Yöntem makalesi

İnce Barsak Nöroendokrin Tümör Spheroidlerinin Kurulması ve Karakterizasyonu

6.3K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/60303

⸱

14 Ekim 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, University of Iowa Carver College of Medicine, 2High Throughput Screening Facility, University of Iowa Carver College of Medicine, 3Department of Pathology, University of Iowa Carver College of Medicine

Bu makalede

Özet

Nöroendokrin tümörler (NeTs) nöral ibik nöroendokrin hücrelerden kaynaklanır. Onlar yavaş büyüyen ve kültüre meydan okuyor. Biz küresel olarak onları culturing tarafından ince bağırsak tan NETs büyümek için alternatif bir strateji salıyoruz. Bu spheroids ince barsak NET belirteçleri var ve ilaç testi için kullanılabilir.

Özet

İnce barsak nöroendokrin tümörleri (SBNETs) bağırsak enterokromafin hücrelerinden kaynaklanan nadir kanserlerdir. Çok az hasta sbnet hücre hatları üretilmiştir çünkü bu alanda araştırma sınırlı olmuştur. İyi diferansiye SBNET hücreleri yavaş büyür ve yayılması zordur. Kurulan birkaç hücre satırı kolayca kullanılamaz ve kültürde zaman sonra NET hücrelerinin özelliklerini ifade etmeye devam etmeyebilir. SBNET hücrelerinin uzun bir katlama süresine sahip olması ve kanserle ilişkili fibroblastların hızla bölünmesini ortadan kaldırmak için birçok zenginleştirme adımı na ihtiyaç duyulduğundan, yeni hücre hatlarının üretilmesi uzun yıllar sürebilir. Bu sınırlamaları aşmak için, sbnet hücrelerini cerrahi olarak çıkarılan tümörlerden hücre dışı matrikste (ECM) küresel oidler olarak kültüre getirmek için bir protokol geliştirdik. ECM, SBNET hücrelerini kapsülleyen ve SBNET hücrelerinin büyümesine izin verdiği için tümör mikro ortamını taklit eden 3 boyutlu bir matris oluşturur. Burada SBNET spheroidlerinin büyüme hızını karakterize ettik ve sfheroidlerin nöroendokrin tümör hücreleri olduğunu doğrulamak için immünoreskan mikroskobu ve immünohistokimya kullanarak SBNET belirteçlerini tanımlamak için kullanılan yöntemleri tanımladık. Buna ek olarak, rapamisin sitotoksisitesini test etmek için SBNET spheroids kullanılır.

Giriş

İnce barsak nöroendokrin tümörleri (SBNETs) ince bağırsağın enterokromfin hücrelerinden kaynaklanır. SBNETs genellikle yavaş büyümek için bilinen olmasına rağmen, genellikle karaciğer1metastaz . Cerrahi kaldırma veya tümör ablasyon birçok durumda düşünülebilir iken, nüks neredeyse evrensel, ve bu nedenle, tıbbi tedavi yönetiminde önemli bir rol oynar. Uyuşturucu testi için yeni SBNET hücre hatları oluşturmak için muazzam çabalar gösterilmiştir. Ancak, çok az başarı olmuştur. Sadece 6 SBNET hücre hattı (KRJ-I, CND2, GOT1, P-STS, L-STS, H-STS) bildirilmiştir2,3,4,5; ve ne yazık ki bir hücre hattı artık NET belirteçleri6 ve diğer üç SBNET hücre hatları (KRJ-I, L-STS, H-STS) nets yerine dönüştürülmüş lenfoblastlar türetilmiş olduğu tespit edilmiştir ifade eder7. SBNETs hedeflemeiçin ilaçların belirlenmesini hızlandırmak için, in vitro uyuşturucu testi için alternatif yöntemler gereklidir.

