Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Kırmızı pancar biyofarmasotik aday aşısı geçici ifadede tip 1 diyabet için

7.4K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/59298

⸱

19 Mart 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biotechnology, University of Verona

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Burada, bir sözlü aşı adayı karşı tip 1 diyabet bir yenilebilir bitki üretmek için bir protokol mevcut.

Özet

Bitki moleküler tarım bitkiler ilgi molekülleri üretmek için kullanılır. Bu açıdan, bitkiler hem Biyoreaktörler olarak üretim ve nihai ürünün sonraki arıtma ve kapaklı proteinlerin doğrudan oral teslimat için Yenilebilir bitki türü kullanılırken kullanılabilir. Bu çalışmada, Yenilebilir bitki sistemleri ile vakum infiltrasyon teslim deconstructed bitki virüs tabanlı rekombinant DNA teknolojisi kullanılarak tip 1 diyabet (T1D) karşı bir aday sözlü aşı geliştirilmesi mevcut. Sonuçlarımız kırmızı pancar T1D aşı olarak umut verici bir aday olarak kabul T1D, ilişkili bir insan türetilmiş autoantigen geçici bir ifade için uygun bir ev sahibi olduğunu gösteriyor. Autoantigen üreten yaprakları iyice mide sindirim için onların direnci, bakteriyel şarj kalıntısı varlığı ve ikincil metabolik profilleri, işlem üretim potansiyelini kullanmak için genel bir bakış vermek için karakterize bitkilerin kapaklı bir protein doğrudan oral teslimat için. Bizim analiz neredeyse tam bir kapsülleme strateji bitki kaynaklı GAD aşı üretiminde gerekli olduğunu düşündüren bir simüle mide sindirim takip dondurularak aday sözlü aşı düşüşü gösterdi.

Giriş

Bitki moleküler biyoloji devriminden bu yana 1980'li yıllarda, bitki tabanlı sistemler Biyofarmasötikler üretimi için alternatif mikrobiyal ve memeli hücreleri1üzerinde esaslı geleneksel sistem olarak kabul edilebilir. Bitkiler geleneksel platformlar, çeşitli avantajlar ölçeklenebilirlik, maliyet-etkililik ve en alakalı2güvenlik ile görüntüler. Rekombinant ürün dönüştürülmüş bitki dokudan saflaştırılmış ve sonra yönetilen, ya parenterally ya da sözlü olarak ve ayrıca, dönüştürülmüş Yenilebilir bitki doğrudan oral teslimat için kullanılabilir. Sözlü rota aynı anda Mukozal ve sistemik bağışıklık teşvik ve iğneler ve uzman sağlık personeli için gereksinimini ortadan kaldırır. Ayrıca, oral teslimat normalde rekombinant protein3Toplam üretim maliyetinin % 80'i hesapları karmaşık aşağı akım işleme ortadan kaldırır. Bütün bu avantajları tasarruf üretim, malzeme ve ilaç dünya nüfusunun çoğu için uygun hale her doz maliyetlerini azaltarak emek doğru tercüme edilebilir.

Çeşitli stratejiler, hem istikrarlı dönüşümü ve geçici ifade, bitkilerde rekombinant proteinlerin üretimi için geliştirilmiştir. Bunlar arasında yüksek verimli deconstructed bitki virüs temel ifade sistemi (örneğin, magnICON) rekombinant proteinlerin yüksek verim nispeten kısa zaman çizelgelerine4üzerinde önde gelen üstün performans sağlar. Geçici ifade Nicotiana benthamiana bitkilerde bitki virüs temel ifade sistemi kullanarak pek çok örnek, altın standart üretim ev sahibi olmak raporlanır. Ancak, bu model bitki alkoloidler ve yaprakları içinde birikmiş olan diğer toksik metabolitleri nedeniyle yenilebilir bir tür olarak kabul edilmez.

Bu çalışmada, biz iki Yenilebilir bitki sistemi, kırmızı pancar arasında karşılaştırma tarif (Beta vulgaris cv Moulin Rouge) ve ıspanak (Spinacea oleracea cv Industria), 65 kDa izoformu glutamik asit iki aday türde bir ifade için bitki virüs tabanlı tarafından yürütülen dekarboksilaz (GAD65),5Vektörler. GAD65 tip 1 diyabet (T1D) ilişkili bir büyük autoantigen ve bu şu anda önlemek veya T1D tolerans6inducing tarafından gecikme insan klinik çalışmalarda soruşturma altında. GAD65 üretim tesislerinde kapsamlı modeli bitki türleri içinde tütün ve i. benthamiana4,5,6,7çalışılmıştır. Burada, biz doğrudan sözlü teslim için demek dokularda molekül üretimi için Yenilebilir bitki türlerinin nasıl kullanılacağını açıklar. --Dan teknik görüş, okudu ve bitki agroinfiltration için sistemi ve Yenilebilir bitki platformu GAD65 üretim için farklı parametreler değerlendirilerek seçilen: rekombinant protein ifade seviyeleri, bitki mikrobiyal şarj kalıntısı doku'sözlü dır, GAD65 mide sindirim için direnç ve vahşi türü ile dönüştürülmüş bitkilerin bioequivalence demek istedim.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. kırmızı pancar, ıspanak ekimi

