Rastgele Mikrotohum Matris Taraması Ile Protein Kristallerinin I3C ile Türevleştirilmesi

Özet

Bu makalede, seyrek matris ekranlarda yeni kristalleşme koşulları oluşturmak için mikrotohumlama kullanarak I3C (5-amino-2,4,6-triiodoishthalic asit) ile türemiş protein kristalleri oluşturmak için bir yöntem sunar. Tepsiler sıvı dağıtım robotları kullanılarak veya elle kurulabilir.

Özet

X-ışını kristalografisi kullanılarak protein yapısı açıklaması hem yüksek kaliteli difüzör kristalleri hem de kırınım fazı probleminin hesaplamalı çözeltisini gerektirir. Uygun homoloji modeliolmayan yeni yapılar genellikle deneysel faz bilgisi sağlamak için ağır atomlarla türemiştir. Sunulan protokol, rasgele mikrotohumlama matris taramasını ağır bir atom molekülü Olan I3C (5-amino-2,4,6-triiodoishththalic asit) ile türevleştirme ile birleştirerek türevleştirilmiş protein kristalleri üretir. I3C'yi kristal kafese dahil ederek, kırınım fazı problemi tek dalga boyu anormal dağılım (SAD) aşamalı olarak etkin bir şekilde çözülebilir. I3C'deki iyot atomlarının eşkenar üçgen düzenlemesi doğru anormal alt yapının hızlı bir şekilde doğrulanmasını sağlar. Bu protokol, deneysel phasing ilgi ile kristalografi tabanlı teknikler kullanarak makromoleküler yapıları çözmek yapısal biyologlar için yararlı olacaktır.

Giriş

Yapısal biyoloji alanında X-ışını kristalografisi makromoleküllerin atomik çözünürlük yapılarını belirlemek için altın standart teknik olarak kabul edilir. Bu hastalıkların moleküler temelini anlamak için yoğun olarak kullanılmıştır, rasyonel ilaç tasarım projeleri kılavuzu ve enzimlerin katalitik mekanizması açıklamak^1,2. Yapısal veriler bilgi zenginliği sağlasa da, protein ekspresyonu ve arınma, kristalizasyon ve yapı belirleme süreci son derece zahmetli olabilir. Bu projelerin ilerlemesini engelleyen çeşitli darboğazlarla karşılaşılır ve kristal yapı belirleme boru hattını verimli bir şekilde düzene sokmak için bu konu ele alınmalıdır.

Rekombinant ekspresyon ve arınma sonrasında, genellikle X-ışını kristalografisinin çetin ve zaman alıcı bir yönü olan kristalizasyona yardımcı olan ön koşullar tanımlanmalıdır. Bilinen ve yayınlanmış koşulları pekiştiren ticari seyrek matris ekranlar bu darboğaz^3,4hafifletmek için geliştirilmiştir. Ancak, son derece saf ve konsantre protein örnekleri kullanarak rağmen bu ilk ekranlardan birkaç isabet oluşturmak için yaygındır. Net damlaları gözlemlemek, proteinin bir kristali çekirdeklendirmek için gerekli süper doygunluk seviyelerine ulaşamadığını gösterir. Kristal çekirdekleşme ve büyümeyi teşvik etmek için, önceden varolan kristallerden üretilen tohumlar koşullara eklenebilir ve bu da kristalizasyon alanının daha fazla örneklenmesine olanak sağlar. Ireton ve Stoddard ilk mikrotohum matris tarama yöntemi⁵tanıttı. Düşük kaliteli kristaller bir tohum stok yapmak için ezilmiş ve daha sonra aksi takdirde oluşmuş olmazdı yeni kırınım kalitesinde kristaller üretmek için farklı tuzlar içeren kristalizasyon koşullarına sistematik olarak eklendi. Bu teknik daha da d'Arcy ve ark. olan tohumlar yedek matris kristalizasyon ekranı⁶,⁷içine tanıtıldı rasgele mikrotohum matris tarama (rMMS) geliştirdi tarafından geliştirilmiştir. Bu kristallerin kalitesini artırdı ve 7 faktörü ile ortalama kristalizasyon isabet sayısını artırdı.

Kristaller başarıyla üretildikten ve X-ışını kırınım deseni elde edildikten sonra ,'faz probleminin' çözümü şeklinde başka bir darboğazla karşılaşılır. Veri toplama işlemi sırasında kırınım yoğunluğu (genlik karesi ile orantılı) kaydedilir ancak faz bilgileri kaybolur, bu da hemen yapı kararlılığını durduran faz sorununa yol açar⁸. Eğer hedef protein daha önce belirlenmiş bir yapıya sahip bir proteine yüksek sıralı kimliği paylaşıyorsa, moleküler replasman faz bilgilerini tahmin etmek için kullanılabilir^9,10,11,12. Bu yöntem hızlı ve ucuz olmasına rağmen, model yapıları mevcut veya uygun olmayabilir. Homoloji modeli tabanlı moleküler replasman yönteminin başarısı, dizi kimliği %35'in altına düştüğünden önemli ölçüde^{düşetmektedir.} Uygun bir homoloji modelinin yokluğunda ARCIMBOLDO^14,15 ve AMPLE¹⁶gibi ab initio yöntemleri test edilebilir. Bu yöntemler, moleküler değiştirme için başlangıç noktası olarak hesaplamalı olarak tahmin edilmiş modelleri veya parçaları kullanır. Öngörülen yem modellerini başlangıç noktası olarak kullanan AMPLE, ağırlıklı olarak β yaprak içeren büyük (>100 kalıntı) protein ve proteinlerin yapılarını çözmeye çalışmaz. Arcimboldo, daha büyük bir yapıya genişletmek için küçük parçaları sığdırmaya çalışır, yüksek çözünürlüklü veri (≤2 Å) ve algoritmayeteneği tam bir yapıya parçaları genişletmek için sınırlıdır.

