Kalibrasyon-Alerjik Vitro miktar Protein Homo-Oligomerizasyonda ticari araçları ve ücretsiz, açık kaynak parlaklık analiz yazılımı kullanarak

Özet

Bu iletişim kuralı için ticari ışık mikroskobu tarama kullanarak floresans dalgalanma spektroskopisi üzerinde temel protein homo-Oligomerizasyonda vitro miktarının kalibrasyon-Alerjik bir yaklaşım açıklar. Doğru satın alma ayarları ve analiz yöntemleri gösterilir.

Özet

Numarası ve parlaklık protein homo-Oligomerizasyonda algılamak için bir kalibrasyon-Alerjik floresans dalgalanma spektroskopisi (FFS) tekniğidir. Bu geleneksel bir confocal mikroskop dijital yangın dedektörleri ile donatılmış kullanarak istihdam edilebilir. Vitro tekniği kullanımı için bir iletişim kuralı aracılığıyla nerede numarası ve parlaklık doğru önce ve sonra dimerizing uyuşturucu AP20187 ilavesi mVenus etiketli FKBP12F36V oligomeric durumunu ölçmek için görülebilir bir kullanım örneği gösterilir. Doğru mikroskop edinme parametreleri ve doğru veri ön işleme ve analiz yöntemleri kullanmanın önemini ele alınmıştır. Özellikle, photobleaching düzeltme tercih önemi vurgulanmıştır. Bu ucuz Yöntem protein-protein etkileşimler birçok biyolojik bağlamlarda eğitim için istihdam edilebilir.

Giriş

Protein-protein etkileşimleri ben n in Vitro

Geleneksel olarak, kristalografisi ve cryo-elektron mikroskobu (cryoEM) ile birlikte nükleer manyetik rezonans deneyler doğru proteinlerin üç boyutlu mimari tanımlamak için ve işlevlerine göre anlaması için seçilmiş teknolojiler vardır onların yüksek çözünürlüklü yapısal detayları scrutinizing. Proteinler, ancak, statik yapılar değildir ve konformasyon değişiklikleri ve titreşim çeşitli zaman ve mekan içinde tabi olabilir. Bu yapısal yüzden bilgi crystallographic veya CryoEM veri (Örneğin, moleküler dinamiği simülasyonları ve tek molekül teknikleri) diğer teknikleri ile tamamlanabilir: işlev bir proteinin konformasyon için ilişkilidir değişiklikleri ve etkileşimleri ve bu bilgileri bir statik yapısı içinde mevcut değil. İntra moleküler dynamics için yoklama için çok etkili¹Forster rezonans enerji transferi (smFRET) tek molekül dayalı teknikler vardır. Bu yaklaşımlardan farklı altgrupları karmaşık medya olarak değerlendirmek edebiliyoruz. Bu değişikliklerin hızlı ve veri (Örneğin, ikinci aralığı için nanosecond) edinimi sırasında oluşan çok önemlidir.

İki ana yaklaşım yaygın olarak algılamak ve bu değişiklikleri ölçmek için istihdam edilmektedir: proteinler çözüm ve yüzey-immobilizasyon. Arası moleküler etkileşimleri ve özellikle, ligandlar tarafından indüklenen dimerization süreci algılama için smFRET her zaman en iyi araç değildir. Gerçekten de, sadece mesafe (≈10 nm) ama aynı zamanda iki dipoller (donör ve alıcısı, χ²) yönünü FRET bağlıdır ve donör emisyon alıcısı'nın emilimi spectra², ama belki de bu son durum ile çakışma azdır koşuluyla deneyci olabilir önemli değil FRET çift açmadı. SmFRET homo-dimerization problama için belirli bir dezavantaj faiz protein etiketleme üzerinden gelir: hetero smFRET için dimerization sadece olabilir % 50 tespit (Yani, hetero-perde sadece donör-alıcısı algılamak mümkün olacak ve alıcısı-donör homo-dimer ama değil donör verici veya alıcısı-alıcısı, dimer diğer % 50). Floresans korelasyon spektroskopisi (FCS) ve türevleri (protein difüzyon sabitler ve bağlama sabitler vitro tespit etmek için FCCS, vb³) başka bir alternatif kullanmaktır. Bu yaklaşımların tamamen homo-dimerization de ölçmek mümkün değildir, FCS bir önlemler konsantrasyon ve difüzyon ve RADIUS ve difüzyon katsayısı bir akışkanın parçacık olduğu gibi çok kötü moleküler ağırlık bağlıdır; Örneğin molekül ağırlığı 10 kat artış sadece 2,15 kat değişim difüzyon katsayısı⁴ima. İki renkli FCS veya FCCS, homo-dimer sadece % 50'si aynı sebepten dolayı yukarıdaki gibi görülecektir. Homo-dimerization vitro ve in vivo algılamak için en pratik ve kantitatif yaklaşımlar homo-perde⁵ ve numarası ve parlaklık (Y & B)⁶vardır. Aslında verildi ki homo-perde gerektirir belirli araçları kurtarma anizotropi değeri (Yani, optik elemanları/paralel ve dikey polarizasyon kurtarmak için analiz sistemleri), N & B sunulan burada olumlu bir teknik olarak protein homo-dimerization ve toplama algılar. O-ebilmek var olmak vitro ve in vivo ticari bir kurulum ile istihdam.

