Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Drosophila Hücrelerinde Çekirdek içi Hi-C

4.4K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/62106

⸱

15 Eylül 2021

 ,  ,  , 
1Departamento de Genética Molecular, Instituto de Fisiología Celular, Universidad Nacional Autónoma de México

Bu makalede

Özet

Genom, nükleer uzayda kromozom konformasyon yakalama teknolojileri ile ortaya sunulabilen farklı yapılara düzenlenmiştir. Çekirdek içi Hi-C yöntemi, Drosophila hücre hatlarında, kısıtlama parçası düzeyinde megabase çözünürlükte keşfedilebilen temas haritaları üreten, genom çapında bir kromatin etkileşimi koleksiyonu sağlar.

Özet

Genom, etki alanları arasındaki etkileşimleri yalıtlayan sınırlarla sınırlandırılmış topolojik olarak ilişkili etki alanları (TAD' ler) halinde düzenlenmiştir. Drosophila'da TAD oluşumu ve sınırlarının altında kalan mekanizmalar halen araştırılmaktadır. Burada açıklanan çekirdek içi Hi-C yönteminin uygulanması, Çentik genini izole eden TAD sınırlarında mimari protein (AP) bağlayıcı bölgelerin işlevinin parçalanarak parçalanmasına yardımcı oldu. APS kaybına neden olan etki alanı sınırlarının genetik modifikasyonu TAD füzyonu, transkripsiyon kusurları ve uzun menzilli topolojik değişikliklerle sonuçlanır. Bu sonuçlar, Drosophila'da genetik elementlerin etki alanı sınır oluşumuna ve gen ekspresyon kontrolüne katkısını gösteren kanıtlar sağlamıştır. Burada, protokolle birlikte deneyin kalitesini değerlendirmek için önemli kontrol noktaları sağlayan çekirdek içi Hi-C yöntemi ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Ayrıca, farklı genomik ölçeklerdeki genomik etkileşimleri analiz etmek için gerekli sayıda sıralama okuması ve geçerli Hi-C çiftleri gösterilmiştir. CRISPR/Cas9 aracılı genetik düzenleme düzenleyici unsurların ve bu çekirdek içi Hi-C protokolü kullanılarak genomik etkileşimlerin yüksek çözünürlüklü profillenmesi, genetik elementlerin yapısal işlevinin araştırılması için güçlü bir kombinasyon olabilir.

Giriş

Ökaryotlarda, genom, ara faz1sırasında nükleer alandaki belirli bölgeleri işgal eden kromozomlara bölünür. Kromozomları oluşturan kromatin iki ana hale ayrılabilir: biri transkripsiyonel olarak izin verilen erişilebilir kromatin ve diğeri transkripsiyonel olarak baskıcı olan kompakt kromatin. Bu kromatin durumları nükleer uzayda ayrışır ve nadiren karışır, çekirdekte iki ayrı bölme oluşturur2. Alt megabase ölçeğinde, sınırlar, kromozomal kuruluş3,4,5'i işaretleyen TAD adı verilen yüksek frekanslı kromatin etkileşimlerinin etki alanlarını ayırır. Memelilerde, TAD sınırları cohesin ve CCCTC bağlayıcı faktör (CTCF)6,7,8tarafından işgal edilir. Cohesin kompleksi kromatin ekstrüzyonları ve kararlı kromatin döngüleri oluşturmak için genomik dizideki yakınsak bir yönde bertaraf edilen CTCF bağlayıcı bölgelerde durur9,10,13,14. CTCF DNA bağlayıcı bölgenin sınırlarda genetik bozulması veya CTCF ve cohesin protein bolluğunda azalma, düzenleyici elementler arasında anormal etkileşimlere, TAD oluşumu kaybına ve gen ekspresyon deregülasyonuna neden olur9,10,11,13,14.