Moleküler değiştirme yöntemleri başarısız olursa, izomorf replasman^17,18 ve tek bir dalga boyunda (SAD¹⁹⁾veya birden fazla dalga boyunda (MAD²⁰⁾anormal dağılım gibi doğrudan yöntemler kullanılmalıdır. Bu genellikle kristal oluşmalıdır veya ağır bir atom ile türev olmalıdır gerçekten yeni yapılar için durumdur. Bu, ağır bir atom bileşiği, kimyasal modifikasyon (RNA'da 5-bromouracil birleşme gibi) veya etiketli protein ekspresyonu (birincil yapıya selnometyonin veya selennosistein amino asitleri dahil etmek gibi)^21,22ile ıslatma veya birlikte kristalize edilerek elde edilebilir. Bu daha da kristalizasyon sürecini zorlaştırır ve ek tarama ve optimizasyon gerektirir.

I3C (5-amino-2,4,6-triiodoisofhthalic asit) ve B3C (5-amino-2,4,6-tribromoishttalc asit) dahil olmak üzere phasing bileşikleri, yeni bir sınıf, önceden varolan phasing bileşikleri üzerinde heyecan verici avantajlar sunuyoruz^23,24,25. Hem I3C hem de B3C, doğrudan aşamalı yöntemler ve özellikle proteinle etkileşim edebilen ve bağlayıcı alan özgüllüğü sağlayan amino veya karboksilat fonksiyonel grupları için gerekli anormal dağılımların alternatif düzenlemesine sahip aromatik bir halka iskeleye sahiptir. Ağır metal gruplarının sonraki eşkenar üçgen düzenlemesi, phasing alt yapısının basitleştirilmiş doğrulanmasına olanak sağlar. Yazının yazıldığı sırada Protein Veri Bankası'nda (PDB) 26 Adet I3C'ye bağlı yapı bulunmaktadır ve bunların 20'si SAD phasing²⁶kullanılarak çözülmüştür.

Bu protokol, ağır metal türevileştirme ve rMMS tarama yöntemlerini birleştirerek kristalizasyon isabetsayısını aynı anda artırmak ve kristal türevleştirme işlemini basitleştirmek için yapı belirleme boru hattının etkinliğini artırır. Biz bu yöntem son derece tavuk yumurtası beyaz lysozyme ve bakteriyofaj P68²⁷bir roman lysin protein etki alanı ile etkili olduğunu gösterdi. Yüksek otomasyonlu Auto-Rickshaw yapı belirleme boru hattı kullanılarak yapı çözümü, özellikle I3C phasing bileşik için özel olarak tanımlanmıştır. AutoSol^28,ELVES²⁹ ve CRANK2³⁰gibi kullanılabilecek diğer otomatik boru hatları vardır. SHELXC/D/E gibi tam otomatik olmayan paketler de^{kullanılabilir 31,32,33}. Bu yöntem özellikle PDB'de homolog modelleri olmayan proteinleri inceleyen araştırmacılar için tarama ve optimizasyon adımlarının sayısını önemli ölçüde azaltarak yararlıdır. Bu yöntemin ön koşulu protein kristalleri veya önceki kristalizasyon çalışmalarından elde edilen hedef proteinin kristalin çökeltisidir.

Protokol

1. Deneysel planlama ve dikkat edilmesi gerekenler

1. Tercihen buhar difüzyon kristalizasyonu ile üretilen ilgi proteinin önceden varolan kristalleri kullanın. Buhar difüzyon kristalizasyonu genelleştirilmiş bir protokol için, Benvenuti ve Mangani³⁴bakın. Yağ altında mikrobatch ve serbest arayüz difüzyon gibi kristalizasyon diğer yöntemler mikrotohumlar oluşturmak için kırma önce kristalleri hasat gerektirir.
2. Bir tohum stok hazırlanmasında, feda edilebilir en kaliteli kristalleri kullanın. En yüksek kalitede kristal morfolojiye göre görsel olarak değerlendirilebilir veya bu veriler varsa en iyi difatkristalseçilebilir. Tohumlama yoluyla optimizasyon dan sonra daha da kaliteli kristallerin elde olması çok olasıdır. Kristallerin bulunmadığı durumlarda, spherulites ve iğneler gibi kristal çökelti kullanılabilir.
3. Tuz kristallerini tanımlayın. Tuz kristalleri kristalleşme ekranlarında büyüyebilir ve protein kristalleri gibi görünebilir. rMMS tuz kristalleri kullanarak hiçbir fayda sağlayacak ve değerli örnek atık, bu nedenle tuz yanlış pozitif ortadan kaldırmak için önemlidir.
   1. Tuz kristalleri ezildiğinde gürültülü olurlar. Kristaller bir tohum stok oluşturmak için ezilmiş olmalıdır, bu nedenle bu strateji özellikle ilgilidir. Kristalleri ezerken duyulabilir bir çatlak sesi duyulursa, kristalin tuz olması muhtemeldir.
   2. Protein triptofan ve tirozin kalıntıları içeriyorsa, bu ışık koşullarında floresan protein kristallerini belirlemek için ultraviyole floresan mikroskobu kullanın.
   3. Protein kristallerini göreceli olarak lekelenmemiş tuz kristallerine ayırmak için izit boya (metilen mavisi) kullanın. Ancak, bu yordam daha yıkıcı ve sadece bir aynı damla çoğaltmaları yedek kristalleri varsa önerilir.
      NOT: Yukarıda belirtilen testler umut verici sonuçlar verebilse de, tuz kristalleri hala protein kristalleri ile karıştırılabilir. Bu durumda, kırınım deneyleri kesin bir protein ve tuz kristali arasında ayırt etmek için kullanılabilir.

