Canlı Görüntüleme İçin Fibrin Pıhtıları ile Drosophila Dokularının Hareketsiz Hale Getirilmesi Uygulamaları

Özet

Bu protokol, Fibrin pıhtıları kullanılarak numune hareketsizleştirme uygulamalarını açıklar, sürüklenmeyi sınırlar ve canlı görüntüleme sırasında reaktiflerin eklenmesine ve yıkanmasına izin verir. Örnekler, bir kapak parçasının yüzeyinde kültür ortamı içeren bir fibrinojen damlasına aktarılır, daha sonra trombin eklenerek polimerizasyon indüklenir.

Özet

Drosophila, çok çeşitli biyolojik soruları incelemek için önemli bir model sistemidir. Sineğin farklı gelişim evrelerinden gelen imaginal diskler, yetişkin dişilerin larva beyni veya yumurta odaları veya yetişkin bağırsağı gibi çeşitli organ ve dokular çıkarılabilir ve zaman atlamalı mikroskopi ile görüntüleme için kültürde tutulabilir, bu da hücre ve gelişim biyolojisi hakkında değerli içgörüler sağlar. Burada, Drosophila larva beyinlerinin diseksiyonu için mevcut protokolümüzü ayrıntılı olarak açıklıyoruz ve daha sonra Fibrin pıhtılarını kullanarak larva beyinlerini ve diğer dokuları bir cam örtü üzerinde hareketsizleştirmek ve yönlendirmek için mevcut yaklaşımımızı sunuyoruz. Bu hareketsizleştirme yöntemi sadece Fibrinojen ve Trombin'in kültür ortamına eklenmesini gerektirir. Aynı kültür çanağındaki birden fazla numunenin ters mikroskoplarında yüksek çözünürlüklü zaman atlamalı görüntüleme için uygundur, çok noktalı ziyaret mikroskopisinde mikroskop aşamasının hareketlerinden kaynaklanan yanal sürüklenmeyi en aza indirir ve görüntüleme sırasında reaktiflerin eklenmesini ve çıkarılmasını sağlar. Ayrıca, sürüklenmeyi düzeltmek ve zaman atlamalı analizden belirli nicel bilgileri ayıklamak ve işlemek için rutin olarak kullandığımız özel yapım makrolar sunuyoruz.

Giriş

Drosophila, çok çeşitli biyolojik soruları incelemek için önemli bir model sistemi olmaya devam ediyor ve onlarca yıldır birçok disiplinde bilginin ilerletilmesinde başarılı oldu. Özellikle öne çıkmasını sağlayan bir özellik, özellikle canlı görüntüleme için çok uygun olmasıdır. Hücre altı süreçleri veya hücre ve dokuların davranışlarını gerçek zamanlı olarak izleme yeteneği, hücre ve gelişim biyolojisi ile ilgili temel kavramların üretilmesine katkıda bulunmaya devam eder. Bu tür Drosophila örneklerini canlı ve sağlıklı tutmak için farklı gruplar tarafından birçok başarılı protokol geliştirilmiştir. Hayal diskleri 1 ,², larva beyni^3,4,5,6veya yetişkin dişilerin yumurta odaları 7 ,^8,9veya yetişkin bağırsak¹⁰ gibi sinekten organlar ve dokular çıkarılabilir ve zaman atlamalı mikroskopi ile görüntüleme için kültürde tutulabilir. Canlı görüntüleme için önemli bir zorluk, numunenin mekanik darbelere duyarlı olabilecek numune bütünlüğünden ödün vermeden optimum çözünürlük ve hareketsizlik için görüntüleme yüzeyine yakın tutulmasını sağlamaktır. Drosophila larva beynindeki nöroblastlar veya nöronlar olarak adlandırılan nöral kök hücreleri incelemek için, örneğin, örneklerin görüntüleme yüzeyine yakın tutulması, mühürlü görüntüleme odalarında kültür ortamı ile kaplanarak elde edilebilir^11,12,13. Bununla birlikte, bu yaklaşım medya değişimine kolayca izin vermez, böylece manevra için deneysel alanı sınırlar. Alternatif olarak, numuneler hazırlanabilir ve hücrelerin yapışıklıklarını artırmak ve açık kültür yemeklerinde çok noktalı ziyaret mikroskopisine ve genişletilmiş canlı hücre görüntülemesine izin vermek için tedavi edilen kapaklara yerlenebilir, potansiyel olarak medya değişimine izin verir, ancak medya değişimi sırasında örnek sürüklenmesini veya kaybını önlemek için kolay araçlar sağlamaz^14,15.

Fibrin pıhtı yöntemi başlangıçta canlı vinç-sinek spermatositleri¹⁶ meiosis incelemek için geliştirilmiştir bu sorunların üstesinden gelmek için özel olarak uygundur. Fibrinojen ilgili kültür ortamında çözülür, Thrombin eklenmeden önce bu çözeltinin bir damlasına yerleştirilen ve yönlendirilen numuneler, çözünmeyen bir Fibrin pıhtısının, cam yüzeye yapışan yapışkan lifli bir ağın ve numunelerin kültür ortamına erişimini sağlarken hızlı bir şekilde oluşmasına neden olur. Ortam daha sonra pıhtı veya numune pozisyonuna zarar vermeden değiştirilebilir. Görüntüleme sırasında kültür ortamı değişimi, örneğin, inhibitörlerin orijinal yöntemde olduğu gibi eklenmesi veya yıkama veya nabız kovalama deneyleri için veya hücreleri ve dokuları yerinde tutarken canlı hücre görüntüleme sırasında floresan boyaların eklenmesi gerektiğinde arzu edilir. Fibrin pıhtıları Drosophila dokularının yanı sıra bireysel hücrelerin görüntülenmesi için uygundur^13,17. Fibrin pıhtıları, şekilleri veya diğer özellikleri nedeniyle normalde Fibrin pıhtısı içindeki örnek konumunu ve pıhtının şeklini modüle ederek istenen şekilde yönlendirilmeyecek olan örnekleri yönlendirmeye yardımcı olmak için daha fazla kullanılabilir.

Burada mevcut Fibrin pıhtı bazlı görüntüleme yöntemlerimiz hakkında bir güncelleme sunuyoruz ve segmentasyon tabanlı görüntü analizi için araçlar sağlıyoruz ve gelişmekte olan sinek beynindeki nöroblast bölünmelerini incelemek için bu yöntemin kullanımına odaklanıyoruz. Aynı kültür çanağındaki farklı pıhtılarda birden fazla örneği takip etmek için rutin olarak Fibrin pıhtı yöntemini kullanıyoruz. Bu, i) merkezkant davranış veya mRNA lokalizasyonu canlı^18,19gibi hücre altı olayların görüntülenmesini sağlar, ii) çok noktalı ziyaret kullanarak aynı görüntüleme ayarları altında farklı genotiplerin farmakolojik tedavisi üzerine örneklerin davranışını izlemek mikroskopi²⁰, iii) enzimlerin akut inhibisyonunun etkilerinin incelenmesi²¹ ve iv) hedeflenen lazer-ablasyon üzerine hücrelerin fizyolojik ortamlarındaki hücre bölünmesinin yöneliminde meydana gelen değişiklikleri incelemek için sürüklenmeyi en aza indirmek²². Trombin ve Fibrinojen ve Fibrin pıhtısının istenmeyen etkilerinin her örnek için ampirik olarak test edilmesi gerekirken, Bu yöntem prensip olarak canlı hücre görüntüleme ile analiz edilecek her türlü örneği hareketsiz hale getirmek için uygundur ve Drosophila'da nöroblast biyolojisinin^5,19,2'ninbirden fazla yönünü incelemek için başarıyla kullanılmıştır. 0 , aynı zamanda kadın mikrop hattı kök hücrelerinin sitosensör projeksiyonlarının dinamikleri²³ ve Drosophila dişi yumurta odalarının folikül hücrelerinin akut aPKC inhibisyonu üzerine polaritedeki değişiklikler²¹.