  1. Kırmızı pancar büyümek (B. vulgaris cv Moulin Rouge) ve ıspanak (S. oleracea cv Industria) 150 µE ışık şiddeti, %65 bağıl nem, 12 h açık/koyu döngüsü 23/21 ° C, sırasıyla kullanarak bitkilerde büyüme odası.
  2. Tohum çimlenme sonra haftada bir 1 g/L çözüm ticari gübre (Malzemeler tablo) ile bitkileri döller. Beş haftalık ıspanak ve altı haftalık kırmızı pancar bitkiler için agroinfiltration kullanın.

2. geçici ifade deconstructed bitki virüs tabanlı teknoloji aracılığıyla

  1. Bitki ifade vektörel çizimler inşaatı
    1. -5' modülü (pICH20111), yukarıda açıklanan1,2,7olarak hazırlanan 3' modülleri (pICH31070.GAD65mut, pICH31070.∆87G65mut ve pICH7410.eGFP) ve integrase modülü (pICH14011) - vektörel çizimler tanıtmak Agrobacterium tumefaciens GV3101 zorlanma içinde standart teknikler kullanma. 28 ° C'de 2 gün boyunca 50 μg/mL Rifampisin ve uygun vektör özgü antibiyotik (50 μg/mL carbenicillin pICH20111, pICH14011 ve pICH7410.eGFP), pICH31070 için 50 μg/mL sefaloridin içeren LB ortamdaki büyümek
    2. Kolonilerin koloni her vektör için aşağıdaki belirli primerler kullanılarak PCR tarafından ekran: 5'-ATCTAAGCTAGGGTACCTCG-3' ve 5'-ACACCGTAAGTCTATCTCTTC-3' 3' modüller pICH31070.GAD65mut ve pICH31070.∆87G65mut, bir tavlama sıcaklığı 55 ° c ile ve bir uzama süresi 110 s, 5'-TGAAGTTCATCTGCACCAC-3' ve 5'-ACACCGTAAGTCTATCTCTTC-3' için bir tavlama sıcaklığı 53 ° c ve bir uzama süresi 30 ile üçüncü 3' modülü pICH7410.eGFP, s, 5'-AATGTCGATAGTCTCGTACG-3' ve 5'-TCCACCTTTAACGAAGTCTG-3' bir tavlama sıcaklığı 53 ° c ve bir uzama süresi 20 s ve 5'-GGCAACCGTTATGCGAATCC-3 ile 5' modül için ' ve 5'-GATGCGTTCCGCAACGAACT-3' integrase modülü ile 57 ° C tavlama sıcaklığını ve bir uzama süresi 45 s.
    3. Toplam hacmi 20 μL aşağıdaki belirli tepki döngüsü kullanılarak PCR reaksiyonu gerçekleştirmek: 95 ° C'de 5 dk ilk denatürasyon 30 35 döngüleri s 95 ° c, 30 s tavlama sıcaklığı ve uzama adım 72 ° c (tavlama sıcaklığı ve uzama süresi bir Re her astar çift için belirli) ve son uzama adım 7 dk 72 ° C'de
  2. Şırınga agroinfiltration
    1. Üç A. tumefaciens transformants 50 ml LB orta içeren 50 μg/mL Rifampisin ve aşağıdaki uygun vektör özgü antibiyotik aşılamak: pICH20111 ile dönüştürülmüş A. tumefaciens için 50 μg/mL carbenicillin pICH14011 veya pICH7410.eGFP veya pICH31070 ile dönüştürülmüş A. tumefaciens için 50 μg/mL sefaloridin. Gecede 28 ° C'de sallayarak büyümek
    2. Santrifüjü 4500 x g 20 dk için de tarafından gece bakteriyel kültürlerde cips ve infiltrasyon arabellek 10 mM 4-morpholineethanesulfonic asit (MES; pH 5.5) içeren 100 mL (veya ilk bakteriyel kültürünün iki birim) içinde resuspend ve 10 mM MgSO4OD dikkate almadan,600. Süspansiyonlar, oda sıcaklığında (RT) 3 h için kuluçkaya.
    3. Bakteriyel süspansiyonlar bir üç modül, GAD65mut, ∆87GAD65mut veya eGFP 3' modülü, 5' modülü ile ve integrase modülü içeren eşit miktarda karıştırın. Süspansiyon karışımı kırmızı pancar, ıspanak yaprakları şırınga infiltrasyonu için kullanın.
    4. 5 mL süspansiyon bir şırınga iğne olmadan yerleştirin. Yaprağın alt karşı şırınga ıspanak ve kırmızı pancar bitkiler için bastırın ve bu arada diğer taraftaki yaprak yumuşak basıncın uygulayın.
    5. Her bitki için apex başlayarak ilk üç tamamen genişletilmiş yaprakları sızmak. Yaprak kök agroinfiltrated yapraklarda bir kağıt etiketle etiketleyin. Bitkiler büyüme odası standart koşullar altında dönmek.
      Not: Sağlık ve güvenlik nedeniyle, infiltrasyon işlemi sırasında göz koruması ve eldiven giymek.
    6. 4 14 gün sonrası enfeksiyon (dpi) ve bunları sıvı azot içinde dondurmak için toplamak agroinfiltrated bırakır. Mağaza bitki doku-80 ° C'de
  3. Vakum agroinfiltration
    1. Ayrı ayrı üç A. tumefaciens transformants 50 ml 50 μg/mL Rifampisin ve uygun vektör özel içeren LB orta gecede 28 ° C'de sallayarak antibiyotik büyümek
    2. Santrifüjü 4500 x g 20 dakika süreyle, pelet gecede bakteri kültürleri infiltrasyon arabelleği 0.35 bir OD600 1 L Pelet Resuspend ve RT, süspansiyonlar 3 h için kuluçkaya.
    3. % 0,01 v/v deterjan (polysorbate 20) her süspansiyon için ekleyin. Bakteriyel süspansiyonlar bir üç modül, GAD65mut, ∆87GAD65mut veya eGFP 3' modülü, 5' modülü ile ve integrase modülü içeren eşit miktarda karıştırın.
    4. Bir bitki Ekle (altı haftalık kırmızı pancar bitki, bkz: 1) tutucu. Sahibi ters çevir ve infiltrasyon banyo infiltrasyon süspansiyon yapraklarda daldırın için (2 L) içeren bir ölçek üzerine yerleştirin.
      Not: Bütün yaprakları tamamen bakteriyel süspansiyon daldırma olun. Gerekirse ilave infiltrasyon süspansiyon ilavesi ile düzeyini yükseltmek.
    5. Batık bitki infiltrasyon banyo infiltrasyon odasına aktarmak ve kapatın. Vakum pompası açmak ve infiltrasyon odası vakum emme valfi açın.
    6. Bir kez 90 mbar basınç infiltrasyon odasında azalttı, vakum 3 dk. yayın için 45 için vakum tutmak s. İnfiltrasyon odası atmosferik basınç için döndü sonra odası açmak ve bakteriyel banyodan infiltre bitki kaldırın.
    7. Bitkiler büyüme odası standart koşullar altında dönmek.
    8. Agroinfiltrated yaprak maksimum ifade dpi'de rekombinant protein bağlı olarak toplamak ve onları sıvı azot içinde dondurma. Mağaza bitki doku-80 ° C'de