2. Lityum I3C stokunun hazırlanması

1. 1.5 mL mikrosantrifüj tüp içine I3C (5-amino-2,4,6-triiodoishthalic asit) 120 mg dışarı ölçün.
2. I3C'yi 2 M lityum hidroksitin 200 μL'sinde çözün. Çözelti, çözünmeyi teşvik etmek için 40-60 °C'de bir ısı bloğu kullanılarak hafifçe ısıtılabilir. Elde edilen lityum I3C çözeltisi kahverengi olmalı ve 1 M konsantrasyona sahiptir.
   DİkKAT: Lityum hidroksit aşındırıcıdır. Güvenlik gözlükleri, eldivenler ve laboratuvar önlüğü giyilmelidir.
3. Çözeltinin pH'ını ölçün. Gerekirse, pH'ı 7 ile 8 arasında ayarlamak için küçük miktarlarda 1 M hidroklorik asit veya 2 M lityum hidroksit ekleyin. Son çözelti hacmini 400 μL'ye çıkarmak için milliQ su ekleyin. I3C stok çözeltisinin konsantrasyonu 0,5 M'dir.
   NOT: Adım 2.3 isteğe bağlıdır. Çözeltinin pH'ı herhangi bir pH ayarı öncesinde pH 7-8 arasında olmalıdır. İlgi çeken protein pH'dan güçlü bir şekilde etkileniyorsa bu adım yapılmalıdır. Protokol burada duraklatılmış olabilir. Lityum I3C en az iki hafta boyunca 4 °C'de karanlıkta tutulabilir³⁵.

3. Protein stoğuna I3C eklenmesi

1. Yöntem 1
   1. Hedef proteinin 150 μL aliquot'una stok lityum I3C ekleyin. Son konsantrasyon 5-40 mM lityum I3C arasında olmalıdır.
2. Yöntem 2 (nazik yöntem)
   1. Hedef proteinin tamponuyla eşleşen bir protein seyreltme tamponu hazırlayın. Bu seyreltme tamponu için, 10-80 mM arasında lityum I3C konsantrasyonu vermek için stok lityum I3C ekleyin.
   2. Protein 1:1 protein seyreltme tampon ile lityum I3C son konsantrasyonu vermek için 5-40 mM arasında.
      NOT: Bazı proteinler yöntem 1'de yüksek yoğunlukta lityum I3C ile temas ettikten sonra çökelecektir, diğer proteinler ise buna tahammül edebilirler. Yöntem 2 yağış olasılığını azaltır. Ancak bu yöntem protein konsantrasyonu yarıya indirir. Kristalizasyon protokolü olmayan proteinler için genellikle ilk kristalizasyon taraması için 10 mg/mL'lik bir protein konsantrasyonu önerilir. I3C'nin 8 proteine ilk molar oranı önerilir. İlk ekrandan sonra I3C'nin protein konsantrasyonu ve molar oranı optimize edilebilir.

4. Tohum stoku yapma

1. Kristalleri ezmek için yuvarlak bir sonda yapın.
   1. Mavi alev üzerinde bir Bunsen brülör ile, ortasına doğru bir Pasteur pipet ısı. Bir cızırtı kullanarak Pasteur pipetinin ucunu çekin ve 0,3 mm'den daha az ince çapa çekin.
   2. Orta bölüm yeterince ince olduktan sonra, bu noktada pipet ayırmak ve cam sondasını bitirmek için pipetin ucunu yuvarlamak için o segmenti alev içinde tutun.
      NOT: Yuvarlak prob kristal kırıcılar üçüncü taraf satıcılar tarafından satılmaktadır. Bunlar yuvarlak sondalar yapmak için bir alternatiftir.
2. Buz üzerine beş 1,5 mL mikrosantrifüj tüpü yerleştirin.
3. Hafif bir mikroskop altında, mikrokristaller oluşturmak için uygun bir durum için kristalizasyon tepsisi inceleyin. İdeal olarak, iyi morfoloji büyük kristaller seçilir. Ancak, bu teknik aynı zamanda kötü morfoloji kristalleri, iğneler, plakalar, mikrokristaller ve spherülitler ile çalışır.
4. Kristalizasyon tepsisini iyice açın. 96 iyi kristalizasyon tepsileri plastik ile mühürlü için, iyi sızdırmazlık plastik kesmek için bir neşter kullanın. Yağ ile mühürlenmiş damla tepsileri asılı için, coverslip cımbız kullanılarak kaldırılabilir ve çift bir yüzeye ters.
5. 70 μL rezervuar çözeltisini mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve buz üzerinde soğutun. Diğer mikrosantrifüj tüpleriçin, 90 μL rezervuar çözeltisi ekleyin ve soğumaya buz geri dönün.
   NOT: Rezervuar yeterli hacime sahip değilse veya (yağ altında mikrobatch durumunda) yoksa, uygun reaktifleri karıştırarak kristalizasyon rezervuarı oluşturun.
6. Iyice ezmek için kristal sonda kullanarak damla kristal ajite. Kristalin tamamen ezilmesi gerekiyor ve bu da mikroskop altında izlenebiliyor.
7. Damla tüm sıvı çıkarın ve rezervuar çözeltisi ile mikrocentrifuge tüp aktarın. Karıştırın ve daha sonra mikrocentrifuge tüp karışımı 2 μL almak ve kuyuya geri ekleyin. Çözelti ile iyi durulayın ve mikrocentrifuge tüp aktarın. Bu durulama adımLarını bir kez daha tekrarlayın. Bu noktadan itibaren, karışımdaki mikro tohumların erimesini önlemek için mikrosentrifuge tüpünü soğuk tutun.
8. 3 dakika boyunca 4 °C'de maksimum hızda tüpü girdap, aşırı ısınmayı önlemek için tüpü buz üzerinde soğutmak için düzenli olarak durun.
   NOT: Bazı mikrotohumlama protokolleri kristal kırma 7 ,³⁶yardımcı olmak için mikrosantrifüj tüp bir politetrafloroetilen tohum boncuk ekleyin. Biz başarı ile bir tohum boncuk kullanmadan tekniği istihdam var, ama kristalleri ezmek için bir tohum boncuk kullanarak hiçbir sorun görmüyorum.
9. Soğutulmuş rezervuar çözeltileri arasında 10°L'yi sırayla aktararak tohum stokunun 1'de 1 oranında seri seyreltilmesini yapın.
10. -80 °C'de hemen kullanılmayacak tohum stoklarını saklayın.