Zaman atlamalı floresan görüntüleme, bu nicel bilgileri ayıklamak için yöntemler gerektiren karmaşık zaman çözümlenmiş 3D veri kümelerinin üretilmesiyle sonuçlanır. Burada, Drosophila larva beyinlerinin nöroblastlarında veya birincil hücre kültüründeki bireysel nöroblastlarda kortikal proteinleri ölçmek için geliştirilen hücre korteksinde çok kanallı floresanların yarı otomatik olarak ölçülmesine izin veren hiperstacks ve özel yapım ImageJ makrolarında sürüklenmeyi düzeltmek için kullanılabilecek ImageJ tabanlı²⁴ makronun daha da geliştirilmesini açıklıyoruz.

Protokol

1. Reaktiflerin hazırlanması

NOT: Aksi belirtilmedikçe bu protokoldeki tüm adımlar oda sıcaklığında gerçekleştirilir.

1. 1x PBS-BSA (%0,1 w/v) çözeltisi hazırlamak için, 1 mg Sığır Serum Albüminini (BSA) 1 mL PBS'de çözün. 1.000 birimlik bir stok çözeltisi hazırlamak için·mL^-1, 1.000 birim Trombin'i 1 mL PBS-BSA'da çözün (%0,1 w/v). 10 μL'lik aliquots yapın ve -20 °C'de 4 aya kadar saklayın.
2. Drosophila beyinleri için kültür ortamını hazırlamak için, Schneider'ın ortamının 1 L'sinde steril koşullarda 1 g Glikoz çözün. 4 °C'de 3 aya kadar filtreleyin ve saklayın.
3. Fibrinojen çözeltisini hazırlamak için, oda sıcaklığında 20 dakika veya 37 °C'de 5 dakika boyunca 1 mL kültür ortamında 10 mg Fibrinojen çözün.
   NOT: 1.2. adımda hazırlanandan farklı bir kültür ortamı kullanılıyorsa ve fibrin pıhtıları bu adımda zaten oluşuyorsa, kültür ortamı muhtemelen önceden inaktive edilmesi gereken aktif Trombin içerir. Muhtemel bir Trombin kaynağı, serumun 30 dakika boyunca 56 °C'ye ısıtılmasıyla inaktive edilebilen Fetal Sığır Serumudur.
4. PBS-BSA kaplama çözeltisi hazırlamak için (%5 w/v), 50 mg Sığır Serum Albümini (BSA) 1 mL 1x PBS'de çözün.
5. 4. adımda kullanılan örnek reaktif için, 315 μL Dimetil sülfitte 1 mg NAPP1 çözerek 10 mM NAPP1 stok çözeltisi hazırlayın.

2. Drosophila larva beyinlerinin diseksiyonu

NOT: Bu adımı bir diseksiyon dürbünü altında gerçekleştirin.

1. L3 larvalarını PBS içeren 9 kuyulu bir borosilikat cam tabağa aktarmak için bir fırça kullanın. Sinek yiyeceklerinin çoğunu larvalardan ayırmak ve kültür ortamı içeren başka bir kuyuya aktarmak için karıştırın.
2. Bir larvayı vücut uzunluğunun ortasında, tüm çapı boyunca kavramak için esipler (örneğin, Dumont #55) kullanın (bkz. Şekil 1A,B). Larvayı tutarken, 200 μL taze kültür ortamı içeren borosilikat plakanın başka bir kuyusuna aktarın.
3. Larvaları serbest bırakmayın. Larvayı tüm çapı boyunca ikiye kesmek için (Şekil 1B), kavrayılmış alanı, kanat uçlarının yanal hareketiyle öğütün(Şekil 1A, üst panel) veya başka bir çift tostun bir ucunu larvayı tutan iki ön uç arasında kaydırın(Şekil 1A, alt panel). Larvayı ekstremitelerinden birini çekerek ikiye kesmeyin, çünkü vücut uzunluğunu geçen sinirler yoluyla çekerek beyne zarar verebilir (Şekil 1B'dekikırmızı çizgiler).
4. Larvayı kütikülden tutmak için önseçimleri ve beyni çekmeden kütikülleri soymak için başka bir çift mansiyon kullanın (Şekil 1C). Beyinden kaynaklanan sinirler görünene ve beyni ağız kısımlarına bağlayan organlara Şekil 1D'degösterildiği gibi erişilene kadar tekrarlayın.
5. Beyinden kaynaklanan sinirleri tutmak için asalet kullanın. Diğer kümespsleri ile, beyin ile ağız kısımları arasındaki bağlantıyı kesmek ve beyni kütikül geri kalanından ayırmak için Şekil 1A'da gösterilen tekniklerden birini kullanın (Şekil 1D).
6. Beyni ventral sinir kordonundan çıkan aksonlardan tutmak için asalar kullanın. Şekil 1E'de gri ile tasvir edilen organları beyinden nazikçe çekerek koparın.
   NOT: Göz/anten hayal disklerini (koyu sarı) beyinden ayırmak için çekmeyin. Bu dokular arasındaki bağlantı beyne zarar vermeden çekilerek kırılamayacak kadar sağlamdır.
7. Beyni tutmak ve yönlendirmek için sinirleri kavramaya devam ederken, göz / anten hayal diskleri (koyu sarı) ve beyin arasındaki bağlantıyı diğer forseps çiftiyle kavrayın (Şekil 1F). Bu bağlantıyı beyni çekmeden kesmek için Şekil 1A'da gösterilen tekniklerden birini kullanın. Beynin diğer dokulardan uygun şekilde temizlenip temizlenmediğini kontrol edin (Şekil 1G) ve hasar görmemiş (Şekil 1H). Hasar belirtileri gösteriyorsa beyni atın.
8. Pipet ucunu kaplamak için kaplama solüsyonunu P20 ile içeri ve dışarı borulayın. 3 μL orta (Şekil 2A, sol) ile birlikte kaplamalı uçlu beyni pipetle ve 200 μL temiz kültür ortamı içeren başka bir kuyuda pipet.
9. Yeterli beyin parçalanana kadar 2.2-2.8 adımlarını tekrarlayın, bazen diseksiyonların yapıldığı kuyunun kültür ortamının yerini aldı.

Şekil 1: D. melanogaster larva beyinlerinin diseksiyonu. (A) Forseps kullanmadan kesme tekniği. Örnek (soluk yeşil), ön ayakların uçları (üst panel) arasında öğütülmüş olarak veya numuneyi tutan bir çift ön ucun (alt panel) uçları boyunca bir çift ön uç çalıştırılarak kesilebilir. (B–F) Larva beynini zarar vermeden izole etmek için adımlar (metne bakın). Kırmızı: beyin. Koyu sarı: göz/anten diskleri. Mavi metin: karşılık gelen kümeslerle gerçekleştirilmesi gereken eylemler. (G) Görünür bir hasarı olmayan izole bir beynin görünümü. D sırt tarafı, V ise yanal görünümde ventral taraftır. (H) Diseksiyon sırasında beynin aşırı çekilmesiyle ortaya çıkan yaygın hasarlar. Üst panel: ventral sinir kordonunun kopuşu. Alt panel: bir lobun deformasyonu. Posterior sol ve ön tüm panellerde sağ. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

3. Fibrin pıhtıları ile kapakta hareketsizleştirme

NOT: Bu adımı bir diseksiyon dürbünü altında gerçekleştirin.

