Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Permeable Membran Destekleri ile Co-Culture kullanarak Tümör Salgılanan Parakrin Ligandların Makrofaj Aktivasyonu Üzerine Etkilerinin İnceleştirilmesi

7.3K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/60453

⸱

28 Kasım 2019

 ,  , 
1Lineberger Comprehensive Cancer Center, University of North Carolina at Chapel Hill, 2O'Neal Comprehensive Cancer Center, University of Alabama at Birmingham

Bu makalede

Özet

Burada, bağışıklık yanıtını bastırmak için tümör hücreleri tarafından kullanılan temassız parakrin sinyalçalışmasını kolaylaştırmak için geçirgen membran destekleri kullanan bir yöntem salıyoruz. Sistem makrofaj aktivasyonu sönümleme tümör salgılanan faktörlerin rolünü incelemek için münasip olduğunu.

Özet

Tümör kaynaklı parakrin sinyalizasyon lokal immünsupresyonun gözden kaçan bir bileşenidir ve sürekli kanser büyümesi ve metastaz için izin verilen bir ortama yol açabilir. Parakrin sinyalleri farklı hücre tipleri arasında hücre-hücre teması içerebilir, PD-L1 gibi tümörlerin yüzeyinde doğrudan T hücrelerinin yüzeyinde PD-1 ile etkileşim, ya da bir tümör hücresi tarafından ligands salgılanması bir bağışıklık hücresi etkilemek için ifade. Burada tümör salgılanan ligandların bağışıklık hücresi (makrofaj) aktivasyonu üzerindeki etkilerini sorgulamak için bir ortak kültür yöntemi ni tanımlıyoruz. Bu basit prosedür, ticari olarak mevcut 0,4 μm polikarbonat membran geçirgen destekler ve standart doku kültür plakaları kullanır. Açıklanan süreçte makrofajlar üst haznede, tümör hücrelerinde ise alt odada kültürlenir. 0.4 μm bariyerinin varlığı, iki hücre tipi aynı ortamı ve parakrin ligandlara maruz kalma açısından şaşırtıcı değişkeni olmadan hücreler arası sinyalleme nin incelenmesine olanak sağlar. Bu yaklaşım, makrofajın genetik değişiklikleri (örn. genetik nakavt farelerden izolasyon) veya tümör (örneğin, CRISPR aracılı değişiklikler) gibi diğer kişilerle birleştirilip belirli salgılanan faktörlerin ve reseptörlerin rolünü inceleyebilir. Bu yaklaşım aynı zamanda iki hücre popülasyonlarını ayırmak için akış ayarı gerek kalmadan, kantitatif ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) veya Batı leke analizi gibi standart moleküler biyolojik analizlere de katkıda bulunur. Enzime bağlı immünosorbent tahlilleri (ELISA) benzer şekilde çoklu hücre tipi bağlamda hücre sinyalinin dinamik etkileşimini daha iyi anlamak için salgılanan ligandları ölçmek için kullanılabilir. Eş-kültür süresi de zamansal düzenlenmiş olayların çalışma için çeşitli olabilir. Bu co-kültür yöntemi bağışıklık bağlamında tümör salgılanan sinyallerin çalışmasını kolaylaştıran sağlam bir araçtır.

Giriş

Son çalışmalar, kanser hücrelerinin bağışıklık hücreleri tarafından tespit önlemek için yeteneği üzerinde duruldu, lokal immün aktivasyonu bastırmak, ya da tümör mikroortamda bir tolerojenik tümör-buna kalım ortamı üretmek için. Bu etkileri kolaylaştıran iki geniş tümör ve bağışıklık hücresi etkileşimi sınıfı tanımlanmıştır: temas aracılı etkileşimler veya tümör salgılanan ligandlar. Tümörler tarafından kullanılan temas aracılı immün inhibisyonun en iyi çalışılmış ve klinik olarak çekilebilir mekanizmalarından biri PD-L1 ifadesidir, hangi PD-1 ile T hücreleri onların aktivasyon vefonksiyoninhibe etkileşime 1,2. Aktif bağışıklık hücrelerinin bir dizi tarafından ifade edilen interferon-gama (IFNγ), yanıt olarak, tümör hücreleri PD-1-ifade aktive T hücrelerinin yorgunluğunu neden pd-L1 ekspresyonu artırabilir, bu nedenle etkili tümör hücrelerinin ortadan kaldırılmasını engelleyerek3. PD-L1 ve PD-1 arasındaki etkileşimi engellemek için antikorların kullanımı şu anda insanlarda birden fazla kanser türlerini tedavi etmek için kullanılır4. Bu klinik başarı ve diğerleri ışığında, tümör kaynaklı immünsupresif mekanizmaların tanımlanması ve hedefalınması giderek artan bir ilgi almıştır.

