İzleme GPCR-β-arrestin1/2 etkileşimleri gerçek zamanlı yaşam sistemleri Ilaç Discovery hızlandırmak için

GPCRs piyasada mevcut ilaçların yaklaşık% 35 hedef temsil^1,2 ve onların farmakolojisinin net bir anlayış yeni terapötik ilaçların gelişimi için çok önemlidir³. Özellikle önyargılı agonistlerin gelişimi sırasında GPCR uyuşturucu keşfinin önemli yönlerinden biri, yeni ligizlerin reseptör-β-tutucu etkileşimleri⁴ ve β-tutucu diğer sitosolik proteinlerle etkileşimlerine doğru karakterize edilmedir. Clathrin⁵olarak.

Β-tutucu bağımlı sinyalizasyon, bipolar bozukluk, büyük depresyon ve şizofreni⁶ gibi nörolojik hastalıklarda önemli bir rol oynadığını ve morfin⁷gibi bazı ilaçlarda da ciddi yan etkileri olduğunu belgelenmiş.

Bu etkileşimleri izlemek için kullanılan geçerli yöntemler genellikle çalışma proteinlerinin gerçek endojen düzeylerini temsil etmez, bazı durumlarda zayıf sinyal, photobleaching ve GPCR bağlı olarak teknik olarak⁸kurmak zor olabilir gösterir. Bu roman yapısal uluslara tahlil endojen fizyolojik seviyeleri taklit etmek için düşük ifade Organizatör vektörler kullanır ve mevcut yöntemlerle karşılaştırıldığında yüksek hassasiyet sağlar⁹. Bu yaklaşımı kullanarak, kolayca galanin reseptör-β-arrestin1/2 ve β-arrestin2-Clathrin etkileşimleri karakterize etmek mümkün oldu¹⁰. Bu metodoloji, β-tutucunun önemli bir fizyolojik fonksiyon çalabileceği veya sinyallerinin bazı hastalıklarda ilgili olduğu belirli bir ilgi alanı için yaygın olarak kullanılabilir.

1. Primer tasarım stratejisi

1. Pbit 1.1-c [TK/lgbit], pbit 2.1-c [TK/smbit], pbit 1.1-n [TK/lgbit] ve pbit 2.1-n [TK/smbit] vektörler içine ilgi genler tanıtmak için tasarım astarlar.
2. Şekil 1¹¹' de gösterildiği gibi multicloning siteyi böler bir çerçeve içi stop kodon varlığı nedeniyle yönlü klonlama için gereken iki benzersiz kısıtlama enzimleri biri olarak bu üç siteden en az birini seçin.
3. Tablo 2¹¹' de kırmızı renkte gösterilen bağlayıcı kalıntıları kodlamak için Tablo 1 ' de gösterildiği gibi astar içine nükreotid dizisini birleştirin.
4. Pbit 1.1-c [TK/lgbit] ve pbit 2.1-c [TK/smbit] vektörler için, 5 ' astar bir ATG kodon ve güçlü bir kozak görüş sırası (gccgccacc) içerdiğinden emin olun.
5. PBiT 1.1-N [TK/LgBiT] ve pBiT 2.1-N [TK/SmBiT] vektörler için 3 ́ astar bir stop Codon içerdiğinden emin olun.
   Not: her vektörünün nonspesifik ilişkiyi en aza indirmek ve deneysel eserler azaltmak için HSV-TK promotör içerir, Ayrıca her vektör bakterilerde ampisilin direnci için bir ifade kaseti vardır.