1. Parçalanmış beyinleri 200 μL kültür ortamı + Fibrinojen içeren borosilikat plakanın başka bir kuyusuna aktarmak için adım 2.8'de olduğu gibi kaplamalı uçlu bir P20 pipet kullanın (Şekil 2A).
2. Bir beyinde pipet ve 9 μL kültür ortamı + Fibrinojen. Ucun ucunun neredeyse 35 mm hücre kültürü çanağının kapak camı tabanına değmesiyle, içeriği (kültür ortamı ve beyin) pipet ucu çıktıktan hemen sonra kültür ortamının kapak ucuna dokunmasını sağlar, böylece beyin ve ortam ucun kenarlarına kaymaz ve beyne zarar verir (Şekil 2A).
3. Beyni kültür ortamı + Fibrinojen damlası içinde hafifçe itmek ve konumlandırmak için bir çift tokmak veya kapalı bir çift tokmak kullanın.
   NOT: Damlaya açık bir çift toparlama ile dokunmak, kültür ortamınınps uçları arasındaki kapillarite tarafından çekilmesine neden olabilir (Şekil 2B).
4. Beynin ventral kısmının görüntülenerek ortaya alınması gerekiyorsa, beyni pıhtı içinde düzgün bir şekilde yönlendirmek için Fibrinojen pıhtılaşmasına neden olun (Şekil 2C).
   1. Beyni damlanın bir tarafına itin. P1 ucu, pipet 1 μL Trombin çözeltisi ile donatılmış bir P1 pipeti ile, pipet ucu ile beynin karşı tarafındaki damlanın kenarına dokunun ve Trombin'i pipetle dışarı atın(Şekil 2C, ilk çizim).
   2. Fibrinojen'in polimerizasyona başlaması için 1-2 dakika bekleyin, bu da damlanın bir tarafında bulutlu bir çökeltme oluşumuna neden olur(Şekil 2C, ikinci çizim). Beyni yavaşça Fibrin pıhtısına itin ve "sıkıştırın", görüntüye parçanın (örneğin, ventral taraf) beyni deforme etmeden kapak ucuna mümkün olduğunca yakın olduğundan emin olun(Şekil 2C, üçüncü çizim).
   3. Pipet, beynin yanına yakın 1 μL Trombin çözeltisinin Fibrin pıhtısına sıkıştırılmamış. (Şekil 2C, dördüncü çizim).
   4. İkinci Fibrin pıhtısının ayarını yapmak için 2-3 dakika bekleyin(Şekil 2C, beşinci çizim). Beyni deforme etmemeye dikkat ederek kapak ucuna daha güçlü yapışmasını sağlamak için pıhtının kenarlarına bastırın(Şekil 2C, altıncı ve yedinci çizimler). Beyin örtünün çok uzağı gibi görünüyorsa, Fibrin pıhtısını beyne yakın bastırarak yakınlaştırın.
5. Beynin dorsal kısmının görüntülenebilmesi gerekiyorsa, Fibrin pıhtılaşmasını aşağıdaki gibi indükler (Şekil 2D).
   1. Beyni damlanın ortasına yerleştirin, dorsal kısım kapakçığa bakacak şekilde. İnce uçlu bir P10 pipet, pipet 1 μL Trombin çözeltisi ile, pipet ucu ile beynin karşı tarafındaki damlanın kenarına dokunun ve Trombin'i pipetle dışarı atın(Şekil 2D, ilk çizim).
   2. Fibrinojenin polimerizasyona başlaması için 2-3 dakika bekleyin, bu da bulutlu, lifli bir çökeltme oluşumuna neden olur(Şekil 2D, ikinci çizim). Beyni deforme etmemeye dikkat ederek kapak ucuna daha güçlü yapışmasını sağlamak için pıhtının kenarlarına bastırın(Şekil 2D, üçüncü ve dördüncü çizimler).
6. Kapak kapağında birkaç pıhtı örneğinin hareketsiz hale alınması gerekiyorsa 3.1–3.5 adımlarını tekrarlayın.
7. Ucun ucu pıhtı(lar)ın yaklaşık 0,5 cm üzerine yerleştirilmişken, pıhtı(lar)ın üzerine fibrinojen damla yönünde olmayan hafifçe pipet 390 μL kültür ortamı(Şekil 2B, sağ Petri kabı). Kültür ortamını pıhtının kenarlarından ayırabileceğinden eklemeyin.
8. Kalan Trombin'i yıkamak için, kültür ortamının 300 μl'lik kısmını çıkarmak için bir pipet kullanın ve pıhtıların tamamen daldığından emin olarak 300 μl temiz kültür ortamı ekleyin. Fazla Trombin'i yıkamak için iki kez tekrarlayın.

Şekil 2: Fibrin pıhtıları kullanılarak Drosophila larva beyninin hareketsiz hale getirilmesi. (A) BSA kaplı pipet ucu kullanılarak, beyinler kültür ortamından (sarı) bir kültür ortamına + Fibrinojen çözeltisine (turuncu) aktarılır, daha sonra 3,5 μL kültür ortamı + Fibrinojen ile birlikte bir kültür yemeğinin kapak ucuna (açık mavi) pipetlenir. Fibrinojen pıhtılaşması, dorsal veya ventral pozisyonda beyinleri hareketsiz hale getirmek için Trombin ilavesi ile indüklenmiştir (bkz. D ve E). Pıhtılardaki güvenli beyinler daha sonra Fibrinojen olmadan kültür ortamında kaplanır ve kültür ortamı üç kez eklenerek ve çıkarılarak fazla trombin çıkarılır. (B) Beynin kültür ortamının damlası içindeki konumu + Kapaktaki fibrinojen (turuncu) sadece kapalı bir çift tostun ucuyla hafifçe itilerek veya sadece birps ucu ile ayarlanmalıdır. Damlaya açık bir çift toparla dokunmak, kültür ortamınınps uçları arasındaki kapillarite tarafından çekilmesine neden olabilir. (C) Ventral tarafı görüntülemek için larva beynini konumlandırma adımları (metne bakınız). (D) Sırt tarafını görüntülemek için larva beynini konumlandırma adımları (metne bakınız). In (D) ve (E), yeşil: Trombin. Koyu turuncu: Fibrin pıhtısı. Soluk mavi: kapak. Mavi oklar: pıhtıyı stabilize etmek için kapak çizgisine doğru itilecek pıhtının kenarları. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

4. Canlı görüntüleme sırasında reaktiflerin eklenmesi

1. Odak değişikliklerine neden olan sıcaklık değişikliklerini önlemek için, kültür yemeğine eklenecek reaktiflerle çözeltiyi eklemeden önce aynı sıcaklığa getirmek için kültür yemeğinin kendisiyle aynı sıcaklıkta tutun. Bir çevre odası kullanılıyorsa, çözeltiyi odanın içinde bırakın.
2. Kültür çanağının kapağını, kültür çanağının kendisini yerinden çıkarmadan çıkarın. Daha kolay çıkarmak için, görüntülemeden önce 35 mm'lik kabın kapağını kabın üzerine baş aşağı yerleştirin.
3. P1000 pipet ile pipet ucunu kültür çanağının içindeki kültür ortamının yüzeyine yakın bir yere yerleştirin ve istenen reaktif konsantrasyonuna ulaşmak için yeterli reaktif çözeltisini hafifçe serbest bırakın (örneğin, 10 μM NAPP1'lik son konsantrasyon için 20 μM NAPP1'den 400 μL'lik bir çözeltinin 400 μL'si) pıhtıları ayırabilecek güçlü akılar üretmeden.
4. Çözeltiyi kültür çanağı içinde homojenize etmek için, çözeltinin küçük bir miktarını beş kez yavaşça pipetlamak için bir P200 pipet kullanın (örneğin, çanak içindeki 800 μL'lik bir hacim için 150 μL).
5. Kültür çanağının üst kısmındaki kapağı, kültür çanağının kendisini yerinden etmeden değiştirin ve görüntülemeye devam edin.

