Glial ve Nöronal Hücrelerin 3D Rekonstrüksiyonu ve Sanal Gerçeklik Analizi Için Bir Yöntem

Özet

Açıklanan boru hattı, gigabaytlardan daha büyük elektron mikroskobu veri kümelerinin tüm hücre morfolojilerini ayıklamak için segmentasyonu için tasarlanmıştır. Hücreler 3B olarak yeniden oluşturulduktan sonra, bireysel ihtiyaçlar etrafında tasarlanmış özelleştirilmiş yazılım, görüntüleme tıkanıklığının üstesinden gelmek için sanal gerçekliği kullanarak doğrudan 3D olarak nitel ve nicel bir analiz yapmak için kullanılabilir.

Özet

Elektron mikroskobu (EM) kullanılarak biyolojik dokunun seri kesitlenmesi ve sonraki yüksek çözünürlüklü görüntülemesi, yüksek çözünürlüklü görüntülenmiş yığınların 2D kullanılarak çözülemeyecek ultrayapısal desenleri ortaya çıkarmasını sağlar. Görüntü. Gerçekten de, ikincisi morfolojilerin yanlış yorumlanmasına yol açabilir, mitokondri durumunda olduğu gibi; bu nedenle 3D modellerin kullanımı giderek daha yaygın hale gelmekte ve morfoloji temelli fonksiyonel hipotezlerin formülasyonuna uygulanmaktadır. Bugüne kadar, ışık veya elektron görüntü yığınlarından oluşturulan 3B modellerin kullanımı nitel, görsel değerlendirmelerin yanı sıra nicelleştirmeyi de doğrudan 3D olarak gerçekleştirilmeye daha uygun hale getirir. Bu modeller genellikle son derece karmaşık olduğundan, bir sanal gerçeklik ortamı da tıkanıklık üstesinden gelmek ve 3D yapısı tam olarak yararlanmak için kurulması önemlidir. Burada, görüntü bölümlemeden yeniden yapılandırma ve çözümlemeye kadar adım adım kılavuz ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

Giriş

Otomatik seri bölüm ve görüntülemeye izin veren elektron mikroskobu kurulumu için önerilen ilk model 1981^1'ekadar uzanır; EM kullanarak görüntü büyük örnekler için bu tür otomatik, geliştirilmiş kurulumları difüzyon son on yıl içinde arttı^2,3, ve etkileyici yoğun rekonstrüksiyonlar veya tam morfolojileri sergileyen eserler hemen takip^{4, 5,6,7},^8,9,10.

Büyük veri kümelerinin üretimi, görüntü bölümlemi için geliştirilmiş ardışık hatlar gereksinimiyle birlikte geldi. RECONSTRUCT ve TrakEM2^11,12gibi seri bölümlerin manuel bölümleme için yazılım araçları iletim elektron mikroskobu (TEM) için tasarlanmıştır. Tüm süreç son derece zaman alıcı olabileceğinden, bu araçlar otomatik olarak son teknoloji ürünü, otomatik EM seri bölüm teknikleri (3DEM) ile oluşturulabilen binlerce seri mikrograf ile uğraşırken uygun değildir. blok-yüz taramalı elektron mikroskobu (SBEM)³ veya odaklanmış iyon ışını taramalı elektron mikroskobu (FIB-SEM)². Bu nedenle, bilim adamları segmentasyon verimliliğini artırmak için yarı otomatik araçların yanı sıra tam otomatik araçlar geliştirmek için çaba sarf etti. Makine öğrenimi¹³ veya son teknoloji ürünü, eğitimsiz piksel sınıflandırma algoritmaları^14'ütemel alan tam otomatik araçlar, daha büyük bir topluluk tarafından kullanılmak üzere geliştirilmektedir; yine de, segmentasyon hala tamamen güvenilir olmaktan uzaktır ve birçok eser hala segmentasyon süresi açısından verimsiz ama yine de tam güvenilirlik sağlar el emeği, dayanmaktadır. Ilastik¹⁵gibi yarı otomatik araçlar, gerçek bir düzeltme çerçevesi sağlamasa da, bir dereceye kadar düzeltilebilen segmentasyon için anında bir okuma sağladığından, daha iyi bir uzlaşmayı temsil eder ve entegre edilebilir paralel TrakEM2 kullanarak¹⁶.

Büyük ölçekli segmentasyon, bugüne kadar çoğunlukla konektomik lerle sınırlıdır; bu nedenle, bilgisayar bilim adamları en büyük, açıklamalı veri kümeleri entegre görselleştirmeler için çerçeveler sağlamak ve sinaptik kişilerin varlığı 17 ,¹⁸ile çıkarılan bağlantı desenleri analiz ilgileniyoruz. Bununla birlikte, 3B yapıların nitel değerlendirmeleri yerine nicel morfometrik analizler için doğru 3B rekonstrüksiyonlar kullanılabilir. NeuroMorph^19,20 ve glikojen analizi¹⁰ gibi araçlar uzunlukları, yüzey alanları ve hacimleri için 3D rekonstrüksiyonları ölçümleri almak için geliştirilmiştir ve bulut noktalarının dağılımı, tamamen orijinal EM yığını^8,10atarak . Astrositler ilginç bir vaka çalışmasını temsil eder, çünkü görsel ipuçlarının veya tekrarlayan yapısal örüntülerin eksikliği araştırmacılara bireysel yapısal birimlerin işlevi hakkında bir ipucu verir ve bunun sonucunda astrositik süreçlerin yeterli ontolojisinin eksikliği ^21,analitik araçlar tasarlamayı zorhale getirin. Bir son girişimi Abstractocyte^{oldu 22}, hangi astrositik süreçlerin görsel bir keşif ve astrositik süreçler ve nöritler arasındaki nitel ilişkilerin çıkarım sağlar.