5. RMMS ekranı nın ayarlanması

1. Sıvı dağıtım robotu kullanarak 96 kuyu tarama plakası kurmak. Bir robot yokluğunda, çok kanallı bir pipet de kullanılabilir.
   1. Derin bir kuyu bloğundan 96 kuyu kristalizasyon tepsisine 75°L aktarın. Kristalizasyon damlasına 1 0L ve rezervuara 74°L ekleyin.
   2. Lityum I3C ile desteklenen protein in 1 μL, adım 2 yapılan, kristalizasyon damla.
   3. 0,1 μL'lik tohum stokunu kristalizasyon düşüşüne aktarın.
   4. Plakayı net sızdırmazlık bandıyla kapatın ve kristal büyümesini sağlamak için plakayı sabit bir sıcaklıkta kuluçkaya yatırın.
2. Asılı bırakma ekranları kurma
   1. Asma damla kuyuların kenarlarını yağlayın (asılı damla kristalizasyon tepsileri 24 ve 48 iyi biçimleri bulunabilir).
   2. 500 μL kristalizasyon çözeltisini rezervuara aktarın.
   3. Bir cam kapak slayt merkezi yakınında, adım 2 yapılan lityum I3C ile takviye protein 1 μL damla yerleştirin.
   4. Damlaya kristalizasyon çözeltisinin 1 000'ini ekleyin.
   5. 0,1 μL'lik tohum stokunu kristalizasyon düşüşüne aktarın.
   6. Kapak kaydırağını ters çevirin ve kapak kaydırağını yağa doğru iterek kristalizasyonu iyice kapatın.
   7. Kristal büyümesini sağlamak için plakayı sabit bir sıcaklıkta kuluçkaya yatırın.
      NOT: Yeni ve denenmemiş tohum stokları ile, kristalizasyon isabet alma şansını en üst düzeye çıkarmak için en konsantre tohum stoku kullanılması tavsiye edilir. Sonraki koşullar kristallerin sayısını optimize etmek için azaltılmış tohum konsantrasyonu ile ayarlanabilir.
3. Kristal büyüme için düzenli olarak bir mikroskop altında kristal tepsileri inceleyin. Kristaller yeterli kalitedeyse, veri toplama için hasat edilebilirler. Kristaller aynı zamanda yinelemeli optimizasyon için izin vermek için yeni tohum stokları ve yeni rMMS ekranlar oluşturmak için kullanılabilir.

6. Veri toplama

1. Kriyoloops kullanarak hasat kristalleri, kriyoprotekt kristalleri korumak ve sıvı nitrojen onları serin flaş. Flaş soğutma kristalleri hakkında daha fazla bilgi için Teng³⁷ ve Garman ve Mitchell^38'ebakın.
   1. Kriyokoruma aşamasında, kristal yeni bir sulu çözeltiden geçirilirse, i3C kriyokoruma çözeltisine girmesi nedeniyle kristalden kaybedilebilir. Bunu azaltmak için kristalizasyon durumuna uyan bir konsantrasyonda kriyokoruma çözeltisinde lityum I3C kullanın.
   2. Bu protokol kullanılarak yetiştirilen kristaller Parabar 10312 yağ bazlı kriyoprotektif (Hampton Research) kullanılarak başarıyla kriyokorunmuştur.
      NOT: Kristaller sıvı nitrojende depolanırken protokol burada duraklatılabilir.
      DİkKAT: Sıvı nitrojen soğuk yanıklara neden olabilir. Sıvı nitrojen de kapalı alanlarda kullanıldığında boğulmaya neden olabilir.
2. Kristali X-ışını kaynağıgoniyometreye monte edin ve X-ışını kaynağına özgü protokolü kullanarak kırınım verilerini toplayın.
3. Bu teknik, I3C'deki iyot atomlarından gelen anormal sinyale dayanır. Böylece, bu sinyali en üst düzeye çıkarmak için X-ışınının enerjisini seçin.
   1. Senkrotron X-ışını kaynaklarını mümkün olduğunca düşük ayarlanabilir enerjilere ayarlayın. Birçok makromoleküler kristalografi ışın çizgisi için en düşük yapılandırılabilir enerji 8000 ila 8500 eV'dir.
   2. Dönen anodu X-ışını kaynakları ayarlanamaz. Bakır ile yaygın olarak kullanılan anod kaynakları 8046 eV,iyot için iyi bir anormal sinyal sağlayan Kα kenarına sahiptir (f" = 6.9 e). Kromlu anod kaynakları 5415 eV'de Kα kenarına sahiptir ve iyot için büyük bir anormal sinyal sağlar (f" = 12.6 e).
4. Radyasyon hasarı veri toplama sırasında önemli bir sorundur çünkü anormal sinyali^39'udüşürecektir. Radyasyon dozunu en aza indirirken en iyi kırınımı elde etmek için ışın maruz kalma süresini ve zayıflatma seçin.
   NOT: Brom atomları ile değiştirilen iyot atomları ile benzer bir phasing bileşik, radyasyon hasarı karbon brom bağı radyoliziz ve brom atomlarının doluluk bir azalma neden gösterilmiştir²⁴.
   1. Bir toplama stratejisi olarak ters ışın SAD veri toplama kullanın. Veriler, birbirinden sonra toplanan zıt kamalarla, kamalarda toplanır. Bu, Friedel çiftlerinin eşdeğer bir dozla toplanmasını sağlar ve bu da radyasyon hasarından daha az etkilenen anormal sinyalin daha iyi ölçülmesiyle sonuçlanır. Örneğin, 360° toplamak için sekiz kama stratejisi, kama 1 (0°-45°), kama 2 (180°-225°), kama 3 (46°-90°), kama 4 (225°°) sırasına göre veri toplamayı içerir.-270°), kama 5 (90°-135°), kama 6 (270°-315°), kama 7 (135°-180°) ve kama 8 (315°-360°).
      NOT: Sürekli döndürme ters ışın veri toplama alternatif bir toplama stratejisidir. Toplama stratejilerinin yeni bir karşılaştırması için Garcie-Bonte & Katona^40'abakınız.