5. Canlı görüntüleme sırasında reaktiflerin yıkanması

1. Yıkamadan önce, yıkama solüsyonunu kültür yemeğiyle aynı sıcaklıkta tutun.
2. Kültür çanağının kapağını, kültür çanağının kendisini yerinden çıkarmadan çıkarın.
3. Bir P200 veya P1000 pipetle, pıhtının üst kısmını açığa çıkarmadan kültür çanağından bazı kültür ortamlarını yavaşça çıkarın (örneğin, çanak içindeki 800 μL kültür ortamından 600 μL çıkarın).
4. Reaktifi seyreltmek için, bir P1000 pipet ile pipet ucunu kültür kabının içindeki kültür ortamının yüzeyine yakın yerleştirin ve yıkama çözeltisini yavaşça serbest bırakın (örneğin, 6 seyreltme faktörü için çanak içinde kalan 200 μL kültür ortamına 1 mL yıkama çözeltisi ekleyin).
5. Reaktif gerektiği gibi seyreltilene kadar 5.3 ve 5.4 adımlarını tekrarlayın (örneğin, benzer üç tur daha 1296 seyreltme faktörüne neden olur ve 10 μM NAPP1'in başlangıç konsantrasyonunu 7.7 nM'ye düşürür).
6. Kültür çanağının üst kısmındaki kapağı, kültür çanağının kendisini yerinden etmeden değiştirin ve görüntülemeye devam edin.

6. Xyz'nin üç boyutlu ve/veya çok kanallı zaman atlamalarında sürüklenmesinin düzeltilmesi

1. hazırlık
   1. ImageJ²⁴'ü indirin ve yükleyin. TurboReg²⁵ ve MultiStackReg²⁶ eklentilerini indirin ve Bunları ImageJ'in eklentiler klasörüne yerleştirin.
   2. MultiHyperStackReg (Tamamlayıcı kodlama dosyası 1) ve AutoHyperStackReg ImageJ makrolarını indirin (Tamamlayıcı kodlama dosyası 2). Makro yüklemek için, .ijm dosyasını ImageJ eklentileri klasörünün içine yerleştirin veya .ijm dosyasının içeriğini ImageJ/macros/StartupMacros.txt dosyasına ekleyin.
   3. ImageJ'de, birkaç dilim ve/veya birkaç kanal içeren bir hızlandırılmış film açın (bundan böyle "hyperstack", Şekil 3A,4Aolarak adlandırılır). Zaman atlamalı yalnızca bir dilim ve bir kanal içeriyorsa, hizalama doğrudan MultiStackReg kullanılarak gerçekleştirilebilir.
2. MultiHyperStackReg kullanılarak yanal sürüklenmenin düzeltilmesi
   1. Hizalama için başvuru olarak hangi kanal ve/veya hipersack diliminin kullanılması gerektiğine karar verin. Tek kanallı, tek dilimli bir başvuru yığını oluşturmak için (bundan böyle "başvuru yığını" olarak adlandırılır), Resim | Yinelenen..., Yinelenen hipersack onay kutusunu işaretleyin, Kanallara ilgili kanal numarasını yazın (c): (örneğin, 1–2'yi 1ile değiştirin) ve/veya Dilimler'deki ilgili kanal numarasını (z): (örneğin, 1-15'i 8ile değiştirin) ve Tamam 'a(Şekil 3B)tıklamadan önce Çerçevelerin tüm kareleri (örneğin, 1–50)içerdiğinden emin olun.
   2. 6.2.1 adımına alternatif olarak, tek kanallı, tek dilimli başvuru yığını için birden çok dilim projeksiyonu tercih edilirse, Görüntü | Yığınlar | Z Projesi..., ilk ve son dilimleri ve projeksiyon türünü seçin, Tüm zaman dilimlerinin işaretli olduğundan emin olun ve Tamam'a tıklayın. Zaman atlamalı birden fazla kanal varsa, ilgisiz kanalları silin (Resim | Yığınlar | Eldeedilen projeksiyondan Dilim Sil veya seçilen referans kanalını çoğalt (Resim | Yinelenen) (Şekil 3B).
   3. İsteğe bağlı olarak, araç çubuğundaki dikdörtgen aracını seçerek, ilgilendiğiniz bölge üzerinde bir dikdörtgeni izleyerek ve Görüntü | Kırp.
   4. MultiStackReg'i başlatmak için Eklentiler | Kayıt | MultiStackReg. Yığın 1:açılır menüsünde, önceki adımlarda oluşturulan tek kanallı, tek dilimli yığının adını seçin. Dönüştürme açılır menüsünde:, Çeviri 'yiseçin; Dönüştürme Dosyasını Kaydet onay kutusunu işaretleyin ve diğer tüm alanları yoksayın.
      NOT: Diğer Dönüşüm türleri (bkz.²⁵).
   5. Tamam'a tıklayın. Hizalama dosyasını kaydetmek için bir konum ve ad seçin ve Kaydet 'itıklatın. Başvuru yığını penceresinde, kaydın bittiğini gösteren çerçevelerin otomatik olarak hareket etmesini bekleyin (Şekil 3B).
   6. Hizalamanın tatmin edici olup olmadığını görmek için başvuru yığınını denetleyin. Değilse, 6.2.1–6.2.5 adımlarını farklı bir referans dilimi, kanal ve/veya kırpma ile yineleyin. Başvuru yığınını kapatın.
   7. Hyperstack penceresini seçin ve MultiHyperStackReg makrosunu çalıştırın. 6.2.5 adımında oluşturulan dönüştürme dosyasını seçin ve Aç'ı tıklatın. Hizalamanın hipersack'in her kanalına ve/veya dilimine uygulanmasını bekleyin, bu noktada "_aligned" son ekine sahip yeni bir pencere açılır (Şekil 3C).
3. MultiHyperStackReg kullanılarak odak kaymasının düzeltilmesi
   1. Resim | tıklayın Özellikler..., Piksel Genişliği'nde görüntülenen değeri kopyalayın. Tek kanallı hipersack'i tek piksel aralığıyla ortogonal olarak yeniden boyutlandırmak için Görüntü | Yığınlar | Yeniden Kaydır [/]...), piksel genişliği değerini Çıktı Aralığı: sayısal alanına yapıştırın; Başlangıç: açılır menüsünde Üst'ü seçin, İnterpolasyondan Kaçının 'ı işaretleyin ve Tamam'ı tıklatın.
      NOT: ImageJ'de belleğin serbest bırakılması gerekiyorsa, hyperstack yeniden kaymadan sonra kapatılabilir.
   2. Reslice tarafından oluşturulan yeni pencereyi seçin (bundan böyle "yeniden düzenlenen hiperstack" olarak adlandırılır, Şekil 4B). Yeniden hizalanan hipersack'in birden çok kanalı varsa, hizalamayı gerçekleştirmek için bir başvuru kanalı seçin ve diğer kanalları kanal kaydırma çubuğunda seçerek silin; Resim | tıklayın Yığınlar | Dilim Sil, Geçerli Pop-Up Sil menüsünde Kanal 'ı seçin ve Tamam 'ıtıklatın.
   3. Tek dilimli yeniden dizili bir hipersack oluşturun (bundan böyle "yeniden eklenmiş başvuru yığını" olarak adlandırılır), yeniden düzenlenen hipersack'in tek bir dilimini çoğaltarak (bkz. adım 6.2.1) veya yeniden düzenlenen hipertack'in birkaç dilimini yansıtarak (bkz. adım 6.2.2) (Şekil 4C).
   4. İsteğe bağlı olarak, resim olarak yalnızca bir parçayı başvuru olarak kullanacak şekilde yeniden ayrılmış başvuru yığınını kırpın (bkz. adım 6.2.3).
   5. MutiStackReg ile yeniden eklenmiş başvuru yığınında görüntü kaydını gerçekleştirin (bkz. adımlar 6.2.4–6.2.6) (Şekil 4C).
   6. Yeniden yaslanmış hiper yapışkan penceresini seçin ve MultiHyperStackReg makrosunu çalıştırın. 6.3.5 adımında oluşturulan dönüştürme dosyasını seçin, Aç'a tıklayın ve hizalamanın hipersack'in her kanalına ve/veya dilimine uygulanmasını bekleyin, bu noktada "_aligned" son ekine sahip yeni bir pencere açılacaktır (bundan böyle "yeniden düzenlenen referans yığını" olarak adlandırılır, Şekil 4D). Orijinal yeniden lisanslanmış hipersack'i kapatın.
   7. Yeniden hizalanmış hipersack'i orijinal hipertack'in xy görünümüne dönüştürmek için Yığınlar | Reslice [/]..., Başlangıç: açılır menüsünde Üst'ü seçin, İnterpolasyondan Kaçının 'ı işaretleyin ve Tamam'ı tıklatın. Son odak hizalı hiperstack ile yeni bir pencere açıldıktan sonra (Şekil 4E), yeniden hizalanmış hizalanmış hipertack kapatın.
4. Yanal sürüklenmeyi ve odak sürüklenmesini otomatik olarak düzeltmek için AutoHyperStackReg makrosunu çalıştırın. Varsa referans kanalını ve yanal ve/veya odak kaymasının düzeltilip düzeltülmeyeceğini seçin. Tamam'a tıklayın.