Bununla birlikte, EM altında görüntü kesitli doku kolaylığı bozulmamış beyin örnekleri gizli bilgi miktarı çok büyük olduğu gerçeği ve tek bölümgörüntüleri yorumlayarak bu sorunun üstesinden gelebilir gerçeği geliyor. Beyindeki yapıların yoğunluğu o kadar yüksektir ki, aynı anda görülebilen birkaç nesnenin bile 3 boyutlu yeniden yapılandırmaları onları görsel olarak ayırt etmeyi imkansız kılar. Bu nedenle, yakın zamanda sanal gerçekliğin (VR) karmaşık yapıları gözlemlemek için geliştirilmiş bir yöntem olarak kullanılmasını önerdik. Biz oklüzyon üstesinden^astrosit23 odaklanmak (ikinci bir ilgi nesnenin görünürlüğünü engelleme, bir 3D alanda) ve rekonstrüksiyonlar nitel değerlendirmeler imanları kolaylığı, redaksiyon dahil, yanı sıra nicelemeler uzaydaki nokta sayısını kullanarak özelliklerin. Yakın zamanda GLAM kullanımı ile VR görsel keşif kombine (glikojen kaynaklı laktat emilimi modeli), nöritlerin laktat mekik olasılık bir harita görselleştirmek için bir teknik, ışık yayan organları olarak glikojen granülleri dikkate alarak²³; özellikle GLAM tarafından üretilen ışık tepelerini ölçmek için VR'ı kullandık.

Protokol

1. Fiji kullanarak görüntü işleme

1. Yerel dosyayı yığını içeren mikroskoptan sürükleyip bırakarak veya tüm görüntü yığınını içeren klasörü sürükleyip yazılım penceresine bırakarak görüntü yığınını açın.
   NOT: Fiji, mikroskop sağlayıcılarının özel dosya biçimlerinin yanı sıra .jpg, .tif ve .png gibi tüm standart görüntü biçimlerini otomatik olarak tanıyabilir. Aşağıdaki protokol 3DEM görüntü yığınları için optimize edilmiş olsa da, bu adımlar ışık mikroskobu veri kümeleri için de kullanılabilir.
2. Yığın açıldıktan sonra, voxel boyutunun meta verilerden okunduktan emin olmak için Resim > Özellikler'e gidin. Değilse, el ile girilebilir.
3. Görüntüyü 8 bit'e dönüştürdüğünüzden emin olun. Resim > Yazın'a tıklayın ve 8 bit seçin.
4. Özgün yığın farklı sıralı dosya/klasörlerdeyse, Resim > Yığınlar > Araçlar > Concatenate'iseçerek bunları tek bir yığında birleştirmek için Concatenate'i kullanın.
5. Dosya > Kaydet'iseçerek yığını kaydet. Tek bir .tif dosyası olarak kaydedilir ve yedekleme ve daha fazla işlem için kullanılabilir.
6. Orijinal yığın farklı fayans olarak elde edilirse, TrakEM2 içinde dikiş uygulayın.
   1. Yeni > TrakEM2 (boş)kullanarak yeni bir TrakEM2 projesi oluşturun.
   2. Viewport grafik kullanıcı arabirimi (GUI) içinde, sağ fare düğmesini tıklatarak yığınları içeri aktar > İçe > İtv-kur yığınıve Fiji ana GUI'de açılan tüm döşemeleri içeri aktarın. Sağ tıklatarak tuval boyutunu tüm yığına uyacak şekilde yeniden boyutlandırın > Ekran > Resize Canvas/Layer Set, ve montajın son boyutuna bağlı olarak y/x piksel boyutunu seçin.
      NOT: Örneğin, montaj 4.096 x 4.096 piksel dört fayans kullanılarak sonuçlandırılmalıdır, tuval boyutu en az 8.192 x 8.192 piksel olmalıdır. Biraz daha büyük yapmak düşünün ve daha sonra kırpmak.
   3. Tek tek karoların ortak bölümlerini katman kümesine sürükleyip bırakarak üst üste koyun. Üst üste binmeye yardımcı olmak için saydamlığı değiştirmek için sol üst kaydırıcıyı kullanın.
   4. Sağ fare düğmesini tıklatarak yığınları montaj ve yeniden hizalayın > Hizalave ardından seçeneklerden birini seçin (aşağıdaki nota bakın).
      NOT: SBEM veya FIB-SEM genellikle zaten iyi hizalanmış, ancak küçük yanlış hizalamalar oluşabilir. Katmanları hizala z hizalaması için otomatik ardışık ardışık dır; Montaj birden fazla katman, tüm hacim için, her z yığını üzerinde fayans hizalamak için otomatik ardışık ardışık; Hizala çok katmanlı mozaik önceki iki seçeneği birleştirir. Bu işlem zaman alır ve makinenin rasgele erişim belleği (RAM) tabidir. Üst düzey bir bilgisayar kullanmayı düşünün ve yığının boyutuna bağlı olarak saatlerce/günler boyunca çalışmasına izin verin.
   5. Son olarak, görüntü yığınlarını dışa aktarın ve fare sağ tıklayarak kaydedin > Düz görüntü yapınve ardından açılan menülerde ilki son görüntüye doğru seçtiğinizden emin olun Başlat ve Bırak.
   6. TrakEM2 gömülü işlevleri kullanarak, gerekirse ilgi segment yapıları.
      1. TrakEM2'nin GUI'sinde Şablon penceresinin altındaki Her Şey'e sağ tıklayın ve yeni alt > Alan_listesi ekle'yiseçin.
      2. Project Objectsaltındaki klasörün üstündeki Bir Şeyi sürükleyin ve bırakın ve bir Şey orada görünür.
      3. Alan listesini şablondan Project Nesnelerialtında bulunan her şeye sürükleyin ve bırakın.
      4. Görüntü yığını viewport'unda imleçli Z alanını seçin. Alan listesi, benzersiz bir kimlik numarasıyla görüntülenir. Üstteki fırça aracını seçin (sağ altta) ve fareyi kullanarak bir yapıyı tüm z yığınının üzerinde sitosolunu doldurarak parçalara ayırın.
      5. Ilastik'te kullanılacak segmentli maskeyi, Z uzay listesindeki Alan listesi nesnesine veya viewporttaki maskeye sağ tıklayarak oymak için tohum olarak dışa aktarın ve Dışa aktarma > Alan listelerini etiket (tif) olarakseçin.
7. Daha fazla yeniden yapılandırma için gereken çözünürlüğe bağlı olarak, mümkünse, segmentasyon ve yeniden yapılandırma için kullanılacak yazılımın bellek gereksinimlerini göz önünde bulundurarak, görüntü yığınının piksel boyutunu alt örnekleme yaparak küçültün. Resim > Ayarla > Boyutkullan .
   NOT: ilastik, xy kuyusu üzerinde 500 piksele kadar yığınlar işler. Ayrıca, alt örnekleme yığının çözünürlüğünü azaltacaktır; bu nedenle, nesnenin hala tanınabilir göründüğü ve böylece parçalanabileceği minimum boyutu göz önünde bulundurun.
8. Kontrastı artırmak ve segmentasyona yardımcı olmak için, keskinleşmemiş maske filtresi membranları daha canlı hale getirmek için uygulanabilir. İşlem > Filtre > Keskinliği yitirme maskesinikullanın.
9. Görüntü yığınını, Dosya > Kaydet olarak kullanarak segmentasyon yazılımında (örneğin, ilastik) daha fazla işleme için tek bir görüntü olarak dışa aktarın... > Görüntü sırası ve .tif biçimini seçin.