3. rekombinant protein ifade analizi

  1. Toplam çözünür protein (TSP) çıkarma
    1. Şırınga eziyet veya vakum adım 2.2.6 ve 2.3.8, sıvı azot harç ve havaneli kullanarak ince toz için toplanan, kırmızı pancar, ıspanak yaprakları sızmış. Toz 15 mL plastik tüpler içine aktarın ve malzeme-80 ° C'de depolayın
    2. Ayıklama arabelleği (50 mM sodyum fosfat pH 8.0, 20 mM sodyum metabisulphite) 900 µL 300 mg yaprak tozu ekleyin.
      Not: Bitki doku ağırlığı (mg) arabellek birimine (µL) arasında seçili oranı 1: 3'tür.
    3. 1 dk. için vortexing tarafından karışımı homojenize sonra 30.000 x g 4 ° C'de 40 min için de santrifüj kapasitesi
    4. Süpernatant temiz bir tüp toplamak ve-80 ° C'de saklayın
  2. Bitki eGFP görselleştirme ve miktar
    1. Yapraklarda üç teknik çoğaltır, 96-şey tabağa ifade eGFP elde edilen her tatlı KAŞIĞI özü 100 µL yükleyin.
    2. Bir floresan okuyucu olarak 96-şey plaka koymak ve ölçüm başlar. EGFP floresan algılama için gerekli ayarla 485/535 nm filtre kullanın.
    3. Mutlak miktar için aynı plaka bir kalibrasyon eğrisi yükleme farklı miktarlar hazırlamak (62.5, 125, 500, 750 ve 1000 ng), saf bir eGFP.
  3. Bicinchoninic asit (BCA) tahlil için çay KAŞIĞI miktar
    1. 50 parça (Tablo reçetesi) Reaktif A Reaktif B (Tablo malzemeler), 1 kısım ile karıştırın. Taze BCA çalışma çözüm yeterli hacim denetlesinler için örnekleri ve Kalibrasyon standartları için hazır olun.
      Not: 1,9 mL BCA çalışma çözüm her örnek için gerekli birimdir. 9 standartları (boş bir de dahil olmak üzere) ile standart prosedür, BCA çalışma çözüm 17,1 mL gereklidir.
    2. Her standart (boş bir de dahil olmak üzere) ve çay KAŞIĞI özler etiketli bir tüp içine 0.1 mL pipet.
      Not: Kalibrasyon standartları olarak sığır serum albümin yeni bir set (BSA) standartları tercihen aynı Dilüent örnekleri, su gibi olarak kullanarak 10-1000 μg/mL aralığında hazırlamak. Boş kalibrasyon standart ve numune hazırlama için kullanılan seyreltici 0.1 mL oluşur.
    3. 1,9 mL BCA çalışma çözeltisi ekleyip iyice karıştırın. Tüplerin kapak ve 30 dk 37 ° C'de kuluçkaya.
    4. Tüpler dik ölçmek 562 Absorbans serin nm 10 dakika içinde tüm örnekleri.
      Not: RT bile, renk geliştirme devam ediyor. Tüm tüpler Absorbans ölçümleri 10 dk içinde yapılırsa önemli hata tanıtılacaktır.
    5. 562 nm Absorbans değeri boş okuma standartları ve çay KAŞIĞI özleri gelen çıkarma.
    6. Her standart onun konsantrasyon üzerinde okuma arsa boş düzeltilmiş 562 nm. Her tatlı KAŞIĞI özü protein konsantrasyonu belirlemek.
  4. Coomassie jel Gecchele vd.8daha önce açıklandığı gibi boyama gerçekleştirmek.
  5. Western blot analizi
    1. Daha önce Gecchele vd.8' de açıklandığı gibi Batı leke çözümlemesi gerçekleştirin.