Şekil 3: MultiHyperstackReg ile yanal sürüklenmenin düzeltilmesi için işlem hattı. (A) Birkaç dilim ve zaman noktası içeren bir hiperstack üzerinde yanal ve odak sürüklenmeleri gözlenebilir. (B) Çoğaltma veya Z projeksiyonu ile hiperstack'ten tek bir dilim, tek kanallı başvuru yığını oluşturulur. Başvuru yığını MultiStackReg eklentisi tarafından hizalanır ve bir hizalama dosyası oluşturulur. (C) MultiHyperstackReg makrosu, hizalama dosyasını hipersack'e uygulamak için kullanılır ve bu da yanal sürüklenmenin düzeltilmesine neden olan hizalanmış bir hiperstack ile sonuçlanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: MultiHyperstackReg ile odak kaymasının düzeltilmesi için işlem hattı. (A) Odak sürüklenmeleri, birkaç dilim ve zaman noktası içeren bir hiperstack üzerinde gözlemlenebilir. (B) Hipertack, enterpolasyon olmadan, Y ekseni boyunca her piksel çizgisi boyunca üstten ortogonal olarak yeniden hizalanır. Bu, y ve z koordinatları değiştirilerek hiperstack ile aynı bilgileri içeren yeniden dizili bir hipersack ile sonuçlanır. Orijinal hipersack'in odak kayması (in z), yeniden ayrıştırılan hiperstack üzerinde y'de bir sürüklenme olarak oluşur. (C) Tek bir dilim, tek kanallı yeniden yalıtılmış başvuru yığını, çoğaltılmış hiperstack'ten çoğaltma veya Z projeksiyonu ile oluşturulur. Yeniden hizalanan başvuru yığını MultiStackReg eklentisi tarafından hizalanır ve bir hizalama dosyası oluşturulur. (D) MultiHyperstackReg makrosu, hizalama dosyasını yeniden hizalanmış hipersack'e uygulamak için kullanılır, bu da odak kaymasının (y içinde) düzeltildiği hizalanmış bir yeniden dizili hiperstack ile sonuçlanır. (E) İkinci bir ortogonal reslice, artık bir odak kayması (z) sunmayan hipersack'in orijinal koordinatlarını geri yükler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

7. Dönen hatlar ile kortikal sinyal ölçümü

1. Rotating Linescans ImageJ makrosunu indirin (Ek kodlama dosyası 3).
2. ImageJ'de bir zaman atlamalı açma. Kareler kaydırma çubuğunu ilk kareye yerleştirin ve zaman atlamalı birkaç dilim içeriyorsa, dilimler kaydırma çubuğunu sinyalin ölçüleceği dilime yerleştirin.
3. İzleme modu
   1. Araç çubuğunda düz çizgi aracını seçin. Ölçülecek kortikal bölge boyunca bir çizgiyi takip edin (Şekil 5A), çizginin kortekse kabaca dik olduğundan ve çizginin bir sonraki her zaman noktasında korteksi geçecek kadar uzun olduğundan emin olun(Şekil 5B, birinci ve ikinci panel).
   2. Çizgi Genişliği penceresini açmak için araç çubuğundaki çizgi aracı simgesini çift tıklatın. Çizgi ile korteks arasındaki kesişimi düz bir çizgi olarak tutarken çizginin genişliğini gerektiği kadar artırın(Şekil 5B, üçüncü panel).
   3. Dönen SatırLar makrosunu başlatın. Kortikal bölgenin yönü bir zaman noktasından diğerine çok fazla değişmiyorsa, döndürme aralığını(Şekil 5E)düşük bir değere (yaklaşık 10°) ayarlayın. Yalnızca maksimal sinyal yoğunluğunun algılandığı hattaki sinyali ölçmek için Etrafında Ölç değerini 0 piksel olarak veya bu çizginin etrafındaki sinyali ölçmek için daha yüksek değerlere ayarlayın.
      NOT: Etrafında Ölçü değeri yalnızca korteksin algılanmasının ardından sinyal ölçümünü etkiler ve algılamanın kendisini etkilemez.
   4. Kanalda Korteks Bul: açılır menüsünde, algılamanın gerçekleştirileceği kanalı seçin. Korteksin her zaman noktasında nerede algılandığını görselleştirmek için, Görüntü Konumu... onay kutusunu işaretli tutun (önerilir). Recenter'ı saklayın ve yeniden yönlendirin... onay kutusu işaretlendi. Tamam'a tıklayın.
   5. Bitti, Panoya Kopyalanan Sonuçlar durumu ImageJ pencere durumunda görüntülendiğinde, algılanan korteks konumlarının (sarı kaplama) ve ölçülen alanın (camgöbeği kaplaması) tatmin edici olup olmadığını kontrol etmek için zaman atlamalı olarak kaydırın. Değilse, Dönen SatırLayıcılar seçenekler penceresinde farklı bir çizgi konumu, uzunluk veya genişlik ve farklı ayarlarla 7.3.1–7.3.4 adımlarını yineleyin.
   6. Ölçümleri bir elektronik tablo yazılımına yapıştırın.
      NOT: Sütunlar zaman atlamalı olarak görünüm sırasına göre kanallara karşılık gelir ve çizgiler çerçevelere karşılık gelir.
4. İzleme dışı mod
   1. Araç çubuğunda düz çizgi aracını seçin. Ölçülecek kortikal bölge boyunca bir çizgiyi (siyan, Şekil 5Aile belirtilir) takip edin, çizginin kortekse kabaca dik olduğundan ve çizginin her zaman noktasında korteksi geçecek kadar uzun olduğundan emin olun(Şekil 5C, birinci ve ikinci panel).
   2. Çizgi Genişliği penceresini açmak için araç çubuğundaki çizgi aracı simgesini çift tıklatın. Çizgi ile korteks arasındaki kesişimi düz bir çizgi olarak tutarken çizginin genişliğini gerektiği kadar artırın (Şekil 5C, üçüncü panel).
   3. Dönen SatırLar makrosunu başlatın. Tüm zaman atlamalı boyunca ölçülecek kortikal bölgenin oryantasyon değişikliklerine göre döndürme aralığını (Şekil 5E) ayarlayın. Yalnızca maksimal sinyal yoğunluğunun algılandığı hattaki sinyali ölçmek için Etrafında Ölç değerini 0 piksel olarak veya bu çizginin etrafındaki sinyali ölçmek için daha yüksek değerlere ayarlayın.
      NOT: Etrafında Ölçü değeri yalnızca korteksin algılanmasının ardından sinyal ölçümünü etkiler ve algılamanın kendisini etkilemez.
   4. Kanalda Korteks Bul: açılır menüsünde, algılamanın gerçekleştirileceği kanalı seçin. Korteksin her zaman noktasında nerede algılandığını görselleştirmek için, Görüntü konumlarını koruyun... onay kutusu işaretli (önerilir). Son Kullanılan ve Yeniden Yönlendir... onay kutusunun işaretini kaldırın. Tamam'a tıklayın.
5. Tamamlandığında, Panoya Kopyalanan Sonuçlar ImageJ pencere durumunda görüntülenir, algılanan korteks konumlarının (sarı kaplama) ve ölçülen alanın (camgöbeği kaplaması) tatmin edici olup olmadığını kontrol etmek için zaman atlamalı olarak kaydırın. Değilse, Döndürme SatırLayıcıları seçenekleri penceresinde farklı bir çizgi konumu, uzunluğu veya genişliği ve farklı ayarlarla önceki adımları yineleyin.
6. Ölçümleri bir elektronik tablo yazılımına yapıştırın.
   NOT: Sütunlar zaman atlamalı olarak görünüm sırasına göre kanallara karşılık gelir ve çizgiler çerçevelere karşılık gelir.