2. Segmentasyon (Yarı otomatik) ve İlastik 1.3.2 Kullanarak Yeniden Yapılanma

1. Ana ilastik GUI'de Oyma modülünü seçin.
2. Yeni Ekle > Diziden tek bir 3D/4D birim ekle'yikullanarak görüntü yığınını yükleyin.
3. Tüm dizin'i seçin ve tek dosya olarak kaydedilen görüntü yığınını içeren klasörü seçin. Görüntüleri yükleme seçeneklerinin bulunduğu yeni pencerenin alt kısmında, Z'yi seçili tuttuğundan emin olun.
4. Aşağıdaki adımlar için, tüm işlemler ve düğmeler ana yazılım GUI'nin sol tarafında bulunabilir. Ön işleme sekmesialtında, önceden denetlenen standart seçenekleri kullanın. Parlak çizgiler (sırt filtreleri) kullanın ve filtre ölçeğini 1.600'de tutun. Bu parametre daha sonra değiştirilebilir.
5. Ön işleme tamamlandıktan sonra, Etiketleme modülünün açılır menüsündeki bir sonraki sayfayı seçin. Varsayılan olarak bir Nesne ve bir Arka Plan vardır.
6. Üzerine tıklayarak nesne tohumseçin ve ilgi yapısının üstüne bir çizgi çizin; sonra, arka plan tohumünü seçin ve yeniden oluşturulacak nesnenin dışına bir veya birden fazla çizgi çizin. Ardından Segment'e tıklayın ve bekleyin.
   NOT: Bilgisayarın gücüne ve yığının boyutuna bağlı olarak, segmentasyon birkaç saniye ile saat arasında sürebilir. Bu yapıldıktan sonra, segmentasyonu vurgulayan yarı saydam bir maske, parçalı yapının üstünde görünmelidir.
   1. Segmentasyonu denetlemek için yığında ilerleyin. Segmentasyon doğru olmayabilir ve ilgi yapısını doğru bir şekilde takip etmeyebilir veya ondan dökülmeyebilir. Dökülen segmentasyona bir arka plan tohumu yerleştirerek herhangi bir dökülmeyi düzeltin ve ilgi alanının yeniden oluşturulmayan kesiminin üzerine bir nesne tohumu ekleyin.
   2. Segmentasyon hala doğru değilse, kabul edildiği gibi belirsiz sınıflandırılmış piksel miktarını artıracak veya azaltacak Önyargı parametresi ile değiştirmeye çalışın. Değeri varsayılan olarak 0,95'tir; herhangi bir dökülme sınırlamak için azaltmak (genellikle en az 0,9) veya segmentasyon çok konservatif ise artış (en fazla 1).
   3. Diğer bir olasılık da 2.4 adımına geri dönmek (Ön İşlemeyi tıklatarak) ve filtrenin boyutunu değiştirmektir; değerinin artırılması (örneğin, 2) tuz ve biber gürültü benzeri etkileri en aza indirecek ama aynı zamanda membranlar daha bulanık ve daha küçük ayrıntıları tespit etmek zor hale getirecek. Bu dökülmeyi sınırlayabilir.
7. İstenilen tüm nesneler bölümlere alındığı sürece gerektiği kadar yineleme. Bir nesne tamamlandıktan sonra, Segment'inaltındaki geçerli nesneyi Kaydet'etıklayın. Yeni bir nesnenin segmentasyonunu başlatmak için iki yeni tohum görünür.
8. Tüm meshes Dışaaktar'a tıklayarak .obj dosyaları olarak yüzey meshes ayıklayın.
9. Daha fazla redaksiyon gerekiyorsa, segmentasyon ikili maskeler olarak ayıklanabilir. Nesnelere Gözat'ı tıklatarak maskeyi dışa aktarmak için maskeyi seçin; sonra, Segmentasyon > Dışa Aktarma'ya sağ tıklayın ve daha sonra Çıktı dosyası bilgisialtında biçim olarak tif sırasını seçin.

