Yöntem makalesi

Sağlıklı ve Yaralı Fare Kalplerinde Üç Boyutlu Fibroblast Organizasyonu için Rafine CLARITY Tabanlı Doku Temizleme

DOI:

10.3791/62023

⸱

16 Mayıs 2021

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Genetics, Biochemistry, and Microbiology, University of Cincinnati College of Medicine, 2Division of Molecular Cardiovascular Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 3Confocal Imaging Core, Cincinnati Children's Hospital Medical Center

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rafine bir doku temizleme yöntemi geliştirildi ve yetişkin fare kalbine uygulandı. Bu yöntem, genetik bir muhabir stratejisine atfedilen etiketli fibroblast floresan korurken yoğun, otoflüoresan kalp dokusunu temizlemek için tasarlanmıştır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kardiyovasküler hastalık dünya çapında en yaygın mortalite nedenidir ve genellikle değiştirilmiş kardiyak fonksiyon ile artmış ventrikül sertliğine yol açabilecek yüksek kardiyak fibrozis ile işaretlenir. Kardiyak ventrikül fibrozislerindeki bu artış, yerleşik fibroblastların aktivasyonundan kaynaklanmaktadır, ancak bu hücrelerin 3 boyutlu (3-B) kalp içinde, taban çizgisine veya aktivasyondan sonra nasıl çalıştığı iyi anlaşılamamıştır. Fibroblastların kalp hastalıklarına ve 3 boyutlu kalpteki dinamiklerine nasıl katkıda bulunduğunu incelemek için, tüm fare kalbinde floresan etiketli kardiyak fibroblastları gösteren rafine clarity tabanlı bir doku temizleme ve görüntüleme yöntemi geliştirilmiştir. Doku yerleşik fibroblastlar genetik olarak Rosa26-loxP-eGFP floresan muhabir fareleri tcf21-MerCreMer knock-in hattını ifade eden kardiyak fibroblast ile geçti kullanılarak etiketlendi. Bu teknik, sağlıklı farelerde ve kalp hastalığının fibrotik fare modellerinde tüm yetişkin sol ventrikül boyunca fibroblast lokalizasyon dinamiklerini gözlemlemek için kullanılmıştır. İlginçtir ki, bir yaralanma modelinde, kasnak yönünde sarılmış lif bantlarını takip eden yaralı fare kalbinde benzersiz kardiyak fibroblast desenleri gözlenmiştir. İskemik yaralanma modellerinde fibroblast ölümü meydana geldi, ardından enfarktüs sınır bölgesinden repopülasyon yapıldı. Toplu olarak, bu rafine kardiyak doku netleştirme tekniği ve dijitalleştirilmiş görüntüleme sistemi, antikor penetrasyon yetmezliği veya doku işleme nedeniyle kaybedilen floresan ile ilgili önceki sorunlar sınırlamaları olmadan kalpteki kardiyak fibroblastların 3 boyutlu görselleştirilmesine izin verir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kardiyomiyositler kalpteki en büyük hacim fraksiyonunu oluşturmasına rağmen, kardiyak fibroblastlar daha boldur ve bu organın temel yapısal ve onarıcı özelliklerinin düzenlenmesinde kritik olarak yer almaktadır. Kardiyak fibroblastlar, aktivasyonlarının kapsamına bağlı olarak son derece hareketli, mekanik olarak duyarlı ve fenotipik olarak değişir. Kardiyak fibroblastlar normal hücre dışı matris (ECM) seviyelerini korumak için gereklidir ve bu hücreler tarafından çok az veya çok fazla ECM üretimi hastalığa yol açabilir1,2,3. Hastalıktaki önemleri göz önüne alındığında, kardiyak fibroblastlar, özellikle aşırı fibrozis 4 ,5, 6,7'yi sınırlamaya çalışırken, yeni tedavi stratejilerini belirlemeye yönelik giderek daha önemli bir araştırma konusuhalinegelmiştir. Yaralanma üzerine fibroblastlar, ventriküllerin yeniden şekillendirilmesine yardımcı olan kasılma aktivitesinin yanı sıra proliferatif ve bol ECM salgılaabilen miofibroblast olarak bilinen daha sentetik bir hücre tipini aktive eder ve farklılaşır.

Kardiyak fibroblastlar 2-B kültürleri 6 ,8,9,10'daki özellikleri için kapsamlı bir şekilde değerlendirilirken, 3-B canlı kalpteki özellikleri ve dinamikleri, taban çizgisi veya hastalık stimülasyonu ile çok daha az anlaşılmaktadır. Burada, Rosa26-loxP-eGFP x Tcf21-MerCreMer genetik muhabir sistemi ile etiketlenmiş fibroblastların floresanını korurken yetişkin fare kalbini temizlemek için rafine bir yöntem tanımlanmıştır. Kalp içinde, Tcf21 sessiz fibroblastların nispeten spesifik bir belirtecidir4. Tamoksifen indüklenen MerCreMer proteinini aktive etmek için verildikten sonra, esasen tüm sessiz fibroblastlar Rosa26 lokusundan gelişmiş yeşil floresan proteini (eGFP) kalıcı olarak ifade edecektir, bu da vivo olarak izlenmesini sağlar.