Şekil 5: Dönen çizgilerle kortikal sinyalin ölçümü. (A) Sinyalin ölçüleceği kortekse (siyah) dik olarak bir çizgi (siyan) izleniyor. Grinin farklı tonları, hücre konumunun üç zaman noktasında (t1, t2, t3) değiştiğini gösterir. (B) Sol: izleme modunda hattın doğru konumlandırılması. Orta: bir sonraki zaman noktasında korteksle çakışma olmadığı için hattın izleme modunda yanlış konumlandırılması. Sağ: korteks ile çizgi arasındaki kesişim (turuncu çizgi) düz olmamasına neden olan aşırı geniş çizgi. (C) Sol: hattın takip dışı modda doğru konumlandırılması. Orta: her zaman noktasında korteksle çakışma olmadığı için hattın takip dışı modda yanlış konumlandırılması. Sağ: korteks ile çizgi arasındaki kesişim (turuncu çizgi) düz olmamasına neden olan aşırı geniş çizgi. (D) Tarama hattının uzunluğu ve genişliği. (E) Linescans, "döndürme aralığı" parametresi tarafından tanımlanan (D) içinde gösterilen orijinal oryantasyon etrafında, "döndürme adımı" parametresi tarafından tanımlanan bir aralıkta gerçekleştirilir. (F) Tarama hattının kortekse göre optimum olmayan yönü, hat boyunca düşük bir sinyalle ölçülür. (G) Hattın optimum yönü, hat boyunca ölçülen en yüksek sinyal yoğunluğuyla sonuçlanan hat olarak tanımlanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Sonuçlar

Drosophila dokularının Fibrin pıhtıları ile hareketsiz hale getirilmesi ve canlı görüntüleme sırasında kültür ortamı değişimi.
Adım 2 ' de sunulan prosedürü takiben parçalandıktan sonra (Şekil 1) ve adım 3 ' te sunulan prosedürü takiben aynı kapaktaki Fibrin pıhtılarında hareketsiz hale geldikten sonra (Şekil 2), GFP etiketli Bazukayı (Baz::GFP) ifade eden larva beyinleri, polarite proteini Par-3'ün sinek ortezi, zaman atlamalı çok konumlu konfokal görüntülemede 30 dakika boyunca görüntülenmiştir. Baz::GFP, küçük ATP analogu 1-NAPP1^20'nineklenmesiyle atipik protein kinaz C'nin (aPKC) akut inhibisyonunu sağlayan bir alele olan apkc^as4ile birleştirilir. 1-NAPP1 bu nedenle 4. Kinaz aPKC'nin vahşi tip bir versiyonunu taşıyan kontrol beyinleri ATP analoguna tepki vermemişken, ek olarak aPKC'nin(apkc^as4) analoga duyarlı bir mutasyonu taşıyan beyinler, nöroblastlarda ve soylarında Baz'ın nöroepithelium ve parlak kümelerinde bir kasılma gösterdi (Şekil 6, Video 1). Nöroblastlar zaman atlamalı boyunca bölünmeye devam eder, bu da dokunun sağlıklı kaldığını gösterir ve beyinler kültür orta değişimine rağmen çok az sürüklenme gösterir, bu da iyi hareketsiz olduklarını gösterir. Benzer şekilde,²⁷'de sunulan prosedürü takiben parçalandıktan sonra, Baz::GFP ifade eden ovarioles aynı kapak üzerindeki Fibrin pıhtılarında hareketsiz hale getirildi ve 8 dakika boyunca görüntülendi, daha sonra 1-NAPP1 uygulaması apkc^as4 mutant foliküler hücrelerin kasılmasına neden oldu, ancak kontrollerin değil (Şekil 7, Video 2).

MultiHyperstackReg kullanılarak yanal ve odak sürüklenmesinin düzeltilmesi.
Hem yanal hem de netleme sürüklenmesini gösteren bir hiperstack(Video 3, sol panel) önce yanal sürüklenme için düzeltildi (adım 6.2, Şekil 3, Video 3, orta panel), daha sonra MultiStackReg eklentisi ve MultiHyperstackReg makrosu kullanılarak odak kayması (adım 6.3, Şekil 4, Video 3 , sağ panel) orijinal hiperstack'te gözlenen hareketlerin önemli ölçüde azalmasına neden oldu.

Dönen hatlar kullanılarak kortikal sinyal ölçümü
Baz::GFP (yeşil) ve kızılötesi floresan protein (CD4::mIFP, kırmızı) ile etiketlenmiş transmembran protein CD4'ü ifade eden bir nöroblast bir mitoz sırasında görüntülendi. CD4::mIFP sinyali, nöroblastın çeşitli bölgelerindeki korteksi lineskanlarla (adım 7, Şekil 5, Şekil 8A–C)tespit etmek için referans olarak kullanıldı ve Baz::GFP sinyali tespit edilen konumlarda ölçüldü Şekil 8D). Bölünmeleri sırasında, nöroblastlar farklı ve zıt kortikal alanlar oluşturarak geçici olarak polarize oldular: apikal kutup ve bazal kutup. Baz, apikal kutbu tanımlar ve sürekli olarak, Baz::GFP sinyali nöroblastın apikal kutbunda arttı ve bölme sırasında bazal kutupta azaldı (Şekil 8C,D). Korteksin konumu zaman atlamalı boyunca tatmin edici bir şekilde izlendi (Şekil 8C, Video 4). Drosophila çizgileri ve genotipleri Ek Tablo 1–2'debaşvurulmaktadır.