Burada, rezeke edilmiş SBNET'lerin kullanılabilirliğinden yararlanıyoruz ve ecm'de büyüyen spheroidler olarak bu hasta kaynaklı SBNET'leri kültüre almanın bir yolunu oluşturduk. Bu makalenin genel amacı, SBNET'in immünororesans boyama ve immünohistokimya ile SBNET belirteçlerinin tutulması için bu küresel leri karakterize etmek için üç boyutlu (3D) bir kültür ve anahat prosedürleri olarak kültüre yönelik bir yöntemi tanımlamaktır.

Buna ek olarak, bu SBNET spheroids rapamycin etkisini test etmek için nasıl kullanılabileceğini göstermek, NETs için bir anti-kanser ilaç8. Bu protokolün arkasındaki mantık, SBNET hücrelerini in vitro olarak büyütmek ve bunları uyuşturucu testi için kullanmak için yeni bir yöntem geliştirmektir. Bu tekniğin geleneksel SBNET hücre hattı oluşturma yöntemine göre avantajı, SBNET'lerin 3Boyutlu kültürlerinin hızla elde edilebiliyor olması ve ilaç testinin 3 hafta içinde yapAbildiğidir. SBNET spheroids potansiyel SBNET hastalar için yeni ilaçlar belirlemek için in vitro ilaç ekranları gerçekleştirmek için bir model olarak kullanılabilir. SBNET hücre hatları yaygın olarak mevcut olmadığından, SBNET spheroids 3D kültürleri SBNETs eğitimi için yeni bir in vitro model olarak hizmet verebilir ve alanında bilim adamları arasında paylaşılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

İnsan nöroendokrin tümör örnekleri kullanılarak yapılan tüm deneyler Iowa Üniversitesi Hastanesi ve Klinikleri IRB komitesi tarafından onaylanmıştır (Protokol numarası 199911057). Tüm malzeme ve ekipmanların listesi Malzeme Tablosu'ndaaçıklanmıştır. Büyüme ortamı ve anahtar çözümlerlistesi Tablo 1'debulunmaktadır.

1. İnce barsak nöroendokrin tümör (SBNET) toplanması ve hücre bölünmesi

  1. Cerrahi Patoloji Çekirdeğinden tümör dokuları onayı alındıktan sonra rezeke edilen hasta SBNET örneklerini alın.
  2. SBNET'leri 5 mm küp şeklinde kesin ve 25 mL DMEM/F12 ortamı içinde konik bir tüp içinde saklayın.
  3. DMEM'de %1 FBS, %1 penisilin/streptomisin (Pen/Strep), %1 glutamin (Yıkama Ortası) içeren tümörleri ve bu Yıkama Ortamında 15 dakika kuluçkaya yatırın.
  4. Steril kavisli makas kullanarak tümörleri yeni bir tabağa ve kıyma tümörlerine 1 mm'den daha az parçalara aktarın.
  5. Kıymalı dokuları 25 mL Yıkama Ortamı içeren yeni bir 50 mL tüpe aktarın.
  6. Numuneyi 4 °C'de 15 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj edin.
  7. Kollajenaz (100 U/mL) ve DNase (0.1 mg/mL) içeren Yıkama Ortamı'nın 10 mL'lik kısmını süpernatant'ı atın ve tekrar askıya alın.
  8. Kıymalı tümörlerin sindiriminin 37 °C'lik bir kuluçka makinesinde 1,5 saat boyunca yavaş sallayarak (50 rpm) oluşmasına izin verin.