3. TrakEM2 (Fiji) içinde Redaksiyon / Segmentasyon (Manuel)

1. Görüntü yığınını yükleyin ve adım 1.6.1'e göre yeni bir TrekEM2 projesi oluşturun.
2. Görüntü yığınını almak için kullanılan aynı içeri aktarma menüsünde bulunan alan listeleri olarak etiketleri içe aktarmaseçeneğini kullanarak düzeltmeye ihtiyaç duyan maskeleri içeri aktarın.
3. Z alanında içe aktarılan alan listesini seçin ve segmentasyonu gözden geçirmek için Fırça aracını kullanın.
4. Alan listesi > 3D'de göster'esağ tıklayarak modeli 3B olarak görselleştirin. Yeniden örnekleme numarası isteyen aşağıdaki pencerede, daha yüksek bir değer daha düşük çözünürlükte bir ağ oluşturur.
   NOT: Nesnenin boyutuna bağlı olarak, genellikle çözünürlük ve morfolojik ayrıntı arasında en iyi uzlaşma verir 4 ve 6 arasında bir değer kullanmayı düşünün.
5. 3B kafesi wavefront .obj olarak menüden seçerek dışa aktarın Dosya > Yüzeyleri Dışa Aktar > Wavefront.

4. 3D Analizi

1. Blender'ı aç. Aşağıdaki adımlar için NeuroMorph araç kitini (https://neuromorph.epfl.ch/index.html mevcuttur) ve glikojen analiz araç kitini (https://github.com/daniJb/glyco-analysis mevcuttur) taktığından emin olun.
   1. Aynı anda birden çok nesne almak için Sahne menüsü altında Nesneleri Alma'yı tıklatarak NeuroMorph toplu alma kullanarak nesneleri içe aktarın. Remesh ve Düzgün gölgelemekullanımı etkinleştirdiğinden emin olun.
      NOT: Nesnenin başlangıç boyutu hakkında belirsizlik varsa Finalize remesh'e tıklamanız önerilmez. Değer 7 (varsayılan) de alma ağacı derinliği genellikle kabul edilebilir bir çözünürlük ve nesnenin morfolojisi korumak için iyidir.
   2. Alt satırdan ilgi çekici nesneyi seçin ve vertices sayısını en aza indirmek ve çözünürlük ve doğru morfoloji ayrıntıları kaybetmesini önlemek için değiştirici menü altında yinelemeli remesh işlevinin octree derinliğini değiştirin. Octree derinliğini değiştirirken, ana GUI'deki kafes buna göre değişecektir. Tamamlandıktan sonra, işlemi sonuçlandırmak için Uygula'yı tıklatın.
      NOT: 4 civarındaki değerler genellikle küçük nesneler (postsinaptik yoğunluklar gibi), büyük nesneler için 7 civarındaki değerler (uzun aksonlar veya dendritler gibi) ve farklı çözünürlüklerin ayrıntılarının olması gereken tam hücresel morfolojiler için 8 veya 9 civarındaki değerler için iyidir. Tutulan.
   3. Görüntü yığınını yüklemek için, NeuroMorph menüsünün altındaki sol paneldeki görüntü biriktirme aracı Nı görüntü yığını etkileşimlerini kullanın. X, yve x (kafesin birimlerine bağlı olarak mikron veya nanometreler) için görüntü yığınının fiziksel boyutunu girdiğimden emin olun ve Source_Z'yetıklayarak yığının yolunu seçin. X ve Y ortogonal düzlemlerdir; isteğe bağlıdırlar ve yalnızca kullanıcı geçerli bir yol eklerse yüklenir.
   4. Daha sonra, viewport'ta sağ tıklayarak bir kafes seçin, Sekmetuşuna basarak düzenleme moduna girin, fare sağ tıklatarak bir (veya daha fazla) vertices seçin ve son olarak, tepe noktasında göster resmine tıklayın. Bir (veya daha fazla) kesilmiş düzlem(ler) mikrograf ile mesh üstüne üst üste görünür.
   5. Üzerine sağ tıklayarak kesilen düzlemi seçin, Ctrl + Ytuşuna basın ve fare kaydırma özelliğini kullanarak 3B modelüzerinde ilerleyin. Bu da düzeltme yöntemi olarak kullanılabilir.
   6. Yüzey alanlarının, hacimlerin ve uzunlukların ölçülmesi için Ölçüm araçlarını kullanın. Bu operasyonlar Jorstad ve ark.¹⁹ ve NeuroMorph web sitesi²⁴tarafından daha ayrıntılı olarak belgelenmiştir.
   7. Glikojen yakınlığını dikenlere ve boutonlara doğru ölçmek için Glikojen analiz aracını kullanın. İşlemler bir önceki yayında daha ayrıntılı olarak belgelenmiştir¹⁰ ve glikojen analiz^{deposunda 25}.
2. GLAM²³çalıştırın. Kod, yürütülebilir ve bazı test dosyaları GLAM deposunda kullanılabilir^26.
   1. .ply formatında iki geometri dosyası hazırlayın: glikojen granülleri içeren bir kaynak dosya ve morfoloji yüzeyleri içeren bir hedef dosya.
   2. Yerel soğurma değerlerini, tepe değerlerini ve ortalama soğurma değerlerini temsil etmek için üç .ascii colormap dosyası (her satır t_norm(0..1) R(0..255) G(0..255) B(0.255)) içeren üç hazırlayın.
   3. Etki yarıçapını (mikronlarda), beklenen maksimum soğurma değerini ve emilim tepelerini kümeleme için normalleştirilmiş bir eşik ayarlayarak, geometri dosyaları (adım 4.2.1) ve renk eşlemi dosyalarıyla (adım 4.2.2) C++ komut dosyası GLAM'ı çalıştırın. Diğer parametreler hakkında bilgi için komut dosyasını -yardım seçeneğiyle çalıştırın.
   4. Sonuçları .kat veya .obj dosyaları olarak dışa aktarın: GLAM değerleriyle renk eşlenen hedef nesneler, renk kodlu küreler olarak gösterilen emme tepe işaretleri ve ortalama soğurma değerine göre renk kodlu hedef nesneler.
3. VR Veri Etkileşimini Açın. VR Data Interact-çalıştırılabilir kod genel bir depo²⁷mevcuttur.
   1. VR menüsündeki talimatları izleyerek görselleştirilecek meshe'leri içe aktarın. Bir GLAM çözümlemesi gerekirse, adım 4.2.1'de hesaplanan .obj dosyalarını içe aktarmayı unutmayın.