Şekil 6: Canlı görüntüleme sırasında hareketsiz larva beyinlerine ATP analogunun uygulanması. (A) Baz::GFP'yi ifade eden iki larva beyninin canlı görüntülenmesi aynı kapakta hareketsiz hale getirilir. Kültür ortamı, 0 dakikada 10 μM ATP analogu 1-NAPP1 konsantrasyonuna değiştirilir. Kontrol beyinleri ATP analoguna gözle görülür şekilde tepki vermezken, aPKC'nin(aPKC^AS4)analog hassas mutasyonu taşıyan beyinler nöroblastlarda ve soylarında nöroepithelium (ok uçları) ve parlak Baz kümelerinin daralmasını gösterir. 23 μM derinlik için 33 dilimin maksimum yoğunluk projeksiyonu Ölçek çubuğu: 20 μM. (B) Nöroepithelium büyütme. Ölçek çubuğu: 10 μM. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 7: Canlı görüntüleme sırasında hareketsiz yumurta odalarına ATP analogunun uygulanması. Baz::GFP'yi aynı kapak kapağında hareketsiz olarak ifade eden iki yumurta boyunun canlı görüntülenmesi. Kültür ortamı, 0 dakikada 10 μM ATP analogu 1-NAPP1 konsantrasyonuna değiştirilir. Kontrol yumurtası odaları ATP analoguna gözle görülür şekilde tepki vermezken, aPKC'nin(aPKC^AS4)analog hassas mutasyonu taşıyan yumurta odaları, sonunda yapışan kavşakların belirgin bir şekilde bozulmasına yol açan epitelin (ok uçları) bir daralmasını gösterir. 27 μM derinlik için 33 dilimin maksimum yoğunluk projeksiyonu Ölçek çubuğu: 20 μM. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 8: Dönen çizgikanlar kullanılarak kortikal sinyalin ölçümü. (A) Baz::GFP (yeşil) ve CD4::mIFP (kırmızı) ifade eden canlı D. melanogaster nöroblast. Siyan çizgileri: ilk tarama hatları, ölçmek için dik olarak çeşitli kortikal bölgelere kadar izlendi. Ölçek çubuğu: 5 μM. (B) Kortikal çizgiler kullanılarak korteksin (koyu mavi çizgi) tanımlanması ve referans kanal olarak CD4::mIFP (kırmızı). Siyan çizgisi: korteks algılamadan sonra sinyalin ölçüldüğü "Etrafında ölç" parametresi (burada, 2 piksel) ile tanımlanan alan. Ölçek çubuğu: 2 μm. (C) Siyan: referans kanal olarak CD4::mIFP (kırmızı) kullanılarak (A) görüntülenen ilk tarama çizgilerinden dönen linescans yöntemi ile nöroblast bölünmesi sırasında tanımlanan kortikal alanlar. Ölçek çubuğu: 5 μM. Ok: apikal kutup. Ok ucu: bazal direk. (D) Baz ölçümü::GFP sinyal yoğunluğu zaman içinde görüntülenen dönen linescans tarafından tanımlanan karşılık gelen iki bölgede (C). Mitoz sırasında Baz::GFP, nöroblastın apikal kutbunda geçici olarak zenginleşir ve karşı bazal kutuptan tükenir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Video 1: Canlı görüntüleme sırasında bir inhibitör eklemek için hareketsiz larva beyinlerine medya değişimi uygulaması, Şekil 6'dasunulan ölçek çubuğu: 20 μm. Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Video 2: Canlı görüntüleme sırasında bir inhibitör eklemek için hareketsiz yumurta odalarına medya değişimi uygulaması, Şekil 7'desunulan ölçek çubuğu: 20 μm. Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Video 3: MultiHyperStackReg kullanılarak yanal ve odak sürüklenmesinin düzeltilmesi. Membran probu PH::GFP'yi ifade eden bir nöroblastın canlı görüntülenmesi. Xy: tek odak düzlemi. Xz: ortogonal reslice. Sol: sürüklenmenin düzeltilmesinden önce. Orta: yanal sürüklenmenin düzeltilmesinden sonra. Sağ: Yanal ve odak sürüklenmesini düzeltdikten sonra, ölçek çubuğu: 10 μm. Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Video 4: Şekil 8,ölçek çubuğu: 5 μm'de sunulan dönen çizgikanlar kullanılarak korteksin algılanmasını, lütfen bu videoyu indirmek için buraya tıklayın.

Ek Tablo 1: Görüntülenmiş Drosophila dokularının genotipleri. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Tablo 2: Kullanılan transgenes kökeni. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Kodlama Dosyası 1: Kullanılan transgenes kökeni. Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Tamamlayıcı Kodlama Dosyası 2: Kullanılan transgenes kökeni. Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Kodlama Dosyası 3: Kullanılan transgenes kökeni. Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Tartışma

Tüm D. melanogaster larva beyinlerinin canlı görüntülenmesi, fizyolojik bir bağlama yakın koşullarda asimetrik nöral kök hücre bölünmelerini gözlemleme fırsatı sağlar. Protokolümüzün ilk bölümü larva beyinlerinin diseksiyonu konusundaki yaklaşımımızı tanıtıyor. Daha önce belirtildiği gibi¹³Hazırlığın kritik bir yönü beyne zarar vermekten kaçınmaktır. Bunun en zorlu yanı, beyni aşırı çekmeden komşu hayal disklerinden ayırmaktır. "Çekmeden kesmeye" yaklaşımımız, bir çift tokanın uçlarıyla bir taşlama hareketi yapmak veya dokular arasındaki bağlantıyı tutan diğer ikips ucu boyunca bir tokmak ucu kaydırmaktır (Şekil 1A) oysa Lerit ve ark. bir diseksiyon pimi ile testere benzeri hareketleri tanımlar. Deneyciye tüm yaklaşımları denemesini ve kendileri için en uygun olanı benimsemesini tavsiye ediyoruz. Ayrıca izole edilmiş beyinleri aktarmak için diseksiyon araçları yerine BSA veya FCS kaplı pipet uçları kullanmanızı öneririz. Kaplama, dokuların plastiğe yapışmasını önler ve dokuların güvenli bir şekilde aktarılmasını sağlarken, aktarım sırasında diseksiyon aracına yapıştıkları için olası bir geçici deformasyona maruz bırakmadan her zaman tamamen daldırmalarını sağlar. Kaplanmış uçlar, aynı anda birkaç beynin transferine izin vermek için başka avantajlara sahiptir, bu da örneklerin belirli bir ortamdaki ikamet süresini kontrol etmek için kritik olduğunda özellikle yararlıdır; diğer dokuların, hatta kırılgan olanların, örneğin yağ kütlelerinin transferi için uygundurlar; daha büyük uçlar kullanarak veya ucun ekstremitesini keserek çok çeşitli farklı numune boyutlarına uyum sağlayabilirler.

Daha sonra, bu protokol, bir kültür yemeğinin kapaklarında larva beyinlerini hareketsiz hale getirmek için Fibrinojen pıhtılaşmasının kullanımını açıklar. Bir beyin bir damla kültür ortamı + Fibrinojen içinde yönlendirilir, daha sonra Trombin ilavesi ile pıhtılaşma indüklendi. Fibrin oluşumu kademelidir ve gerekirse numunenin yönünün ince ayarlanabileceği bir zaman aralığı sağlar (Şekil 2C). Örneğin hafif bir sıkıştırması gerekiyorsa - larva beyinleri durumunda karşı tavsiye ettiğimiz - ayrıca 3.4.4 ve 3.5.2 adımları sırasında pıhtıya az çok numuneye yakın bastırılarak ince bir şekilde ayarlanabilir. Bu Fibrinojen pıhtılaşmasının, beyinlerin gaz geçirgen bir zar ve bir kapak kılıfı arasına monte edildiği Lerit ve ark.'da açıklanan protokole göre pıhtılaşmasının ana avantajı, canlı görüntüleme sırasında kültür ortamını değiştirme yeteneğidir. Protokolümüz üzerinde gaz geçirgen bir membran kullanmanın olası bir avantajı, beyinler pıhtı ve bazı ortamlar tarafından havadan ayrıldığı için yaklaşımımızla daha sınırlı olabilecek numunelerin optimal bir oksijenlenmesini sağlaması olabilir. Bu nedenle, kültür çanağı içindeki kültür ortamı miktarının etkisini değerlendirmemiş olsak da, pıhtıları tamamen daldırırken pıhtıların üstündeki kültür ortamı miktarını sınırlamayı öneriyoruz.

Pıhtıların manipülasyonu deneysel olarak zor ve zaman alıcı olabileceğinden, deneycinin ilk olarak pıhtıları örneksiz manipüle etmeyi uygulamasını öneririz. Kapakta kültür ortamı + Fibrinojen damlasının hacminin modüle edilmesi, Fibrinojen konsantrasyonu veya Trombin hacmi ve konsantrasyonu, hazırlığı kolaylaştırmaya yardımcı olabilir ve protokolü diğer doku türlerine uyarlarken önemli olabilir. Pıhtıları manipüle etme konusunda yeterli deneyime sahip olan birkaç beyin, gerekirse bir pıhtıda hareketsiz hale getirilebilir, ancak oryantasyonun ince ayarını zorlaştırır. Kapakta birkaç pıhtı oluşabilir, örneğin farklı genotiplerin görüntü örneklerine izin verir. Aynı kapak üzerindeki farklı pıhtıları farklı kültür ortamlarına maruz bırakmak da mümkündür, ancak farklı pıhtıları kaplayan kültür ortamı damlalarını asla karıştırmamaya özen gösterilmelidir. Larva beyinleri hareketsiz hale geldikten ve canlı görüntülemeye hazır hale geldikten sonra, aşırı fotodamajdan kaçınmak için^Lerit ve ark. Bu önerilere sadece bir sahne inkübatörü ile canlı görüntüleme sırasında beyinleri 25 °C'de tutmak için değil, aynı zamanda görüntüleme başlamadan önce bu aşamayı en az 30 dakika önceden ısıtmak için de ekliyoruz. Elimizde, bunu sistematik olarak yapmamak güçlü bir odak kaymasına neden olur.