Bazıları kalbe uygulanan çok sayıda köklü doku temizleme protokolü vardır11 , 12,13,14,15,16,17. Bununla birlikte, farklı doku temizleme protokollerinde kullanılan reaktiflerin çoğunun endojen floresan sinyallerini söndürdür olduğu bulunmuştur18. Ek olarak, yetişkin kalbinin otofluoresans üreten bol miktarda heme grubu içeren proteinler nedeniyle temizlenmesi zordur19. Bu nedenle, bu protokolün amacı, in vivo 12 , 13,14,16,17,20'deoptimal3-B görselleştirme için yaralı yetişkin kalbinde heme otofluoresansının eşzamanlı inhibisyonu ile fibroblast belirteç floresanını korumaktı.

Kardiyak fibroblast in vivo'yu incelemeye çalışan önceki çalışmalar, bu hücreleri etiketlemek için perfüzyonlu antikorlar istihdam etti, ancak bu çalışmalar antikor penetrasyonu ve kardiyak vasküler yapı ile sınırlıydı14,16,17,20. Salamon ve arkadaşları yenidoğan kalbinde topikal nöronal floresan bakımı ile doku temizleme göstermiş olsalar da ve Nehrhoff ve diğerleri miyeloid hücreleri işaretleyen floresanların bakımını göstermiş olsalar da, yetişkin kardiyak fibroblastların taban çizgisine görselleştirilmesi veya yaralanmanın ardından13,20. Bu doku temizleme protokolü, CLARITY yöntemine (berrak lipid ile değiş tokuş edilen akrilamid-hibrid sert Görüntüleme/immünostaining/in situ-hibridizasyon uyumlu doku hidrojel) ve PEGASOS (polietilen glikol (PEG) ilişkili çözücü sistemi) temel alınarak önceki protokollerin bir karışımını rafine eder. Bu rafine protokol, fare kalbindeki kardiyak fibroblastların taban çizgisine ve farklı yaralanma türlerine nasıl tepki verdiklerine dair daha sağlam bir incelemeye izin verdi. Protokol basit ve tekrarlanabilir ve in vivo kardiyak fibroblastların davranışını karakterize etmenize yardımcı olacaktır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cincinnati Çocuk Hastanesi Tıp Merkezi'nde fareleri içeren tüm deneyler Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı. Kurum aynı zamanda AAALAC (Amerikan Laboratuvar Hayvanları Bakımı Akreditasyon Derneği) sertifikalıdır. Fareler servikal çıkık yoluyla ötenaziye tabi tökezlendi ve sağkalım cerrahi prosedürlerinden geçen farelere ağrı kesici verildi (aşağıya bakınız). Ağrı yönetimi ve ötenazi için kullanılan tüm yöntemler, Amerikan Veteriner Hekimleri Birliği Ötanazi Paneli'nin önerilerine dayanmaktadır. Tüm fareler, her zaman su ve yiyecek içeren mısır koçani yatak ünitelerinde barındırıldı. Fareler aynı cinsiyete sahip bir kafese 4'e yerleştirildi. Ameliyat veya yaralanmamış doku temizleme için eşit sayıda 6-8 haftalık erkek ve dişi fareler kullanıldı.

NOT: Tüm ameliyatlarda steril cerrahi durumlar sürdürülmektedir. Cerrah temiz önlük ve steril bir gece elbisesi ve sonra donned ayakkabı örtüleri ve bir saç teli haline döndü. Cerrah daha sonra ellerini klorheksidin ile temizledi ve steril cerrahi eldivenler giydi. Cerraha, kesi bölgesini her biri 3 kez sakinleştirici, tıraş eden ve ovarak% 2 klorohexidin glukokonat ve% 70 izopropanol arasında değişen bir teknisyen yardımcı oldu. Fareler daha sonra cerraha getirildi ve ameliyat yapıldı. Hayvanlar arasında, aletler boncuk sterilizatörde sterilize edildi.

1. Cre rekombinasyonu

  1. Çapraz Rosa26-loxP-eGFP fareler (Rosa26-nLacZ [FVB. Cg-Gt(ROSA)26Sortm1 (CAG-lacZ,-EGFP)Glh/J]) tcf21-MerCreMer fareleri ile (Şekil 1A)6,21.
  2. Bu haçın yavruları 6 haftalık olduğunda, mısır yağında çözünmüş 75 mg / kg tamoksifen intraperitoneal enjeksiyonu uygular. 22 Bu tamoksifen'i iki kez, 48 saat arayla yönetin (Şekil 1B).
  3. Tamoksifen enjeksiyonlarından sonra, fareleri bir hafta boyunca tamoksifen gıda (~0.4 g / kg tamoksifen sitrat) diyetine koyun. Bir haftalık tamoksifen chow'dan sonra, fareleri ameliyat yapmadan önce bir hafta boyunca normal bir otoklavlı yemek diyetinedöndürün (Şekil 1B). Yaralanmamış kontroller için uygun sayıda fare (cerrahi durum başına 3) belirleyin. Bu fareleri kurban edin ve bir haftalık normal yemek diyetini takiben aşağıda açıklanmış temizleme işlemine devam edin.
  4. Tamoksifen rejimi ve rekombinasyonu takiben ameliyat yapın.