Adaptif bağışıklık baskılanması ötesinde, tümörler de doğuştan gelen bağışıklık hücrelerinin pro-inflamatuar yanıtları bastırmak faktörlerse salgılamak bilinmektedir. Tümör kaynaklı veya tümör kaynaklı salgılar, IL-6 dahil, IL-10, VEGF, IL-23, ve koloni uyarıcı faktör (BOS-1), doğal katil antitümör yanıtlarını inhibe gösterilmiştir (NK) hücreleri, granülositler, ve tümör mikroortamında dendritik hücreler5,6,7. Tümör hücreleri de t hücre aktivasyonu bastırılması teşvik etmek için tümör mikroortamında işe alım ve miyeloid türetilmiş hücrelerin farklılaşması çarpık faktörler salgılayabilir8,9.

Tümör progresyonu üzerinde derin bir etkiye sahip doğuştan gelen bağışıklık hücresi bir türü makrofaj olduğunu. Uzun yıllar boyunca, tümör ilişkili makrofajlar varlığı (TAMs) hasta sağkalım negatif prognostik olarak kullanılmıştır10. İmmünsupresif TAM'ların immün hücre aracılı tümörlerin temizlenmesini azalttağı kavramı 40 yıldan daha uzun bir süre önce11. Daha yakın zamanda, makrofaj pro-inflamatuar yanıtın alt regüle edilebildiği, tümör mikroortamında pro-tümör fenotipinin indüklenebileceği gösterilmiştir. Bu immünsupresif makrofajlar tolerojenik bir yanıta katkıda bulunabilir, tümör ilerlemesi ve kemoterapi direnci sürüş- ve immünoterapi12. Makrofajlar genellikle tümör ile en bol lökositler biri olduğu göz önüne alındığında, onların tümöre özgü bağışıklık aktivitesinin restorasyonu antikanser terapötikler için potansiyel bir hedef temsil13.

Tümör hücreleri ve makrofajlar arasındaki temas aracılı etkileşimler doğrudan kokültür yoluyla modellenebilir iken, geçirgen membran desteklerkullanımı tümör-immün hücre hücre teması potansiyel şaşırtıcı etkisi olmadan hangi tümör salgılanan faktörlerin immünomodülatör olduğunu açıklayabilir. Biraz benzer yöntemler kullanarak, diğerleri mikroglia / nöronal etkileşimleri salgılanan faktörlerin belirlenmesi potansiyelini göstermiştir14 yanı sıra mezotelyal hücreleri ile tümör hücreleri15. Ayrıca bu ortak kültür tekniğini, LPS ve interferon-gamma16ile periton makrofajlarının uyarılmasından sonra pro-inflamatuar gen ekspresyonunun bastırıcısı olarak tümör salgılanan bir protein olan Pros1'in rolünü karakterize etmek için başarıyla kullandık. Burada tümör salgılanan faktörlerin makrofaj aktivasyonunu nasıl etkileyebileceğini sorgulamak için kullanılabilecek basit bir metodolojiyi açıklıyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Murin periton makrofajlarının hasat ve kullanımı ile ilgili tüm prosedürler Chapel Hill'deki North Carolina Üniversitesi'nde (UNC) yürütülmüş ve UNC Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.

1. Makrofaj kültürü

NOT: Bu yordam, birincil periton makrofajları (aşağıda ayrıntılı olarak açıklanmıştır), kemik iliği kaynaklı makrofajlar veya J774 (ATCC) veya RAW264 (ATCC) gibi makrofaj hücre hatlarını kullanabilir.

  1. Hasat periton makrofajlar daha önce açıklandığı gibi16,17 ve plaka doğrudan üst hazneiçine 0.4 μm polyester membran eklemek co-kültür 6 kuyu plakası(Şekil 1A).
    NOT: Her izolasyondan makrofajların yaklaşık verimi toplam 1 x 106 hücredir, bu nedenle kuyu başına ortalama hücre sayısı ~1.5-1.6 x 105 hücredir.
  2. Kültür Dulbecco's Modifiye Kartal Orta (DMEM)/F12, 10% Fetal Sığır Serum (FBS), 1x penisilin / streptomisin, 20 ng / mL makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CF) 3 gün için hasat makrofajlar 37 °C, 5% CO2.
    NOT: Alt hazne 1,5 mL ile doldurulurken üst haznede 1 mL kültür ortamı içerir. Ortam her odaya eklenmelidir.