2. PCR

1. Adım 1 ' den tasarlanan astar kullanarak, faiz geninin eklemek DNA 'sını yükseltmek için PCR reaksiyonları ayarlayın ve çalıştırın. Mutasyonları en aza indirmek için yüksek sadakat DNA polimeraz kullanmak önemlidir.
2. 50 μL PCR reaksiyonu hazırlamak için tam olarak aşağıdaki sırayı kullanın. Ekle 35,5 μL distile su, 5 μL 10X polimeraz tampon, 5 μL dNTP karışımı (2,5 mM her), 1 μL Plasmid şablonu (200 ng/μL), 1,25 μL ileri ve ters astar (10 μM) ve 1 μL yüksek sadakat polimeraz (5 U/μL).
3. Bir termocycler kullanarak aşağıdaki DNA amplifikasyon programı kurmak.
   1. 95 Ila 5 dk. arasında denature
   2. Aşağıdaki termal döngüsü 25 kez tekrarlayın: 95 °C için 30 s, 60 °C 1 dk, 72 °C için 1 KBP başına 2 dk amplifikatördür.
   3. 72 °C ' de 10 dakika boyunca son bir uzatma çalıştırın.
   4. Numuneleri 4 °C ' de thermocycler içinde tutun.
      Not: özellikle uzun sıraları amplifikasyon sırasında meydana gelen nokta mutasyonları en aza indirmek için yüksek sadakat polimeraz kullanmak için tavsiye edilir. Amplikon uzunlaştığında, DNA 'nın çoğaltmasında doğruluk derecesi azalır. PCR reaksiyon için, oligos doğrudan DNA şablonu ile melezleşme ve astar tüm dizisi ile değil bölgenin erime sıcaklığına dayalı tavlama sıcaklığını seçin.
4. PCR ürün arıtma
   1. PCR ürününü,¹²' si bir üreticiden bir kit kullanarak PCR reaksiyonunun geri kalanından ayırın. PCR ürün şimdi kısıtlama sindirim için hazırdır.

3. DNA sindirim

1. PCR ürün sindirim hazırlamak için 50 μL sindirim reaksiyonu aşağıdaki gibi.
   1. 1,5 mL 'Lik bir tüp kullanarak 12 μL distile su ekleyin.
   2. Her iki kısıtlama enzimiyle en iyi uyumluluğa sahip 5 μL 10X tampon ekleyin.
   3. 2,4 adımda 30 μL PCR ürün ekleyin
   4. Son olarak, her kısıtlama enzim 1,5 μL ekleyin.
   5. Girdap ile kısaca karıştırın ve 37,5 °C ' de bir gecede inküye yapın.
2. Alıcı Plasmid sindirim için hazırlamak 50 μL sindirim reaksiyonu aşağıdaki gibi:
   1. 1,5 mL 'Lik bir tüp kullanarak 23 μL distile su ekleyin.
   2. Her iki kısıtlama enzimiyle en iyi uyumluluğa sahip 5 μL 10X tampon ekleyin.
   3. 15 μL alıcı Plasmid (200 ng/μL) ekleyin.
   4. Her kısıtlama enziminin 1,5 μL değerini ekleyin.
   5. Girdap ile kısaca karıştırın ve 37,5 °C ' de bir gecede inküye yapın.
      Not: DNA agaroz jel arıtma sonrası yeterli malzeme elde etmek için 3 μg alıcı plazmid kullanmak önemlidir. Ayrıca, yüksek klonlama verimliliği elde etmek için her iki enzimi kullanarak bir gecede DNA sindirimleri bırakmak ilgilidir.

4. DNA agaroz jel arıtma ve klonlama

1. Sindirilmiş DNA plazmid ve ekler çalıştırmak için% 1 agaroz jel hazırlayın ve ilgili bantları kesmek için devam. Karşılık gelen vektör ve kesici uç bantları purified12 olduktan sonra, spektrofotometreyi kullanarak DNA konsantrasyonunu belirleyin.
2. Alıcı Plasmid için eklemek sigorta DNA ligasyon gerçekleştirin.
3. Yaklaşık 100 ng, plazmid vektörü 50 ng dahil toplam DNA 'nın ligasyon reaksiyonları hazırlayın.
4. Yaklaşık 1:3 alıcı Plasmid-kesici uç oranını ayarlayın; bir Vector-INSERT Calculator¹³kullanılarak hesaplanabilir.
5. Negatif denetimler paralel olarak ayarlayın. Örneğin, herhangi bir Ekle olmadan alıcı plazmid DNA bir ligasyon sindirilmemiş veya self-ligating alıcı Plasmid ne kadar arka plan mevcut hakkında bilgi verecektir.