    2. Proteinler elektroforetik Boşanmadan sonra onları standart yöntemlerle nitroselüloz membran aktarın. Engelleme çözüm fosfat tamponlu tuz (PBS) pH %7,4 4 süt karıştırarak hazırlayın. Membran ile 10 mL 1 h için RT, çözüm engelleme engellemek.
    3. Tavşan birincil antikor 1:10,000 anti-GAD65/67 ve anti-LHCB2 ve 1:20,000 anti-eGFP 5 ml %0,1 deterjan ile engelleme çözüm için hazır olun. Gecede 4 ° C'de veya sabit ajitasyon ile RT 4 h için hazırlanan birincil antikor çözümleri ile membran kuluçkaya.
    4. Birincil antikor atın ve 5 min için 3 kez membran % 0,1 deterjan içeren engelleme çözüm ile yıkayın.
    5. Hazırlamak horseradish peroksidaz (HRP)-% 0.1 deterjan çözüm engelleme 1:10,000, eşlenik Anti-tavşan antikor. Membran ile sürekli ajitasyon RT, 1,5 saat için kuluçkaya.
    6. İkincil antikor atın ve membran PBS-T (% 0,1 deterjan ile desteklenmiş PBS) ile her 5 min için 5 kere yıkayın.
    7. Membran üreticinin yönergelerini izleyerek bir piyasada bulunan luminol Çözümle kuluçkaya. Kemiluminesan görüntüleme sistemi kullanarak sinyali algılamak.

4. bitki malzeme işleme

  1. Hasat vakum agroinfiltrated ∆87GAD65mut ifade kırmızı pancar ifade tepe (11 dpi) bırakır ve onları sıvı azot içinde dondurma.
  2. 72 h-50 ° C ve 0,04 mbar için dondurulmuş yaprakları lyophilize. Onları-80 ° C'de depolayın
  3. Yapraklarını ince toz için eziyet ve nem dışlamak için silis jeli ile kapalı bir kapta RT saklayın.

5. mide sindirim simülasyon ve hücre bütünlük analizi

  1. Mide sindirim simülasyon
    1. Öğütülmüş kurutulmuş kırmızı pancar yaprakları 100 mg tartmak ve PBS (pH 7,4) 6 mL resuspend.
    2. Örnek pH 2 6 M HCl ile ayarlayın.
    3. 4 mg/mL pepsin domuz Gastrik mukoza 10 mm HCl bir son pepsin konsantrasyonu 1 mg/mL veya 1:20 toplam çözünen proteinler için bir oranı elde etmek için ekleyin. 120 dk 37 ° C'de örnek sallamak.
    4. Örnekleri ile pepsin devre dışı bırakabilirsiniz için 1 M NaOH pH 8 için ayarlayın.
    5. 750 µL aliquots 20.000 x g 4 ° C'de 20 dk için de her örneğinin santrifüj kapasitesi Ayrı ayrı süpernatant toplamak ve Pelet arabellek yükleme bir süpernatant hacmindeki resuspend (1.5 M Tris HCl, pH 6.8, % 3 SDS, % 15 gliserol ve % 4 2-mercaptoethanol).
      Not: Sağlık ve güvenlik nedeniyle, eldiven ve numune hazırlama için duman başlık altında çalışmak.
    6. Süpernatant ve resuspended Pelet western blot analizi8tarafından analiz.
  2. Hücre bütünlük analizi
    1. Öğütülmüş kurutulmuş kırmızı pancar yaprakları 100 mg iki örnek hazırlamak ve PBS (pH 7,4) 6 ml her ikisi de resuspend.
    2. Bir örnek yalnızca için 2 ile 6 M HCl. sallamak her iki örnekleri için 120 dk 37 ° C'de pH değeri ayarlayın.
    3. 750 µL aliquots 20.000 x g 4 ° C'de 20 dk için de her örneğinin santrifüj kapasitesi Ayrı ayrı süpernatant toplamak ve Pelet arabellek yükleme bir süpernatant hacmindeki resuspend.
    4. Süpernatant ve resuspended pelet tarafından western blot analizi.

