Parça Bazlı Kurşun Keşfinde Tarama için Nano-Diferansiyel Tarama Florüretrisi

Özet

Hedef proteinin erime sıcaklığındaki değişiklikleri izlemek(yani,termal kayma tahlili, TSA), birkaç yüz bileşik parça kütüphanelerini taramak için etkili bir yöntemdir. İç triptofan floresanını ve parça taraması için hafif geri saçılmaları izlemek için robotik destekli nano-Diferansiyel Tarama Florüreti (nano-DSF) uygulayan bir TSA protokolü sunuyoruz.

Özet

Termal kayma tahlilleri (TSA'lar), hedef proteinin erime sıcaklığının (T_m)ortamındaki değişikliklere(örneğintampon bileşimi) yanıt olarak nasıl değiştiğini inceler. TSA'nın ve özellikle nano-Diferansiyel Tarama Florürünün (nano-DSF) faydası, hem belirli bir proteini stabilize eden koşulları bulmak hem de belirgin T_m'dekideğişiklikleri izleyerek ligand bağlamaya bakmak için yıllar içinde kurulmuştur. Bu makale, Diamond-SGC-iNEXT Poised (DSi-Poised) parça kütüphanesinin (768 bileşik) nano-DSF kullanılarak verimli bir şekilde taranmasını ve potansiyel parça bağlamasını tanımlamak için T_m'nin izlenmesini sunun. Nano-DSF deneyleri yapmak için protein kalitesi ve konsantrasyonu ile ilgili önkoşullar, 96 kuyu plakalarında gerekli örnekleri hazırlamak için yapısal biyoloji laboratuvarlarında yaygın olarak kullanılan nano litrelik bir robotik dağıtıcı kullanan adım adım bir protokol ile kısaca özetlenmiştir. Protokol, reaktif karışımlarının nano-DSF ölçümleri için gerekli kılcal damarlara nasıl aktarıldığını açıklar. Buna ek olarak, bu makale termal denatürasyonu (iç triptofan floresan izleme) ve toplamayı (ışık geri saçılımını izleme) ve veri aktarımı ve analizi için sonraki adımları ölçmek için protokoller sağlar. Son olarak, bu prosedürün lider keşif kampanyaları bağlamında kullanımını göstermek için üç farklı protein hedefiyle tarama deneyleri tartışılmaktadır. Açıklanan yöntemin genel prensibi diğer parça kitaplıklarına kolayca aktarılabilir veya diğer araçlara uyarlanabilir.

Giriş

İlaç keşif programları genellikle kimyasal bileşikleri, çoğu zaman proteinler olan ilaç hedeflerinin işleviyle etkileşime girme ve/ veya değiştirme yetenekleri için tarayarak başlar. Bu tür ekranlarda bulunan sözde "hitler", yeni başrol ve geliştirme adaylarının ve bugünlerde ruhsat verilen yeni ilaçların çoğunun keşfine zemin hazırlamaktadır. Bu nedenle, yüksek aktarım hızı yöntemlerinin kullanılabilirliği, sıkı bağlamalarını veya hedefin belirli bir işlevini modüle etme yeteneklerini hızlı bir şekilde tanımlamak için çok sayıda farklı bileşikle çok sayıda mevcut hedefi taramak için vazgeçilmezdir. İsabetler belirlendikten sonra, en umut verici hit-target kombinasyonları, "yapı-aktivite ilişkilerini" (SAR) anlamak için diğer, genellikle pahalı ve zaman alıcı teknolojiler kullanılarak kapsamlı bir ilaç geliştirme boru hattına itilir.

"Çevirisel Araştırmalar için NMR, EM ve X ışınları altyapısı" (iNEXT) ve mevcut halefi iNEXT-Discovery tarafından sunulanlar gibi yapısal biyoloji yaklaşımları, genellikle birkaç sentetik kimya turu tarafından ilk isabetlerin benzeşimini ve farmakolojik özelliklerini geliştirirken çok sayıda bileşiğin etkileşimlerini aşırı ayrıntılı olarak incelemek için kullanılır^1. Bu "darbeden kurşuna" kampanyalardan çıkan kurşun bileşikleri kalkınma adayı olur ve preklinik çalışmalara girer. İyi gelişmiş moleküler tarama metodolojisi kabaca iki yaklaşıma kategorize edilebilir, yani ligand tabanlı kurşun keşfi (LBLD) ve parça bazlı kurşun keşfi (FBLD). LBLD kampanyalarında, protein reseptörleri ya birkaç bin elle seçilmiş ligandla (doğal ligandların yapısına veya hedefin yapısına göre) ya da kimyasal alanın büyük bir kısmını kaplayan ilaç benzeri ligand kütüphanelerinde on binlerce bileşikle taranır.