5. klonlar dönüşümü

1. -80 °C ' de dondurucudan DH5α yetkili hücrelerin bir tüp yerleştirin ve hemen 20 dakika buz üzerine aktarın.
2. O zamandan sonra, 55 μL DH5α yetkili hücre alın ve 4 μL ligasyon reaksiyonu ekleyin ve tüp Flicking ve 45 dakika boyunca buz üzerinde mağaza karıştırın.
3. Daha önce tam 48 s için 42 °C ısıtılmış bir su banyosuna tüp yerleştirin ve hemen başka bir 3 dakika için buz üzerinde geri tüpler almak.
4. 37,5 °C ' de daha önce ısınmış Luria broth (LB) orta 600 μL ekleyin ve 200 devirde 1 saat boyunca sallayarak inküye yapın.
5. 200 μL 'yi ampisilin 100 μg/mL içeren bir agar plakasına aktarın ve yüzeyden hafifçe yayılır ve sıvıyla çoğunlukla absorbe edilir.
6. Ertesi sabah kolonileri görmek için plakaları bir gecede kulbe etmek. Ekle plakasının alıcı plazmid alıcı Plasmid tek başına plaka daha önemli ölçüde daha fazla koloniler olmalıdır.

6. bitmiş Plasmid izolasyonu

1. Seçin 3-10 bireysel bakteriyel koloniler ve 1 mL LB orta içeren ampisilin (100 μg/mL) içine transfer ve 6 h için inkük.
2. 200 μL bakteriyel süspansiyon alın ve 6,1 adımda olduğu gibi aynı ampisilin konsantrasyonu içeren 5 mL LB orta transfer ve 37,5 ° c 'de bir gecede, 200 rpm 'de sallayarak ile inküye.
3. Bir Sage DNA kiti arıtma kullanarak, 5 ml lb kullanarak Sage DNA saflaştırmaları gerçekleştirmek bir gecede üretici talimatlar¹⁴aşağıdaki büyüdü.
4. Başarılı ligasyonları belirlemek için, ilk PCR sırasında Bölüm 2 ' de olduğu gibi aynı astar ile bir şablon olarak adım 6,3 elde edilen DNA 'Yı kullanarak bölüm 2 ' de aynı şekilde PCR reaksiyonları ayarlayın. Pozitif klonlar ilgili boyutta PCR ürünleri üretecektir.
5. Pozitif klonlar büyük hazırlık DNA arıtma sonra, klonlama aşamasında kullanılan enzimler ile 500 ng bir tanı kısıtlama sindirim davranış ve% 1 agaroz jel sindirilmiş ürünleri çalıştırın. İki bant olmalıdır: bir vektör boyutu ve bir yeni ekleme boyutu.
6. Aşağıdaki Primers kullanarak sıralama tarafından yapı sırasını doğrulayın: Forward 5 '-aaggtgacgcgtgtggcctcgaac-3 ' ve Reverse 5 '-gcatttttttcactgcattctagtt-3 '.
   Not: DNA, PCR kullanılarak çoğaltıldığında, yüksek sadakat polimeraz kullanırken bile amplifikasyon sırasında her zaman hata olasılığı vardır, bu nedenle son yapıları sıralamak çok önemlidir.

7. transfeksiyon ve protein ifadesi

1. Daha önce poli-L-lizin-kaplamalı beyaz 96 iyi plaka, bir gün transfeksiyon önce 2,5 x 10⁴ hücrelerde Iyi Dulbecco değiştirilmiş Eagle 'Nın orta fetal Sığır serum% 10 ile tamamlayıcı kullanarak hücre yapmak, 100 U/ml penisilin G, ve 100 μg/ mL streptomisin.
2. Sadece 60 iç kuyuları kullanarak, plaka ve buharlaşma kenar efektleri boyunca termal degradelerin potansiyelini en aza indirmek için. 36 dış kuyularına ve 150 μL 'ye 200 μL steril damıtılmış su ekleyin ve gece boyunca 37,5 °C ve CO₂' nin% 5 ' inde kulyur.
3. Ertesi sabah kullanarak transfeksiyon gerçekleştirmek 100 toplam DNA NG (50 ng her yapı).
4. Şekil 2B'ye göre dört farklı Plasmid kombinasyonu (reseptör: β-tutucu) ayarlayın.
5. Her bir Plasmid kombinasyonu için, iyi başına 0,3 μL lipidik transfeksiyon reakajını kullanarak HEPES ile tamponlu 20 μL modifiye kartal minimum Essential medya kullanılır.
6. Her bir kuyu için 20 μL lipidik transfeksiyon reagent-DNA karışımı ekleyin ve plakayı 10 s için çevrelerde karıştırın.
7. 37,5 °C ve% 5 CO₂' de 6 saat İnkübasyon sonrasında taze ortamı değiştirin.
8. 37,5 °C ve% 5 CO₂' de 24 saat boyunca plakayı kulbe etme.