Drosophila'da, TAD'ler arasındaki sınırlar, sınır elemanı ile ilişkili faktör 32 kDa (BEAF-32), Motif 1 bağlayıcı protein (M1BP), centrosomal protein 190 (CP190), kıllı kanadın baskılayıcısı (SuHW) ve CTCF dahil olmak üzere çeşitliAP'ler tarafından işgal edilir ve aktif histone modifikasyonları ve Polymerase II16,17,18ile zenginleştirilir. Drosophila'da, TAD'lerin transkripsiyon13 , 17,19'unbir sonucu olarak ortaya çıktığı ve bağımsız AS'lerin sınır oluşumu ve yalıtım özelliklerindeki tam rolünün hala araştırıldığu ileri sürlenmiştir. Bu nedenle, Drosophila'daki etki alanlarının benzer transkripsiyon durumlarındaki bölgelerin toplanmasının tek sonucu olup olmadığı veya CTCF de dahil olmak üzere AP'lerin sınır oluşumuna katkıda bulunup bulunmadığı tam olarak karakterize olmaya devam etmektedir. Genomik temasların yüksek çözünürlükte araştırılması, kromozom konformasyon yakalama teknolojilerinin geliştirilmesi ve yeni nesil dizileme ile mümkün olmuştur. Hi-C protokolü ilk olarak kromatin parçaları arasında sahte ligasyon ürünlerini önlemek amacıyla "çözeltide"2 gerçekleştirilen ligasyon adımı ile tanımlanmıştır. Bununla birlikte, birkaç çalışma, verilerdeki yararlı sinyalin, çözelti20,21'deolmayan kısmen lile çekirdeklerinde oluşturulan ligasyon ürünlerinden geldiğinin farkına işaret etti.

Protokol daha sonra tek hücreli Hi-C deneyi22'ninbir parçası olarak çekirdeğin içindeki ligasyonu gerçekleştirmek için değiştirildi. Çekirdek içi Hi-C protokolü daha sonra tüm genomik mesafelerde daha tutarlı bir kapsama alanı sağlamak ve daha az teknik gürültü ile veri üretmek için hücre popülasyonuHi-C'yedahil edildi23,24. Burada ayrıntılı olarak açıklanan protokol, çekirdek içi Hi-C protokolü23,24'e dayanmaktadır ve CTCF ve M1BP için DNA bağlayıcı motiflerin Drosophila25'teki Çentik gen çekirgesinde bir etki alanı sınırından genetik olarak çıkarılmasının sonuçlarını araştırmak için kullanılmıştır. Sonuçlar, sınırdaki AP'ler için DNA bağlayıcı motiflerin değiştirilmesinin Çentik etki alanı oluşumu, Çentik çekirgesini çevreleyen bölgelerde daha büyük topolojik kusurlar ve gen ekspresyon deregülasyonu için büyük sonuçlar doğurdığını göstermektedir. Bu, etki alanı sınırlarındaki genetik elementlerin Drosophila25'tegenom topolojisinin ve gen ekspresyonunun sürdürülmesi için önemli olduğunu gösterir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Fiksasyon

  1. Oda sıcaklığında (RT) %10 fetal sığır serumu (FBS) içeren Schneider ortamında 17,5 mL hücre süspansiyonu hazırlamak için 10 milyon Schneider'ın hat 2 artı (S2R+) hücresiyle başlayın.
  2. Son konsantrasyonu% 2 elde etmek için metanol içermeyen formaldehit ekleyin. RT'de 10 dakika karıştırın ve kuluçkaya yatırarak her dakika karıştırmaya özen edin.
    NOT: Formaldehit tehlikeli bir kimyasaldır. Uygun sağlık ve güvenlik yönetmeliklerine uyun ve duman kaputunda çalışın.
  3. Son 0.125 M konsantrasyonunu elde etmek için glisine ekleyerek reaksiyonu söndür ve karıştırın. RT'de 5 dakika kuluçkaya yatır, ardından buzda 15 dakika.
  4. RT'de 5 dakika boyunca 400 × g ve ardından 4 °C'de 10 dakika santrifüj; üstnatant atın. Peletin 25 mL soğuk 1x fosfat tamponlu salin içinde dikkatlice yeniden depolanın.
  5. 4 °C'de 10 dakika boyunca 400 × g'da santrifüj, ardından süpernatantı atın.
    NOT: Protokole devam ediyorsanız, liziz için 2.1. aksi takdirde, peletin sıvı N2'de flaşla dondurulması ve peletin -80 °C'de saklanması.