2. Cerrahi modeller

  1. İskemi/reperfüzyon (I/R)23,24
    1. Havalandırılan bir kutuda oda havasında% 1,5 izofluran gazı ile fareleri uyuşturmak; göğüslerini ve boyunlarını elektrikli makaslarla tıraş edin ve tıraş edilen bölgeleri% 2 klorheksidin glukozat ıslatılmış bir çubukla ovalayın.
    2. Yatıştırıcı farelerin gözlerine merhem koyarak ameliyat sırasında kuruluğu önlemek için yapay gözyaşı merhem kullanın.
    3. Trakeanın görselleştirilmesini sağlamak için cerrahi makas kullanarak orta boyunlu bir kesim gerçekleştirin. Entübasyon tüpünü nefes borusuna yerleştirerek 20 gr kateter ile entübe edin ve trakeal kateteri orta boyun kesiğinden görselleştirin. Fareleri izofluran gazı ile sakinleştirilirken bir ventilatöre yerleştirin (%1,5) oda havasında.
    4. Cerrahi makasla sol ön uzvun altından bir kesi yapın ve kaburgalar arasındaki interkostal kasları 3 ile 4 arasında kesin. Kaburgaları bir retraktör kullanarak açın.
    5. Akciğerin zarar görmesini önlemek için akciğer ve kalp arasına tuzlu suya batırılmış küçük bir sünger yerleştirin.
    6. Balık kancası iğnesi (6,5 mm, 3/8 c) kullanarak, sol koroner arteri 8-0 kullanarak serbest bırakılabilir bir kayma düğümü ile bağlayın eğilimli.
    7. Süngeri eleps kullanarak çıkarın.
    8. 4-0 örgülü ipek ve sürekli bir dikiş kullanılarak kapatılan interkostal kasları dikerken, 8-0'ın sonunu da dışladı prolene kayma düğümü.
    9. Tıkayıcı kayma düğümü çıkıntısının ucuyla topikal doku yapıştırıcısı kullanarak cilt kesilerini kapatın.
    10. Bir saatlik tıkanıklık sonrası, koroner arter tıkanıklığını dahili olarak serbest bırakmak için kayma düğümün dış ucunu çekin, iskemiyi hafifletin ve reperfüzyona neden olabilir.
    11. Ağrı kesici olarak subdermal enjeksiyon (72 h salınım) yoluyla 1 mg / mL genişletilmiş salınım buprenorfin 0.02 mL'yi verin ve fareleri diğer hayvanlardan ayrı olarak 37 ° C'de oksijenli bir inkübasyon odasına yerleştirin. Fareleri anesteziden kurtulana ve sternal veya oturma pozisyonunu koruyabilene kadar en az 15 dakikada bir izleyin. Fareleri normal konutlarına geri döndürün.
    12. Ameliyattan sonra hayvanları 48 saat boyunca ağrı ve sıkıntı açısından değerlendirin ve kesi bölgesini tamamen iyileşene kadar günlük olarak izleyin.
    13. Kurban edilene kadar ameliyattan sonra hidrasyon, beslenme ve genel refah için fareleri gözlemleyin.
  2. Miyokard enfarktüsü (MI)25,26,27
    1. 2.1.1–2.1.7 adımlarını gerçekleştirin.
    2. 4-0 örgülü ipek kullanarak interkostal kasları kapatmak için sürekli bir dikiş kullanın.
    3. Topikal doku yapıştırıcısı kullanarak cilt kesisini kapatın.
    4. 2.1.11–2.1.13 adımlarını gerçekleştirin.
  3. Anjiyotensin II/fenilefrin mikro-ozmotik pompa infüzyonu
    1. Hazırlanın Steril koşullar altında 10 μg/μL anjiyotensin II ve fenilefrin 500 μg/μL çalışma çözeltisi hazırlayın (yani, laminer akış davlumbazında) 100 μL'ye 100 μL steril fosfat tamponlu salin (PBS) ve 500 μL PBS'ye 250 mg fenilefrin hidroklorür ekleyerek.
    2. Fare ağırlığına göre mikro ozmotik pompaya dağıtmak için her çalışma çözeltisinin seyreltilmesini ve son hacmini hesaplayın.
      NOT: Örneğin, 20 g fare 20 g x 14 gün x 1,5 μg/gün = 420 μg anjiyotensin veya 42 μL çalışma çözeltisinin yanı sıra 20 g x 14 gün x 50 μg/gün = 14000 μg fenilefrin hidroklorür veya 28 μL çalışma çözeltisi gerektirir.
    3. Her farenin ağırlığı için, ilacın çalışma stoğunu steril PBS'de seyreltin ve mikro ozmotik pompaları (0,25 μL / s, 14 gün, yaklaşık 100 μL) 27 G iğne ve 1 mL şırınga kullanarak doldurun.
      NOT: Bu, farelere yerleştirildikten sonra 1,5 μg⭐g-1⭐gün-1 anjiyotensin II ve 50 μg⭐g-1⭐gün-1 fenilenfrin hidroklorür akış hızı üretecektir.
    4. Fareleri oda havası içeren havalandırılmış bir odada% 1.5 izofluran inhalasyonu (etkili olmak için) ile uyuşturun.
    5. Uyuşturuldu fareleri opine pozisyonunda steril bir cerrahi masaya yerleştirin ve izofluran gazı soluma ile anesteziyi koruyun (%1,5) burun konisi yoluyla.
    6. Ameliyat sırasında kuruluğu önlemek için hayvanın gözlerinde yapay gözyaşı merhem kullanın.
    7. Kürkü implantasyon bölgesinin üzerinde elektrikli saç kesme makası ile tıraş edin ve etanol ve steril bir bez kullanarak kesilecek alanı sterilize edin. Arkanın sağ yan tarafında, omuz bıçağının altında fare derisinin epidermal tabakasında cerrahi makasla küçük bir kesi (yaklaşık 1 cm) yapın. Minipump'ı yerleştirmek için cildi implantasyon alanına ve çevresine hafifçe germek için bir çift cerrahi makasın donuk taraflarını kullanın.
    8. Mikro ozmotik pompayı kesi içine yerleştirin ve pompayı cildin altına manuel olarak masaj yaparak farenin dorsal orta çizgisinin soluna fiziksel olarak manevra yapın.
    9. Konik nokta iğnesi ile 4-0 ipek kullanarak sürekli dikiş ile kesiği kapatın.
    10. Pompa implantasyonundan sonra, analjezi için subdermal enjeksiyon (72-h yavaş salınım) yoluyla 0,1 mg/kg vücut ağırlığı dozda yavaş salınım buprenorfin sürün. Fareleri diğer hayvanlardan ayrı olarak 37 ° C'de oksijenli bir kuluçka odasına yerleştirin. Fareleri anesteziden iyileşene kadar en az 15 dakikada bir izleyin ve sternal veya oturma pozisyonunu koruyabilir.
    11. 37 °C ısınma odasında anesteziden iyileştikten sonra, fareleri standart muhafaza birimlerine geri yerleştirin.
    12. Ameliyattan sonra fareleri 48 saat boyunca ağrı ve sıkıntı açısından izleyin ve kesi bölgesini tamamen iyileşene kadar günlük olarak izleyin.
    13. Kurban edilene kadar ameliyattan sonra hidrasyon, beslenme ve genel refah için fareleri gözlemleyin.