Numarası ve parlaklık

N & B son zamanlarda gözden geçirilmiş⁷oldu. O eleştiriyi canlı hücreleri tekniğinde uygulanması üzerinde duruldu. İçin faydalıdır bu denklemler olarak matematiksel biçimcilik verilere uygulanacak yeniden toplanan içinde vitro. İlk olarak, bazı terimleri ve matematiksel miktarları tanımlamak gereklidir:

• Birbirimize bağlıyız molekülleri bir dizi bir varlıktır.
• Bir varlığın parlaklık ε birim birim zamanda (kare) başına yayar fotonlar sayısıdır.
• n varlıklar mevcut sayısıdır.
• Bir görüntü serisi boyunca belirli bir piksel için < ı > onun ortalama yoğunluğu ve σ² şiddeti varyans olmasıdır.

O zaman, foton sayma dedektörleri ve varsayarak hareket eden varlıklar ve hiçbir arka plan ile

N B ve belirgin numarası olan belirgin parlaklıkolduğunu. Bu sonuçlar

Gamze vd. ⁸ gösterdi analog ekipman ile bir üç düzeltme dönem gerekir: S faktörü, arka plan ofsetve okuma gürültü σ₀². O zaman, tekrar hareket eden varlıklar varsayarsak,

veren

Yukarıdaki Denklem için farklı olduğuna dikkat edin gamze ve ark. içinde verilen ⁸ ve sonraki bir daha gözden geçirme. ⁷ içinde gamze vd. S payda içinde bir yazım hatası nedeniyle ihmal ve bu hata İnceleme çoğaltılamaz. Yukarıdaki denklem doğru olandır. Talimatları Sölçmek için uzaklık ve σ₀² - anlamlarını - açıklaması ile birlikte verilen tarafından gamze vd. ⁸

Parlaklık ε akışkanın varlıkların oligomeric durumuna orantılıdır: ε iki kez ve benzeri trimers için olduğu gibi monomerleri, iki kez hexamers için büyük için olduğu gibi monomerleri, trimers için üç kez büyük için olduğu gibi dimer için büyük olacak. Böylece parlaklık ε, ölçme, bir multimerization her türlü ölçmek.

Varsa mevcut, sayı oligomeric Birleşik bir karışımı ve parlaklığı bireysel oligomeric Birleşik mevcut kurtarma yeteneğine sahip değildir. Bu tekniğin bir kısıtlamadır.

Algoritma ve nandb yazılım detrend

Have be photobleaching düzeltme önemini daha önce⁹vurguladı. Photobleaching kaçınılmaz olarak hızlandırılmış modunda ışık mikroskobu deneyler sırasında oluşur; hem canlı hücreleri ve içinde vitro. Pek çok yaklaşım⁷beyazlatma için düzeltmek için literatürde tarif edilmistir. Üstel filtreleme detrending parametre T otomatik seçeneği ile mevcut en iyi tekniktir. Ücretsiz, açık kaynak yazılım nandb⁹içine entegre edilmiştir. Gerçekten de, bu parametre seçim büyük olasılıkla keyfi ve yanlış olacaktır çünkü onların detrending parametre el ile seçmek Kullanıcı yazılımlar hatalı sonuçlara yol açabilir. Otomatik algoritması verileri inceler ve uygun parametresi, Kullanıcı müdahalesi⁹için gerek kalmadan belirler. Hatta en iyi seçim düzeltme parametresi ile detrending kendi sınırlamaları vardır ve iyi sadece photobleaching yüzde % düşük simülasyonlar⁹ile gösterildiği gibi çalışır. Öyle ki bir parlaklığı düşük değerlerle çalışabilirsiniz ilginçtir, otomatik detrending rutin, onun doğruluğunu kullanıldığında (hatta B < 1,01) ve bu nedenle düşük yoğunluklarda ve hala homo-dimerization ölçmek için kesin olarak.