2. ECM'de tümör küreseloidleri olarak SBNETs Kültürü

  1. Sindirim tamamlandıktan sonra (adım 1.8), 4 °C'de 15 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj, supernatant'ı atın ve 15 mL Yıkama Ortamı'nda peleti yeniden askıya alın.
  2. Yeni bir 50 mL tüp üstüne 70 μm hücreli süzgeç yerleştirin ve hücre süzgeci üzerinde Yıkama Ortamı 10 mL aktarın. NET hücrelerinin plastik tüpün yan tarafına yapışmasını önlemek için Yıkama Ortamını plastik tüpün yan tarafını kaplayacak şekilde döndürün.
  3. Hücre süspansiyonuna hücre süzgecinden geçirin.
  4. 4 °C'de 15 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj edin, süpernatantı atın, 200 μL Yıkama Ortamı'nda peleti yeniden askıya alın (toplam hacim ~ 250°L'dir) ve buzun üzerine yerleştirin.
  5. 5 μL'lik hücreyi Yıkama Ortamının 500°L'sine (1/100 seyreltme faktörü) aktarın. Mililitre başına hücre sayısını elde etmek için bir hemositometre kullanarak hücre sayma için seyreltilmiş hücreleri kullanın. Seyreltme faktörü için düzeltmek için 100 ile çarpın.
  6. Adım 2.5'te elde edilen mL başına hücre sayısını, 2.4 (~ 250 μL) olarak alınan süspansiyondaki hücrelerin toplam hacmiyle çarpın.
  7. 4 °C'de 15 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj edin, süpernatantı atın ve sıvı ECM (1 x 106 hücre/mL) hücreleri yeniden askıya alın ve buzda tutun.
  8. ECM'deki SBNET spheroidlerinin 5-20 μL'sini 96 kuyulu bir plakaya aktarın ve sıvı ECM'nin plakayı 37 °C'lik bir kuluçka makinesine koyarak 5 dakika boyunca katılamasını bekleyin.
  9. ECM'de SBNET sferoidleri içeren 96 kuyulu plakanın her bir kuyusuna 200 μL SBNET kültür ortamı (DMEM/F12 + %10 FBS + %1 PEN/STREP + %1 Glutamin + 10 mM nikotinamid + 10 mL insülin) ekleyin.
  10. Alternatif olarak, kök hücre medyasında kültür SBNET organoidler daha önce insan karaciğerveya pankreas organoidler9 veya büyüyen için tarif edilmiştir ne benzer ve Malzemeler Tablosu'ndalistelenmiştir.
  11. Her 5-7 günde bir ortam değiştirin.

3. ImageJ kullanarak SBNET küresel boyutunun ölçülmesi

  1. 10x hedefi kullanarak kültürün 1, 4, 7, 14, 23 ve 97.
  2. ImageJ'de kaydedilen görüntüleri açın. Analiz sekmesine gidin, Ölçümleri Ayarla seçeneğini seçin ve Alan seçeneğine bir denetim yerleştirin.
  3. İyi odaklanmış bir küresel balığın etrafında bir elipsoid veya daire oluşturmak için takım çubuğundan oval seçim aracını kullanın.
  4. Analiz sekmesine gidin ve Ölçüseçeneğini seçin. 25-50 SBNET spheroids alan ölçümü almak için 3.4 ve 3.5 adımlarını tekrarlayın. Değerler piksel karesinde sağlanır.
  5. Her pikselin boyutunu her pikselin uzunluğuyla birlikte mikroskop görüntülerinin dönüşüm faktörüne bölerek piksel alanını μm2'ye dönüştürün.
    NOT: SBNET hücreleri esas olarak küresel ve bazen elipsoid ler olarak büyür.