Sonuçlar

Yukarıda sunulan yordamı kullanarak, araçların esnekliğinin yordamı daha büyük veri kümelerine ölçeklendirmeyi nasıl mümkün kdığını göstermek için farklı boyutlardaki iki görüntü yığınının sonuçlarını gösteririz. Bu durumda, iki 3DEM veri kümesi (i) P14 sıçan, somatosensoriyel korteks, katman VI, 100 μm x 100 μm x 76.4 μm⁴ ve (ii) P60 sıçan, hipokampus CA1, 7.07 μm x 6.75 μm x 4.73 μm¹⁰.

Ön işleme adımları(Şekil 1)her iki veri kümesi için de aynı şekilde gerçekleştirilebilir, sadece ilk yığın gibi daha büyük bir veri kümesinin, yani 25 GB'lık, büyük veri görselleştirme ve işleme işlemek için daha fazla performans donanımı gerektirdiği göz önünde bulundurularak . İkinci yığın sadece 1 GB, mükemmel bir isotropic voxel boyutu ile.

Verilerin boyutu, mikroskobun sensörünün maksimum piksel boyutuna ve yığının büyütülmesine bağlı olan yığının çözünürlüğü yerine doğrudan görüş alanıyla (FOV) ilişkili olmayabilir. Her durumda, mantıksal olarak, daha büyük FOV'lar aynı çözünürlükte elde edilirse, küçük FOVs ile karşılaştırıldığında daha fazla fiziksel alan işgal olasılığı yüksektir.

Görüntü yığını içe aktarıladıktan sonra, protokolün bölüm 1'inde belirtildiği gibi, Fiji yazılımında(Şekil 1A),ImageJ^12'ninbilimsel bir sürümü, görüntü biçiminin 8-bit olduğundan emin olmaktır (Şekil 1B). Bunun nedeni, birçok satın alma yazılımı farklı mikroskopi şirketleri üreticileri 16-bit olarak edinme süreci (yani, piksel boyutu, kalınlığı, akım / gerilim hakkında bilgi ile ilgili meta verileri depolamak için kendi özel dosya biçimini oluşturmak elektron ışını, oda basıncı) ile birlikte görüntü yığını. Meta veriler içeren ekstra 8 bit görüntüleri etkilemez gibi bu tür ayarlamalar, bilim adamları bellek kaydetmek için izin verir. Kontrol etmek için ikinci önemli parametre voxel boyutu, daha sonra segmentasyon aşağıdaki rekonstrüksiyon doğru ölçekte (mikrometre veya nanometre; Şekil 1B).

Yığınlar, fayans kullanılarak elde edilmişse yeniden hizalama ve/veya dikiş gerekebilir; bu işlemler TrakEM2(Şekil 2A)içinde gerçekleştirilebilir, ancak yeniden hizalama ile ilgili olarak, FIB-SEM veya 3View gibi otomatik 3DEM teknikleri genellikle iyi hizalanır.