2. Lizis

  1. Hücreleri 1 mL buz gibi lizis tamponunda (10 mM Tris-HCl, pH 8; iyonik olmayan yüzey aktif maddelerinin% 0,2'si (Malzeme Tablosunabakın); 10 mM NaCl; 1x proteaz inhibitörleri) yeniden depolar ve hacmi buz gibi lizis tamponu ile 10 mL'ye ayarlayın. 1 × 106 hücre/mL konsantrasyon elde etmek için hacmi ayarlayın. Tüpleri ters çevirerek her 2 dakikada bir karıştırarak 30 dakika buz üzerinde kuluçkaya yatırın.
  2. Çekirdeği 300 × g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüj edin ve ardından süpernatantı dikkatlice atın. Pelezi 1 mL soğuk lizis tamponu ile 1x yıkayın ve bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Peletin 1x'ini 1 mL soğuk 1,25x kısıtlama tamponu ile yıkayın ve her hücre peletini 360 μL 1,25x kısıtlama tamponunda yeniden depola.
  3. Tüp başına 11 μL sodyum dodecyl sülfat (SDS) ekleyin (%0,3 son konsantrasyon), pipetleme ile dikkatlice karıştırın ve 37 °C'de 45 dakika boyunca kuluçkaya yatırarak 700-950 rpm'de sallayın. Kuluçka sırasında birkaç kez kümelenmeyi bozmak için yukarı ve aşağı boru.
  4. Tüp başına 75 μL iyonik olmayan yüzey aktif madde (%10 çözelti, bkz. Malzeme Tablosunabakın) ekleyerek SDS'yi söndürün (%1,6 son konsantrasyon) ve 37 °C'de 45 dakika boyunca kuluçkaya yatırın, 950 rpm'de sallayarak. Kuluçka sırasında kümelenmeleri bozmak için birkaç kez yukarı ve aşağı borulayın.
    NOT: Kümeler büyükse ve bozulması zorsa, SDS ve yüzey aktif madde tedavileri sırasında dönme hızını 400 rpm'ye düşürün. Kümeler pipetleme ile ayrılması zorsa, örneği ikiye bölün; kısıtlama arabelleği, SDS ve yüzey aktif madde birimlerini ayarlayın; ve permeabilizasyona devam edin. Daha sonra, çekirdeği minimum hızda döndürün (200 × g),süpernatant'ı dikkatlice atın, örnekleri 1X kısıtlama tamponunda bir araya gelin ve sindirime devam edin. Sindirilmemiş örnek (UD) olarak 10 μL aliquot alın.

3. Enzymatic sindirim

  1. Tüp başına 200 birim (U) Mbo I ekleyerek kromatin sindirin ve dönerken 4 saat ile geceleme (950 rpm) arasında değişen bir süre boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
  2. Ertesi gün, tüp başına ek 50 U Mbo I ekleyin ve dönerken 2 saat boyunca 37 °C'de kuluçkaya yaslanın (950 rpm).
  3. Tüpleri 60 °C'de 20 dakika kuluçkaya yatırarak enzimi inaktive edin. Tüpleri buza yerleştirin.
    NOT: Sindirilen örnek (D) olarak 10 μL aliquot alın.

4. DNA'nın biyotinilasyonu sona erer

  1. Kısıtlama parçası çıkıntılarını doldurmak ve DNA uçlarını biotin ile etiketlemek için, 10 mM dCTP, dGTP, dTTP, 20 μL 0,4 mM biotin dATP'nin her birini 1,5 μL ekleyin, Tüm tüplere 17,5 μL Tris düşük EDTA (TLE) tamponu [10 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, pH 8,0] ve 5 U/μL'nin 10 μL'si (DNA polimeraz I büyük parça). Dikkatlice karıştırın ve 37 °C'de 75 dakika kuluçkaya yatır. 30 sn boyunca her 10 s'de 700 rpm'de sallayın. Ligasyon karışımını hazırlarken tüm tüpleri buza yerleştirin.

5. Ligasyon

  1. Sindirilen her kromatin karışımını ligasyon karışımı (100 μL 10x ligasyon tamponu, 10 μL 10 mg/mL sığır serum albümini, 15 U T4 DNA ligazı ve 425 μL çift damıtılmış su [ddH2O]) ile ayrı bir 1 mL tüpe aktarın. Hafif pipetleme ile iyice karıştırın ve 16 °C'de gece boyunca kuluçkaya yatırın.

6. Crosslink ters çevrilmesi ve DNA saflaştırması

  1. Tüp başına 50 μL 10 mg/mL Proteinaz K ekleyerek proteinleri bozun ve 2 saat boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatırın. Sıcaklığı 65 °C'ye artırarak çapraz bağlantıları ters çevirin ve bir gecede kuluçkaya yatırın.
  2. 10 mg/mL RNase A'nın 20 μL'si eklenerek RNA'yı bozun ve 1 saat boyunca 37 °C'de kuluçkaya yaslanın.
  3. Fenol:kloroform ekstraksiyonu ve ardından etanol çökelterek gerçekleştirin.
    1. 1 hacim fenol-kloroform ekleyin ve homojen bir beyaz faz elde etmek için ters çevrilerek iyice karıştırın.
      NOT: Fenol tehlikeli bir kimyasaldır. Uygun sağlık ve güvenlik yönetmeliklerine uyun. Duman kaputunda çalış.
    2. 15 dakika boyunca 15.000 × g'da santrifüj. Sulu fazı taze bir 2 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın. 100 μL TLE tamponu ile alt katmanın geri ekstraksiyonu gerçekleştirin ve sulu fazı aynı 2 mL tüpe aktarın.
    3. 2 cilt %100 etil alkol (EtOH), 0,1 cilt 3 M sodyum asetat ve 2 μL 20 mg/mL glikojen ekleyerek DNA'yı çökeltin. -20 °C'de 2 saat ile bir gece arasında değişen bir süre kuluçkaya yatırın.
    4. 4 °C'de 30 dakika boyunca 15.000 × g'da dön ve peletleri buz gibi % 70 EtOH ile 2x yıkayın. Peletleri RT'de kurutun ve 100 μL TLE tamponunda yeniden dirildi. Üreticinin talimatlarına göre DNA'ya ve florometreye seçici olarak bağlanan florojenik bir boya kullanarak DNA'yıölçün( Malzeme Tablosu ).
      NOT: Protokol burada duraklatılabilir. Ligasyon ürünlerini kısa vadede 4 °C'de veya uzun vadede -20 °C'de saklayın. Kalite kontrolü için liglenmiş numune (L) olarak malzemeden bir aliquot (100 ng) kullanın.