4. SBNETS küreseloidlerinin immünoresans ile karakterizasyonu

  1. ECM'de yetişen organoidleri P1000 pipet kullanarak 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın.
  2. 1 dk için 1.500 x g santrifüj ve supernatant çıkarın.
  3. 1 dk için 1 mL PBS, mix, santrifüj 1.500 x g ekleyerek organoid kültürü yıkayın ve supernatant çıkarın.
  4. Organoidleri %4 paraformaldehit 500 μL ekleyerek düzeltin ve 15 dakika kuluçkaya yatırın.
  5. 1 mL PBS ile kültürü iki kez yıkayın.
  6. 5 dakika boyunca 500 μL PBS + %3 BSA + %0,1 Triton X 100 ekleyerek kültürü permeabilize edin.
  7. Daha sonra 1 mL PBS + %3 BSA ile üç kez yıkayın.
  8. Sinaptophysin (SYP)10 1/600 seyreltme veya kromogranin A (CgA)11 ve somatostatin reseptör 2 (SSTR2)12 1/400 antikor tampon (%2.5 sığır serum albumin, 0.1% sodyum karşı primer antikorlar ile 1 saat için kuluçka azit, 25 mM Tris pH 7.4, 150 mM sodyum klorür).
    NOT: Tüp başına 300 μL veya daha fazla antikor çözeltisi kullanın.
  9. 1 mL PBS + %3 BSA ile üç kez yıkayın.
  10. 1 saat boyunca antikor tamponunda 1/500 seyreltme de FITC ile birleşen ikincil antikorlarla inkübat.
  11. 1 mL PBS + %3 BSA ile 3 kez yıkayın. Aspire ve tüm supernatant atmak emin olun.
  12. Nükleer leke DAPI içeren montaj ortamı 5 μL ekleyin.
  13. SBNET küresel spheroidlerinin 5 μL'sini 4,12 adımdan cam bir kaydırağa aktarmak için P20 pipetini kullanın ve kapak lı bir mühür leyin.
  14. 10x, 20x veya 40x hedeflerini kullanarak floresan mikroskop kullanarak fotoğraf çekin.

5. SBNET küreseloidler immünohistokimya (IHC) ile karakterizasyonu

  1. P1000 pipet kullanarak SBNET küreselleri kültür plakasından 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın.
  2. 1 dk için 1.500 x g santrifüj ve supernatant çıkarın.
  3. SBNET küreselleri adım 5.2'den tüpe %10 formalin ekleyerek düzeltin ve parafin gömmeden 2-5 gün önce oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın ve 4 μm kalınlığında küresel kesitler kesin.
  4. Antikor kuluçkaiçin slaytlar hazırlamak için 3'ü 1 arada otomatik slayt işleme istasyonunu kullanarak pH 9'da Antijen Alma Solüsyonunda ısıya bağlı epitop alma işlemini 20 dk için 97 °C'ye ısıtarak deparafinleştirin, yeniden suitrin ve kullanın.
  5. 15 dk için 1/100 seyreltme de SYP10 karşı birincil antikorlar ile blok slaytlar ve inkübat, CgA11 15 dakika için 1/800 seyreltme ve SSTR212 30 dakika için 1/5,000 seyreltme.
  6. Anti-SYP ve CgA boyama için 15 dk ve anti-SSTR2 boyama için 30 dk ikincil antikor algılama sistemi ile inkübat. 400x hedefi kullanarak fotoğraf çekmek.

6. Rapamisin ile SBNET organoidlerinin tedavisi

  1. 10 mM stok çözeltisi elde etmek için DMSO'da rapamisini eritin.
  2. DMSO (örneğin, 1 mL SBNET kültür ortamı + 1 μL DMSO) ile SBNET kültür ortamını ve 10 μM rapamisin (örneğin, 1 mL SBNET kültür ortamı + 1 μL 10 mM rapamycin stok çözeltisi) ile SBNET kültür ortamıhazırlayın.
  3. DMSO veya 10 μM rapamycin içeren SBNET kültür ortamına sahip 200 μL ortamını SBNET küresel kültürlere aktarın.
  4. 37 °C inkübatörde 5 gün boyunca Kuluçka SBNET spheroids.
  5. 30 dk. Ethidium homodimer için 1 μM ethidium homodimer ve inkübat ekleyin.
  6. Floresan mikroskobun 10x, 20x veya 40x hedefleri ile kırmızı filtre küpü kullanarak ilaç tedavisi olan ve olmayan SBNET küreseloidlerinin mikroskopi görüntülerini alın.
    NOT: Ethidium homodimer ile boyanmış ölü hücreler, ticari olarak kullanılabilen bir mikroskobun(Malzeme Tablosu)kırmızı filtre küpü G kullanılarak kırmızı olarak görünür. Alternatif olarak, sinyal 535 nm uyarma ve 624 nm emisyon bir spektrofotometre kullanılarak yakalanabilir.

