaHN23.1
L-aspartik asitCarl Roth, AlmanyaT202.1
L-sisteinCarl Roth, Almanya3467.3
L-glutaminCarl Roth, Almanya3772.1
L-glutamik asitCarl Roth, Almanya3774.1
L-glisinCarl Roth, Almanya3187.3
L-histidinCarl Roth, Almanya3852.3
L-izolösinCarl Roth, Almanya3922.3
L-lösinCarl Roth, Almanya3984.3
L-lizin monohidratCarl Roth, Almanya4207.2
L-metiyoninCarl Roth, Almanya9359.4
L-fenilalaninCarl Roth, Almanya4491.2
L-prolinCarl Roth, AlmanyaT205.3
L-serinCarl Roth, Almanya4682.4
L-treoninCarl Roth, AlmanyaT206.2
L-triptofanCarl Roth, Almanya4858.2
L-tirozinCarl Roth, AlmanyaT207.2
L-valinCarl Roth, Almanya4879.4
amonyum sülfatCarl Roth, Almanya3746.3
magnezyum sülfatCarl Roth, Almanya0261.2
D-glikozCarl Roth, Almanya6780erimiş agar kalsiyum klorür içine eklemek için% 20 (a / h) çözelti hazırlayın
Carl Roth, AlmanyaPN93.2
demir (II) klorürSigma-Aldrich, Almanya372870
tiamin hidroklorürSigma-Aldrich, AlmanyaT1270
biotinCarl Roth, Almanya3822.2
bakır(II) sülfatMerck, Almanya102792
manganez(II) klorürCarl Roth, AlmanyaKK36.2
çinko klorürMerck, Almanya108816
immonium ortomolibdatSigma-Aldrich, Almanya277908
gliserolCarl Roth, Almanya7533.3
izopropil ve beta;-D-1-tiyokalaktopiranosidSigma-Aldrich, AlmanyaI6758
ampisilin sodyum tuzuCarl Roth, AlmanyaK029.5çalışma konsantrasyonu 100 &mikro; E. coli için g / mL, ddH < sub > <2 / sub >
amisin sülfatCarl Roth, AlmanyaT832.2çalışma konsantrasyonu 50 & mikro'da 100 mg / mL stok hazırlayın; E. coli için g / mL, ddH < sub>2 O
kloramfenikolRoth, Almanya3886.1çalışma konsantrasyonu 5 & mikro'da 50 mg / mL stok hazırlayın; L. lactis için g / mL, etanol
(4S) -floroprolinBachem, İsviçreF-3970
(4S) -hidroksiprolinBachem, İsviçreF-1395
(4R) -hidroksiprolinBachem, İsviçreF-2980
(4S) -metanoprolinkimyasal olarak sentezlenmiş
(4R) -metanotrolinkimyasal olarak sentezlenmiş
hidroklorik asit (HCl)Carl Roth, AlmanyaP074.4
etanolVWR, Almanya20825.324
M17 et suyuSigmal-Aldrich, Almanya56156ticari ürün, bkz. Terzaghi BE & Sandine WE, Appl Microbiol., 1975, 29(6):807-13 içindekiler ve hazırlık için
agar-agarCarl Roth, Almanya5210.5
Lactococcus lactis'ten Nisin Sigma-Aldrich, AlmanyaN5764ticari ürünü, biyoaktivite
dimetil sülfoksit (DMSO)kullanılabilirCarl Roth, AlmanyaA994.1
imidazolCarl Roth, Almanya3899.3
LC-MS için 1.5 mL otomatik örnekleyici şişesiSigma-Aldrich, AlmanyaSupelco 854165
asetonitrilVWR, AlmanyaHiPerSolv LC-MS için CHROMANORM ULTRA, 83642LC-MS sınıfı gerekli
formik asitVWR, AlmanyaHiPerSolv LC-MS için CHROMANORM, 84865LC-MS sınıfı gereklidir
1 mL Ni-NTA IMAC kolonu, örneğin HisTrap FF Crude GEHealthcare, UK29-0486-31için farklı üreticiler ve reçineler mevcuttur
; m şişe üstü filtre ünitesiVWR, Almanya10040-470kullanarak çözeltilerin steril filtrasyonu
; m şırınga filtresi PVDF membranıCarl Roth, AlmanyaCCY1.1şırınga kullanarak çözeltilerin steril filtrasyonu ve hücre lizatlarından partikülleri uzaklaştırmak için
luer-lock şırınga, PP, 50 mlCarl Roth, AlmanyaT552.2çözeltilerin steril filtrasyonu   
1,5 mL Eppendorf tüpleriEppendorf, Almanya30120086
petri kapları (polistiren, steril)Carl Roth, AlmanyaTA19
Nil kırmızısıSigma-Aldrich, Almanya72485
E. coli & Delta; proA suşuCGSC, Keio koleksiyonuJW0233-2prolin-oksotrofik E. coli K-12 suşu
E. coli B834 (DE3)Novagen (Merck), Almanya69041metiyonin-oksotrofik E. coli B suşu