2. Makrofajlı tümör hücrelerinin eşkültürü

  1. Kullanmadan önce, atcc tarafından önerilen doku kültürü yöntemlerini takiben kendi ortamlarında ticari olarak mevcut olan tümör hücreleri.
  2. Yapışık tümör hücrelerini bir kez fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın, %0,05 tripsin + etilenediamintetraasetik asit (EDTA) ekleyin ve hücreler ayrışana kadar 37 °C'de kuluçkaya yatırın. Orta içeren FBS hücreleri resuspend, bir hemositometre veya hücre sayacı kullanarak hücrelerin toplam sayısını quantitate, ve sonra pelet için 220 x g 5 dakika santrifüj.
  3. Santrifüj sırasında, makrofaj içeren geçirbilebilir membran destek plakalarının üst ve alt odalarından orta aspirat ve taze ortam ile değiştirin.
    1. Tümör hücrelerinin kaplandığı alt bölmeler için, hücre ilavesi için yeterli hacim sağlamak için 1,5 mL yerine 1 mL orta ile doldurun.
  4. DMEM/F12'de %10 FBS, 1x penisilin/streptomisin ve 3 x 105 hücre/mL konsantrasyonda 20 ng/mL M-CSF ile pürelenmiş tümör hücrelerinden aspire ortamı.
  5. İstenilen kuyuların alt haznesine 0,5 mL 3 x 105 hücre/mL tümör hücresi ekleyin (Şekil 1B).
    NOT: Hücreler hemen tedavi edilebilir.

3. Ortak kültürlü hücrelerin tedavisi

  1. Makrofaj pro-inflamatuar gen ekspresyonunu indüklemek için, 100 ng/mL IFNγ ve 50 ng/mL LPS ekleyerek tek başına veya eş kültürlü makrofajları tedavi edin.
    1. Kültürde tedavi sürelerini gerektiği gibi değiştirin. Makrofaj aktivasyonu içinde oluşur 2 saat ve bazı tümör aracılı bastırma oluşur 8 h. Co-kültür için 24 h sağlam ve tutarlı tümör kaynaklı baskılama verimleri.
      NOT: Alternatif olarak, makrofajlar interlökin-10 (IL10) gibi faktörlerin eklenmesi ve tümör salgılanan ligand etkisi değerlendirilerek yara yanlısı bir iyileşme fenotip indüklenebilir.
  2. Olumsuz bir kontrol olarak, kültür makrofajlar tek son ve tedavi edilmezse bırakın. Pozitif kontrol olarak, 100 ng/mL IFNγ ve 50 ng/mL LPS ile tek kültürlü makrofajları tedavi edin.

4. Ortak kültürlü hücrelerin downstream analizi

  1. İstenilen kuluçka süresi geçtikten sonra, test ihtiyaçlarına bağlı olarak, hücre lisate veya koşullandırılmış kültür ortamını istenilen şekilde izole edin.
  2. Kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) analizi için hücre lisatını izole etmek için, kuyunun her iki odasından da ortam alıvurun ve 2 mL PBS ile bir kez yıkayın. RNA lysis tamponu makrofajları içeren üst hazneye uygulayın. Hücre lisatını serbest bırakmak için membranı yavaşça kazıyın ve RNA izolasyon kiti üreticisinin protokolüne göre daha fazla işlem için bir toplama tüpüne aktarın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Tümör salgılanan ligandların makrofaj polarizasyonu üzerindeki etkisini belirlemek için açıklanan prosedür kullanılmıştır. Tümör hücrelerinin yokluğunda kültürlenmiş peritoneal makrofajlar negatif (tedavi edilmemiş = çok sol) ve pozitif (IFNγ ve LPS uyarılmış = 2soldan) kontrolleri olarak kullanılmıştır (Şekil 2A). Alternatif olarak, periton makrofajları B16F10 melanom tümör hücreleri (ATCC) ile birlikte kültürlendi (Şekil 1A). Kaplamadan hemen sonra ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada sunulan co-kültür tahlil bağışıklık hücresi aktivasyonu üzerinde tümör salgılanan faktörlerin incelenmesi için izin veren daha önce kurulmuş tahliller bir değişikliktir. Hücre-hücre temasının immün aktivitede değişikliklere yol açtığı bilinmekle birlikte, tümörse salgılanan ligandların bağışıklık aktivasyonunu modüle etme yeteneği daha az anlaşılmaktadır. Doğrudan ortak kültürün aksine, tümörkaynaklı salgılanan sekans faktörlerinin temas aracılı sinyalin kafa karıştırıcı doğası olmadan bağışıklık hücre aktivasyonu...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Eric Ubil, kısmen, Amerikan Kanser Derneği Doktora Sonrası Bursu (128770-PF-15-216-01-LIB) tarafından finanse edildi. Çalışma NIH (R01-CA205398) ve Meme Kanseri Araştırma Vakfı ödülü (BCRF-18-041) hse bir hibe tarafından desteklendi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
B16-F10ATCCATCC CRL-6475
cDNA sentez kitiPromegaA3500
DMEM/F12 ortamıThermoFisher Scientific- Gibco11320033
Fetal Sığır SerumuMilliporTMS-013-B
J774A.1ATCCATCC TIB-67
Escherichia coli O111: B4'ten lipopolisakkaritlerSigma-AldrichL5293-2ML
Murin, M-CSFProspecCYT-439
Penisilin-Streptomisin (10.000 U/mL)ThermoFisher Scientific- Gibco, 15140122
Pros1, ELISAMyBioSourceMBS2886720
BioLegend575302
Sensimix SYBR Low-ROX kitiBiolineQT625-05
Transwell geçirgen desteklerFisher Scientific07-200-170
Tripsin-EDTAThermoFisher Scientific- Gibco25200056
, , , , , , , RAW264.7, ATCC, ATCC, TIB-71, Rekombinant Fare, IFN&gama;