7. SBNET küresellerinin bölünmesi

NOT: Bu genişleme ve diğer araştırmacılar ile paylaşmak için yapılır.

  1. ECM'yi mekanik olarak kırmak ve SBNET küresel oidlerle ECM'yi steril 1,5 mL'lik bir tüpe aspire etmek için P1000 pipet kullanın.
  2. 4 °C'de 1.000 x g'de santrifüj, tüm supernatant'ı çıkarın ve tüpü buza yerleştirin.
  3. Pelete 2-4kat yeni ECM hacmi ekleyin. 10x yukarı ve aşağı boru lama ile eski ECM ve SBNET küresel ile yeni ECM karıştırın. Hava kabarcıkları tanıtan kaçınarak.
  4. ECM ve SBNET küresel oidkarışımının 5-20 μL'sini yeni bir plakaya aktarın ve ECM'nin katılaşmasını bekleyin.
  5. Yeni SBNET ortamı ile kaplayın ve kuvöze aktarın. Kurtarma oranı yaklaşık% 95-100'dür.
  6. SBNET küreselleri başka bir laboratuvara nakletmek için, SBNET küresel leri yeni ECM ile T25 şişesine aktarın ve ECM'nin katılaşmasını bekleyin.
  7. T25 şişesini SBNET küresel orta ile doldurun, kapağı sıkıca vidalayın ve sevkiyat paketini hazırlayın.
  8. Bir SBNET küresel kültür aldıktan sonra, kültür ortamını kaldırın ve SBNET küresellerini kültüre geri sokmak için 7.1'den 7.5'e kadar adım atın.