ve lambda; DE3 Lizojenizasyon KitiNovagen (Merck), Almanya69734-3
Lactococcus lactis NZ9000 pNG nisPTbakteri indikatör suşu, bakınız Khusainov R & Kuipers OP, PLoS One, 8 (9),
1,5 mL Eppendorf tüpleri içinEppendorf, Almanya5427 R
peristaltik pompaGE Healthcare, İngiltereP1
FPLC sistemiGE Healthcare, UK& AUML; kta Purifier 10 veya benzeri
ters mikroskopNikonTI Eclipse geniş alan floresan mikroskobu  100x (NA 1.4) objektif ve Cıva Lambasıile floresan mikroskobu
elektron çarpma CCD (EMCCD) kameraAndor Technologies, İngiltereAndor Luca Floresan mikroskobu için örnek kurulum
floresan uyarma filtresiThorlabs, ABDDikroik küp (TLV-U-MF2-TRITC)floresan mikroskobu için örnek kurulum
Floresan Emisyon FiltresiAHF Analysentechnik, AlmanyaT 560 LPXRörnek floresan mikroskobu
kapak kayması için kurulum 24 x 60 mmCarl Roth, AlmanyaLH26.1floresan mikroskobu için örnek kurulum
Daldırma YağıCarl Zeiss, AlmanyaImmersol 518 Ffloresan mikroskobu
probu sonicatorBandelin, AlmanyaSonopuls HD3200 sonotrotlu MS-72200 W maksimum HF çıkışı
C5 HPLC kolonu (2.1x100 mm, 3 & mikro; m parçacık boyutu)Sigma-Aldrich, Almanya567227-Ukütle spektrometresi için örnek kurulum
HPLC sistemine bağlı ESI-TOFAGILENT, ABDKütle spektrometresi için1260 HPLC örnek kurulumu ile Agilent 6530 Doğru Kütle QTOF
kan Carl (4R) -floroprolin Bachem, İsviçre F-3975 için referans olarak IMAC 0.45 ve mikro vakum pompası 0.45 ve mikro bir e74890 tezgah üstü santrifüj için örnek kurulum için örnek kurulum

Kaynaklar

  1. Ferri, M., Ranucci, E., Romagnoli, P., Giaccone, V. Antimicrobial resistance: A global emerging threat to public health systems. Crit Rev Food Sci Nutr. 57 (13), 2857-2876 (2017).
  2. Bahar, A. A., Ren, D. Antimicrobial peptides. Pharmaceuticals. 6 (12), 1543-1575 (2013).
  3. Ageitos, J. M., Sánchez-Pérez, A., Calo-Mata, P., Villa, T. G. Antimicrobial peptides (AMPs): Ancient compounds that represent novel weapons in the fight against bacteria. Biochem Pharmacol. 133, 117-138 (2017).
  4. Arnison, P. G., et al. Ribosomally synthesized and post-translationally modified peptide natural products: overview and recommendations for a universal nomenclature. Nat Prod Rep. 30 (1), 108-160 (2013).
  5. Lubelski, J., Rink, R., Khusainov, R., Moll, G. N., Kuipers, O. P. Biosynthesis, immunity, regulation, mode of action and engineering of the model lantibiotic nisin. Cell Mol Life Sci. 65 (3), 455-476 (2008).
  6. Shin, J. M., Gwak, J. W., Kamarajan, P., Fenno, J. C., Rickard, A. H., Kapila, Y. L. Biomedical applications of nisin. J Appl Microbiol. 120 (6), 1449-1465 (2016).
  7. Scherer, K. M., Spille, J. -H., Sahl, H. -G., Grein, F., Kubitscheck, U. The lantibiotic nisin induces lipid II aggregation, causing membrane instability and vesicle budding. Biophys J. 108 (5), 1114-1124 (2015).
  8. Jung, G. Lantibiotica - ribosomal synthetisierte Polypeptidwirkstoffe mit Sulfidbrücken und α,β-Didehydroaminosäuren. Angew Chemie. 103 (9), 1067-1084 (1991).
  9. Rink, R., et al. Lantibiotic structures as guidelines for the design of peptides that can be modified by lantibiotic enzymes. Biochemistry. 44 (24), 8873-8882 (2005).
  10. Lagedroste, M., Smits, S. H. J., Schmitt, L. Substrate Specificity of the Secreted Nisin Leader Peptidase NisP. Biochemistry. 56 (30), 4005-4014 (2017).