Genellikle, bileşikler bir aktivite testinde inhibitör aktiviteleri için test edilir, tipik olarak enzmatik bir işlevin izlenmesi. Bununla^birlikte,FBLD kampanyaları²,^3,4,5'te, genellikle ilaçlardan (100-200 Dalton) daha küçük olan bazı yüzlerce bileşik, bir etkinlik testi kullanmadan hedefi doğrudan bağlama yetenekleri için test edilir. Bu bağlama hedef aktiviteyi engelleyebilir ve parçaların hedefe bağlanma yeteneğini doğrudan rapor eden birçok biyofiziksel yöntemle veya X-ışını kristalografisi⁶ ve nükleer manyetik rezonans spektroskopisi⁷ve daha yakın zamanda kriyo-elektron mikroskopisi gibi yapısal yöntemlerle ölçülebilir. Parçalar protein üzerinde birbirine yakın olan farklı konumlarda bağlandığında, farklı, genellikle düşük benzeşimli bağlayıcı parçalar, daha ayrıntılı olarak çalışılabilen küçük bir müşteri adayı kümesi oluşturmak için rasyonel olarak kimyasal olarak birleştirilebilir. Bu sıklıkla daha yüksek benzeşim, daha güçlü bileşikler ile sonuçlanır ve bu metodoloji klinik potansiyele sahip önemli moleküller vermeye başlamıştır. Kimyasal grupları verimli bir şekilde sömüren "ideal" bir parça kütüphanesi seçimi uzun yıllardır aktif bir araştırma alanı olmuştur^8,9,10.

İlk vurgu tam kimyasal alanı kaplamak iken, daha sonra dikkat, kurşun bileşikleri üretmek için parça isabetlerinin aşağı akış kimyasal kombinasyonunu sağlamaya odaklandı. Bu tür araştırmalar sözde "hazır" kütüphanelere yol açmıştır. Bunlar, SAR'ı çalışmada verimli ilerleme için hızlı, ucuz takip sentetik kimyaya izin veren en az bir fonksiyonel gruba sahip parçalar içerir. iNEXT tarafından katalİze edilen faaliyetlerden biri, Diamond Light Source ve Structural Genomics Consortium'daki araştırmacılar tarafından geliştirilen hazır kütüphaneyi güncellemekti. Bu birleşik çaba, iNEXT¹²içinde de doğrulanmış olan DSi-Poised kütüphanesi¹¹ile sonuçlandı. Daha sonra, bu kütüphane, kimyasal bir araştırma kuruluşu ve tarama için büyük yapı taşları ve bileşik kütüphane koleksiyonlarının üreticisi olan Real Database of Enamine Ltd.'deki bileşiklerin mevcudiyeti ile uyumlu hale geldi. DSi-Poised artık satın almak için herkes tarafından kullanılabilir, ancak desteklenen parça tarama projeleri için birçok iNEXT-Discovery ortak laboratuvarında da mevcuttur.

Üst düzey X-ışını kristalografisi ve NMR yapısal biyoloji teknolojilerinin FBLD için avantajları ve dezavantajları vardır. Her ikisi de yalıtılmış hedef örnekleri gerektirir ve FBLD için gereken yüksek çözünürlüklü atomik ayrıntıları verir. Bununla birlikte, kristaller X-ışını kristalografisi için gereklidir ve parçalar, üç boyutlu kristal kafesin yapımında yer almayan iyi sıralanmış protein bölgelerindeki boşluklara bağlanır. Çözüm NMR genellikle X-ışını kristalografisinden farklı darbeler verir, çünkü kristal ortamından etkilenmez ve kısmen sıralanmış protein bölgelerinde de bağlamayı tespit etmede iyidir. Bununla birlikte, ligand tabanlı NMR deneyleri nispeten hızlı olsa da, yine de önemli miktarda zaman ve malzeme gerektirir ve rutin olarak yalnızca nispeten küçük protein hedefleri veya etki alanları için yapılabilir. Kristalografik veya NMR deneyleri için bileşiklere öncelik vermek amacıyla biyofiziksel yaklaşımlar^{kullanılmıştır 13,14,15.}

Son enstrümantasyon ve hesaplama protokolleri, yapıları belirleyerek ve ~1.000 parçayı çok verimli bir şekilde analiz ederek FBLD için verimli kristalografik taramaya izin verdiğinden, bu önceliklendirme X-ışını tabanlı araştırmalarda daha az gerekli hale gelmiştir. Bununla birlikte, NMR için kütüphane taramasına öncelik vermek ve en üst düzey ekipmanlarda enstrüman zamanından tasarruf etmek için daha ucuz ve daha hızlı deneyler kullanmak arzu edilir. Aynı zamanda, temelde farklı teknolojilerin bir kombinasyonunu kullanmak, bağlama olaylarının bağımsız onayını veya hatta yalnızca kristalografi veya NMR yöntemini kullanarak alınmayan ek isabetleri sağlayabilir. Kristalografik ve NMR teknikleri hem çok pahalı ekipmanlar gerektirir hem de genellikle sadece yerel, yüksek vasıflı uzmanların yardımıyla özel harici tesislerde yapılabilir. Buna ek olarak, sonuçların doğru analizi de yüksek uzmanlık talep eder. iNEXT ve iNEXT-Discovery gibi programlar bu tür tesislere erişimi demokratikleştirirken¹⁶, ucuz, hızlı ve yüksek verimli FBLD taramanın diğer yöntemlerle çok daha geniş bir laboratuvar yelpazesinde ilaç tarama programlarını teşvik edebileceği kabul edilmiştir. Bu sonuçlar daha sonra tıbbi kimyagerlerle işbirlikleri kurmak ve NMR ve kristalografi tesisleri taranabilecek bileşiklerin sayısına kısıtlamalar getiriyorsa, en pahalı tarama deneylerini en umut verici bileşiklere öncelik vermek için bir gösterge olarak kullanılabilir.