İlişkili mikroskopi yapabilmek ve canlı görüntülemeden sonra bir örneği düzeltebilmek ve immün yetisini düzeltmek bazı bağlamlarda avantajlı olabilir. Bununla birlikte, Fibrin pıhtılarını kullanmanın bir sınırlaması, bir beyni zarar vermeden bir pıhtıdan mekanik olarak izole etmenin neredeyse imkansız olmasıdır. Bu sınırlamayı aşmanın olası bir yolu, Plasmin ile Fibrin pıhtılarını bozmak veya Fibrin polimerizasyonuna izin vermek için düğmeleri taklit eden bir peptit eklenerek pıhtı sökülmesine neden olacak yöntemler geliştirmek olabilir²⁸. Fibrin pıhtılarını tipik olarak tek hücreden 200 μM uzun dokuya kadar değişen örneklerde kullanırız, ancak 3 mm genişliğindeki yetişkin bombus arılarından pıhtılarda ve görüntü beyinlerinde de başarılı bir şekilde hareketsiz hale gelebiliriz. Pıhtılarda hareketsiz hale getirilebilen numune boyutunun üst sınırı belirlenmeye devam etmektedir. Benzer şekilde, genellikle hareketsiz örnekleri 4 ila 5 saat boyunca görüntülesek de, nöroblastları birincil kültürde 3 güne kadar başarıyla görüntüledik, bu da pıhtının en azından daha uzun süreli canlılığa engel olmadığını gösteriyor. Aksine, pıhtılar, bu amaç için peristaltik pompalar gibi cihazlara ihtiyaç duymadan, daha uzun süreli görüntüleme için bir gereklilik olan ortamın düzenli olarak değiştirilmesini kolaylaştırabilir. Fibrin pıhtılarının geçirgenlik parametrelerini ölçmemiş olsak da, pıhtıların lifli jel benzeri doğası hücre geçirgen molekülleri tarafından penetrable gibi görünmektedir. Latrunculin A, Colcemid veya 1-NAPP1, HALO etiketli ligandların ve hücre biyolojisinde kullanılan diğer standart boyaların fibrin pıhtısındaki hücrelere sorunsuz bir şekilde ulaştığını ve şimdiye kadar pıhtı tarafından tutulacak moleküllerle karşılaşmadığını, bunun da ampirik olarak test edilmesi gereken bir olasılık olduğunu bulduk.

Sonuç olarak, Fibrin pıhtılarının kullanılması, canlı görüntüleme için canlı dokuları hareketsiz hale getirmek için güvenilir ve nispeten kolay bir uygulama yolu sağlar. Yanal sürüklenmeyi sınırlamadaki kullanışlılığının ötesinde, canlı görüntüleme sırasında kültür ortamını değiştirme yeteneği, D. melanogaster nöroblastlarının asimetrik hücre bölümünü incelemeye yönelik kimyasal genetik yaklaşımımız için paha biçilmez olduğunu kanıtlamıştır²¹. Bu tekniğin, özellikle kimyasal genetik veya örneğin protein kendi kendini etiketleme²⁹içeriyorsa, çok çeşitli farklı dokulardaki çalışmalara faydalı olacağını öngörüyoruz.

MultiHyperStackReg makromuz, ardışık çerçeveleri veya yığın dilimlerini hizalayan TurboReg ImageJ eklentisine ve dönüşümleri diğer yığınlara uygulamaya izin veren MultiStackReg ImageJ eklentisine dayanır. MultiHyperStackReg, bu dönüşümleri hipertacklara (en az dört boyutlu yığınlar) uygulamak için izin verir. MultiHyperStackReg kullanımı, açıkladığımız gibi, çok fazla eylem gerektirir ve oldukça zaman alabilir, ayrıca 6.2 ve 6.3 adımlarında açıklanan tüm adımları otomatik olarak gerçekleştiren AutoHyperStackReg makrosunu yazdık. Ancak, MultiHyperStackReg aksine, AutoHyperStackReg şu anda bu yığının bir alt bölgeye dayalı bir yığının hizalamasını hesaplama imkanından yoksundur, bulduğumuz bir seçenek bazen tatmin edici bir hizalama için çok önemlidir. AutoHyperStackReg'in başka bir sınırlaması, kullanımının TurboReg ve MultiStackReg tarafından önerilen diğer dönüşümlerle değil, çevirilerle sınırlı olmasıdır, oysa MultiHyperStackReg, kullanıcının ihtiyaç duyması durumunda herhangi bir dönüştürme türüne bir hiperstack için geçerli olabilir. Gelecekteki sürümler bu işlevleri uygulayacak ve GitHub³⁰. Son olarak, dönen linescan makromuz, korteks zaman içinde konumunu veya yönünü değiştirse bile, kortikal sinyalleri zaman atlamalarında hızlı bir şekilde ölçmenin kolay bir yolunu sağlar. İzleme modunun veya takip etmeme modunun analiz için en uygun olup olmadığı kortikal sinyalin kalitesine ve tutarlılığına bağlıdır. Kullanıcının her zaman noktası için korteksin nerede olacağını düşünmesi gerekmediğinden ve zaman içinde büyük konum ve yönelim değişikliklerine uyum sağlayabildiğinden, izleme modunun kullanımı daha kolaydır. Bununla birlikte, kortikal sinyal tüm film boyunca algılama için yeterince güçlü kalırsa uygundur: korteksten başka bir şeyin algılanmaması (örneğin, kortekse yakın parlak bir sitoplazmik bölme) aşağıdaki her zaman noktası için algılamayı tehlikeye atabilir (örneğin, sitoplazmik bölme korteksten uzaklaşır ve kortikal çizgiler onu geri kalan süre boyunca takip edebilir). Algılama, kullanıcı tarafından başlangıçta çizilen çizgiyle sınırlı olduğundan (örneğin, parlak bir sitoplazmik bölme algılamanın birkaç zaman noktası için başarısız olmasına neden olabilir, ancak sitoplazmik bölme algılama bölgesinden uzaklaştıkça, korteksin doğru tespiti devam ederse) bu tuzak yoktur, ancak korteks konumu veya oryantasyonu zaman içinde çok değişirse iyi davranmaz. İzleme modu için geliştirilecek bir sonraki özellik (GitHub^30'damevcut olacak), yalnızca belirtilen zaman noktalarını analiz etme ve algılamanın gerçekleştirileceği ve daha sonra kullanıcının en azından sorunlu zaman noktalarından kaçınmasını sağlayacak bir referans zaman noktası (ilk zaman noktası yerine) tanımlama seçeneği olacaktır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Albümin sığır serumu, BSA	Merck	5470
D-(+)-Glikoz	Sigma	G7021
Dimetil sülfoksit	Sigma	D2650
Dumont #55 Forseps	Güzel Bilim Araçları	11255-20
Fetal Bovie Serum, hücre kültürü için uygun	Sigma	F7524
İnsan plazmasından	fibrinojenSigma	F3879
FluoroDish Hücre Kültürü Kabı - 35mm, 23 mm kuyu	World Precision Instruments	FD35-100
PP1 Analog (1NA-PP1)	Merck Millipore	529579
Pyrex nokta plakası, dokuz çöküntü ile	Sigma	CLS722085-18EA
Schneider'in Böcek Ortamı	Sigma	S0146
Sığır plazmasından trombin	Merck	T4648