Son bir adım, hangi nesnelerin yeniden oluşturulması gerektiğine ve alt örneklemenin yeniden oluşturulabilir özelliklerin tanınmasını etkileyip etkilemediğine bağlı olarak filtreleme ve büyük olasılıkla yığının alt örneklemesini gerektirir. Örneğin, daha büyük yığın için (P14 sıçanların somatosensoriyel korteks) rekonstrüksiyon verimliliği yararına çözünürlüğü tehlikeye atmak mümkün değildi, daha küçük yığın (P60 sıçanların hipokampus CA1) için ise, bunu yapmak mümkün oldu çünkü çözünürlük, en küçük nesnelerin yeniden oluşturulabilmesi için gerekenin çok üzerindeydi. Son olarak, keskinolmayan maskenin kullanımı membranlar ve arka plan arasındaki farkı artırarak, sınırları önceden değerlendirmek için degradekullanan ilastik gibi yazılımların yeniden yapılandırılması için elverişli hale getirir.

Görüntü işleme sonrasında yeniden yapılandırma, TrakEM2 kullanılarak manuel olarak veya yarı otomatik olarak ilastik kullanılarak gerçekleştirilebilir (Şekil 2C). Burada listelenen küçük bir gibi bir veri kümesi (ii), belleğe sığacak şekilde alt örneklenebilir, yoğun bir yeniden yapılanma üretmek için ilastik(Şekil 2B)kullanılarak tam olarak segmente edilebilir. Burada listelenen ilk veri kümesi söz konusu olduğunda (i), 500 GB RAM ile bir Linux iş istasyonu ile tüm veri kümesini yüklemeyi ve önceden işlemeyi başardık. 16 tam morfolojinin seyrek segmentasyonu, TrakEM2 kullanılarak elle prova edilen kaba segmentasyon çıkarılarak hibrit bir boru hattı ile elde edildi.

Yüzey alanları, hacimler veya hücre içi glikojen dağılımı gibi özelliklerin 3B analizi, NeuroMorph¹⁹ veya glikojen analizi¹⁰gibi özel kodlar kullanılarak Blender ortamında(Şekil 3)gerçekleştirilebilir.

Glikojen granülleri içeren veri kümelerinin de olması durumunda, dağılımları üzerinde analiz, doğrudan kafes üzerinde etki alanına sahip renk eşlemleri oluşturacak bir C++ kodu olan GLAM kullanılarak çıkarılabilir.

Son olarak, bu tür karmaşık veri kümeleri, belirli bir tıkanmış görünüme sahip veri kümelerinin analizinde yararlı olduğu kanıtlanan VR kullanılarak görselleştirilebilir ve analiz edilebilir(Şekil 4). Örneğin, GLAM haritalarından çıkarılan zirveler, burada tartışılan ikinci veri setinde dendritlerden görsel olarak kolayca çıkarılmıştır.

Şekil 1: Görüntü işleme ve görüntü bölümleme için hazırlık. (a) Ana Fiji GUI. (b) Temsili sonuçlarda tartışılan veri kümesinin (i) yığılmış görüntüleriörneği. Sağdaki panel, kullanıcının voxel boyutunu ayarlamasına izin veren özellikleri gösterir. (c) Tek bir görüntüye uygulanan filer ve yeniden boyutlandırma işlemi örneği. Sağdaki paneller görüntünün merkezinden büyütmeler gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: TrakEM2 ve ilastik. (a) TrakEM2 GUI kullanılarak elle bölümlere ayrılmıştır (kırmızı) nesnelerle segmentasyon ve rekonstrüksiyon. (b) A panelinden dışa aktarılan maske ,(c)yarı otomatik segmentasyon (oyma) için giriş (tohum) olarak kullanılabilir. Ilastik itibaren, maskeler (kırmızı) daha trakEM2 manuel redreading için ihraç edilebilir. (d) Maskeler daha sonra yeniden yapılandırılan yapıları ortaya çıkarmak için 3D üçgen meshes olarak ihraç edilebilir. Bu örnekte, dataset (i) (i) (temsili sonuçlarda tartışılan) dört nöron, astrosit, mikroglia ve perisit bu süreç kullanılarak yeniden inşa edilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Özelleştirilmiş araçlar kullanılarak yeniden yapılandırılan morfolojilerin 3Boyutlu analizi. (a) FIB-SEM veri setinden (ii) izotropik görüntülenmiş hacim (temsili sonuçlarda anlatıldığı gibi). (b) Panel a'danyoğun rekonstrüksiyon . Gri = akson; yeşil = astrositik süreç; mavi = dendritler. (c)Doğru büyütmelerde sinapslar (dataset (i)) ve astrositik glikojen granülleri (dataset (ii)) gibi niceliklere yönelik hedef örneklerini gösteren mikrograf. (d) Sinapslar etrafında glikojen granüllerin dağılımını gösteren c panelinden maske. (e) Blender'dan glikojen analiz alet kutusunu kullanarak cpanelinden gelen veri setinden glikojen dağılımının ölçülmesi. Hata çubukları standart hataları gösterir. N = 4,145 glikojen granül. (f) GLAM'ın giriş ve çıktı görselleştirmesinin grafik selüliti. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: VR analizi. (a) Üzerinde çalışırken VR kulaklık takan bir kullanıcı (b) FIB-SEM veri kümesinden (ii) yoğun yeniden yapılanma (temsili sonuçlarda anlatıldığı gibi). (c) B panelindenbir alt nötrit kümesinden sürükleyici VR sahnesi . Yeşil lazer GLAM zirvesini gösteriyor. (d) GLAM tepe sayar VR bir analiz örneği. N = 3 fare her çubuk başına. Bir önceki yayından FIB-SEM analizi²⁸. Hata çubukları standart hataları gösterir; *p < 0.1, tek yönlü ANOVA. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Burada sunulan yöntem, fib-SEM veya diğer otomatik seri kesit ve görüntüleme teknikleri gibi yüksek çözünürlüklü görüntüleme tekniklerinden gelsin, çok ölçekli bir EM veri setinin segmentasyonu ve 3D rekonstrüksiyonu için yararlı bir adım adım kılavuzdur. FIB-SEM, voxel boyutunda, odaklanmış bir iyon ışını kullanarak 5 nm'ye kadar ince keserek mükemmel izotropiye ulaşma avantajına sahiptir, fov'u yan objeler nedeniyle 15-20 m ile sınırlı olabilir, ki bu da muhtemelen kesilen dokunun birikmesi nedeniyle fo V bu değeri aşıyor. Bu tür eserler, mikroskop odası nın içindeki seri bölümleri kesmek için elmas bir bıçak kullanan SBEM gibi diğer teknikler kullanılarak önlenebilir. Bu ikinci durumda, z çözünürlüğü en iyi ihtimalle 20 nm civarında olabilir (genellikle, 50 nm), ancak piksel çözünürlüğü ilgi geniş bir bölge için tehlikeye gerekir rağmen, FOV daha büyük olabilir. Bu tür sınırlamalar (büyütme vs FOV) aşmak için bir çözüm fayans ilgi bölgesi bölmek ve her biri daha yüksek bir çözünürlükte elde etmektir. Burada hem temsili sonuçlarda bir SBEM yığın-veri kümesinin (i) hem de temsilci sonuçlarında FIB-SEM yığın-dataset (ii) sonuçlarını gösterdik.