TSA, FBLD taraması için kullanılabilecek hızlı, verimli ve nispeten ucuz ve erişilebilir bir biyofizik yöntem¹⁷ oluşturur. Kristalizasyon denemeleri için kararlı protein koşullarının bulunmasına yardımcı olmaktan¹⁸, hücrelerde belirli hedeflere bağlanan bileşiklerin bulunmasına kadar birçok ortamda kullanılmıştır¹⁹. TSA'lar, ligand bağlama hedef proteinleri için ayrışma sabitlerini ölçmek için de kullanılmıştır, çünkü ligand bağlama genellikle termal stabilitede değişikliklere yol açar. Tüm TSA'larda, bir proteinin denatürasyon sıcaklığındaki değişim (stabilitesi) yavaş bir sıcaklık artışının bir işlevi olarak ölçülür. Isıtma sırasında protein denatürasyonunu izlemenin etkili bir yolu, sıcaklık artışı nedeniyle ortaya çıkan proteinin maruz kalan hidrofobik bölgeleriyle etkileşim üzerine bir hidrofobik boyanın (tipik olarak Sypro Orange) floresan söndürülmesini ölçen DSF veya Thermofluor tarafından yapılır.

Nano-DSF tipik olarak dış boyaların yokluğunda proteinin termal kararlılığının ölçülmesi anlamına gelir. Bu olasılığı sunan ilk araçlardan biri, bir numunenin ışık saçılmasının yanı sıra geniş bir ışık yoğunluğu yelpazesini ölçen OPTIM1000 idi. Bu makine, proteinin açılma (tipik olarak triptofan floresanını takiben) ve protein toplamanın eşzamanlı ölçümüne izin verdi (oluşan nanopartiküller ~400 nm'de ışık saçılımının artmasına neden oldu). Daha sonra Prometheus, floresan sinyalinin toplanması ve hassas algılanması için geri yansıma kullanımını tanıttı ve düşük protein konsantrasyonlarının iyi hassasiyetle taranmasını sağladı²⁰. Aşağıdaki bölümde Prometheus'un farklı protein hedefleri için isabetleri tespit etmek için bir parça tarama protokolünü göstermek için nasıl kullanıldığı açıklanmaktadır. Beklenen protein kalitesi ve miktarı hakkında kısa bir giriş, parça tarama deneylerinin hazırlanması, gerçekleştirilmesi ve analiz için adım adım bir protokol ile takip edilir. Üç protein için tarama sonuçları, iNEXT-Discovery işbirliklerinin bir parçası olarak elde edilen örnek veriler olarak gösterilmiştir.

Protokol

NOT: Nano-DSF deneylerinde kullanılan proteinler sodyum dodecylsulfate-poliakrilamid jel elektroforezi ile değerlendirilmiş saf (%>95) ve homojen olmalıdır. Parça ekranını gerçekleştirmeden önce, proteinlerin stabilitesi çeşitli tampon koşullarında belirlenmelidir. Düşük iyonik mukavemetli, proteine minimum müdahale eden düşük tuz tamponu, parçalarla doğrudan etkileşimini etkilememek için kullanılmalıdır. Bu iletişim kuralında genellikle kararlılığı denetlemek için kullanılan arabellekler Ek Tablo S1'de gösterilir. Bu deney için stok çözeltisi olarak kullanılması gereken proteinin konsantrasyonu tipik olarak 0,2 mg mL^{-1 'dir.} Tüm DSi-Poised kütüphanesini (768 bileşik) taramak için, bu konsantrasyonda toplam ~12 mL protein, toplam ~2,5 mg gereklidir. Bu deneylerde kullanılan DSi-Poised kütüphanesi 96 kuyu formatında sağlanmıştır (Şekil 1). Parçaların konsantrasyonu % 20 v/v dimetilsüllfoksit (DMSO) olarak 100 mM'ye ayarlandı. Burada açıklanan karıştırma protokolünün% 0.4 v / v düşük nihai DMSO konsantrasyonları ile sonuçlandığı belirtilmelidir; Bunun proteinin stabilitesini etkileme olasılığı çok düşük olsa da, DMSO'nun etkisi her yeni protein için kontrol edilmelidir.

Şekil 1: Bu deneyler için kullanılan plaka türleri. (A) U-alt plaka. (B) 96 kuyu plakası. (C) Subwell 1'i gösteren 96 kuyu plakasının yakından görünümü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

1. Plaka hazırlama

1. -20 °C/-80 °C dondurucudan bir parça plaka alın ve oda sıcaklığında çözünsün, tezgah üstü çalkalayıcıda hafifçe sallanarak. Kuyuların kenarına yapışan damlaları toplamak için plakayı 30 s için 500 × g'da santrifüj edin.
   NOT: Parça kitaplığı DMSO-d_6'da (erime noktası 19 °C) çözünmüş olarak mevcut olduğundan, her bileşiğin tamamen çözüldüğünden ve çözündüğünden emin olmak önemlidir.
2. Her alt kuyuya MRC 2 kuyu kristalizasyon plakası (Şekil 1A) ve protein stok çözeltisinin pipet 14,7 μL'si alın. Bunu zaman verimli bir şekilde yapmak için, proteini bir reaktif rezervuarında(Malzeme Masası)tutun ve dağıtmak için çok kanallı bir pipet kullanın (Şekil 2A,B).
   NOT: DSi-Poised kütüphanesi için, formata bağlı olarak, 96 kuyu plakasının tüm kuyuları bileşik içermez. Genellikle, A, H satırları ve sütun 1, 12 DMSO ile doldurulur. Bu nedenle, A, H ve sütun 1, 12 satırları proteinle doldurulmamalıdır, çünkü bu kuyular bir sonraki adımın sonunda herhangi bir parça içermeyecektir; sadece DMSO robot tarafından oraya aktarılacaktır. Boş satır ve sütunların bazı plakalarda farklılık gösterir.