7. Veri işleme ve yapı çözümü

1. Anormal sinyali en üst düzeye çıkarmak amacıyla XDS⁴¹kullanarak kırınım verilerinde veri azaltma gerçekleştirin. Veri azaltma giriş parametreleri veri kümesine özgüdir ve bazı deneme yanılma ları gerektirebilir. Başlamak için bazı öneriler aşağıda veda edebilirsiniz.
   1. FRIEDEL HUKUK =FALSE ayarlayın. STRICT_ABSORPTION_CORRECT = DOĞRU ve STRICT_ABSORPTION_CORRECT = FALSE' u ayarlayarak CORRECT'u iki kez uygulayın. Bir koşuda diğerinden daha yüksek anormal sinyal olabilir. Çıkıştaki 'Anomal Corr' ve 'SigAno' disiplinlerini kullanarak koşular arasındaki anormal sinyalleri karşılaştırın. Bu, veri kalitesinin bir göstergesidir.
   2. XDS_ASCII SHELXC çalıştırın. Anormal sinyalin daha doğru bir göstergesi için HKL dosyası. 'Ranom' disiplini farklı çözünürlüklerde anormal sinyalin bir göstergesi olacaktır.
2. Verileri ölçeklendirmek için POINTLESS⁴² ve AIMLESS^43'u çalıştırın. AIMLESS'da anomalous ON parametresini ayarlayın. GUI kullanılırsa, aykırı reddedilme ve birleştirme istatistikleri için ayrı anormal çiftleriseçeneğini seçin. Anormal sinyali en üst düzeye çıkarmak için farklı çözünürlük kesiklerinin test edilmesi gerekebilir.
3. Auto-Rickshaw otomatik kristal yapısı belirleme boru hattı⁴⁴kullanarak protein yapısını çözün. Auto-Rickshaw faz sorunu çözmek ve protein modelleme ve arıtma yazılımı ile otomatik olarak protein kristal yapısını oluşturmak için çalışacağız.
   1. Homoloji modeli şablonu olmayan proteinler için Gelişmiş Mod'da Auto-Rickshaw'Un SAD protokolünü çalıştırın. Gerekli parametreleri girin.
      1. Molekül türü olarak PROTEIN'i seçin.
      2. Angstroms (Å) veri toplama dalga boyu girin.
      3. İyot atomlarının kullanıldığını belirtmek için alt yapı elemanı olarak "I" seçeneğini belirleyin.
      4. I3C'nin phasing molekülü olduğunu belirtmek için alt yapı türü olarak "i3c"yi seçin.
      5. Alt yapı belirleme yöntemi olarak "sub_direct" seçeneğini belirleyin. Bu yöntem, alt yapıyı aramak için SHELXD³² kullanır.
      6. Monomer başına beklenen alt yapı sayısı olarak "3"ü seçin.
      7. Alt yapı aramasının çözünürlük kesimi olarak "1" girin. Bu, Otomatik Çekçek'in uygun çözünürlük kesimini otomatik olarak belirlemesine olanak tanır.
      8. Matthews katsayısına göre tek bir monomer, veri kümesinin uzay grubundaki kalıntı sayısını ve asimetrik birimdeki molekül sayısını girin.
      9. İhtiyaçları karşılayan x-ışını verilerinin uygun yayma düzeyini seçin. "AutoRickshaw geliştiricileri" seçilmesi, Auto-Rickshaw geliştiricilerinin sorunlar ortaya çıkarsa sorunu gidermelerine olanak tanır.
      10. Anormal verileri mtz dosyası olarak girdi.
      11. Protein dizisini seq, pir veya txt dosyası olarak girin. Bir seq dosyası bir metin düzenleyicisinde oluşturulabilir (Windows'ta Notepad++⁹ veya Linux'ta nano gibi). Yeni bir dosya oluşturun, proteinin birincil sırasını uzun bir satır olarak girin veya satır sonları ile ayırın. .seq dosya uzantısı ile dosyayı kaydedin.
      12. Kurumsal bir e-posta adresi girin.
4. Sonuçlar, sağlanan e-posta adresine gönderilen bir web bağlantısı aracılığıyla teslim edilir.
   NOT: AutoRickshaw bir X-ışını kristal yapısı 32 çözmek için çeşitli kristalografi yazılım paketleri çağırır otomatik bir boru hattı^{32,33,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58}. Otomatik Çekçek çalıştırılan çalıştırış yapıyı çözemezse, diğer Otomatik Çekçek ayarları sınanabilir. Yapı belirleme yöntemi SHELXD³²yerine Phaser⁵⁹ kullanmak için "sub_phassade" olarak değiştirilebilir. Monomer başına beklenen alt yapı sayısı da artırılabilir veya azaltılabilir.
5. Kristal yapının deneysel phasing sırasında, Auto-Rickshaw birim hücre içinde ağır atomlar konumlandırmak için çalışacağız, bir alt yapı oluşturma. I3C'deki iyot atomlarının eşkenar üçgen düzenlemesi alt yapıyı doğrulamanın etkili bir yolunu sunar. Adım 6.3 başarısız olursa, alt yapının doğrulanması sorun giderme yapısı çözümüne yardımcı olabilir.
   1. Ağır atom sitelerinin listesini Auto-Rickshaw sonuçları sayfasından indirin. "Ağır atom bölgeleri" adı verilen bir köprüdür. Bu ağır atom siteleri ile bir metin dosyası indirecektir.
   2. Dosyanın dosya uzantısını .txt'dan .pdb'a değiştirin.
   3. PDB dosyasını Coot^60'daaçın. Komşu asimetrik birimlerden diğer ağır atomları görmek için simetriyi açın.
   4. Asimetrik birimler arasında da dahil olmak üzere ağır atomlar arasındaki mesafeleri ölçün. I3C 6 angstroms bir yan uzunluğu ile eşkenar üçgen olarak görünür. Bu boyutlara sahip bir üçgenin varlığı, bu ağır atomların yerleşimlerinin doğru olduğunu gösterir.