6. Bioburden tahlil

  1. Kurutulmuş kırmızı pancar yaprakları 100 mg tartın. 8 mL steril PBS (pH 7,4) ve 1 dk. için girdap toz resuspend.
  2. Antibiyotik veya (i) 50 µg/mL Rifampisin, (ii) 50 µg/mL, Rifampisin ve carbenicillin her, (iii) 50 µg/mL her sefaloridin ve Rifampisin veya (iv) 50 µg/mL her Rifampisin, carbenicillin ve sefaloridin içeren olmadan LB orta hazırlayın.
  3. Plaka her kurutulmuş yaprak homogenate birinde 5 seçmeli LB medya 1 mL.
  4. Tüm plakaları 28 ° C'de 3 gün kuluçkaya
  5. Her plaka üzerinde yetiştirilen Agrobacterium koloniler sayılır.
  6. Hesaplamak ve bakteriyel şarj kalıntısı koloni oluşturan birimler (CFU) sayı olarak kurutulmuş yaprak homogenate (CFU/mL) mL tanımlayın.

7. metaboliti çıkarma

  1. Birincil metaboliti çıkarma
    1. -80 ° C depolanan 30 mg tartmak, agroinfiltrated ∆87GAD65mut-ifade vakum kırmızı pancar yaprağı tozu 2 mL plastik tüp içinde.
    2. Soğuk 70/30 (v/v) metanol/kloroform ve girdap 750 µL 2 h için-20 ° C'de 30 s. Incubate ekleyin.
      Not: Tüm maddeleri ve katkı maddeleri LC-MS sınıf olması gerekir.
    3. Soğuk su ve 10 dk. toplamak için 17,900 x g 4 ° C'de, santrifüj ve transfer 600 µL üst hydroalcoholic faz yeni 2 mL tüp içine ekleyin. Alt chloroformic faz ve Interphase atmak.
    4. Örnekleri çözücüler buharlaşır için bir vakum yoğunlaştırıcı 3 h için koymak.
    5. Adım 7.1.4 300 µL 50/50 (v/v) Asetonitril/su elde Pelet dağıtılması ve örnekleri 3 dk için solüsyon içeren temizleyicide.
    6. Çözümler 0,2 mikron membran filtreleri ile geçmek ve bir şeffaf sabit 300 µL Ekle cam tüpler içine koydu.
  2. İkincil metaboliti çıkarma
    1. 300 mg-80 ° c depolanan tartmak, agroinfiltrated ∆87GAD65mut-ifade vakum kırmızı pancar yaprağı tozu 15 mL plastik tüp içinde.
    2. 3 mL metanol, 30 için girdap ekleyin s ve 40 kHz 15dk için solüsyon içeren temizleyicide.
      Not: Tüm maddeleri ve katkı maddeleri LC-MS sınıf olması gerekir.
    3. 4500 x g 10 dk 4 ° C'de de örnekler santrifüj kapasitesi ve supernatants yeni 15 mL tüpler içine aktarın.
    4. Seyreltik 100 µL 1:3 (v/v) su ile ayıklamak ve çözüm 0,2 mikron membran filtreden geçmek.
    5. Çözüm bir saydam sabit 300 µL Ekle cam tüp koymak.
  3. Polar lipit çıkarma
    1. -80 ° c depolanan 200 mg tartmak, agroinfiltrated ∆87GAD65mut-ifade vakum kırmızı pancar yaprağı tozu 15 mL plastik tüp içinde.
    2. Su 200 µL ve sonra 2 mL metanol ekleyin ve 1 h için buz üzerinde kalmasını sağlayın.
      Not: Tüm maddeleri ve katkı maddeleri LC-MS sınıf olması gerekir.
    3. Girdap 30 s ve 40 kHz 15dk için solüsyon içeren temizleyicide.
    4. 4500 x g 25 dk. toplamak için 4 ° C'de, örnekleri ve transfer kloroform Faz 2 mL tüpler içine santrifüj kapasitesi. Üst hydroalcoholic faz ve Interphase atmak.
    5. Örnekleri çözücü buharlaşır için bir vakum yoğunlaştırıcı 3 h için koymak.
    6. Adım 7.3.5 600 µL metanol ile elde edilen Pelet geçiyoruz.
    7. Seyreltik 100 µL 1:5 (v/v) metanol ile ayıklamak ve çözüm 0,2 mikron membran filtreden geçmek.
    8. Çözüm bir saydam sabit 300 µL Ekle cam tüp koymak.