Şekil 2: Parça tarama prosedürünün ana hatları. (A) Proteini dağıtmak için çok kanallı pipet ve reaktif rezervuarı kullanmak. (B) Proteini 96 kuyu plakasına dağıtmak. (C) Dağıtıcı robot tarafından parça dağıtımı. (D) Proteinin kılcal damarlara yüklenmesi. (E) Kılcal tutucuyu gösteren çekmece. (F) Kılcal damar tutucunun yakından görünümü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Bu deneylerde kullanılan ekipmana genel bakış. (A) Parça dağıtımı için kullanılan nanodispenser robot. Plaka konumları belirtilmiştir. (B) Yeni bir plaka tanımlamak için program arayüzü. (C) Dağıtım programının arayüzü. (D) Parçaları dağıtmak için kullanılan dağıtım programı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

2. Sivrisinek robotu tarafından parça nano dağıtım

1. Parçaların sağlanmayan plaka türünü kontrol edin (Malzeme Tablosu).
2. Sivrisinek üzerindeki parça ve protein plakası tanımlarını kontrol edin.
   1. Nanodispenser'ı aç (Şekil 3A). Hareketli bileşenlerin etrafında herhangi bir engel olmadığından emin olun.
   2. Grafik kullanıcı arabirimini açın, Kurulum sekmesini tıklatın ve Güverte Yapılandırmasıaltında, bileşiklerin sağlandığını ve proteinin bölüm 1'de aktarıldığı plaka türünün Kullanılabilir plakalarlistesinde zaten bulunup bulunmadığını kontrol edin. Değilse, Seçenekler'i tıklatın| Plakalar ve Özellik türü için doğru değerleri doldurarak yeni bir plaka tanımı oluşturun (Şekil 3B).
      NOT: MRC 2 kuyu plakası ve bu deneyde kullanılan 96 kuyu plakası için bu değerler sırasıyla Ek Tablo S2 ve Tamamlayıcı Tablo S3'tegösterilmiştir.
3. Dağıtım programı
   1. Kurulum sekmesinin altında, Güverte Yapılandırmasıaltında plaka konumlarını belirtin.
      NOT: Bu deneyde kullanılan Sivrisinek güvertede iki plaka pozisyonuna sahiptir. Konum 1 Kaynak plakasıolarak tanımlanır ve Konum 2 Hedef plakadır.
   2. Açılır menüyü kullanarak, Konum 1 için Greiner U alt plakasını ve Konum 2 için MRC 2-well plakasını seçin (Şekil 2C). Protokolü kaydedin.
4. Parça dağıtma
   1. Parça plakasını Konum 1'e ve protein plakasını güvertenin 2 konumuna yerleştirin (Şekil 3A).
   2. Protokol sekmesinde (Şekil 3D), Dosya'ya tıklayın ve parçaları dağıtmak için bölüm 2.3'te kaydedilen protokolü seçin. Dağıtılacak parçaların hacmini tanımlayın; 0,3 μL kullanın. Sütun 1 ve 12'nin parça içermediği tipik bir plaka için, Başlangıç konumunu sütun 2'ye ve Bitiş konumunu sütun 11'e tanımlayın. Bazı plakalarda, sütun 2 veya 11 boşsa, sırasıyla başlangıç ve bitiş değerleri olarak 3 ve 10 sütunlarını kullanın.
      NOT: Sivrisinek kurulumu nedeniyle, satırlar değil, yalnızca sütunlar atlanabilir; sıralar için, sivrisinek DMSO pipet olacaktır. Parça kitaplığını çapraz kirletmemek için İpucu Değiştirme seçeneğinin Her Zamanolarak seçildiğinden emin olun.
   3. Programı başlatmak için Çalıştır'ı tıklatın. ~ 2 dakika süren dağıtım tamamlandıktan sonra, proteini ve parça plakalarını robottan çıkarın ve yapışkan bir sızdırmazlık filmi ile geri kapatın. Bir sonraki adıma geçmeden önce kuyuların kenarlarına yapışan damlaları toplamak için protein plakasını (500 × g, 30 s) kısaca santrifüj edin.

3. Nano-DSF ölçümü

NOT: Prometheus NT.48 kullanarak TSA'ları gerçekleştirme hakkında ayrıntılı bir açıklama daha önce^{yayımlanmıştır 20}. Burada parça taraması bağlamında önemli noktalardan bahsedilmektedir.