8. HEK293 hücrelerde reseptör-β-arrestin1/2 etkileşimlerini izleme

1. Aspirate orta ve eklemek 100 μL değiştirilmiş Eagle 's asgari Essential Media her iyi HEPES ile tamponlu ve plaka RT 10 dakika stabilize izin.
2. 100 x substrat 1 hacminin LCS seyreltme tamponu 19 hacimleri ile birleştirerek furimazin substrat hazırlayın (20 kat seyreltme)¹¹, hücre kültürü orta ile karıştırmak için 5x stok oluşturma.
3. Her bir kuyu için 25 μL 5x furimazin ekleyin ve 10 s için çevrelerde hafifçe karıştırın.
4. RT 'de sinyal stabilizasyonu için 10 dakika boyunca Luminesans ölçmek.
   Not: her iyi tepkisi normalleştirmek için bu taban çizgisi sinyali kullanarak, aynı zamanda transfeksiyon verimliliği, vb farklılıkların hücre sayısı farklılıklar neden farklılıkları azaltmak için yardımcı olacaktır. Hesaplanan bir kez, belirli bir ilaç tedavisi için çoğaltmak kuyuları normalleştirilmiş yanıt ortalama.
5. Modifiye kartal asgari Essential medya HEPES ile tamponlu 13.5 x ligand solüsyonu hazırlayın.
6. 10 μL 13.5 x ligand ilavesi ile Oda sıcaklığında deneyler için, enjektörler veya çok kanallı pipet kullanarak bileşikleri ekleyin ve plakayı elle veya orbital Shaker (200 rpm 'de 20 s) kullanarak karıştırın.
7. 10 μL 13.5 x ligand ilavesi ile 37,5 °C ' de deneyler için, cihaz orbital Shaker kullanarak bileşikleri ve karışımı dağıtmak için enjektörler kullanın. Enjektörleri kullanmıyorsanız, plakayı luminometreden çıkarın, ligleri ekleyin ve plakayı elle veya orbital Shaker (200 rpm 'de 20 s) kullanarak karıştırın.
   Not: armataktaki plakayı kaldırarak ilgili sıcaklık dalgalanmalarını en aza indirmek için tespit aleti içinde Enjektörler ve bir shaker kullanın. Bu tahlil için standart standtop Luminometreler kullanılabilir. 0.25 – 2 s entegre süresini kullanın.

Burada sunulan prosedürü kullanarak, prototip GPCR ile iki β-tutucu isoform arasındaki etkileşimler izleniyor. Peptid reseptör (GLP-1R) gibi glukagon yapıları NheI ve EcoRI enzim kısıtlama siteleri içeren astar kullanılarak yapılmıştır ve vektörler pBiT 1.1-C [TK/LgBiT] ve pBiT 2.1-C [TK/SmBiT] içine klonlanmış β-tutucu durumunda, iki ek vektörler β-arrestin1 durumunda β-arrestin2 ve NheI ve XhoI durumunda pBiT 1.1-N [TK/LgBiT] ve pBiT 2.1-N [TK/SmBiT] kullanarak enzim kısıtlama siteleri Bgiıı ve EcoRI kullanılır. HEK293 hücreler 50 ng GLP-1R-lgbit/smbit ve 50 ng β-tutucu ile etiketlenmiş lgbit veya smbit N-veya C-terminali kullanılarak transfekte edildi. Dört farklı Plasmid kombinasyonu (Şekil 3) ve daha fazla deney için en yüksek Işıksaçan sinyal ile seçilmiş olan (Şekil 4). Her β-tutucu izoformu işe alma için EC50 değerlerini belirlemek amacıyla, doz tepkisi eğrileri 10 μm, 1 μm, 100 Nm, 10 Nm ve 1 Nm GLP-1 ligand konsantrasyonu kullanılarak yapılmıştır (Şekil 4c). Doz tepkisi eğrileri kinetik çalışmalarda her konsantrasyon maksimum tepki elde edildi (Şekil 4a, 4B).