8. sıvı Kromatografi Kütle spektrometresi analiz ve veri işleme

  1. LC-MS sistemi tedarikçi tarafından tavsiye edilen şekilde ayarlarsınız.
    Not: Bir sütunla C18 Muhafız (75 x 2.1 mm, parçacık boyutu 5 µm) önünde bir C18 sütun (150 x 2.1 mm, parçacık boyutu 3 µm) Sekonder metabolitler ve Kutup lipidler analizi için donatılmış HPLC ile birleştiğinde bir Otomatik Örnekleyici LC bölüm oluşur , oysa bir sütunla HILIC görevlisi (7,5 x 2.1 mm, 3 µm) önünde HILIC bir sütun (150 x 2.1 mm, parçacık Boyut 2,7 µm). MS electrospray iyonlaşma (ESI) ya da bir atmosfer basıncı kimyasal iyonizasyon (APCI) kaynakları ile sağlanan bir iyon kapanı Kütle Spektrometre var.
  2. Uygun çözücüler HPLC degradeler için hazırlayın. Birincil metaboliti analizi için 20 mM amonyum formiat çözelti A olarak kullanın; % 95 Asetonitril, %5 su artı 10 mM amonyum formiat çözücü b olarak İkincil metaboliti analiz için su + %0,05 formik asit (A) ve Asetonitril + %0,05 formik asit (B) kullanın. Polar lipit analiz için su ile %0,05 formik asit (A) ve % 100 Asetonitril (B) kullanın.
    Not: Maddeleri ve katkı maddeleri LC-MS sınıf olması gerekir.
  3. Metaboliti elüsyon için Tablo 1 ' de rapor degradeler kullanın. Akış oranı, 0.2 mL/dak enjekte 10 µL Sekonder metabolitler ve Kutup lipidler, her örneğinin ise küme için birincil metabolitleri 5 µL enjekte et.
  4. Kalite kontrol (QC) örnek eşit deneysel her koşul temsilcisi karışımı için farklı örnekleri bölümlerini karıştırarak hazırlayın. QC örnek enstrüman etkinliğini izlemek için deneme sırasında analiz. Özellikle, bir QC örnek analiz her 10 örnek toplu iş sonra ekleyin.
  5. Enstrüman tahrik etkilerinden korunmak için örnekleri rastgele.
  6. 9 analizleri sonra temizleme yöntemi ve boş bir analiz bir sütun eklemek hemen sonra.
    Not: en güçlü çözücü yüksek bir yüzdesini, bir isocratic elüsyon ile iki çözücüler arasında yavaş bir degrade uygulayın. Boş bir saf metanol bir enjeksiyon oluşur: tutma zaman tekrarlanabilirlik aşağıdaki analizi geliştirmek için su (50/50, v/v).
  7. Tablo 2' de listelenen parametreleri kullanarak diğer pozitif ve negatif iyonlaşma modlarında kitle spectra almaya gerecini ayarlama.
    Not: Diğer parametreler belirli platform üzerinde bağlıdır.
  8. Sonraki veri işleme Dal Santo vd.9' da açıklandığı gibi gerçekleştirin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu çalışmada, Yenilebilir bitki dokularında sözlü bir aşı geliştirilmesi için iş akışı gösterilmektedir. Bu eser bir yenilebilir ana bitki türü bir hedef proteinin ifade ve potansiyel sözlü aşı karakterizasyonu odaklanmıştır.