3. Değiştirilmiş bir aktif CLARITY protokolü kullanarak yetişkin fare kalplerini temizleme

  1. Ameliyat yüzeyini ve tüm cerrahi aletleri %70 etanol ile sterilize derek temiz bir cerrahi alan hazırlayın. PBS'de (her biri 100 mL) soğuk 1x PBS ve %4 paraformaldehit (PFA) çözeltisi hazırlayın. Eldiven, laboratuvar önlüğü, yüz maskesi ve göz koruması giyin.
  2. 10 ünite heparini %0,9 w/v sodyum klorür çözeltisinde seyrelterek heparin tamponu hazırlayın. Her fareye 1 mL şırınga ve 27 G iğne kullanarak 60 μL heparin-NaCl ile intraperitoneally enjekte edin.
  3. Heparin-NaCl çözeltisinin enjeksiyonundan beş dakika sonra, oda havası içeren havalandırılmış bir odada% 1.5 izofluran inhalasyonu (etkili olmak için) kullanarak fareleri uyuşturun.
  4. Fareleri servikal çıkık ile ötenazi, burada başın arkası düz, kapalı uçlu bir şekilde tutulur, omurilik sütunu ise kuyruğu çekerek çıkar.
  5. Farenin ventral yüzeyini pamuklu çubuk üzerinde% 70 etanol ile temizleyin. Cerrahi makas kullanarak xiphoid işleminin yaklaşık 3 cm altında 3 cm enine kesi yapın.
  6. Karnı xiphoid işlemine kadar degloving yaparak cildi alttaki karın duvarı dokusundan ayırın (kuyruğun en yakın derisini tutun ve başa en yakın cildi göğüs kafesine doğru çekin). Cerrahi makas kullanarak xiphoid işleminin 3 cm altında deri altı karın duvarı dokusunda 2 cm enine kesi yapın. Bu enine kesiden, orta çizgiden ve göğüs kafesinden dikey bir kesim yapın. Göğüs kafesini geriye sabitleyerek kalbi açığa çıkardı.
  7. Kalpteki kanı temizlemek için üstün vena kava ve aort içine soğuk PBS enjekte etmek için 27 G iğne ve 10 mL şırınga kullanın (kalbin herhangi bir pozisyonel manipülasyonu delinmeyi önlemek için künt tokalarla dikkatlice yapılmalıdır).
    NOT: Kuyruk seğirmesi ve akciğerlerin renk değişikliği ile yeterli perfüzyona dikkat edilebilir.
  8. Sabitleme işlemine başlamak için üstün vena kava ve aort içine soğuk% 4 PFA enjekte etmek için 27 G iğne ve 10 mL şırınga kullanın.
  9. Kalpleri genişletin. Atria, sağ ventrikül ve septum ve sol ventrikül düz bıçaklı neşter kullanılarak ayrılmalıdır. Bu dokuyu soğuk % 4 PFA ile dolu 15 mL santrifüj tüpüne yerleştirin ve bir gecede 4 ° C'de bir somun makinesine yerleştirin.
  10. Fazla PFA'yı çıkarmak için kalbi her biri 1 saat boyunca soğuk 1x PBS ile 3 kez yıkayın.
  11. Aşağıdaki kimyasalları 15 mL santrifüj tüpünde karıştırarak hidrojel (göreceli akrilamid/poliakrilamid bileşimi için A4P0 olarak ad verilen) hazırlayın: %40 akrilamid, %10 1x PBS, %80 damıtılmış suyun %10'u.
  12. Fotoinitiatörin %0,25'lik çözeltisini (2,2-Azobis[2-(2-imidazolin-2yl)propan)dihidroklorür) hidrojel çözeltisine kalbi hidrojene batırmaya hemen önce ekleyin.