Photobleaching da başka bir sorun neden olur: photobleached fluorophores içinde karmaşık bir multimer varlığı. Bu bir trimer görünür bir dimer gibi trimer olarak üç birimi olmayan flüoresan olduğunda Örneğin, yapar. Hur ve Mueller¹⁰ için bu sorunu gidermek nasıl gösterdi ve bu düzeltme da bir sonraki İnceleme⁷' vurguladı. Bu düzeltme⁹nandb yazılımlardır.

FKBP12 F36V sistem

FKBP12F36V hangi değil doğal olarak oligomerize ama AP20187 ilaç (halk dilinde ligand dimerizing BB da bilinir)^11,12eklenmesi dimerize için bilinen bir proteindir. Bu sayı ve parlaklık için ideal bir test çalışması yapar: etiketli FKBP12F36V ile oligomeric durumunu iki katına BB eklenmesi dikkat edilmelidir.

Protokol

1. FKBP12 F36V - mVenus arıtma

1. Monomerized insan FKBP12F36V¹² ve N-terminal His6 ve mVenus Etiketler (vektör istek üzerine temin edilebilir) içeren pET22b vektör ile (DE3) pLysS hücreleri dönüşümü. Plaka hücreleri üzerine LB agar 50 µg/mL ampisilin ve 34 µg/mL kloramfenikol ile desteklenmiştir.
2. Dönüştürülmüş kolonileri 100 mL LB starter kültür aktarmak ve 16-20 saat 37 ° C'de sallayarak ile büyür.
3. Yoğun starter kültür seyreltik (OD600 > 1) 1: 100 LB Orta (2 x 500 mL toplu işlemleri) ve OD600 için 2-3 saat boyunca büyümeye = 0,6 - 0,8 (37 ° C, 200 devir/dakika).
4. Buz üzerinde serin kültürler. 250 µM IPTG ikna etmek ve 16-20 saat 21 ° c, 200 rpm için büyür.
5. 20 dakikadır 2.000 x g de Santrifüjü tarafından hücre hasat.
6. Pelet 40 ml EDTA ücretsiz proteaz inhibitörleri (hücre Pelet başına 1 tablet) ile (20 mM sodyum fosfat pH 7.5, 500 mM NaCl, 3 mM imidazole, 1 mM β-mercaptoethanol) takıma IMAC arabelleği resuspend.
7. Hücreleri solüsyon içeren temizleyicide (500 watt, 20 kHz, % 40 genlik, 9 s 11 tarihinde kapalı s 15dk için) aralıklarla 20.000 x g de buz ve hasat çözünür malzeme üzerinde.
8. Transfer çözünür konik bir şişesi için lysate ve reçine 2 mL ekleyin ( Tablo malzemelerigörmek). 105 rpm döndürme ile 1 saat için kuluçkaya
   Not: Nikel sepharose de bu IMAC adım için kullanılabilir.
9. Reçine hasat ve IMAC arabelleği 500 mL tarafından IMAC arabelleği B (20 mM sodyum fosfat pH 7.5, 500 mM NaCl, 7 mM imidazole, 1 mM β-mercaptoethanol) takip A 250 mL ile yıkayın.
   Not: 50 mM imidazole nikel sepharose reçine kullanıyorsanız artırın.
10. His6 öğesini protein IMAC tampon C (20 mM sodyum fosfat pH 7.5, 500 mM NaCl, 300 mM imidazole, 1 mM β-mercaptoethanol) kullanarak elute.
11. Bir boyut dışlama enjekte sütun 10 mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM DTT equilibrated ( Tablo malzemelerigörmek). FKBP12F36V onun tepe elüsyon 87.71 mL biz kullanılan sütun vardır.
12. Saflık SDS-sayfa ve havuzu ile değerlendirmek ve gerektiğinde konsantre.