İlk adım rekombinant proteinler Yenilebilir bitki sistemlerinde üretmek için bitki virüs temel ifade teknoloji uygunluğunun değerlendirilmesi söz konusu. Bu amaç için ilk eGFP bir modeli protein kullandığım...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu çalışmada otoimmün şeker hastalığı için bir aday sözlü aşı tasarımı için ön analizler gösterdi. Bu deneme için hedef proteini insan 65 kDa Glutamat dekarboksilaz, hangi üretim ve işlevselliği kolayca ortaya ve ölçülebilir12olduğunu mutasyona uğramış biçimiydi. Onun ifade farklı Yenilebilir bitki dokularında vektörel çizimler tarafından5, hangi rekombinant protein üretim çok kısa bir süre içinde yüksek düzeyde aracılık aracılı. Kırmızı pancar eGFP ifadede yenilebilir ana ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Bu eser ortak projesi "Bitkilerin kullanımı bir otoimmün diyabet yenilebilir aşısı (eDIVA) üretimi için" tarafından desteklenmiştir (Proje kodu: 891854) çağrı 2014 çerçevesinde Verona Üniversitesi tarafından finanse edilmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0.2-μ m Minisart RC4 membran filtrelerSartorius-Stedim17764
2– merkaptoetanolSigmaM3148Toksik; Gliserol, SDS ve Tris-HCl ile yükleme tamponu yapmak için% 4
4-Morfolineetansülfonik asit (MES)SigmaM8250pH 5.5
96 oyuklu plakaSarstedt833924
Asetik asitSigma27221Korozif
Asetonitril LC-MS sınıfıSigma34967
AsetosiringonSigmaD134406 Maya özütü0.1 M stok &ndash
; 15 g / L
Amonyum formatSigma70221
Anti-eGFP antikoruABCamab290
Anti-GAD 65/67 antikoruSigmaG5163
Anti-LHCB2 antikoruAgriseraAS01 003
Parlak Mavi R-250SigmaB7920
C18Kolon Zarafeti    -Alltima HP C18 (150 mm x 2.1 mm; 3 μ m) Kolon
C18 Koruma Kolonu Grace    -Alltima HP C18 (7,5 mm x 2,1 mm; 5 μ m) Muhafız  Sütun
CalMag YetiştiriciPeter Excel15-5-15Gübre
Karbenisilin disodyumDuchefa BiochemieC0109Toksik
Kemilüminesans görüntüleme sistemiBioRad1708370ChemiDoc Dokunmatik Görüntüleme Sistemi
KloroformSigmaC2432
DeterjanSigmaP5927Polisorbat 20
Floresan okuyucuPerkin-Elmer  1420-011VICTOR Çok Etiketli Sayaç
Formik asit LC-MS sınıfıSigma94318
GliserolSigmaG5516Tris-HCl, SDS ve 2&ndash ile yükleme tamponu yapmak için% 15; merkaptoetanol
GoTaq G2 polimerazPromegaM7841
HClSigmaH1758Aşındırıcı
HILIC KolonuGrace    -Ascentis Express HILIC (150 mm x 2,1 mm; parçacık boyutu 2,7 μ m) Sütun
HILIC Koruma SütunuGrace    -Görüş HT HILIC (7,5 mm x 2,1 mm; 3 μ m) Muhafız  Sütun
Yaban turpu peroksidaz (HRP) konjuge anti-tavşan antikoruSigmaA6154Çok fazla dondurmayın / çözmeyin
HPLC Otomatik ÖrnekleyiciBeckman Coulter    -System Gold 508 Otomatik Numune Alma Cihazı
HPLC SistemiBeckman Coulter    -System Gold 128 Solvent Modülü HPLC
İzopropanolSigma24137Yanıcı
Kanamisin sülfatSigmaK4000Toksik
KClSigmaP9541NaCl, Na2< / sub>HPO4< / sub> ve KH2< / sub>PO4< / sub> yapmak için
2< / sub>PO4< / sub> SigmaP97912.4 g/L, NaCl ile NaCl, Na2< / sub>HPO4< / sub> ve KCl ile PBS
Yükleme Tamponu
Luminol çözeltisiGe HealthcareRPN2232ECL Prime Western Blotting System ticari kitini kullanarak çözeltiyi hazırlayın
Liyofilizatör5PascalLIO5P0000DGT
Kütle SpektometresiBruker Daltonik  -Bruker Esquire 6000; kütle spektrometresi bir ESI kaynağı ile donatılmıştı ve analizör bir iyon tuzağıydı
MetanolSigma32213
MgSO4SigmaM7506
Süt engelleme solüsyonuRistora    PBS Na
2HPO4SigmaS7907'deSodyum Fosfat tamponu yapmak için NaH2PO4
SigmaS3014PBS yapmak için KCl, Na2HPO4 ve KH2PO4 ile 80 g/L; Maya özü ile LB ortamı (NaOH ile pH 7.5) yapmak için 10 g / L, Tripton ve Agar Bakteriyolojik Sınıf
NaH2PO4SigmaS8282  Sodyum Fosfat tamponu yapmak için Na2HPO4 ile kullanın; PBS NaOH yapmak için 14,4 g / L
SigmaS8045
Nitroselülaz membranGe Healthcare10600002
Domuz mide mukozasından PepsinSigmaP7000
Peroksidaz substratı ECLGE SağlıkRPN2235Işığa duyarlı malzeme
Pompa Vakum PresVWR111400000098
Reaktif ASigmaB9643BCA çalışma çözeltisini hazırlamak için bu reaktifin 50 parçasını 1 parça reaktif B ile kullanın
Reaktif BSigmaB9643BCA çalışma solüsyonunu hazırlamak için bu reaktifin 1 kısmını 50 parça reaktif A ile kullanın
RifampisinDuchefa BiochemieR0146toksik – 25 mg / mL stok
Yanıcı, toksik, aşındırıcı-% 10 stok; Tris-HCl, Gliserol ve 2&ndash ile yükleme tamponu yapmak için% 3; merkaptoetanol
Sodyum metabisülfitSigma7681-57-4
Sonicator sistemiSoltec090.003.0003Sonica® 2200 MH; frekans 40 khz
ŞırıngaTerumo& nbsp;   -
Şeffaf sabit 300-&mikro; L cam tüpleri yerleştirinThermo Scientific11573680
Trizma BaseSigmaT1503Tris-HCl tamponu yapmak için pH'ı 1N HCl ile ayarlayın, SDS, Gliserol ve 2&ndash ile yükleme tamponu yapmak için 1,5M Tris-HCl (pH 6.8) kullanın; merkaptoetanol
TryptoneFormediumTRP0310 g / L, Maya özütü, NaCl ve Agar ile LB ortamı (NaOH ile pH 7.5) yapmak için Bakteriyolojik Sınıf
Vakum yoğunlaştırıcıHeto3878 F1-3Speed-vac Sistem
Suyu LC-MS sınıfıSigma39253
Maya özüSigmaY1333Tripton, NaCl ve Agar Bakteriyolojik Sınıf ile LB ortamı (NaOH ile pH 7.5) yapmak için 5 g / L
, NaCl ve Tripton ile LB ortamı (NaOH ile pH 7.5) yapmak için DMSO Agar Bakteriyolojik Sınıf Aplikit A0949'da , -%3 ile kullanın DMSO SDS (Sodyum dodesil sülfat) Sigma L3771'de