8. SBNET küresellerinin kriyodepolama ve geri kazanımı

  1. SBNET küreselleri 5-10 küçük kuyudan 15 mL'lik bir tüpe aktarın. 4 °C'de 15 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj yapın, süpernatantı çıkarın, dondurucu ortamda yeniden askıya alın (%90 FBS + %10 DMSO), bir hücre dondurma kabında saklayın ve bunu -80 °C'ye yerleştirin.
  2. Daha uzun depolama için sıvı nitrojene aktarın.
  3. SBNET küreselleri kurtarmak için donmuş şişeyi buza yerleştirin ve içeriğin tamamen çözülmesini bekleyin. Tüpü ters çevirin ve erime işlemini hızlandırmak için buza yeniden yerleştirin.
  4. Numune çözüldükten sonra önceden soğutulmuş bir santrifüjün içine yerleştirilir ve 10 dk boyunca 1.000 x g'de döner.
  5. Supernatant çıkarın ve ECM küresel leri yeniden askıya. Tüpü buzda tutun, 20°L'yi yeni bir plakaya aktarın ve ECM'nin katılaşmasını bekleyin.
  6. 10 μM ROCK inhibitörü (Y-27632)13 ile SBNET kültür ortamının 200 μL'sini transfer edin ve kuvöze aktarın.
  7. SBNET küresellerinin 1 hafta boyunca iyileşmesine ve büyümesine izin verin. Eski kültür ortamını çıkarın, 200 μL'lik SBNET kültür ortamıile yenilenin ve kuluçka makinesine geri dönün.
  8. SBNET küresellerinin büyümeye devam etmesine izin verin.
    NOT: Hızla büyüyen küreseloidlerin kriyopreservation13sonra iyileşmeye başlaması için en az 1 hafta sürer. SBNET spheroids büyümeye başlamak için en az 2-4 hafta sürer. Birçok SBNET hücreleri ilk 2 hafta içinde ölecek ve sağkalım oranı% 10'dan azdır. Bu çok zaman alıcı ve düşük verim süreci olduğundan, kültür şişelerinde diğer araştırmacılar SBNET sferoidler ile paylaşmak daha iyidir (adım 7 açıklandığı gibi). Kriyodepolama ve kurtarma sadece bakteriyel kontaminasyon meydana gelmesi durumunda yedek plan olarak kullanılmalıdır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Şu anda sadece 2 SBNET hücre hatları kurulmuş veyayınlanan 2,3,4,5 ve birçok araştırmacı için hazır değildir. Burada, ECM'de spheroids olarak Kültür SBNET önermek ve SBNET ilaç duyarlılığı çalışma için alternatif bir model olarak kullanabilirsiniz. Karaciğere metastaz yapan bir SBNET'ten elde edilen hasta kaynaklı tümör toplandı, SBNET hücrelerini serbest bırakmak için sindirildi ve SBNET küres...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Tümör 3D kültürleri preklinik ilaç testi için değerli bir kaynak haline gelmiştir15. Çeşitli tümör organoid biobanks son zamanlarda meme kanseri ve prostat kanseri tümörlerikurulmuştur 16,17. Bu çalışmada, spheroids olarak kültür SBNET için ayrıntılı bir protokol ve immünofloresan ve test ilaç duyarlılığı ile NET belirteçleri için küresel kültürleri doğrulamak için basit ve hızlı bir yöntem sağlar. Deneyimlerimize göre, SBNET spheroids çeş...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma NIH'nin P50 CA174521 (J.R. Howe ve A.M. Bellizzi'ye) verdiği hibelerle desteklenmiştir. P.H. Ear, P50 CA174521 Kariyer Geliştirme Programı ödülüne layık görülmüştür.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Anti-tavşan FITCJackson ImmunoResearch11-095-152Yeşil bir florofora ikincil antikor çifti
Antijen Alma ÇözeltisiAgilent DakoS2367için slaytlar hazırlamak için pH 9'da çözelti
Agilent DakoMevcut DeğilAntikor boyama için otomatik sistem
Hücre dondurma kabıThermo Scientific5100-0001Hücreleri dondurmak için kap
CellSenceOlympusSürüm 1.18Floresan mikroskop
Chromogranin A antikoruAbcam-45179RB-9003-POIF
Chromogranin A antikoru için antikorlar (klon LK2H10)Thermo ScientificMA5-13096
KollajenazSigmaC0130için AntikorlarTümör dokusunu sindirmek için enzim
DMEMGibco11965-092Doku hazırlığı için ortam
DMEM/F12Gibco11320-033Organoid kültürler için ortam
DMSOSigmaD8418çözmek için çözücü
SigmaDN25Tümör dokusunu sindirmek için enzim
Ethidium HomodimerChemodexCDX-E0012-T1EDNA ve RNA bağlayıcı boya
FBSGibco16000044Kültür ortamı için reaktif
Floresan mikroskopOlympusCKX35SBENT sferoidlerinin fotoğraflarını çekmek için mikroskop
GlutaminGibcoA2916801Kültür ortamı için reaktif
ImageJUlusal Sağlık EnstitüleriSürüm 1.51Görüntü için bilgisayar yazılımı analiz
İnsülinSigmaI0516Kültür ortamı için reaktif
MatrigelCorning356235Organoidleri gömmek ve sabitlemek için matris
Montaj ortamı (VECTASHIELD)Vektör LaboratuvarlarıH-1200Nükleer lekeli etiketli hücreler için fiksatif
NikotinamidSigma72340Kültür ortamı
için reaktifParaformaldehitElektron Mikroskobu Bilimleri15710Hücreleri sabitlemek için reaktif
PEN/STREPGibco15140-122Kültür ortamı için reaktif
PT LinkAgilent DakoMevcut DeğilIHC boyama için slaytlar hazırlamak için otomatik sistem
RapamisinAlfa AesarJ62473NET büyümeyi inhibe edebilen ilaç
IHCiçin ikincil antikorlarAgilent DakoK8000Polimer bazlı EnVision FLEX sistemi SSTR2 antikoru kullanan IHC için ikincil antikorlar
GeneScritpA01591için antikorlar
(klon UMB1)Abcamab134152
Sinaptofizin antikoruAbcam32127için antikorlar
(klon DAK-SYNAP)Agilent DakoM7315IHC
TritonXMallinckrodt3555 KBGEHücreleri geçirgen hale getirmek için reaktif
Y-2763 ROCK inhibitörüAdipogenAG-CR1-3564-M005Donarak çözülme işleminden sonra SBNET küresel canlılığını artırmak için
IHC Autostainer Link 48 IHC İlaç DNAse'ı IF SSTR2 antikoru IHC için antikorlar IF Sinaptofizin antikoru için Antikorlar