7. Hi-C şablon kalitesini değerlendirin

  1. Sindirim ve ligasyon nitel kontrolleri
    1. Çapraz bağlantıları tersine çevirerek DNA'yı UD ve D aliquotlardan arındırın ve yukarıda açıklandığı gibi fenol:kloroform ekstraksiyonu ve etanol çökeltme gerçekleştirin.
    2. %1,5 agarose jel içinde 100 ng UD, D ve L örnekleri yükleyin. D örneğinde yaklaşık 500 bp merkezli bir smear ve L örneği için yüksek moleküler ağırlık bandı arayın (bkz. temsili sonuçlar).
  2. Sindirim verimliliği nicel kontrolü
    NOT: Sindirim verimliliğini daha doğru değerlendirmek için, aşağıdaki gibi tasarlanmış astarları kullanarak nicel polimeraz zincir reaksiyonları (qPCR) gerçekleştirmek için UD ve D örneklerini şablon olarak kullanın.
    1. 7.2.3 adımındaki formülde R adı verilen sindirim için kullanılan enzim için DNA kısıtlama bölgesini içeren bir DNA parçasını (mevcut protokoldeki Mbo I) içeren bir astar çifti tasarlayın.
    2. 7.2.3 adımındaki formülde C adı verilen, sindirim için kullanılan enzim için kısıtlama bölgesini içermeyen bir kontrol DNA parçasını (mevcut protokol için Mbo I) içeren bir astar çifti tasarlayın.
    3. Aşağıda gösterilen formüle göre kısıtlama verimliliğini hesaplamak için amplifikasyonun döngü eşiği değerlerini (Ct değerleri) kullanın:
      Kısıtlama yüzdesi = 100 - 100/2{(ctr - ctc)d - (ctr - ctc)ud}
      Burada ToR, R parçasının Ct değerini, CtC ise örnek D ve örnek UD için C parçasının Ct değerini ifade eder.
      NOT: Kısıtlama yüzdesi, kısıtlama DNA'sını içermeyen bir kontrol (C) DNA parçasına kıyasla kısıtlı (R) DNA parçasını parçalayan kısıtlama enziminin verimliliğini yansıtır. %80'≥ bir kısıtlama verimliliği önerilir.
  3. Bilinen etkileşimlerin algılanmasını
    1. Kısa ve/veya orta veya uzun menzilli etkileşimleri incelemek üzere dahili ligasyon kontrolünü güçlendirmek için PCR gerçekleştirin (bkz. temsili sonuçlar).
    2. Alternatif olarak, astarların bitişik kısıtlama parçalarında ileri veya geri-geri yönde olduğu bir ligasyon ürününü yükseltmek için astarlar tasarlayın.
  4. Doldurma ve biotin etiketleme kontrolü
    1. Yukarıda açıklandığı gibi, genomdaki bitişik kısıtlama parçaları arasında bilinen bir etkileşimin veya ligasyon ürününün amplifikasyonu ve sindirimi ile Hi-C işaretleme ve ligasyon verimliliğini doğrulayın.
      NOT: Mbo I sitesinin (GATC) başarılı bir şekilde doldurulması ve ligasyonu, ligasyon kavşağında Cla I (ATCGAT) kısıtlama enzimi için yeni bir site oluşturur ve Mbo I sitesini yeniler.
    2. PCR ürününü Mbo I, Cla I veya her ikisiyle de sindirin. Numuneleri% 1,5-2 jel üzerinde çalıştırdıktan sonra, kesim ve kesilmemiş bantların yoğunluğunu ölçerek 3C ve Hi-C ligasyon bağlantılarının göreli sayısını tahmin edin26.
      NOT: %70'> bir verimlilik istenmek istenmemektedir (bkz. temsili sonuçlar).