Sonuçlar

I3C'nin rMMS'ye dahil edilmesi, türev kristal büyümesini destekleyen yeni koşullar oluşturabilir
Eşzamanlı rMMS taraması ve I3C türevizasyonunun etkinliği iki proteinde gösterilmiştir: tavuk yumurtası akı lysozyme (HEWL, lyophilized toz olarak elde edilir) ve bakteriyofaj P68'den putatif Orf11 lysin N-terminal etki alanı (Orf11 NTD). Her protein PEG/ION HT'ye karşı dört farklı koşulda tarandı: tohumsuz, tohumsuz, I3C ile tohumsuz ve I3C ile tohumlu(Şekil 1). Her iki protein için de, I3C'nin tek eklenmesi kristalleşmeye elverişli koşulların sayısını artırmadı. Orf11 NTD durumunda, I3C(Şekil 1B)ile ve olmadan sadece bir uygun koşul tanımlanmıştı. I3C HEWL ekranlarına eklendiğinde, isabet sayısı 31'den 26'ya düşürüldü ve çarpma bileşiklerini tanıtırken kristalleşmenin karmaşıklığı vurgulandı(Şekil 1A). Diğer çalışmalarile tutarlı, bir rMMS ekran oluşturmak için ticari seyrek matris ekranlara tohum ekleyerek önemli ölçüde her iki protein için olası kristalizasyon koşullarının sayısını artırdı, HEWL ve Orf11 NTD için 2.1 ve 6 kat artış ile sonuçlanan, sırasıyla^6,61 (Şekil 1). En önemlisi, I3C ve tohum eşzamanlı eklenmesi, sırasıyla HEWL ve Orf11 NTD için 2,3 ve 7 kat artış gösteren, tohumsuz bir ekrana göre isabet sayısını artırdı. I3C varlığında rMMS kristallerin çoğu mükemmel kristal morfolojisi göstermektedir(Şekil 2).

Tohumlama, I3C rMMS ekranlarda kristal sayısının dikkatli bir şekilde kontrol altına alınır
Mikro tohumlama deneylerinde, bir kristalizasyon deneme içine tanıtılan tohum sayısı tohum stok seyreltme ile kontrol edilebilir ve bu damla çekirdeklenme hassas kontrol sağlar^7,36. Çekirdekleşme bölgelerinde protein moleküllerinin rekabeti azaldığı için bu genellikle daha büyük kristallerin oluşmasını sağlar. Bu avantaj aynı zamanda I3C-rMMS yöntemine de uzanır ve hem HEWL hem de Orf11 NTD'de başarıyla gösterilmiştir. Seyreltilmiş tohum stoku ile I3C-rMMS ekranından tanımlanan bir kristalizasyon durumunun rekreasyonu daha az ama daha büyük kristaller ortaya çıkarmaktadır(Şekil 3).

SAD phasing rMMS I3C ekranından elde edilen kristallerden yapıları çözmek için kullanılabilir
Şekil 3'te gösterilen seyreltilmiş tohum stoğu kullanılarak yetiştirilen kristaller, tek bir kristalden gelen kırınım verileri kullanılarak SAD emzitleme kullanılarak proteinlerin yapısını çözmek için kullanılmıştır(Şekil 4). Veriler Avustralya Synchrotron MX1 Beamline⁶²toplandı. Ayrıntılı veri toplama ve yapı çözüm detayları başka bir yerde²⁷açıklanmıştır.