2. Multiwell plaka dizi hazırlanması

1. Saf FKBP12F36V çözülme (veya ilgi protein etiketli) üzerinden-80 ° C.
2. 100 çözeltisi hazırlamak nM saf FKBP12F36V (orta, 10 mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM DTT). Solüsyon içeren temizleyicide ve toplamları oluşumunu önlemek için (hızlı spin 13000 RPM) santrifüj kapasitesi.
3. 8 iyi gözlem odasına bir cam alt ile 100-200 µL pipette.
4. BB dimerizer 10, 20, 40, 80, 100, 150, 300 ve 500 nM^12,13son konsantrasyonları ekleyin.
5. Bir referans olarak 100 çözeltisi hazırlamak nM yalnız potansiyel toplama ve yağış etkileri değerlendirmek ve monomer için bir parlaklık değeri ile aynı satın alma ayarları kurtarmak için mVenus.

3. Kalibrasyon-Alerjik Confocal edinme

1. Confocal sistemi (Şekil 1) başlatın. Dijital dedektörleri ya iyi karakterize analog dedektörleri⁸mikroskop confocal sistem tarama herhangi bir ışık ile donatılmış ve tutma yeteneğine sahip bir sabit Işınma Zamanı elde her piksel için çalışacak.
2. Uyarma ışın yolu ayarla:
   1. 514 nm lazer ve set 20-100 NW güç amaç çıkış (için FKBP12F36V-mVenus) açın.
   2. 63X1.4NA amaç veya FCS için tasarlanmış bir yaka düzeltme su daldırma hedefi seçin.
   3. Bir HyD, APD veya kalibre edilmiş Devresel_ödeme dedektörü açın. Dedektörleri yeteneğine foton sayma tercih, bu davada olduğu gibi hesaplama S, uzaklık ve σ₀² gereksizdir.
   4. 520-560 nm Emisyon pencereyi seçin
   5. İğne deliği ve sondaj 1 havadar ünitesinde karşılık gelen emisyon ~ 545 nm için ayarlayın.
   6. 16 x 16 piksel satın alma modunu ayarlamak
   7. Bu t_çerçeve karşılayan gibi piksel Işınma Zamanı t_durmak ayarlamak >> T_D >> _D nerede ikamet süresi akışkanın protein ve t t_durmak, _{kare hızı çerçevedir} . Bu bekleme süresi ~ 13 µs için ayarlama denk.
      Not: Ticari bazı üreticiler Işınma Zamanı piksel başına sabit tutan değil tarayıcılar vardı. Bu süreklilik yöntemin işe yaraması için çok önemlidir.
   8. ~ 120 piksel boyutunu belirlemek nm.
   9. Xyt satın alma modunu seçin ve satın alma ve iyi (örneğin 5000) elde edilebilir için kare sayısını seçin.
   10. Sistem yüksek üretilen iş moduyla varsa, her şey ve iyi ücret satın alma sayısını otomatikleştirmek belgili tanımlık oluşum koordinatlarını tanıtmak.
       Not: Eğer bir daldırma amacı istimal için su dağıtıcısı varlığını sağlamak dikkat et.
   11. Eğer sistem ile donatılmış bir perfüzyon sistemi BB çözüm yükleyin ve perfüzyon sağ sonra başlatmak için Örneğin, 10.000 görüntüleri alma sırasında dimerization kinetik değerlendirmek için 5000^inci çerçeve programı.
3. Bir damla yağı yağı daldırma amaç eklemek / FCS için tasarlanmış bir yaka düzeltme su daldırma objektif kullanmak Eğer su.
4. 8 iyi gözlem odası sahne içine monte.
5. Doğru şey seçin ve çözüm üzerinde odaklanmak.
   Not: Önemli: yansıma ve saçılma önlemek için yakın alt cam odaklanarak kaçının. Çözüm içine daha derin netleme yaparken otomatik odaklama seçeneği bağlantısını kesin.
6. Satın başlatmak ve görüntüleri elde edilen yığını TIFF formatında kaydedin.