  13. Kalbi hidrojel içeren konik bir tüpe yerleştirin. Konik tüpü folyoya sarın ve fiziksel rahatsızlık vermeden 4 °C'de gece boyunca kuluçkaya yatırın.
  14. 4 °C'de yaklaşık 14 saat sonra, kalbi içeren konik tüpü 37 °C boncuk banyosuna taşıyın.
  15. Boncuk banyosunda 2,5 saat sonra, kalbi hidrojelden dikkatliceps ile çıkarın.
  16. Kalpleri bir besleyici üzerinde 37 °C'de 1x PBS içeren 15 mL konik tüpte her biri 1 saat boyunca 3 kez yıkayın.
  17. Kalpleri, prosptikler kullanarak aktif elektroforezi makinesinin sepetine yerleştirin ve kapağı sepete yerleştirin. Kapağın güvenli bir şekilde yerinde olduğundan emin olun.
  18. Aktif elektroforezi odası haznesini, çözeltiyi odaya dökerek elektroforetik temizleme çözeltisi ile doldurun.
  19. Oda elektroforetik temizleme çözeltisi ile dolduğunda, kalbi içeren sepet suya batırılabilir. Kapağı elektroforezi makinesine güvenli bir şekilde yerleştirin.
  20. Elektroforezi makinesini 1,5 saat boyunca 1,5 A, 37 °C'de çalıştırın.
  21. 1,5 saat elektroforezi takiben, opak doku kalmadığından emin olmak için kalpleri görsel olarak kontrol edin. Dokunun bölgeleri hala opaksa, kalbi elektroforetik odadaki elektroforez çözeltisine yeniden batırın ve elektroforezise bir seferde 0,5 saat devam edin.
    NOT: Elektroforezi doku hasarının ilk belirtilerinde (doku yıpranması gibi) kesilmelidir.
  22. Kalpleri 1x PBS içeren 15 mL konik tüpte 1 saat boyunca, her biri 3 kez, bir besleyici üzerinde 37 °C'de yıkayın.
  23. Kalpleri N, N,N′,N′- Tetrakis(2-Hydroxypropyl)etilenediamin içeren 15 mL konik bir tüpe batırın- heme otoflorooresansını azaltan bir renksizleştirici ajan.
    NOT: Bu çözüm, kalpler tamamen temizleninceye kadar (yaklaşık 2 gün) her 24 saatte bir değiştirilmelidir.
  24. Fazla renksizleştirici maddeyi çıkarmak için kalpleri 1x PBS ile 15 mL konik bir tüpte 1 saat boyunca 3 kez yıkayın.
  25. 30 mL 0,02 M fosfat tamponu, 40 g 5-(N-2, 3-dihidroksipropylacetamido)-2, 4, 6-tri-iodo-N, N'-bis (2, 3 dihidroksipropil) karıştırmalı izoftalamid (tamamen çözülmelidir— bu bir saate kadar sürebilir), 5 mg sodyum azide, 50 μL Tween20 ve 1 g 1,4-diazabicyclo[2.2.2]oktan ve pH'ı 7.5'e ayarlayın.
  26. Görüntülemeden önce 48 saat boyunca RIMS'de kalpleri aşındırın.

4. Dik tek foton konfokal mikroskop kullanarak kalpleri görüntüleme

NOT: Görüntüleme aparatı, 10 cm'lik cam Petri kabının alt yarısından, 3D baskılı alt hazneden, yuvarlak cam kapaklıktan ve 3D baskılı üst hazneden(Şekil 1C–E)oluşur. Cincinnati Çocuk Hastanesi Klinik Mühendisliği Bölümü tarafından şirket içinde 3D baskılı malzemeler yapılmıştır.