Şekil 1 - rMMS iki test proteinleri için I3C varlığında kristal büyümesi için yeni koşullar oluşturmak için kullanılmıştır. 96 kuyu buharı difüzyon kristalizasyon ekranı ticari seyrek matris ekranlar kullanılarak yapılmıştır. (A) Tavuk yumurtası beyaz lysozyme Index HT ekranı ile test edildi. Tepsiler 0.2 M amonyum tartarat dibasic pH 7.0, %20 (w/v) polietilen glikol 3350'de yetiştirilen HEWL kristalleri ile tohumlandı. (B) P68 bakteriyofajından Orf11 NTD PEG/ION ekranı ile test edildi. Orf11 NTD tepsiler, mavi renkte gösterilen tohumsuz ekrandan G12 koşulundan kristallerden tohumlandı. Kristal büyümesini destekleyen koşullar kırmızı renkte gösterilir. I3C varlığı ve yokluğunda rMMS tohumlama hem de tohumsuz tepsiler daha önemli ölçüde daha fazla kristal isabet verdi. Şekil Truong ve ark.²⁷uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2 - Şekil 1 (a) ve (b)'de gösterilen buhar difüzyon denemelerinden elde edilen kristallerin temsili görüntüleri. Şekil Truong ve ark.²⁷uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3 - Tohum stokunun seyreltilmesi, i3C-rMMS yöntemi kullanılarak bulunan kristalizasyon durumunda çekirdekleşmeyi azaltmanın etkili bir yoludur. Bir damla içinde çekirdekleşmeyi azaltmak genellikle kristallerin daha büyük boyutlara doğru büyümesine neden olabilir. Şekil Truong ve ark.²⁷uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4 - Orf11 NTD (PDB ID 6O43) ve HEWL (PDB ID 6PBB) I3C-rMMS yöntemi kullanılarak kristalize edildi ve Auto-Rickshaw SAD phasing kullanılarak çözüldü. (A) HEWL ve Orf11 NTD'nin şerit yapıları deneysel phasing ile çözülür. (B) I3C molekülü HEWL ve Orf11 NTD'ye bağlıdır. (C) I3C'deki anormal iyot atomları 6 Å'lık eşkenar üçgen de düzenlenir. Bu nedenle bu üçgenin phasing alt yapısındaki varlığı bu konumda bir I3C molekülü olduğunu gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Moleküler replasman için uygun bir homoloji modeli nin yokluğunda yeni bir proteinin yapı tayini deneysel fazing gerektirir. Bu yöntemler, protein kristaline ağır atomların dahil edilmesini gerektirir ve bu da yapı belirleme boru hattına bir karmaşıklık düzeyi ekler ve ele alınması gereken çok sayıda engeli ortaya atabilir. Ağır atomlar selenomethionine ve selennosistein kullanılarak etiketli ifade yoluyla doğrudan proteiniçine dahil edilebilir. Bu yöntem pahalı, zahmetli ve daha düşük protein verimlerine neden olabileceğinden, etiketli protein genellikle kristalizasyon koşulları bulunduktan ve etiketlenmemiş proteinle optimize edildikten sonra ifade edilir. Alternatif olarak, kristaller ağır atomlar^22,63,64içeren bir çözelti içinde ıslatma tarafından türevolabilir. Bu yöntem genellikle yüksek kaliteli kristaller kullanır ve bu nedenle sağlam bir kristalizasyon yöntemi zaten geliştirilmiştir sonra gerçekleştirilir. Bu yöntemi kullanarak türetiye edilmiş bir kristalin başarıyla elde edilmesi, ıslatma prosedürlerinin daha fazla optimizasyonu ve farklı kademeli bileşiklerin taranmasını gerektirir, bu nedenle zaten zahmetli bir sürece daha fazla zaman katmak.

Proteinin ağır atomla birlikte kristalizasyonu tarama aşamasında gerçekleştirilebilir, böylece süreci verimli bir şekilde düzene sokabilir ve hasara yol açabilecek kristal manipülasyon adımlarını azaltır. Ancak, hala birkaç ilk kristalizasyon isabet ve uyumlu bir ağır atom bileşik seçme sorunu elde potansiyel senaryo var. Birçok şu anda mevcut phasing bileşikleri genellikle kristalizasyon koşullarında bulunan çökeltme, tamponlar ve katkı maddeleri ile uyumsuzdur. Onlar sülfat ve fosfat tamponlar çözünmez olabilir, sitrat ve asetat için chelate, HEPES ve Tris tamponlar ile olumsuz tepki veya DTT ve β-mercaptoetanol tarafından tecrit olmak²¹. I3C phasing bileşik bu uyumsuzluklar muzdarip değildir gibi, birçok farklı koşullara uygun olabilir sağlam bir phasing bileşiktir.

Bu çalışmada, I3C phasing bileşik ve rMMS eşzamanlı co-kristalizasyon yoluyla SAD phasing için hazır türevi kristaller üreten aerodinamik bir yöntem sunulmuştur. Her iki tekniğin kombinasyonu kristalizasyon isabet sayısını artırır, koşulların çoğu morfoloji ve kırınım özellikleri geliştirilmiş olan. Hem Orf11 NTD hem de HEWL test olgularında, I3C-rMMS ekranında I3C olmadığında bulunmayan yeni koşullar saptandı. Potansiyel olarak, I3C proteine olumlu bağlanabilir, kristal kontaklar oluşumunu ve stabilizasyonunu kolaylaştırarak²⁷. Buna karşılık, bu kristalizasyon neden olabilir ve muhtemelen kırınım özelliklerini geliştirmek. Seyrek matris ekranları ile uyumlu bir bileşik olmasının yanı sıra, I3C aynı zamanda içsel özellikleri nedeniyle çekici bir phasing bileşiktir. Aromatik halka iskeleüzerinde iyot ile dönüşümlü fonksiyonel gruplar proteinlere özel bağlama sağlar. Bu daha fazla doluluk yol açar ve potansiyel arka plan sinyali^{azaltır 23.} Ayrıca, eşkenar üçgende anormal dağılımların düzenlenmesi alt yapıda belirgindir ve I3C 'nin(Şekil 4B ve 4C)bağlanmasını hızla doğrulamak için kullanılabilir. Son olarak, tunable senkrotron radyasyonu yanı sıra krom ve bakır dönen anot X-ışını kaynakları ile anormal bir sinyal üretebilir. Böylece, birçok farklı iş akışları uygulanabilir. I3C yaygın olarak kullanılabilir ve satın almak için ucuz olduğundan, bu yaklaşım en yapısal biyoloji laboratuvarları için ulaşılabilecek bir yaklaşımdır.