4. detrend ve parlaklık R paket nandb kullanarak çözümleme

1. Önişleme kalite kontrolü, ImageJ¹⁴ resimler bir göz atın ve yoğunluk profili yeniden elde etmek için Şekil 2biriçinde gösterildiği gibi kullanın. Bu çok fazla photobleaching oluştu olup olmadığını belirlemek yararlıdır. Çok fazla ağartma varsa, verileri daha ayrıntılı bir çözümleme için uygun değildir.
   Not: ImageJ da ticari oluşum--dan için TIFF görüntüleri dönüştürmek yararlı olabilir. Aşağıda açıklanan nandb yazılım yalnızca TIFF dosyalarıyla çalışabilirsiniz.
2. Karşıdan yükleyip R ve RStudio^15,16. R yükleyip kurmanız en iyisi ilk, o zaman RStudio.
   Not: Aşağıda nandb R paketini kullanmak nasıl bir açıklama olduğunu. Hayatı daha kolay hale getirecek ancak R dil bilgisi nandb, kullanmak için gerekli değildir.
3. Nandb paketini yükleyin.
   1. RStudio açın ve install.packages("nandb") yazın konsol ve yükleme işleminin tamamlanmasını bekleyin.
4. Nandb tanıyın
   1. El ile¹⁷gözden geçirin.
   2. Yerleşik RStudio yardım çeşitli işlevler için gözden geçirin. Kullanılacak en olası işlevini-ecek var olmak kullanma-ecek var olmak brightness(). Bu işlev için yardım dosyasına yazarak bakın? Brightness() konsol.
5. Parlaklık hesaplamak
   1. Bir img001.tif ('nandb' sadece TIFF dosyaları ile çalışır Not) olarak adlandırılan Masaüstü üzerinde bir görüntü dosyası varmış. Bir o görüntü parlaklığını hesaplayabilirsiniz:
      b <-parlaklık ("~/Desktop/img001.tif", tau "auto" =)
      1. Bu değişken b R., görüntünün parlaklığını atar Tau = "otomatik" sağlar görüntü düzgün parlaklık hesaplama önce değişimleri ki. En yaygın olanı buradan ortalama veya ortalama parlaklığının hesaplamak etmektir. Bir mean(b) veya median(b) yazarak yapabilirsiniz. Bir de okul sırası kullanma için parlaklık görüntünün yazabilirsiniz
         ijtiff::write_tif (b, "~/Desktop/whatever_img_name")
   2. Bir klasör masaüstü görüntüleri images_folder dolu ve bu görüntülerin brightnesses hesaplamak ve parlaklık görüntüleri TIFF dosyaları olarak yazmak ihtiyacı demek. O zaman? brightness_folder(). Bu işlev tüm bir klasör birden işler:
      brightness_folder ("~/Desktop/images_folder", tau "auto" =)
      Bu özellikle iyi olanlar R için tercih ettikleri bir yazılım var, tüm dosyaları tek bir komutta işlenir ve o zaman bir çıkış parlaklık TIFF görüntüleri onların seçilen yazılımı ile çalışmaya gitmek, ImageJ¹⁴ olması , Python veya başka bir şey.

Sonuçlar

Detrending ve monomeric parlaklık

Veriyi kazanılmış sonra bir çözüm ilgi protein oligomeric durumunu belirlemek için parlaklık hesaplamalar başlayabilirsiniz. Çözümde ağartma etkisi kadar sert olmayabilir olsa bile olarak vivo içindeolabilir, yoğunluğu izleme hala muhtemelen fluorophore,¹⁸ ama bu arkasındaki nedenleri ile ilgili photophysical etkileri nedeniyle sabit demek olmaya...

Tartışma

N & B ticari ışık confocal mikroskoplar dijital yangın dedektörleri ile donatılmış tarama kullanarak multimerization algılamak için tekniktir. Bu yaklaşım tek noktadan FCS, FCCS ve smFRET çünkü kalibrasyon ücretsiz ve parlaklık hesaplama basit ve konsantrasyon bağımsız⁶ile karşılaştırıldığında oldukça çekici olduğunu. Bu büyük, ancak, ağartma ve uzun süreli şiddeti dalgalanmalar için parlaklık hesaplamalar⁹gerçekleştirmeden önce düzeltmek için önemlidir; detrending ihmal ve...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
RosettaTM (DE3) pLysS hücreleri	Novagen	70956-3
Ampisilin	Sigma Aldrich	PubChem Madde Kimliği 329824407
Kloramfenikol	Sigma Aldrich	PubChem Madde Kimliği: 24892250
LB başlangıç kültürü	QIAGEN
LB ortamı	QIAGEN
IPTG	Sigma Aldrich	PubChem Madde Kimliği 329815691
IMAC tamponu	Medicago	09-1010-10
EDTA içermeyen proteaz inhibitörleri	Sigma Aldrich	11873580001
TALON reçinesi	Clonetech
Nikel sefaroz	GE Healthcare
S200 16/60 sütun	GE Healthcare
Cam tabanlı 8 kuyulu gözlem çanağı	Ibidi	80827