  11. Ross, A. C., Liu, H., Pattabiraman, V. R., Vederas, J. C. Synthesis of the lantibiotic lactocin S using peptide cyclizations on solid phase. J Am Chem Soc. 132 (2), 462-463 (2010).
  12. Fukase, K., et al. Synthetic Study on Peptide Antibiotic Nisin. V. Total Synthesis of Nisin. Bull Chem Soc Jpn. 65 (8), 2227-2240 (1992).
  13. Dumas, A., Lercher, L., Spicer, C. D., Davis, B. G. Designing logical codon reassignment - Expanding the chemistry in biology. Chem Sci. 6 (1), 50-69 (2015).
  14. Kuthning, A., Durkin, P., Oehm, S., Hoesl, M. G., Budisa, N., Süssmuth, R. D. Towards Biocontained Cell Factories: An Evolutionarily Adapted Escherichia coli Strain Produces a New-to-nature Bioactive Lantibiotic Containing Thienopyrrole-Alanine. Sci Rep. 6, 33447(2016).
  15. Piscotta, F. J., Tharp, J. M., Liu, W. R., Link, A. J. Expanding the chemical diversity of lasso peptide MccJ25 with genetically encoded noncanonical amino acids. Chem Commun (Camb). 51 (2), 409-412 (2015).
  16. Hartman, M. C. T., Josephson, K., Lin, C. -W., Szostak, J. W. An expanded set of amino acid analogs for the ribosomal translation of unnatural peptides. PLoS One. 2 (10), 972(2007).
  17. Johnson, J. A., Lu, Y. Y., Van Deventer, J. A., Tirrell, D. A. Residue-specific incorporation of non-canonical amino acids into proteins: recent developments and applications. Curr Opin Chem Biol. 14 (6), 774-780 (2010).
  18. Ibba, M., Söll, D. Aminoacyl-tRNAs: setting the limits of the genetic code. Genes Dev. 18 (7), 731-738 (2004).
  19. Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J Mol Biol. 189 (1), 113-130 (1986).
  20. Budisa, N., Steipe, B., Demange, P., Eckerskorn, C., Kellermann, J., Huber, R. High-level biosynthetic substitution of methionine in proteins by its analogs 2-aminohexanoic acid, selenomethionine, telluromethionine and ethionine in Escherichia coli. Eur J Biochem. 230 (2), 788-796 (1995).
  21. Rink, R., et al. Dissection and modulation of the four distinct activities of nisin by mutagenesis of rings A and B and by C-terminal truncation. Appl Environ Microbiol. 73 (18), 5809-5816 (2007).
  22. Kubyshkin, V., Durkin, P., Budisa, N. Energetic contribution to both acidity and conformational stability in peptide models. New J Chem. 40 (6), 5209-5220 (2016).
  23. Molloy, E. M., Field, D., O'Connor, P. M., Cotter, P. D., Hill, C., Ross, R. P. Saturation mutagenesis of lysine 12 leads to the identification of derivatives of nisin A with enhanced antimicrobial activity. PLoS One. 8 (3), 58530(2013).
  24. Wang, L., Brock, A., Herberich, B., Schultz, P. G. Expanding the genetic code of Escherichia coli. Science. 292 (5516), 498-500 (2001).
  25. Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annu Rev Biochem. 79, 413-444 (2010).
  26. Anderson, J. C., Wu, N., Santoro, S. W., Lakshman, V., King, D. S., Schultz, P. G. An expanded genetic code with a functional quadruplet codon. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (20), 7566-7571 (2004).
  27. Zambaldo, C., Luo, X., Mehta, A. P., Schultz, P. G. Recombinant macrocyclic lanthipeptides incorporating non-canonical amino acids. J Am Chem Soc. 139 (34), 11646-11649 (2017).
  28. Al Toma, R. S., et al. Site-directed and global incorporation of orthogonal and isostructural noncanonical amino acids into the ribosomal lasso peptide capistruin. Chembiochem. 16 (3), 503-509 (2015).
  29. Chatterjee, A., Xiao, H., Schultz, P. G. Evolution of multiple, mutually orthogonal prolyl-tRNA synthetase/tRNA pairs for unnatural amino acid mutagenesis in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (37), 14841-14846 (2012).
  30. Budisa, N., Pal, P. P. Designing novel spectral classes of proteins with a tryptophan-expanded genetic code. Biol Chem. 385 (10), 893-904 (2004).
  31. Voller, J. -s, Thi To, T. M., Biava, H., Koksch, B., Budisa, N. Global substitution of hemeproteins with noncanonical amino acids in Escherichia coli with intact cofactor maturation machinery. Enzyme Microb Technol. 106, 55-59 (2017).