I3C-rMMS yöntemini kullanırken ele alınması gereken birkaç deneysel husus vardır. Proteinin ilk kristal materyali elde edilemiyorsa bu yöntem uygulanamaz. Zor durumlarda, homolog bir proteinden elde edilen kristal malzeme tohum stoku oluşturmak için de kullanılabilir. rMMS bu çapraz tohumlama yaklaşım bazı umut verici sonuçlar^{göstermiştir 7}. Tohum stokunun seyreltilmesi yoluyla kristal sayısının optimize edilmesi, yüksek kaliteli büyük kristaller üretme ve uygun kırınım verileri elde etme şansını en üst düzeye çıkarmak için göz ardı edilmemesi gereken önemli bir adımdır. Asimetrik birimde tanımlanan az sayıda I3C alanı varsa, kristalleşmeye elverişli koşullar daha fazla I3C konsantrasyonu ile optimize edilmelidir. Bu anormal sinyal ve yardım kristal türevi maksimize etmek için I3C doluluk artırabilir.

Bu tekniğin protein kristallerini türemiş olmak için en uygun yöntem olmadığı durumlar olabilir. Bir protein veya protein kompleksi boyutu arttıkça, protein yüzeyindeki sınırlı sayıdaki I3C bölgesi yapıyı çözmek için yeterli phasing gücü sağlamayabilir. Protein boyutunun phasing'i engellediğinden şüphelenilen bu senaryolarda, proteinin selenometiyonin etiketlemesi proteinin phasing için daha uygun bir yaklaşım olabilir. Protein proteinde yeterli sayıda metiyonin kalıntısı varsa (100 kalıntıbaşına en az bir metiyonin olması önerilir⁶⁵⁾ve yüksek verimli selenomethionine bir proteine dahil edilebilir (bakteriyel ekspresyon sistemlerinde olduğu gibi^66),kristallerde yapıyı faza uygun çoklu yüksek doluluk selenyum atomları bulunacaktır.

Buna ek olarak, bazı proteinler doğal olarak I3C ile türeviçin uygun olmayabilir. Proteinler üzerindeki I3C bağlanma bölgeleri protein yapısına bağlıdır. Doğal olarak I3C bağlanması ile uyumlu az sayıda maruz kalan yamalar var proteinler olabilir. Bu nedenle, Bazı hedef proteinlerin I3C ile birlikte kristalize edilmesinde güçlükler olabileceği öngörülemez değildir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
10 mL tek kullanımlık luer kilitli şırıngalar	Adelab Scientific	T3SS10LAT	Damla kristal tepsi kuyuları için vakum yağ dağıtımında kullanılır
24 kuyu doku kültür plakası	Sigma Aldrich	CLS3527	Damla kristal tepsisini asmak için kullanılır
3 inç genişliğinde Kristal Berrak Sızdırmazlık Bant	Hampton Araştırmaları	HR4-506	Robot tarafından kurulan 96 kuyu kristalizasyon ekranları için
5-amino-2,4,6-triiodoizoftalik asit	Alfa Aesar	B22178	Makalede genellikle I3C olarak anılır
Art Robbins Intelli-Plate 96-2 Orijinal	Hampton Araştırmaları	HR3-297	Robot tarafından kurulan 96 kuyu kristalizasyon ekranları için
Coverslips	Thermo Fisher Scientific	18X18-2	Askı damla kristal tepsi kuyuları için kapak kapakları
Dow Corning vakum yağı	Hampton Araştırmaları	HR3-510	Askı damla kristal tepsi kuyularını kapatmak için kullanılır
Eppendorf Pipet 0.1 μ L-2.5 μ L	Eppendorf	3120000011
Gilson Pipet 2 μ L-20 μ L	John Morris Grubu	1153247
Gilson Pipette 20 & mu; L-200 μ L	John Morris Grubu	1152006
Cam pasteur pipetleri	Adelab Scientific	HIR92601.01
Tavuk Yumurtası Beyazı Lizozimi	Sigma-Aldrich	L6876	Yaklaşık %95 saf
IndexHT ekranı	Hampton Araştırmaları	HR2-134
Mikroskop aydınlatıcısı	Meiji Techno	FT192/230	Kristalografi deneylerini aydınlatmak için ışık kaynağı
PEG/ION HT ekranı	Hampton Araştırmaları	HR2-139
Phoenix Sıvı Dağıtıcı	Art Robbins Enstrümanları	602-0001-10
15 numaralı bistüri bıçağı olan bistü	Adelab Scientific	LV-SMSCPO15
Tohum boncuk kiti	Hampton Araştırmaları	HR2-320	Kit, kristalleri ezmek için cam bir sonda içerir. Kristalleri ezmek için tasarlanmış bir PTFE tohum boncuk da kitin bir parçasıdır ancak bu protokolde kullanılmaz.
Stereo mikroskop & nbsp;	Meiji Techno	EMZ-5TR	Kristalografi deneylerini görselleştirmek için mikroskop
Cizbit	Sigma-Aldrich	T5415
Vortex mikser	Adelab Scientific	RAVM1