Şekil 1 ' de. GLP-1R-β-arrestin1/2 yapısal tamamlayıcı tahlil tasarımında kullanılan vektörler multicloning sitelerin nükvotid dizileri.
GLP-1R-β-arrestin1/2 sistemi için yapısal uluslara tahlil geliştirmek amacıyla, pbit 1.1-c [TK/lgbit] ve pbit 2.1-c [TK/smbit] içinde enzimlerin kısıtlamaları nhei ve ecori kullanarak lgbit ve smbit ile C-Terminal GLP-1R etiket gerekli oldu Vektör. Β-arrestin1/2 durumunda, dört vektörde β-arrestin1 için β-arrestin2 ve NheI/XhoI için enzim kısıtlamaları BglII/EcoRI kullanarak C-ve N-terminalde LgBiT ve SmBiT ile etiketlenmiştir. Tüm vektörler, nonspesifik ilişkiyi en aza indirmek ve deneysel eserler azaltmak için HSV-TK promotör kullanın ve her vektör bakterilerde ampisilin direnci için bir ifade kaseti içerir. Görüntü referans 11 ' den uyarlanmıştır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Şekil 2. GPCR şematik temsili: β-arrestin1/2 yapısal tamamlayıcı tahlil.
(a) nasıl GPCR: β-arrestin1/2 yapısal uluslara tahlil ligand varlığında çalışır. (b) lgbit veya smbit ile etiketlenmiş GPCR ve β-tutucu isoformlar için farklı Plasmid kombinasyonları yapısal temsili. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Şekil 3 ' ü. GLP-1R/β-tutucu oryantasyon taraması.
En yüksek hassasiyete sahip olmak için 4 farklı Plasmid kombinasyonu transfeksiyondan sonra 24 saat içinde ifade edildi. Sadece bir GLP-1R: β-tutucu oryantasyon (d) haricinde neredeyse tüm farklı Plasmid kombinasyonlarında (a-c) Işıksaçan sinyaller tespit edildi. Sonuçlar, yinelenen olarak gerçekleştirilen iki deneyin ortalama ± S.E.M. olarak ifade edilir; her yinelenen S.E.M. hesaplanmadan önce ortalamadan Oklar, hücrelerin 10 μM son konsantrasyonda GLP-1 ile tedavi edildiği zamanı gösterir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Şekil 4. GLP-1R-β-arrestin1/2 etkileşimleri doz bağımlı şekilde.
Β-arrestin2 (a) ve β-arrestin1 işe alma (b) dozunun bağımlı ligand ilişkisi. Β-arrestin1 ve β-arrestin2 arasında GLP-1R (c) ile diferansiyel işe alma gösteren doz tepkisi eğrileri. Sonuçlar, yinelenen olarak gerçekleştirilen iki deneyin ortalama ± S.E.M. olarak ifade edilir; her yinelenen S.E.M. hesaplanmadan önce ortalamadan Oklar, hücrelerin ilgili konsantrasyonlarda GLP-1 ile tedavi edildiği süreyi gösterir (10 μM, 1 μM, 100 nM, 10 nM ve 1 nM, son konsantrasyonlar). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Tablo 1. PBiT 1.1 ve pBiT 2.1 vektörler için bağlayıcı kodlama dizideki farklı kısıtlama enzim siteleri için astar dizileri.
Sı = ilgi dizisi; Rev sı = ilgi dizisinin tersine tamamlayıcı. Tablo referans 11 ' den uyarlanmıştır.

Tablo 2 ' ye. PBiT 1.1 ve pBiT 2.1 vektörler sacı, EcoRI veya XhoI kısıtlama siteleri ile ilgili bağlayıcı amino asit dizileri.
Kırmızı kalıntıları PCR astar tarafından kodlanmış olması gerekir. Tablo referans 11 ' den uyarlanmıştır.

Yazarlar hiçbir rakip ilgi bildirir.