Kaynaklar

  1. Freeman, G. J., et al. Engagement of the PD-1 immunoinhibitory receptor by a novel B7 family member leads to negative regulation of lymphocyte activation. Journal of Experimental Medicine. 192 (7), 1027-1034 (2000).
  2. Agata, Y., et al. Expression of the PD-1 antigen on the surface of stimulated mouse T and B lymphocytes. International Immunology. 8 (5), 765-772 (1996).
  3. Dong, H., et al. Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potential mechanism of immune evasion. Nature Medicine. 8 (8), 793-800 (2002).
  4. Sznol, M., Chen, L. Antagonist antibodies to PD-1 and B7-H1 (PD-L1) in the treatment of advanced human cancer--response. Clinical Cancer Research. 19 (19), 5542(2013).
  5. Kortylewski, M., et al. Regulation of the IL-23 and IL-12 balance by Stat3 signaling in the tumor microenvironment. Cancer Cell. 15 (2), 114-123 (2009).
  6. Halak, B. K., Maguire, H. C., Lattime, E. C. Tumor-induced interleukin-10 inhibits type 1 immune responses directed at a tumor antigen as well as a non-tumor antigen present at the tumor site. Cancer Research. 59 (4), 911-917 (1999).
  7. Wang, T., et al. Regulation of the innate and adaptive immune responses by Stat-3 signaling in tumor cells. Nature Medicine. 10 (1), 48-54 (2004).
  8. Mazzoni, A., et al. Myeloid suppressor lines inhibit T cell responses by an NO-dependent mechanism. The Journal of Immunology. 168 (2), 689-695 (2002).
  9. Zea, A. H., et al. Arginase-producing myeloid suppressor cells in renal cell carcinoma patients: a mechanism of tumor evasion. Cancer Research. 65 (8), 3044-3048 (2005).
  10. Steele, R. J., Eremin, O., Brown, M., Hawkins, R. A. A high macrophage content in human breast cancer is not associated with favourable prognostic factors. British Journal of Surgery. 71 (6), 456-458 (1984).
  11. Evans, R. Regulation of T- and B lymphocyte responses to mitogens by tumor-associated macrophages: the dependency on the stage of tumor growth. Journal of Leukocyte Biology. 35 (6), 549-559 (1984).
  12. Noy, R., Pollard, J. W. Tumor-associated macrophages: from mechanisms to therapy. Immunity. 41 (1), 49-61 (2014).
  13. Pollard, J. W. Tumour-educated macrophages promote tumour progression and metastasis. Nature Reviews Cancer. 4 (1), 71-78 (2004).
  14. Renaud, J., Martinoli, M. G. Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact. Journal of Visualized Experiments. (113), e54356(2016).
  15. Dasari, S., Pandhiri, T., Haley, J., Lenz, D., Mitra, A. K. A Proximal Culture Method to Study Paracrine Signaling Between Cells. Journal of Visualized Experiments. (138), e58144(2018).
  16. Ubil, E., et al. Tumor-secreted Pros1 inhibits macrophage M1 polarization to reduce antitumor immune response. Journal of Clinical Investigation. 128 (6), 2356-2369 (2018).
  17. Ray, A., Dittel, B. N. Isolation of mouse peritoneal cavity cells. Journal of Visualized Experiments. (35), e1488(2010).
  18. Zaks-Zilberman, M., Zaks, T. Z., Vogel, S. N. Induction of proinflammatory and chemokine genes by lipopolysaccharide and paclitaxel (Taxol) in murine and human breast cancer cell lines. Cytokine. 15 (3), 156-165 (2001).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Parakrin SinyalizasyonTümör Salgılayan LigandlarKo-Kültür YöntemiGeçirgen Membran DestekTümör İmmünosüpresyonuProtein SWestern Blotİnterferon GamaPro-İnflamatuar Genler
Permeable Membran Destekleri ile Co-Culture kullanarak Tümör Salgılanan Parakrin Ligandların Makrofaj Aktivasyonu Üzerine Etkilerinin İnceleştirilmesi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.