  32. Moghal, A., Hwang, L., Faull, K., Ibba, M. Multiple Quality Control Pathways Limit Non-protein Amino Acid Use by Yeast Cytoplasmic Phenylalanyl-tRNA Synthetase. J Biol Chem. 291 (30), 15796-15805 (2016).
  33. Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (12), 6640-6645 (2000).
  34. Engelke, G., Gutowski-Eckel, Z., Hammelmann, M., Entian, K. D. Biosynthesis of the lantibiotic nisin: genomic organization and membrane localization of the NisB protein. Appl Environ Microbiol. 58 (11), 3730-3743 (1992).
  35. Baumann, T., Nickling, J. H., Bartholomae, M., Buivydas, A., Kuipers, O. P., Budisa, N. Prospects of In vivo Incorporation of Non-canonical Amino Acids for the Chemical Diversification of Antimicrobial Peptides. Front Microbiol. 8, 124(2017).
  36. Plat, A., Kluskens, L. D., Kuipers, A., Rink, R., Moll, G. N. Requirements of the engineered leader peptide of nisin for inducing modification, export, and cleavage. Appl Environ Microbiol. 77 (2), 604-611 (2011).
  37. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: The Heat Shock Method. J Vis Exp. , (2017).
  38. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: Electroporation. J Vis Exp. , (2017).
  39. Shi, Y., Yang, X., Garg, N., van der Donk, W. A. Production of lantipeptides in Escherichia coli. J Am Chem Soc. 133 (8), 2338-2341 (2011).
  40. Hochuli, E., Bannwarth, W., Döbeli, H., Gentz, R., Stüber, D. Genetic Approach to Facilitate Purification of Recombinant Proteins with a Novel Metal Chelate Adsorbent. Nat Biotechnol. 6 (11), 1321-1325 (1988).
  41. Zhang, Z., Marshall, A. G. A universal algorithm for fast and automated charge state deconvolution of electrospray mass-to-charge ratio spectra. J Am Soc Mass Spectrom. 9 (3), 225-233 (1998).
  42. JoVE Science Education Database. High-Performance Liquid Chromatography (HPLC). J Vis Exp. , (2017).
  43. JoVE Science Education Database. Dialysis: Diffusion Based Separation. J Vis Exp. , (2017).
  44. Khusainov, R., Kuipers, O. P. The presence of modifiable residues in the core peptide part of precursor nisin is not crucial for precursor nisin interactions with NisB- and NisC. PLoS One. 8 (9), 74890(2013).
  45. Terzaghi, B. E., Sandine, W. E. Improved medium for lactic streptococci and their bacteriophages. Appl Microbiol. 29 (6), 807-813 (1975).
  46. Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Mol Reprod Dev. 82 (7-8), 518-529 (2015).
  47. Phosphate-buffered saline (PBS). Cold Spring Harb Protoc. 2006 (1), (2006).
  48. van Hest, J. C. M., Tirrell, D. A. Efficient introduction of alkene functionality into proteins in vivo. Febs Lett. 428 (1-2), 68-70 (1998).
  49. Prince, A., et al. Lipid-II Independent Antimicrobial Mechanism of Nisin Depends On Its Crowding And Degree Of Oligomerization. Sci Rep. 6 (1), 37908(2016).
  50. Zhou, L., et al. Incorporation of tryptophan analogues into the lantibiotic nisin. Amino Acids. 48 (5), 1309-1318 (2016).
  51. Presolski, S. I., Hong, V. P., Finn, M. G. Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Click Chemistry for Bioconjugation. Curr Protoc Chem Biol. 3 (4), 153-162 (2011).
  52. Abts, A., et al. Easy and rapid purification of highly active nisin. Int J Pept. 2011, 175145(2011).
  53. Francklyn, C. S., First, E. A., Perona, J. J., Hou, Y. -M. Methods for kinetic and thermodynamic analysis of aminoacyl-tRNA synthetases. Methods. 44 (2), 100-118 (2008).
  54. van Heel, A. J., et al. Production and Modification of Five Novel Lantibiotics Using the Promiscuous Nisin Modification Machinery. ACS Synth Biol. 5 (10), 1146-1154 (2016).
  55. Wiegand, I., Hilpert, K., Hancock, R. E. W. Agar and broth dilution methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances. Nat Protoc. 3 (2), 163-175 (2008).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Nisin VaryantlarAgar Dif zyon DeneyiFloresan MikroskopiK tle SpektrometrisiProlin AnaloglarEscherichia coliLactococcus lactis
Antimikrobiyal peptidler kanonik olmayan Amino asitler ve seçici basınç eklenmesi tarafından üretilen
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.