8. Sonication

  1. 200-500 bp DNA parçaları elde etmek için örnekleri sonicate edin. Bu protokolde kullanılan cihaz için (Bkz. Malzeme Tablosu),numuneyi (5 ila 10 μg) tüp başına 130 μL ddH2O'da seyreltin ve cihazı 400 bp'ye sonicate edecek şekilde ayarlayın: doldurma seviyesi: 10; görev faktörü: %10; tepe olay gücü (w): 140; patlama başına döngü: 200; zaman (lar): 80.

9. Biotin kaldırma / bitiş onarımı

NOT: Aşağıda gösterilen adımlar 5 μg Hi-C DNA'sı için ayarlanır.

  1. Biotin çıkarma işlemini gerçekleştirmek için, numuneyi (130 μL) taze bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. 16 μL 10x ligasyon tamponu, 2 μL 10 mM dATP, 5 μL T4 DNA Polimeraz (15U) ve 7 μL ddH2O (toplam hacim 160 μL) ekleyin. 20 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatır.
  2. 5 μL 10 mM dNTP, 4 μL 10x ligasyon tamponu, 5 μL T4 polinükleotid kinaz (10 U/μL), 1 μL Klenow ve 25 μL ddH 2 O (toplam hacim200μL) ekleyin. 20 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatır.

10. Boyut seçimi

  1. Parçaları çoğunlukla 250-550 bp boyut aralığında seçmek için, önce 0,6x ile sıralı katı faz geri dönüşümlü hareketsizleştirme (SPRI) boyut seçimi, ardından üreticinin talimatlarına göre 0,90x gerçekleştirin ve 100 μL TLE kullanarak DNA'yı ayıklayın.

11. Biotin çekme/ A-tailing / adaptör ligasyonu

NOT: Manyetik boncukları girdaplayarak yeniden oluşturarak yıkamaları gerçekleştirin, numuneleri dönen bir tekerlek üzerinde 3 dakika döndürün ve ardından numuneyi kısa bir süre aşağı döndürün ve manyetik standa yerleştirin. Boncukların mıknatısa yapışmasına izin verin, üst saltant atın ve aşağıdaki yıkama adımına devam edin. Yıkamaları 55 °C'de dönen tekerlek yerine dönme ile bir termo blok üzerinde gerçekleştirin.

  1. Çekme için TLE ile numune başına 300 μL'ye kadar son hacmi yaratın. Boncuk yıkama tamponlarını hazırlayın: 1x Ara Tampon (TB) (TB: 5 mM Tris-HCl pH 8.0, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl, %0,05 Ara), 0,5x TB, 1x Arasız Tampon (NTB) (5 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl), 2x NTB.
  2. Kütüphane başına 150 μL streptavidin bağlantılı manyetik boncuk kullanın (Bkz. Malzeme Tablosu). Boncukları 400 μL 1x TB ile 2x yıkayın. Daha sonra boncukları 300 μL 2x NTB'de yeniden ıslatır.
  3. Boncukları 300 μL Hi-C malzemesiyle karıştırın ve streptavidin boncuklarına biyotin bağlanmasına izin vermek için dönen bir tekerlek üzerinde 30 dakika RT'de kuluçkaya yatırın.
  4. Boncukları 400 μL 0,5x TB ile yıkayın ve 55 °C'de 3 dakika kuluçkaya yaslanın, 750 rpm'de döndürün. Boncukları 200 μL 1x kısıtlama tamponunda yıkayın.
  5. Boncukları 100 μL dATP kuyruk karışımında (5 μL 10 mM dATP, 10 μL 10x kısıtlama tamponu, 5 μL Klenow exo-ve 80 μL ddH2O) yeniden ıslatın. 37 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatır.
  6. Süpernatantı çıkarın, boncukları 3 dakika boyunca 55 °C'de inkübe ederek ve 750 rpm'de döndürerek 400 μL 0,5x TB ile 2x yıkayın.
  7. Boncukları 400 μL 1x NTB ve ardından 100 μL 1x ligasyon tamponu ile yıkayın.
  8. Boncukları 50 μL 1x ligasyon tamponunda yeniden ıslatır ve süspansiyonu yeni bir tüpe aktarın. 4 μL önceden tavlanmış PE adaptörü (15 μM stok) ve 2 μL T4 ligase (400 U/μL, yani 800 U/tüp) ekleyin; RT'de 2 saat kuluçkaya yatır.
    NOT: Hem PE 1.0 hem de PE 2.0 adaptörlerinin (30 μM stok) eşit hacimlerini ekleyerek ve RT'de 10 dakika kuluçkaya yatırarak adaptörleri önceden tavlama (Bkz. Malzeme Tablosu).
  9. Süpernatantları çıkararak ve boncukları 400 μL TB ile 2x yıkayarak boncukları yeniden yakalayın. Boncukları 200 μL 1x NTB ile yıkayın, ardından 100 μL 1x kısıtlama tamponu ile yıkayın ve boncukları 40 μL 1x kısıtlama tamponunda yeniden diriltin.