Daha büyük ve daha büyük veri kümelerinin oluşturulması giderek yaygınlaştıkça, piksel sınıflandırması ve otomatik görüntü bölümleme için araçlar oluşturma çabaları çoğalıyor; Yine de, bugüne kadar, hiçbir yazılım güvenilirliği insan redaksiyon, bu nedenle hala gerekli, ne kadar zaman alıcı olursa olsun karşılaştırılabilir kanıtlamıştır. Genel olarak, veri kümesi (ii) durumunda olduğu gibi alt örneklenebilen daha küçük veri kümeleri, düzeltme süresi de dahil olmak üzere bir hafta içinde tek bir uzman kullanıcı tarafından yoğun bir şekilde yeniden oluşturulabilir.

Burada sunulan protokol özellikle üç yazılım programlarının kullanımını içerir: Fiji (sürüm 2.0.0-rc-65/1.65b), ilastik (sürüm 1.3.2 rc2) ve Blender (2.79), hepsi açık kaynak ve çoklu platform programları ve ücretsiz indirilebilir. Fiji ImageJ bir sürüme, biyolojik görüntü analizi için eklentileri tarafından desteklenmektedir. Bu sağlam bir yazılım mimarisine sahiptir ve yaşam bilim adamları için ortak bir platform olarak önerilmektedir ve TrakEM2, görüntü segmentasyonu için ilk ve en yaygın olarak kullanılan eklentileri içerir. Son zamanlarda birçok kullanıcı tarafından yaşanan bir sorun java 6 Java 8, uyumluluk sorunları yaratıyor geçiş; bu nedenle, Fiji'nin düzgün çalışmasına izin vermek için mümkünse Java 8'e güncellemekten kaçınmanızı öneririz. ilastik piksel sınıflandırması için bir dizi çerçeve sağlayan güçlü bir yazılımdır, her biri kendi web sitesinde belgelenmiş ve açıklanmıştır. EM yığınlarının yarı otomatik bölümlemasyonu için kullanılan oyma modülü, bilim adamlarının deneyimli bir kullanıcı için el ile çalışma için harcanan zamanı aylardan günlere düşürmelerine olanak tanıyan, tek bir tıklamayla tüm bir neurite olabileceği için çok zaman kazandırır. saniyeler içinde bölümlenir. Ön işleme adımı donanım açısından çok yoğundur ve burada sunulan SBEM yığını gibi çok büyük veri kümeleri, 26 GB'lık bir özellikti, belleğe sığacak tuhaf stratejiler gerektirir, çünkü büyük veri seti elde edilemeyeceğini göz önünde bulundurarak görüş ve çözüm alanı uzlaşma. Bu nedenle, alt örnekleme bu durumda uygun bir çözüm olmayabilir. Yazılımın en son sürümü güçlü bir Linux iş istasyonu ile birkaç saat içinde önişleme yapabilirsiniz, ancak segmentasyon dakika sürer ve yığın arasında kaydırma hala nispeten yavaş olacaktır. Biz hala ilk, kaba segmentasyon için bu yöntemi kullanmak ve TrakEM2 kullanarak proofread. Son olarak, Blender bir 3D modelleme yazılımı, güçlü bir 3D render motoru ile, hangi eklentileri olarak ana GUI gömülü olabilir python komut ile özelleştirilebilir, NeuroMorph ve glikojen analizi gibi. Bu yazılımın esnekliği, örneğin Fiji'nin aksine, büyük veri kümelerinin çevrimiçi görselleştirmesi için tasarlanmadığının dezavantajıile birlikte gelir; bu nedenle, büyük meshes (1 GB aşan) ile görselleştirme ve gezinme yavaş ve verimli olmayabilir. Bu nedenle, her zaman örgü karmaşıklığıazaltmak ama ilgi yapısının orijinal morfolojisi bozmak için dikkatli teknikleri seçmek için tavsiye edilir. Remesh işlevi kullanışlı dır ve NeuroMorph toplu alma aracının gömülü bir özelliğidir. Bu işlevle ilgili bir sorun, özgün kafesin tepe sayısına bağlı olarak, son çözümle ilgili octree derinlik değerinin buna göre değiştirilmesi gerektiğidir. Küçük nesneler küçük bir octree derinliği (örneğin 4) ile yeniden kullanılabilir, ancak aynı değer daha büyük değerlere ihtiyaç olan büyük nesnelerin morfolojisini bozabilir (en iyi ihtimalle 6, tam hücre gibi çok büyük bir ağ için 8 hatta 9). Nesnenin boyutu net değilse, bu işlemi yinelemeli yapmak ve farklı octree derinliklerini test etmek tavsiye edilir.