Kaynaklar

  1. Maxwell, J. E., Sherman, S. K., Howe, J. R. Translational Diagnostics and Therapeutics in Pancreatic Neuroendocrine Tumors. Clinical Cancer Research. 22, 5022-5029 (2016).
  2. Pfragner, R., et al. Establishment of a continuous cell line from a human carcinoid of the small intestine (KRJ-I). International Journal of Oncology. 8, 513-520 (1996).
  3. Kolby, L., et al. A transplantable human carcinoid as model for somatostatin receptor-mediated and amine transporter-mediated radionuclide uptake. American Journal of Pathology. 158, 745-755 (2001).
  4. Van Buren, G., et al. The development and characterization of a human midgut carcinoid cell line. Clinical Cancer Research. 13, 4704-4712 (2007).
  5. Pfragner, R., et al. Establishment and characterization of three novel cell lines - P-STS, L-STS, H-STS - derived from a human metastatic midgut carcinoid. Anticancer Research. 29, 1951-1961 (2009).
  6. Ellis, L. M., Samuel, S., Sceusi, E. Varying opinions on the authenticity of a human midgut carcinoid cell line--letter. Clinical Cancer Research. 16, 5365-5366 (2010).
  7. Hofving, T., et al. The neuroendocrine phenotype, genomic profile and therapeutic sensitivity of GEPNET cell lines. Endocrine Related Cancer. 25, 367-380 (2018).
  8. Moreno, A., et al. Antitumor activity of rapamycin and octreotide as single agents or in combination in neuroendocrine tumors. Endocrine Related Cancer. 15, 257-266 (2008).
  9. Broutier, L., et al. Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation. Nature Protocols. 11, 1724-1743 (2016).
  10. Saito, Y., et al. Establishment of Patient-Derived Organoids and Drug Screening for Biliary Tract Carcinoma. Cell Reports. 27, 1265-1276 (2019).
  11. Park, S. J., et al. Detection of bone marrow metastases of neuroblastoma with immunohistochemical staining of CD56, chromogranin A, and synaptophysin. Applied Immunohistochemisty and Molecular Morphology. 18, 348-352 (2010).
  12. Clifton-Bligh, R. J., et al. Improving diagnosis of tumor-induced osteomalacia with Gallium-68 DOTATATE PET/CT. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 98, 687-694 (2013).
  13. Clinton, J., McWilliams-Koeppen, P. Initiation, Expansion, and Cryopreservation of Human Primary Tissue-Derived Normal and Diseased Organoids in Embedded Three-Dimensional Culture. Current Protocols in Cell Biology. 82, 66(2019).
  14. Markovits, J., Roques, B. P., Le Pecq, J. B. Ethidium dimer: a new reagent for the fluorimetric determination of nucleic acids. Analytical Biochemistry. 94, 259-264 (1979).
  15. Weeber, F., Ooft, S. N., Dijkstra, K. K., Voest, E. E. Tumor Organoids as a Pre-clinical Cancer Model for Drug Discovery. Cell Chemical Biology. 24, 1092-1100 (2017).
  16. Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 172, 373-386 (2018).
  17. Puca, L., et al. Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes. Nature Communication. 9, 2404(2018).
  18. Singh, S. P., et al. SSTR2-based reporters for assessing gene transfer into non-small cell lung cancer: evaluation using an intrathoracic mouse model. Human Gene Therapy. 22, 55-64 (2011).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

SBNET Sferoidleri3B K lt r ProtokolH cre D Matriksmm nofloresan MikroskopiH cre zolasyonuDoku SindirimiRapamisin SitotoksisitesiSinaptofizin Mark rKromogranin A

İlgili makaleler