12. PCR amplifikasyonu

  1. 5, 6, 7 ve 8 döngülü 25 μL hacimli PCR'leri ayarlayın. Her PCR için şunları kullanın:
    Reaksiyon Tarifi
    Hi-C boncuklar2,5 μL
    10 μM PE PCR astar 1 (Malzeme Tablası)0,75 μL
    10 μM PE PCR astar 2 (Malzeme Tablası)0,75 μL
    10 mM dNTP0,6 μL
    5x reaksiyon tamponu5 μL
    DNA polimeraz0,3 μL
    ddH2O14,65 μL
    Toplam25 μL
    DöngüSıcaklıkSaat
    198 °C30 sn
    n döngüleri98 °C10 sn
    65 °C30 sn
    72 °C30 sn
    172 °C7 dk

13. Son PCR amplifikasyonu

  1. Yukarıda açıklanan koşulları ve seçilen döngü sayısını kullanarak son PCR amplifikasyonu gerçekleştirin. Numuneyi 50 μL reaksiyonlarda şablon olarak 5 μL Hi-C boncuk kullanarak bölün.
  2. Tüm PCR reaksiyonlarını toplayın ve yeni bir tüpe aktarın. Streptavidin boncuklarını çıkarmak ve süpernatant (PCR ürünleri) kurtarmak için mıknatısı kullanın. Boncukları taze bir tüpe aktarın, boncukları adım 11.2.9'da belirtildiği gibi yıkayın ve yedek olarak 4 °C'de 1x kısıtlama tamponunda saklayın.
  3. Üreticinin talimatlarına göre SPRI boncuklarının hacminin 0,85 katını kullanarak PCR ürünlerini arındırın. 30 μL TLE tamponu ile elute.
  4. Hi-C kütüphanesini florometrik bir alet kullanarak ölçün ve çip bazlı kılcal elektroforez ile kütüphanenin kalitesini onaylayın.
  5. Son kalite kontrol noktası olarak, 12.1 adımında açıklanan koşulları kullanarak 10 döngü kullanarak PCR reaksiyonsu gerçekleştirmek için şablon olarak Hi-C kitaplığının 1 μL'sini kullanın. PCR ürününü iki mikrosantrifüj tüpüne bölün: birini Cla I ile sindirin ve diğerini kontrol olarak sindirilmemiş bırakın. Ürünleri% 1.5-2 agarose jelde çalıştırın (bkz. temsili sonuçlar).
  6. Uygun bir sıralama platformunda 50 bp veya 75 bp eşleştirilmiş uç sıralamaya geçin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Aşağıda başarılı bir Hi-C protokolünün sonuçları açıklanmıştır (Şekil 1A'dakiHi-C protokolü iş akışının özetine bakın). Çekirdek içi Hi-C deneyi sırasında çeşitli kalite kontrol noktaları vardır. Örnek aliquots önce (UD) ve sonra (D) kromatin kısıtlama adımı yanı sıra ligasyon (L) sonra toplanmıştır. Çapraz bağlar tersine çevrildi ve DNA arındırıldı ve agarose jel üzerinde çalıştırıldı. Mbo I ile kısıtlama başarılı olduğunda 200-1000 bp'lik bir leke gözlendi (Şekil 1B

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada sunulan çekirdek içi Hi-C yöntemi, Drosophila genom topolojisinin yüksek çözünürlükte ayrıntılı olarak araştırılmasına izin verdi, farklı genomik ölçeklerdeki genomik etkileşimlerin bir görünümünü sağladı, organizatörler ve arttırıcılar gibi düzenleyici elementler arasındaki kromatin döngülerinden TAD'lere ve büyük bölmetanımlamasına 25. Aynı teknoloji bazı değişikliklerle memeli dokularına da verimli bir şekilde uygulanmıştır33. Örneğin, tek hücreli süspansiyon yeri...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar rakip çıkarlar beyan etmemektedir.