1. Ölçüm öncesi plaka muayenesi
   1. Parçaların eklenmesi nedeniyle oluşabilecek yağış için protein plakasının kuyularını görsel olarak inceleyin. Birçok kuyuda yağış görülürse, parçaların konsantrasyonlarını azaltın ve deneyi tekrarlayın.
      NOT: Protein plakasının oda sıcaklığında tutulması önerilir; parçalar daha düşük sıcaklıklarda çözünmez hale gelme eğilimindedir.
2. Prometheus'un Hazırlanması
   1. Prometheus enstrümanını aç. Dokunmatik ekranda, cihazın kılcal yükleme modülüne erişmek için Çekmeceyi Aç'a basın. Manyetik şeridi yükleme modülünden çıkarın ve herhangi bir toz parçacığını çıkarmak için aynayı etanol ile temizleyin.
3. Protein parçaları plakasından kılcal damarlara transfer
   NOT: Bu adım, protein plakasındaki her kuyudan karışık protein/parça örneğinin Prometheus ile kullanılmak üzere kılcal damarlara aktarılmasını içerir. Bunun için Standart kılcal damar tipi tipik olarak kullanılsa da, çok düşük protein konsantrasyonları için Yüksek Hassasiyetli kılcal damarları kullanmak mümkündür.
   1. Kılcal damar yükleme modülüne kolay erişim sağlamak için protein plakasını ve kılcal damarları cihazın yanına yerleştirin.
   2. Bir kılcal damar alın, bir ucunda tutun ve numuneyi kılcal damar etkisiyle aktarmak için kılcal damarın uzak ucuyla protein plakasındaki çözeltiye dokunun. Eldivenlerden kaynaklanan safsızlıklar(örneğin,toz parçacıkları) ölçümü etkileyeceğinden, her zaman eldiven giyin ve ortadaki kılcal damara dokunmamaya dikkat edin.
   3. Kılcal damarı tutucunun belirlenen konumuna getirin, düzgün hizalanmış ve ortalanmış olduğundan emin olun.
   4. 3.3.2 ve 3.3.3 adımlarını tekrarlayın, böylece yükleme modülündeki tüm konumları doldurun. Ölçüm için ihtiyacınız olan tüm kılcal damarları yükleyin.
      NOT: Tek bir çalışma için en fazla 48 kılcal damar yüklenebilir.
   5. Sonunda, manyetik şeridi yerinde tutmak için kılcal damarların üzerine yerleştirin ve deneyi başlatmak için Çekmeceyi Kapat'a basın.
4. Nano-DSF denemesini gerçekleştirin
   1. Floresan taraması
      1. Prometheus uygulama PR'ını açın. ThermControl'ü tıklatın ve ProteinName_ScreenName_PlateNumberadını kullanarak Yeni Oturum Başlat 'ı tıklatarak yeni bir proje oluşturun. İlk olarak, örneklerin floresanını tespit etmek için bir Keşif Taraması yapın.
         NOT: Floresan seviyeleri ideal olarak her örnek için 3.000 sayımın üzerinde olmalıdır. Cihazın doygunluk sınırının üzerinde floresan olan numuneler (20.000 sayım) ölçülmeyecektir.
      2. Lazerin Heyecan Gücünü ayarlayarak numunelerin floresan sinyalini değiştirin ( Şekil4).
   2. Termal denatürasyon
      1. Eriyen Tarama sekmesine tıklayın. Denemeyi gerçekleştirmek için Başlangıç Sıcaklığını 20 °C, Bitiş Sıcaklığını 95 °C ve Sıcaklık Eğimini 1 °C dk^-1olarak ayarlayın. Ölçümü Başlat'a tıklayın.
   3. Deneye açıklama ekleme
      1. Denemeler başladıktan sonra Ek Açıklama ve Sonuçlar sekmesine tıklayın. Her kılcal damara benzersiz bir plaka ve iyi bir sayı vererek açıklama ekleme.
         NOT: Örneğin, kılcal damar 1B2 Plaka 1 ve kuyu B2'ye karşılık gelir. Bu sekmede, deney için protein adı, tampon, protein konsantrasyonu gibiekstra sütunlar eklenebilir. Deneme tamamlandıktan sonra sonuçlar da bu sekmede görüntülenir. Bu, günün sonunda duraklamak için iyi bir zamandır; deneyler bir gecede gerçekleşir, sonuçlar ertesi gün toplanabilir.
   4. Veri görselleştirme ve dışa aktarma
      1. Deneme tamamlandıktan sonra, numunelerin erime ve saçılma eğrilerini görüntülemek için Erime Taraması sekmesine tıklayın. Sonuçları bir elektronik tabloda dışa vermek için, Eriyen Tarama sekmesini tıklatın, Dışarı Aktar'ı tıklatın ve açılan menüden İşlenmiş Verileri Dışarı Aktar'ı seçin.

Şekil 4: Heyecan verici gücü ve floresan sinyalinin ayarlanması. (A) % 80'lik heyecan gücüyle, numunelerin çoğu için floresan sinyali doygunluk sınırının ötesindedir. (B) Floresan sinyali, heyecanlanma gücünü % 60'a düşürerek ölçülebilir seviyelere düşürülür. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

4. Yineleme

1. 768 bileşiklerden oluşan Tüm Enamine kitaplığında 16 çalıştırma gerçekleştirmek için 1-3 arası adımları yineleyin (16 × 48 = 768).
2. Her plakanın ölçümü ~1,5 saat sürdüğünden, ek açıklamayı (3,4,3) tamamlayın ve 1 ve 2 bölümlerindeki adımları tekrarlayarak bir sonraki protein parçaları plakasını hazırlayın.
   NOT: Tipik bir iş gününde, deneyime bağlı olarak 4-6 plaka ölçülebilir. DSi-kütüphanenin tamamının taraması toplam 3-4 gün içinde bitirilebilir.