Kaynaklar

  1. Merlin, M., Pezzotti, M., Avesani, L. Edible plants for oral delivery of biopharmaceuticals. British Journal of Clinical Pharmacology. 83 (1), 71-81 (2017).
  2. Merlin, M., Gecchele, E., Capaldi, S., Pezzotti, M., Avesani, L. Comparative evaluation of recombinant protein production in different biofactories: The green perspective. BioMed Research International. , (2014).
  3. Menkhaus, T. J., Bai, Y., Zhang, C., Nikolov, Z. L., Glatz, C. E. Considerations for the recovery of recombinant proteins from plants. Biotechnology Progress. 20 (4), 1001-1014 (2004).
  4. Avesani, L., Bortesi, L., Santi, L., Falorni, A., Pezzotti, M. Plant-made pharmaceuticals for the prevention and treatment of autoimmune diseases: Where are we? Expert Review of Vaccines. 9 (8), 957(2010).
  5. Marillonnet, S., Thoeringer, C., Kandzia, R., Klimyuk, V., Gleba, Y. Systemic Agrobacterium tumefaciens-mediated transfection of viral replicons for efficient transient expression in plants. Nature Biotechnology. 23, (2005).
  6. Ludvigsson, J. Update on treatment of type 1 diabetes in childhood. Current Pediatric Reviews. 1 (2), 118-127 (2013).
  7. Merlin, M., et al. Enhanced GAD65 production in plants using the MagnICON transient expression system: Optimization of upstream production and downstream processing. Biotechnology Journal. 11 (4), 542-553 (2016).
  8. Gecchele, E., Merlin, M., Brozzetti, A., Falorni, A., Pezzotti, M., Avesani, L. A Comparative Analysis of Recombinant Protein Expression in Different Biofactories: Bacteria, Insect Cells and Plant Systems. Journal of Visualized Experiments. 23 (97), (2015).
  9. Dal Santo, S., et al. The terroir concept interpreted through grape berry metabolomics and transcriptomics. Journal of Visualized Experiments. 5 (116), (2016).
  10. Chen, Q., et al. Agroinfiltration as an effective and scalable strategy of gene delivery for production of pharmaceutical proteins. Advanced Techniques in Biology and Medicine. 1 (1), (2013).
  11. Bertini, E., et al. Design of a type-1 diabetes vaccine candidate using edible plants expressing a major autoantigen. Frontiers in Plant Science. 9, Article 572 (2018).
  12. Avesani, L., et al. Improved in planta expression of the human islet autoantigen glutamic acid decarboxylase (GAD65). Transgenic Research. 12 (2), 203-212 (2003).
  13. Sepúlveda-Jiménez, G., Rueda-Benítez, P., Porta, H., Rocha-Sosa, M. A red beet (Beta vulgaris) UDP-glucosyltransferase gene induced by wounding, bacterial infiltration and oxidative stress. Journal of Experimental Botany. 56, jxb/eri036 (2005).
  14. Renukuntla, J., Vadlapudi, A. D., Patel, A., Boddu, S. H. S., Mitra, A. Approaches for enhancing oral bioavailability of peptides and proteins. International Journal of Pharmaceutics. 447, 75-93 (2013).
  15. Mustafa, A. Z. Encapsulation importance in pharmaceutical area, how it is done and issues about herbal extraction. , Available from: https://www.researchgate.net/publication/271702091_Encapsulation_importance_in_pharmaceutical_area_how_it_is_done_and_issues_about_herbal_extraction (2015).
  16. Kamei, N., et al. Complexation hydrogels for intestinal delivery of interferon beta and calcitonin. Journal of Controlled Release. 134, 98-102 (2009).
  17. Tuesca, A., et al. Complexation hydrogels for oral insulin delivery: effects of polymer dosing on in vivo efficacy. Journal of Pharmaceutical Sciences. 97, 2607-2618 (2008).
  18. Twyman, R. M., Schillberg, S., Fischer, R. Optimizing the yield of recombinant pharmaceutical proteins in plants. Current Pharmaceutical Design. 19, 5486-5494 (2013).
  19. Dhama, K., et al. Plant-based oral vaccines for human and animal pathogens – a new era of prophylaxis: current and future perspectives. Journal of Experimental Biology and Agricultural Sciences. 447 (0), 75-93 (2013).
  20. Hefferon, K. Reconceptualizing cancer immunotherapy based on plant production systems. Future science. O3, FSO217 (2017).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Oral AVakumlu nfiltrasyonAgrobacteriumWestern BlotGastrik SindirimLiyofilizasyonRekombinant Protein
Kırmızı pancar biyofarmasotik aday aşısı geçici ifadede tip 1 diyabet için
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.