Teşekkürler

Bu çalışma UNAM Teknoloji Yenilik ve Araştırma Destek Programı (PAPIIT) hibe numarası IN207319 ve Bilim ve Teknoloji Ulusal Konseyi (CONACyT-FORDECyT) hibe numarası 303068 tarafından desteklendi. A.E.-L. Bilim ve Teknoloji Ulusal Konseyi (CONACyT) CVU numarası 968128 tarafından desteklenen bir yüksek lisans öğrencisidir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
%16 (hacim/hacim) paraformaldehit çözeltisiAgar ScientificR1026
Biotin-14-dATPInvitrogenCA1524-016
ClaI enzimiNEBR0197S
COVARIS UltrasonicatorCovarisLE220-M220
Cut SmartNEBB72002S
Dulbecco'nun Modifiye Eagle Ortamı (DMEM) 1xYaşam Teknolojileri41965-039
Dynabeads MyOne Streptabidin C1Invitrogen65002
Fetal sığır serumu (FBS) steril filtreliSigmaF9665
Klenow Dna PolI büyük parçaNEBM0210L
Klenow exo (-)NEBM0210S Ligasyon Tamponu
NEBB020S
MboI enzimiNEBR0147M
NP40-IgepalSIGMACA-420Lizis tamponuna ekleme için iyonik olmayan yüzey aktif madde
PE adaptörü 1.0Illumina5'-P-GATCGGAAGAGCGGTTCAGCAG
GAATGCCGAG-3'PE
adaptörü 2.0Illumina5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCT
CTTCCGATCT-3'PE
PCR astar 1.0Illumina5'-AATGATACGGCACCACCGAGAT
CTACACTCTTTCCCTACACGACG
CTCTTCCGATCT-3'PE
PCR astar 2.0Illumina5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG
ATCGGTCGGCATTCCTGCTGA
ACCGCTCTTCCGATCT-3'Fenol
: Kloroform:İzoamil Alkol 25:24:1SIGMAP2069
Primer 1 (bilinen etkileşim, Şekil 2A)Sigma5'-TCGCGGTAATTTTGCGTTTGA-3'Primer
2 (bilinen etkileşimler, Şekil 2A)Sigma5'-CCTCCCTGCCAAAACGTTTT-3'Proteaz
inhibitörü kokteyl tabletiRoche4693132001
Proteinaz KRoche3115879001
QubitThermoFisherQ33327
RNAseRoche10109142001
SPRIBoncukları BeckmanB23318
T4 DNA ligazInvitrogen15224-025
T4 DNA polimerazNEBM0203S
T4 polinükleotid kinaz (PNK) NEBM0201L
TaqPhusionNEBM0530SDNA polimeraz
Triton X-100SDS'nin söndürülmesi için iyonik olmayan yüzey aktif madde