5. Veri analizi

1. Oluşturulan verileri inceleme
   1. Her çalıştırma tamamlandıktan sonra, sonuçları görüntülemek için Ek Açıklamalar ve Sonuçlar sekmesine tıklayın. Her örnek için, bu genel bakışta en önemli olan iki hesaplanan değere odaklanın: 1) Saçılma başlangıç sıcaklığı (Saçılma için başlangıç #1), artan numune saçılma olaylarının başlangıcındaki sıcaklığı gösterir ve toplamanın karakteristiğidir; 2) tipik olarak triptofan floresan floresanının ortamdaki değişiklikler üzerine maksimum değişikliklerine karşılık gelen 330 ve 350 nm değerlerindeki floresan olayları arasındaki orandan çıkarılan T_m ( Oran için ÇekimNoktası #1)değeri.
   2. Bu değerlerin güvenilir olduğundan emin olmak için Erime Taraması sekmesindeki her kılcal damar için saçılma ve erime eğrilerini kontrol etmeyi unutmayın.
2. Elektronik tabloya verme ve denetleme
   1. Verileri, 3.4.4'te açıklandığı gibi, incelenmek üzere tüm farklı çalıştırmalardan bir elektronik tablo yazılımına verin ve genel bakış tabloları ve çizimleri oluşturun. Her sayfadaki bilgileri not etmek için elektronik tablo dosyasındaki çeşitli Sayfalar'a tıklayın.
      1. Genel Bakış sayfasında, her satırın bir denemeye karşılık geldiğini unutmayın. Parametrelere genel bir bakış(örneğin,başlangıç ve bitiş sıcaklığı), T_m ve saçılma başlangıcı için hesaplanan değerleri gözlemleyin (adlar ve açıklama için yukarıdaki 5,1'e ve bir örnek için Ek dosyalar 1 ve 2'ye bakın). Yazılım bazı örnekler için iki veya daha fazla T_m değeri (Oran için Çekim Noktası #1 ve #2) hesaplarken, T_m değerlerinden hangisinin doğru olduğunu belirlemek için erime geçiş eğrisine bakın.
      2. Oran sayfasında, her sütunun bir örneğe ve her satırın her sıcaklık adımında okunan verilere karşılık geldiğini unutmayın. Her sıcaklık adımına karşılık gelen floresan sayısı değerlerini gözlemleyin ve sıcaklık sütununu floresan sayısı sütununa göre çizerek belirli numuneler için erime eğrilerini çizmek için bunları kullanın. Oran (ilk türev), 330 nm, 330 nm (ilk türev), 350 nm, 350 nm (ilk türev) verileri, oranı ve ilk türevini (maksimum değişim hızında maksimum değere sahip) benzer bir formatta hesaplamak için kullanıldığını unutmayın.
      3. Saçılma sayfasında saçılma için benzer verileri gözlemleyin. Sıcaklık sütununu saçılma sütununa göre çizerek her örnek için saçılma eğrisini oluşturun. Saçılma ilk türevi için Sayfa'yı arayın.
3. Tüm parçalar için genel genel bakış oluşturma ve doğrulama
   1. Parçalar için doğru T_m değerlerini doğruladıktan sonra, tek bir yeni sonuç dosyasındaki tüm çalıştırmalardan 330/350 nm oran (T_m) örnek kimliği ve çekim noktası sütunlarını birleştirin ve bu sütunları her çalıştırmadan kopyalayın.
   2. ΔT_m'yi almak için yerel proteinin ortalama T_m değerini kullanın (genellikle on çalıştırma üzerinden hesaplanır) ve her örneğin T_mdeğerlerinden çıkarın. En büyük kaymayla sonuçlanan örnekleri tanımlamak için sonuçları azalan sırada ΔT_m üzerinde sıralayın.
   3. Parçaları ΔT_m kaymasına bağlı olarak depo kutularına bölün ve her depo gözü için ΔT_m'yi parça sayısına göre çizerek tüm kitaplık için bir frekans tablosu oluşturun (Şekil 5). Kolaylık sağlamak için, günlük ölçeğindeki parça sayısını temsil eden ekseni gösterin. Örneği ΔT_m ±1 ile depolayın ve aykırı değerlerin sayısını ampirik olarak ayarlamak için diğer kutuları her çalıştırmaya uyarla.

Sonuçlar

DSi-Poised kütüphanesinin tam ekranı (768 parça) tıbbi ilgiye sahip üç protein üzerinde, yani Kanser 1 proteininde Yüksek Eksprese Edilen dış kinetochore (Hec1, veya Ndc80), monopolar mil kinaz 1 'in (Mps1) düzenleyici tetrarikopeptid tekrarı (TPR) alanı ve 11 bölgede replika poliproteinin C-terminusunu parçalayan SARS-CoV-2 3C benzeri proteaz, Nsp5. Her protein için seçilen tampon koşulları, protein konsantrasyonu ve proteinlerin T m'si, Ek Tablo S4'tegösterilmiştir.

Şekil 5: Hec1, Mps1 ve Nsp5 olmak üzere üç protein için erime sıcaklığındaki (ΔT_m)kaymanın frekans dağılımı bu çalışmada temsili sonuçlar olarak sunulmuştur. Kısaltmalar: Hec1 = Kanser 1 proteininde Yüksek Oranda İfade Edilir; Mps1 = monopolar mil kinaz 1; Nsp5 = SARS-CoV-2 3C benzeri proteaz. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Yukarıda açıklanan protokolü kullanan üç taramanın sonuçları, T_m'deki değişimin parça sayısına karşı frekans dağılımı olarak görüntülenir, Şekil 5'te gösterilmiştir. Bu çizimler, protokolün bölüm 5.3'lerinde açıklandığı gibi oluşturulmuş ve T m'de gözlenen değişimin sıklığını_çizmiştir. Vardiyanın öneminin, aşağıdaki tartışma bölümünde açıklandığı gibi, her farklı proje için öznel bir şekilde tanımlanması gerekir. Negatif değerler, bir parçanın varlığında erime sıcaklığında bir azalmaya, pozitif bir değer T_m'debir artışa işaret eder. Bu tür arsalardan, Nsp5 için tüm parçaların istikrarsızlaştırıcı bir etkiye sahip olduğunu gözlemlemek kolaydır, Hec1 ve Mps1 için ise hem dengeleyici hem de istikrarsızlaştırıcı isabetler gözlenir. Bu beklenebilir ve tartışılacaktır.