  1. 3D baskılı parçanın altına ince bir vakum gresi tabakası koyarak 3D baskılı alt hazneyi cam petri kabına kapatmak için vakum gresi kullanın (Şekil 1C).
    NOT: Rezervuar, görüntülenen numuneyle aynı yükseklikte olmalıdır (yani, numune üzerine yerleştirilen cam kapak kapağı tarafından sıkıştırılmamalı ve numune ayrıca rezervuar içinde yüzdürülemez ve hareket ettirememelidir).
  2. Rezervuarı RIMS ile doldurun ve tüm kabarcıkları bir pipet ucuyla çıkarın. Sol ventrikül duvarı yukarı bakacak şekilde kalbi RIMS'e dikkatlice yerleştirin ve çözeltiye kabarcık sokulmamasını sağlayın.
  3. Vakum gresi kullanarak 3D baskılı üst rezervuar parçasının(Ek Şekil 1A)alt yüzeyine bir cam kapak kapağı yapıştırın (yine 3D baskılı parçanın üzerine ince bir vakum gresi tabakası yerleştirerek ve kapak kaymasına yerleştirerek) (Şekil 1D).
  4. Cam kapak ve üst rezervuarı, kapak tarafını aşağı, kabarcıkların sokulması olmadan alt rezervuarın üzerine(Ek Şekil 1B)yerleştirin. RIMS ve kapak kayması arasındaki yapıştırma, üst ve alt rezervuar parçaları arasında bir sızdırmazlık sağlayacaktır (Şekil 1E).
  5. 10x gliserol daldırma hedefi ile kullanmak için üst rezervuarı gliserol ile doldurun.
  6. Temizlenmiş kalpleri görüntülemek için multifon konfokal tarama kafası ile donatılmış tek bir foton mikroskobu kullanın.
  7. Tek foton mikroskopunun aşamasını kıtır ve numuneyi içeren Petri kabını sahnenin ortasına yerleştirin. Sahneyi kaldırın ve 10x gliserol daldırma hedefini numune aparatının üst rezervuarındaki gliserol içine diriltin. Göz merceği kullanarak numunenin kenarına bakarak numunenin odakta olduğundan emin olun.
  8. Canlı düğmeye tıklayarak göz merceği görünümünden bilgisayardaki kamera görünümüne geçin.
    1. Önce Petri kabının dibinde olması gereken doku örneğinin en geniş kısmını bularak X ve Y parametrelerini ayarlayın.
    2. ND Edinme ve özel çok nokta 'yatıklayın. Önce doku örneğinin ortasını bularak, joystick'i kullanarak soldan sağa ve yukarıdan aşağıya doğru süpürerek çok nokta oluşturun.
    3. Daha sonra, dokunun boyutuna bağlı olarak, gereken döşeme boyutunu belirleyin (tipik olarak 6-8 haftalık bir fare kalbi için 6 x 5). Bunu, dokunun tüm uzunluğunun ve genişliğinin yakalanıp yakalanmadığını kontrol etmek için yalnızca X ve Y parametrelerini (ND Edinme sekmesialtındaki z işaretini kaldırın) yakalayarak test görüntülemesini çalıştırarak yapın.
  9. z parametrelerini ayarlamak için XYZ gezintisiniaçın ve örneğin üst ve alt kısmını bulana kadar yukarı ve aşağı simgelerini tıklatın.
    1. Z yoğunluğu düzeltme panelini açın ve her z noktasında lazer gücünü artırarak veya azaltarak doku yoğunluğunu düzeltmek için dokunun üst, orta ve alt kısmındaki floresanları ayarlayın. Bunları, Z Yoğunluğu Düzeltme panelinin sağındaki ayarlanan oka tıklayarak ayarlayın.
    2. ND Edinme panelinde Z adım boyutunu 5 μm olarak ayarlayın.
  10. Kalbin X, Y ve Z parametreleri belirlendikten ve z-yoğunluk düzeltmesi ayarlandıktan sonra, temizlenmiş kalpleri görüntülemek için rezonans tarayıcı ve galyum arsenit fosfit fotomultiplier tüpler (GaAsP PMT' ler) ile 10x gliserol daldırma hedefine sahip otomatik dik mikroskobu kullanın. XY ve Z sekmelerinin ND alımıaltında işaretli olduğundan emin olun ve Z Düzeltmeyi Çalıştır 'abasın.
  11. İşleme yazılımındaki çok noktalı görüntüyü açarak ve dikiş düğmesine tıklayarak elde edilen görüntüleri dikin, karıştırın ve denoize edin. Resimaltında, kör karıştırma, 2 kanalve sonra bulunüzerine tıklayın. ve Resimaltında, denoise.aitıklayın, ardından floresan tercih kanalına (örneğin, GFP)tıklayın.
    NOT: Bu işlem, sol ventrikülde GFP pozitif fibroblastların 3D görüntüsüyle sonuçlanır.
  12. Kardiyak fibroblastların dağılımındaki kalıpları ve eğilimleri daha fazla tanımlamak için ikincil analiz yazılımını kullanın. Noktalar sihirbazı programını çalıştırarak Noktalar işlevini kullanın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kardiyak fibroblastlar kalbin temel fonksiyonu ve kalp hasarına yanıt için gereklidir. Bu hücrelerin düzenini ve morfolojisini anlamaya yönelik önceki girişimler büyük ölçüde 2-B ortamlarda gerçeklenmiştir. Bununla birlikte, kardiyak fibroblastların ileri, daha ayrıntılı görselleştirilmesini sağlayan rafine bir kardiyak doku temizleme (Şekil 2) ve 3-B görüntüleme tekniği yayınlanmıştır. Bu görüntüleme tekniği ile fibroblastların yoğun olarak paketlenmiş ve yaralanmamış kalplerde iğdelenmiş m...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makale, fare kalbindeki fibroblastları karakterize etmek ve daha iyi anlamak için hem taban çizgisi hem de yaralanmayı takiben in vivo kardiyak fibroblastların görselleştirilmesine izin veren doku temizleme için rafine bir yöntem sunmaktadır. Bu gelişmiş protokol, yetişkin veya yenidoğan kalbindeki belirli hücre tiplerini tanımlamaya çalışan mevcut doku temizleme protokollerindeki sınırlamaları ele12 , 13,14,16