Kaynaklar

  1. Cremer, T., Cremer, C. Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells. Nature Review Genetics. 2, 292-301 (2001).
  2. Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326, 289-293 (2009).
  3. Dixon, J. R., et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 485, 376-380 (2012).
  4. Sexton, T., et al. Three-dimensional folding and functional organization principles of the Drosophila genome. Cell. 148 (3), 458-472 (2012).
  5. Dixon, J. R., Gorkin, D. U., Ren, B. Chromatin domains: the unit of chromosome organization. Molecular Cell. 62, 668-680 (2016).
  6. Bonev, B., Cavalli, G. Organization and function of the 3D genome. Nature Reviews Genetics. 17, 661-678 (2016).
  7. Lupiáñez, D. G., Spielmann, M., Mundlos, S. Breaking TADs: how alterations of chromatin domains result in disease. Trends in Genetics. 32, 225-237 (2016).
  8. Phillips, J. E., Corces, V. G. CTCF: master weaver of the genome. Cell. 137 (7), 1194-1211 (2009).
  9. Hong, S., Kim, D. Computational characterization of chromatin domain boundary-associated genomic elements. Nucleic Acids Research. 45, 10403-10414 (2017).
  10. Zuin, J., et al. Cohesin and CTCF differentially affect chromatin architecture and gene expression in human cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (3), 996-1001 (2014).
  11. Guo, Y., et al. CRISPR inversion of CTCF sites alters genome topology and enhancer/promoter function. Cell. 162, 900-910 (2015).
  12. Lupiáñez, D. G., et al. Disruptions of topological chromatin domains cause pathogenic rewiring of gene-enhancer interactions. Cell. 161, 1012-1025 (2015).
  13. Van-Steensel, B., Furlong, E. E. M. The role of transcription in shaping the spatial organization of the genome. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20, 327-337 (2019).
  14. Merkenschlager, M., Nora, E. P. CTCF and cohesin in genome folding and transcriptional gene regulation. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 17 (1), 17-43 (2016).
  15. Hansen, A. S., Pustova, I., Cattoglio, C., Tjian, R., Darzacq, X. CTCF and cohesin regulate chromatin loop stability with distinct dynamics. Elife. 6, 1-10 (2017).
  16. Van Bortle, K., et al. Insulator function and topological domain border strength scale with architectural protein occupancy. Genome Biology. 15, 82(2014).
  17. Ramírez, F., et al. High-resolution TADs reveal DNA sequences underlying genome organization in flies. Nature Communications. 9, 189(2018).
  18. Ulianov, S. V., et al. Active chromatin and transcription play a key role in chromosome partitioning into topologically associating domains. Genome Research. 26, 70-84 (2016).
  19. Rowley, M. J., et al. Evolutionarily conserved principles predict 3D chromatin organization. Molecular Cell. 67, 837-852 (2017).
  20. Gavrilov, A. A., Golov, A. K., Razin, S. V. Actual ligation frequencies in the chromosome conformation capture procedure. PLoS One. 8, 60403(2013).
  21. Gavrilov, A. A., et al. Disclosure of a structural milieu for the proximity ligation reveals the elusive nature of an active chromatin hub. Nucleic Acids Research. 41, 3563-3575 (2013).
  22. Nagano, T., et al. Single-cell Hi-C reveals cell-to-cell variability in chromosome structure. Nature. 502, 59-64 (2013).
  23. Rao, S. S. P., et al. A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping. Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).
  24. Nagano, T., et al. Comparison of Hi-C results using in-solution versus in-nucleus ligation. Genome Biology. 16, 175(2015).
  25. Arzate-Mejía, R., et al. In situ dissection of domain boundaries affect genome topology and gene transcription in Drosophila. Nature Communications. 11, 894(2020).
  26. Schoenfelder, S., et al. Promoter capture Hi-C: high-resolution, genome-wide profiling of promoter interactions. Journal of Visualized Experiments. (136), e57320(2018).
  27. Servant, N., et al. HiC-Pro: an optimized and flexible pipeline for Hi-C processing. Genome Biology. 16, 259(2015).
  28. Philip, E., Måns, M., Sverker, L., Max, K. MultiQC: Summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report. Bioinformatics. 10, 1093(2016).
  29. Wingett, S., et al. HiCUP: pipeline for mapping and processing Hi-C data. F1000 Research. 4, 1310(2015).
  30. Imakaev, M., et al. Iterative correction of Hi-C data reveals hallmarks of chromosome organization. Nature Methods. 9 (10), 999-1003 (2012).
  31. Akdemir, K. C., Chin, L. HiCPlotter integrates genomic data with interaction matrices. Genome Biolog. 16, 198(2015).
  32. Ramirez, F., et al. High-resolution TADs reveal DNA sequences underlying genome organization in flies. Nature Communications. 9, 189(2018).
  33. Ando-Kuri, M., et al. The global and promoter-centric 3D genome organization temporally resolved during a circadian cycle. bioRxiv. , (2020).
  34. Cuellar-Partida, G., et al. Epigenetic priors for identifying active transcription factor binding sites. Bioinformatics. 28 (1), 56-62 (2012).
  35. Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biology. 9, 137(2008).
  36. Ong, C. -T., et al. Poly(ADP-ribosyl)ation regulates insulator function and intrachromosomal interactions in Drosophila. Cell. 155 (1), 148-159 (2013).
  37. Fresán, U., et al. The insulator protein CTCF regulates Drosophila steroidogenesis. Biology Open. 4 (7), 852-857 (2015).
  38. Quinodoz, S., et al. RNA promotes the formation of spatial compartments in the nucleus. Cell. 174, 744-757 (2018).
  39. Olivares-Chauvet, P., et al. Capturing pairwise and multi-way chromosomal conformations using chromosomal walks. Nature. 540 (7632), 296-300 (2016).
  40. Beagrie, R., et al. Complex multi-enhancer contacts captured by genome architecture mapping. Nature. 543, 519-524 (2017).
  41. Redolfi, J., et al. DamC reveals principles of chromatin folding in vivo without crosslinking and ligation. Nature Structural and Molecular Biology. 26, 471-480 (2019).
  42. Maxwell, R., et al. HiChIP: efficient and sensitive analysis of protein-directed genome architecture. Nature Methods. 13, 919-922 (2016).
  43. Gao, X., et al. C-BERST: Defining subnuclear proteomic landscapes at genomic elements with dCas9-APEX2. Nature Methods. 15 (6), 433-436 (2018).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Kromatin OrganizasyonuTopolojik Olarak İlişkili AlanlarTAD SınırlarıMimari ProteinlerKromatin SindirimiBiyotin PulldownCRISPR Genetik DüzenlemeGenomik Etkileşimler
Drosophila Hücrelerinde Çekirdek içi Hi-C
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.