Tartışma

Bu protokol, bazı yaygın robotik ve ölçüm araçlarını kullanarak parça kitaplıklarını taramak için orta ila yüksek aktarım hızı yöntemini açıklar. Bu protokolde açıklananlar gibi ekranlar, amsterdam'daki NKI Protein Tesisi tarafından rutin olarak gerçekleştirilebilir, örneğin bir iNEXT-Discovery hizmeti olarak, genellikle teklif başvurusu ve akran incelemesinden sonra kullanıcılar için ücretsiz olarak bile. Bu gibi durumlarda, DSi-Poised kütüphanesi tesis tarafından sağlanabilir, ancak diğer kütüphanelerin kullanımı da her farklı kullanıcı uygulaması ve hizmet sözleşmesi bağlamında tartışılabilir. Bu protokoldeki aletlerin seçimi birçok laboratuvar için pratik çözümleri temsil eder, ancak altın bir standart olarak düşünülmemelidir. Ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyon termositlerinde açılmayı tespit etmek için çevreye duyarlı etiketler kullanan yöntemler yerine, parça taraması için hedef proteinin termal kararlılığını ölçmek için etiketsiz yöntemler önerilir.

Prometheus enstrümanı kullanılarak burada sunulan gibi etiketsiz yöntemlerin bazı avantajları vardır: düşük miktarda protein kullanırlar, genellikle birkaç büyüklük sırasını daha az kullanırlar; numunenin saçılmasını ve dolayısıyla toplamayı aynı anda ölçmek için kullanılabilirler; ve diğer yaklaşımlarda açılmayı tespit etmek için kullanılan etiketler her parçayla farklı etkileşime girebilir ve bu da ölçüm yapıtlarına neden olabilir. Bu protokol, manuel olarak yapılamayan çok küçük bir numune hacminin (0,3 μL) pipetlemesine izin veren Sivrisinek robotu bağlamında tanımlanmıştır. Sivrisinek, yapısal biyoloji ve ilaç keşif projeleri üzerinde çalışan birçok laboratuvarda bulunan popüler bir robottur; ancak, protokol açıkça düşük hacimli pipetleme için alternatif yaklaşımlar kullanabilirsiniz.

Parça kitaplıkları DMSO'da çözünmüş bileşikler içerir. İlk zorluklardan biri, proteinin stabil kaldığı ve bileşiklerin çözünür kaldığı en uygun DMSO konsantrasyonu bulmaktır. Bu, tarama için en uygun koşulları belirlemek için ölçümlerin çeşitli DMSO konsantrasyonlarında gerçekleştirilmesini içerir. Burada kullanılan proteinden parça seyreltmeye kadar olan protein, %0,2'lik DMSO konsantrasyonlarıyla sonuçlanır; çoğu protein bu koşullarda oldukça kararlıdır. Ölçümler tipik olarak düşük protein konsantrasyonlarında (0,2 mg mL^-1)gerçekleştirildiği için, 768 bileşik kütüphane için taramanın yapılması için gereken protein miktarı toplamda ~2-3 mg'dır. Bu kadar düşük protein konsantrasyonlarıyla çalışmak sadece protein üretim maliyetlerini azaltmakla kalmaz, aynı zamanda protein çökeltme şansını da azaltır. Deneydeki parçaların konsantrasyonu ~2 mM olduğundan, düşük protein konsantrasyonu parça bağlamanın algılanmasını etkilemez ve zayıf bağlayıcıların tanımlanmasına izin verir.

Bu deneylerdeki erime geçiş tespiti floresan yoğunluğuna dayandığından, kritik bir husus ölçümlerin gerçekleştirildiği lazerin uyarlama gücünü belirlemektir. Bileşiklerin proteinle etkileşimi (i) iç floresan üzerinde hiçbir etkisi yoktur, (ii) söndürme ile sonuçlanır veya (iii) iç floresanını arttırır. Buna ek olarak, düşük protein konsantrasyonları ile çalışmak, yerel protein için floresan sayısının düşük olacağı anlamına gelir. Bu nedenle, ekscitasyon gücü, numunelerin çoğu ölçülebilecek şekilde ayarlanmalıdır. Her çalıştırmanın saçılma profili, herhangi bir parçanın eklenmesiyle tetiklenebilecek toplama efektleri hakkında önemli bilgiler sağlar. Ek olarak, sıcaklığın bileşik çözünürlük üzerindeki etkisi saçılma profilinde de görülebilir.

Beklenmedik bir şekilde, birçok bileşik için saçılmanın aslında artan sıcaklıkla azaldığı gözlenmiştir (Şekil 6). Bu nedenle, özellikle X-ışını kristalografisi veya NMR spektroskopisi tarafından daha zorlu ölçümler için aday olarak kabul edilen veya hatta takip kimyası için isabet olarak kabul edilen parçalar için, her deneyin güvenilirliği hakkında karar vermek için hem erime geçiş eğrisine hem de beraberindeki saçılma profiline bakmak önemlidir. Parça tarama amacıyla yöntemin belirli bir sınırlaması, DSi-Poised kütüphanesindeki birçok parçanın, bazen dedektörün doygunluk sınırının ötesinde, önemli içsel floresanlara sahip olmasıdır ve bu nedenle bunlar düşük heyecan gücünde bile hedef bağlama için uygun şekilde taranamaz. Bu yöntem için dikkat edilmesi gereken bir diğer nokta, sadece triptofan kalıntıları içeren proteinlerle kullanılabilmesidir.