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların bu makalenin içeriği ile ilgili herhangi bir açıklaması bulunmamaktadır.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, bu modelin geliştirilmesinde yardımları ve rehberlikleri için CCHMC Confocal Imaging Core'un yanı sıra tüm 3D baskılı parçaların tasarımı için Klinik Mühendislik'ten Matt Batie'yi kabul etmek istiyor. Demetria Fischesser Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden (NHLBI, T32 HL125204) ve Jeffery D. Molkentin Howard Hughes Tıp Enstitüsü tarafından desteklendi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
4-0 örgülü ipekEthiconK871H
8-0 proleneEthicon8730H
%40 Akrilamid SolüsyonuBio-Rad1610140
Anjiyotensin IISigmaA9525-50G
Yapay Gözyaşı MerhemiCovetrus048272
DABCO (1,4-diazabisiklo [2.2. 2] oktan)Millipore SigmaD27802-25G
GLUture topikal doku yapıştırıcısıHeparin503763
Aletler SigmaH0777
Imaris Start Analiz YazılımıOxford Instruments N/A
pompalarAlzetModel 1002
Nikon Elements Analiz YazılımıNikonN/A
Nikon A1R HD dik mikroskopNikonN/A
Normal otoklavlı chowLabdiet5010
Nycodenz, 5- (N-2, 3-dihidroksipropilaminamido)-2, 4, 6-tri-iyodo-N,
N'-bis (2, 3 dihidroksipropil) izoftalamid		CosmoBioAXS-1002424
ParaformaldehitElektron Mikroskobu Bilimleri15710
Fenilefrin HidroklorürSigmaP6126-10G
Foto BaşlatıcıWako KimyasallarıVA-044
Rosa26-nLacZ [FVB. Cg-Gt (ROSA) 26Sortm1 (CAG-lacZ, -EGFP) Glh / J ]Jackson LaboratuvarlarıJax Stok No: 012429
Sodyum AzidSigma AldrichS2002-5G
Sodyum Klorür çözeltisiHospira, Inc.NDC 0409-4888-10
TamoksifenSigma AldrichT5648
Tamoksifen gıdaEnvigoTD.130860
Ara-20Thermo Fisher ScientificBP337-500
Quadrol, N, N, N ve prime;, N ve prime;-Tetrakis (2-Hidroksipropil) etilendiamin, renk giderici ajanMillipore Sigma122262-1L
X-Clarity elektroforetik temizleme odasıLogos BiosystemsC30001
X-Clarity elektroforetik temizleme çözeltisiLogos BiosystemsC13001
X-Clarity elektroforez doku sepetiLogos BiosystemsC12001
X-Clarity elektroforez doku sepeti tutucuLogos BiosystemsC12002
Dünya Hassas Mikro-ozmotik