Daha önce de belirtildiği gibi, dikkate alınması gereken bir yönü kullanılan yazılım ile ilgili, yeniden yapılanma ve analiz, adanmış olması hesaplama gücüdür. Bu makalenin temsili sonuçlarında gösterilen tüm işlemler, AMD FirePro D500 Ekran kartı, 64 GB RAM ve 8 çekirdekli Intel Xeon E5 Işlemci ile donatılmış bir MacPro kullanılarak elde edilebilmektedir. Fiji büyük veri kümelerini işlemek için iyi bir yazılım mimarisine sahiptir; bu nedenle, 2,5 GHz Intel i7 işlemcive 16 GB RAM ile MacBook Pro gibi iyi bir donanım performansına sahip bir dizüstü bilgisayar kullanılması önerilir. ilastik yazılım, özellikle ön işleme aşamasında donanım kaynakları açısından daha talepkardır. Görüntü yığınının alt örneklemesi yazılımdan gelen donanım isteklerini sınırlamak için iyi bir hile olsa da ve kullanıcının bir dizüstü bilgisayarla bir desteyi işlemesine izin veriyor (genellikle x, y ,z'de 500 pikselin altındaysa), üst düzey bir kullanım önermekteyiz. bilgisayar sorunsuz bu yazılımı çalıştırmak için. Intel Xeon Gold 6150 Işlemci ile donatılmış, 16 çekirdekli ve 500 GB RAM ile donatılmış bir iş istasyonu kullanıyoruz.

Doğru bir 3D rekonstrüksiyon sağlandığında, bilim adamları orijinal mikrografları atabilir ve aynı türdeki hücrelerin yanı sıra farklı hücre türlerini karşılaştırmak için yararlı morfometrik verileri ayıklamak için doğrudan 3B modeller üzerinde çalışabilir ve morfolojilerin nitel ve nicel değerlendirmeleri. Özellikle, ikincisinin kullanımı, görsel oklüzyon (yani, gözlemci ve fi arasında yerleştirilen ikinci bir ilgi nesnesinin görüş engellemesi) mevcut yoğun veya karmaşık morfolojilerin analizleri durumunda yararlı olduğu kanıtlanmıştır rst nesne), temsil etmek ve 3D onları analiz etmek zor. Sunulan örnekte, deneyimli bir kullanıcının veri kümelerini gözlemleyebilmek ve nesneleri saymak yaklaşık 4 saat üst üste zaman aldı. VR analizi nde harcanan zaman, VR hastalığı gibi yönleri (bir dereceye kadar araba hastalığı ile ilgili olabilir) kullanıcı deneyimi üzerinde olumsuz bir etkiye sahip olabilir gibi değişebilir; Bu durumda, kullanıcı diğer analiz araçlarını tercih edebilir ve VR'a adanmış zamanlarını sınırlandırabilir.

Son olarak, tüm bu adımlar görüntü yığınları oluşturmak diğer mikroskopi ve olmayan EM teknikleri uygulanabilir. EM, genel olarak, işlemek ve segment zor görüntüler üretir, örneğin, floresan mikroskopisi ile karşılaştırıldığında, bir şey ikili maske karşılaştırılabilir (siyah bir arka plan karşı sinyal), prensipte kolayca 3D işlenebilir daha fazla işleme, genellikle ele alınması gerekir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Fiji	Açık Kaynak	2.0.0-rc-65/1.65b	Açık Kaynak görüntü işleme editörü www.fiji.sc
iLastik	Açık Kaynak	1.3.2 rc2	Görüntü Segmentasyon aracı < / > www.ilastik.org
Blender	Blender Foundation	2.79	Açık Kaynak 3D Modelleme yazılımı < br / > www.blender.org
HTC Vive Kulaklık HTC Vive		/ Vive Pro	Sanal Gerçeklik (VR) Başa monte kulaklık www.vive.com
Nöromorf	Açık Kaynak	---	3D Analiz için Blender Eklentileri Koleksiyonu < br / > neuromorph.epfl.ch
Glikojen Analizi Glikojen	https://github.com/daniJb/glyco-analysis analizi için	Kaynak	---
GLAM	Haritaları oluşturmak için Açık Kaynak---C++ Kodu oluşturmak için https://github.com/magus74/GLAM