Şekil 6: Sıcaklığın bileşik çözünürlük üzerindeki etkisi. Hec1'in eriyen geçiş eğrisi ve saçılma profili iki farklı bileşikle. (A) Saçılma profili, bu örnek için çözünürlüğün sıcaklık tarafından etkilenmediğini gösterir. (B) Saçılma profili, bu numunenin çözünürlüğü artan sıcaklıkla birlikte arttığını göstermektedir. Bu durumda erime geçiş eğrisi bu nedenle güvenilir değildir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Açık bir soru, T_m'deönemli bir değişiklik olarak düşünülmesi gereken şey matematiksel açıdan değil, pratik açıdan: T_m'deki hangi değişikliğin bir ligandın bir proteine bağlanmasının göstergesi olarak düşünülmesi önemlidir? Bu örneklerde, Hec1'i bağlamak için parçaların% 74'ü, Mps1 için% 66'sı ve Nsp5 için% 53'ü için 1 °C'den daha az kaymalar görülür. Genel bakış grafiklerinde (Şekil 5), pozitif veya negatif olarak 1, 2, 5 veya 5 dereceden fazla T_m kayması depo gözleri dikkate alındı. Bu, iyi bir genel bakış sağlamak ve bir sonraki adımı belirleyerek bilinçli karar vermeye izin vermek için her özel duruma göre değişiklik gerektirir. Özellikle, bazı proteinler için, düşünülen parçalara bağlı olarak hedefin hem stabilizasyonu hem de stabilizasyonu gözlenmiştir. Her iki olay da ilginçtir, çünkü her ikisi de parça bağlamanın sonucu olabilir ve her ikisi de protein davranışını manipüle etmek için iyi bir takip molekülüne yol açabilir.

Son bir soru kalır, yani, "yararlı bir vuruşu tanımlayan nedir?". Aslında, cevap belirli bir duruma bağlıdır. Örneğin, Hec1 için, proteini 2 dereceden fazla stabilize eden veya 5'ten fazla istikrarsızlaştıran tüm parçalar, bu isabetlere dayanarak yeni moleküller tasarlayan kimya işbirlikçilerimize iletildi. Bununla birlikte, Nsp5 için, nanoDSF türevi isabetleri NMR deneyleriyle doğrulamak için en dengeleyici isabetler NMR işbirlikçilerimize iletildi. Yani bu protokolden elde edilen tarama sonuçları dikkatle ve bağlama bağlı bir şekilde analiz edilmeli, özel soru ve çevresindeki metodolojiye dayalı bilinçli kararlar verilmelidir. Her durumda, burada açıklanan yöntem, kimya kampanyaları için doğrulamayı, önceliklendirmeyi veya yeni fikirler vermeyi amaçlayan X-ray ve NMR tabanlı tarama gibi mevcut metodolojilere tamamlayıcı bir yaklaşımdır.

Ek Tablo S1: Proteinlerin taranmasında kullanılan tamponların listesi. Kısaltmalar: HEPES = 4-(2-hidroksyetil)-1-piperazineethanesülonik asit; DTT = dithiothreitol; MOBS = 4-(N-morfoolino)butanesülfonic asit. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Tablo S2: Nanodispenser robot ile kullanım için MRC 2 kuyu plakası özellikleri.

Ek Tablo S3: Nanodispenser robot ile kullanım için 96 kuyulu V-alt plaka özellikleri. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Tablo S4: Temsilisonuçlarda tartışılan proteinlerin tamponu, protein konsantrasyonu ve T m.'si. Kısaltmalar: DTT = dithiothreitol; Hec1 = Kanser 1 proteininde Yüksek Oranda İfade Edilir; Mps1 = monopolar mil kinaz 1; Nsp5 = SARS-CoV-2 3C benzeri proteaz. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Dosya 1: Genel bakış parametreleri-örnek veriler. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 2: 406 parça örnek veri için T m ve ΔT_m değerleri. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
ClearVue Levhalar	Moleküler Boyutlar		protein plakası için yapışkan sızdırmazlık filmi
CORNING 6570 Alüminyum Sızdırmazlık Bandı	CORNING		yapışkan sızdırmazlık filmi
DSi dengeli kitaplığı	çalışmada kullanılan 768 bileşiği içeren	Enamine
Elisa Reaktif Rezervior	ThermoFisher Scientific	15075	Proteini pipetlemek için kullanılan reaktif rezervuarı
Greiner yuvarlak (U) alt plakalar		Cat. Hayır.  650201	Bu plakalarda sağlanan parçalar
Sivrisinek tipi X1	sptlabtech	Parça nr- 3019-0003	Nanolitre dağıtıcı
MRC 2 kuyulu kristalizasyon plakası		MRC96T-PS
Pierce ELISA Reaktif Rezervuarları	Pierce
Prometheus Yüksek Hassasiyetli kılcal damarlar	Katalog PR-C006
Prometheus NT.48 nanoDSF	Nanotemper	Kataloğu nr PR001 (+ Agregasyon Algılama Optikleri, katalog nr PR-AGO)	nanoDSF ve hafif geri saçılma
Prometheus Standart kılcal tip	Katalog PR-C002
TX-1000	Plakalar		için Termobilimsel Santrifüj