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nagaraju, C. K., et al. Myofibroblast phenotype and reversibility of fibrosis in patients With end-stage heart failure. Journal of the American College of Cardiology. 73 (18), 2267-2282 (2019).
  2. Yoon, S., Eom, G. H. Heart failure with preserved ejection fraction: present status and future directions. Experimental and Molecular Medicine. 51 (12), 1-9 (2019).
  3. Borlaug, B. A., Redfield, M. M. Diastolic and systolic heart failure are distinct phenotypes within the heart failure spectrum. Circulation. 123, 2006-2014 (2011).
  4. Ivey, M. J., Tallquist, M. D. Defining the cardiac fibroblast. Circulation Journal. 80 (11), 2269-2276 (2016).
  5. Fu, X., et al. Specialized fibroblast differentiated states underlie scar formation in the infarcted mouse heart. Journal of Clinical Investigation. 128 (5), 2127-2143 (2018).
  6. Kanisicak, O., et al. Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart. Nature Communications. 7, 12260(2016).
  7. Sadeghi, A. H., et al. Engineered 3D cardiac fibrotic tissue to study fibrotic remodeling. Advanced Healthcare Materials. 6 (11), 1601434(2017).
  8. Nam, Y. J., et al. Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors. Development. 141 (22), 4267-4278 (2014).
  9. Bruns, D. R., et al. The right ventricular fibroblast secretome drives cardiomyocyte dedifferentiation. PLoS One. 14 (8), 0220573(2019).
  10. Skiöldebrand, E., et al. Inflammatory activation of human cardiac fibroblasts leads to altered calcium signaling, decreased connexin 43 expression and increased glutamate secretion. Heliyon. 3 (10), 00406(2017).
  11. Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the pegasos method. Cell Research. 28, 803-818 (2018).
  12. Kolesová, H., Čapek, M., Radochová, B., Janáček, J., Sedmera, D. Comparison of different tissue clearing methods and 3D imaging techniques for visualization of GFP-expressing mouse embryos and embryonic hearts. Histochemistry and Cell Biology. 146 (2), 141-152 (2016).
  13. Salamon, R. J., Zhang, Z., Mahmoud, A. I. Capturing the cardiac injury response of targeted cell populations via cleared heart three-dimensional imaging. Journal of Visualized Experiments. (157), (2020).
  14. Wang, Z., et al. Imaging transparent intact cardiac tissue with single-cell resolution. Biomedical Optics Express. 9 (2), 423-436 (2018).
  15. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
  16. Yokoyama, T., et al. Quantification of sympathetic hyperinnervation and denervation after myocardial infarction by three-dimensional assessment of the cardiac sympathetic network in cleared transparent murine hearts. PLoS One. 12 (7), 0182072(2017).
  17. Perbellini, F., et al. Free-of-Acrylamide SDS-based Tissue Clearing (FASTClear) for three dimensional visualization of myocardial tissue. Scientific Reports. 7, 5188(2017).
  18. Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32, 713-741 (2016).
  19. Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159, 911-924 (2014).
  20. Nehrhoff, I., et al. 3D imaging in CUBIC-cleared mouse heart tissue: going deeper. Biomedical Optics Express. 7 (9), 3716-3720 (2016).
  21. Yamamoto, M., et al. A multifunctional reporter mouse line for Cre- and FLP-dependent lineage analysis. Genesis. 47 (2), 107-114 (2009).
  22. Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: Routes of administration and factors to consider. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50 (5), 600-613 (2011).
  23. Means, C. K., et al. Sphingosine 1-phosphate S1P2 and S1P3 receptor-mediated Akt activation protects against in vivo myocardial ischemia-reperfusion injury. American Journal of Physiology - Heart and Circuatory Physiology. 292 (6), 2944-2951 (2007).
  24. Michael, L. H., et al. Myocardial ischemia and reperfusion: A murine model. American Journal of Physiology - Heart and Circuatory Physiology. 269 (6), 2147-2154 (1995).
  25. Ahn, D., et al. Induction of myocardial infarcts of a predictable size and location by branch pattern probability-assisted coronary ligation in C57BL/6 mice. American Joural of Physiology: Circulatory Physiology. 286 (3), 1201-1207 (2004).
  26. Patten, R. D., et al. Ventricular remodeling in a mouse model of myocardial infarction. American Journal of Physiology - Heart and Circuatory Physiology. 274 (5), 1812-1820 (1998).
  27. Gao, X. M., Dart, A. M., Dewar, E., Jennings, G., Du, X. J. Serial echocardiographic assessment of left ventricular dimensions and function after myocardial infarction in mice. Cardiovascular Research. 45 (2), 330-338 (2000).
  28. Vagnozzi, R. J., et al. An acute immune response underlies the benefit of cardiac stem cell therapy. Nature. 577, 405-409 (2020).
  29. Sengupta, P. P., Tajik, A. J., Chandrasekaran, K., Khandheria, B. K. Twist mechanics of the left ventricle. Principles and application. Journal of the American College of Cardiology: Cardiovascular Imaging. 1 (3), 366-376 (2008).
  30. Arts, T., et al. Macroscopic three-dimensional motion patterns of the left ventricle. Advances in Experimental Medicine and Biology. 346, 383-392 (1993).
  31. Willems, I. E. M. G., Havenith, M. G., De Mey, J. G. R., Daemen, M. J. A. P. The muscle actin-positive cells in healing human myocardial scars. American Journal of Pathology. 145 (4), 868-875 (1994).
  32. Hashmi, S., Al-Salam, S. Acute myocardial infarction and myocardial ischemia-reperfusion injury: A comparison. International Journal of Clinical Experimental Pathology. 8, 8786-8796 (2015).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Tissue ClearingCardiac FibroblastsCLARITY ProtocolThree Dimensional ImagingMouse HeartCardiac InjuryConfocal MicroscopyFibrosis ModelElectrophoretic ClearingFluorescent Labeling

İlgili makaleler