Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Mitokondriyal Hastalık Modellemesi için İnsan Beyni Organoidlerinin Üretimi

6.2K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/62756

⸱

21 Haziran 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of General Pediatrics, Neonatology and Pediatric Cardiology, Duesseldorf University Hospital, Medical Faculty, Heinrich Heine University, 2Institute of Neurobiology, Heinrich Heine University, 3Berlin Institute for Medical Systems Biology (BIMSB), Max Delbrueck Center for Molecular Medicine (MDC), 4Seaver Autism Center for Research and Treatment, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 5Max Delbrueck Center for Molecular Medicine (MDC)

Bu makalede

Özet

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre türevi beyin organoidlerinin üretimi ve mitokondriyal hastalıkların modelinde kullanımları için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz.

Özet

Mitokondriyal hastalıklar metabolizmanın en büyük doğuştan gelen hata sınıfını temsil eder ve şu anda tedavi edilemez. Bu hastalıklar, alttaki mekanizmaları aydınlatılmaya devam eden nörogelişimsel kusurlara neden olur. Önemli bir engel, hastalarda görülen erken başlangıçlı nöronal bozukluğu yeniden özetleyen etkili modellerin eksikliğidir. İndüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) teknolojisindeki gelişmeler, hastalıkların sinir sisteminin gelişimi ve organizasyonu üzerindeki etkisini araştırmak için kullanılabilecek üç boyutlu (3D) beyin organoidlerinin üretilmesini sağlar. Bu yazarlar da dahil olmak üzere araştırmacılar, son zamanlarda mitokondriyal bozuklukları modellemek için insan beyin organoidlerini tanıttılar. Bu makale, insan iPSC türevi beyin organoidlerinin sağlam üretimi ve mitokondriyal biyoenergetik profilleme ve görüntüleme analizlerinde kullanımları için ayrıntılı bir protokol bildirmektedir. Bu deneyler, metabolik ve gelişimsel işlev bozukluklarını araştırmak için beyin organoidlerinin kullanılmasına izin verecek ve mitokondriyal hastalıkların nöronal patolojisini inceleyecek önemli bilgiler sağlayabilir.

Giriş

Mitokondriyal hastalıklar metabolizmanın en büyük doğuştan gelen hata sınıfını temsil eder1. Oksidatif fosforilasyon (OXPHOS)2, solunum zinciri montajı, mitokondriyal dinamikler ve mitokondriyal DNA transkripsiyonu veya replikasyonu3 dahil olmak üzere farklı mitokondriyal süreçleri bozan genetik mutasyonlardan kaynaklanırlar3. Enerji gereksinimi olan dokular özellikle mitokondriyal disfonksiyondan etkilenir4. Buna göre, mitokondriyal hastalıkları olan hastalarda tipik olarak erken başlangıçlı nörolojik belirtiler gelişir.

Şu anda mitokondriyal hastalıklardan etkilenen çocuklar için herhangi bir tedavi bulunmamaktadır5. Mitokondriyal hastalıkların ilaç gelişimi için önemli bir engel, insan hastalığı seyrini yeniden özetleyen etkili modellerin eksikliğidir6. Şu anda çalışılan hayvan modellerinin birçoğu hastalarda mevcut nörolojik kusurları göstermez7. Bu nedenle, mitokondriyal hastalıkların nöronal patolojisinin altında kalan mekanizmalar hala tam olarak anlaşılamamıştır.

Son çalışmalar mitokondriyal hastalıklardan etkilenen hastalardan iPSC'ler üretti ve bu hücreleri hastaya özgü nöronal hücreler elde etmek için kullandı. Örneğin, mitokondriyal hastalık olan Leigh sendromu ile ilişkili genetik kusurların hücresel biyoenergetiklerde 8,9, protein sentezinde10 ve kalsiyum homeostaz9,11'de sapmalara neden olduğu bulunmuştur. Bu raporlar, mitokondriyal hastalıklarda meydana gelen nöronal bozukluk hakkında önemli mekanistik ipuçları sunarak, bu tedavi edilemez hastalıklar için ilaç keşfinin önünü açtı12.

Bununla birlikte, iki boyutlu (2D) kültürler, 3D organların mimari karmaşıklığının ve bölgesel organizasyonunun araştırılmasını sağlamaz13. Bu amaçla, hastaya özgü iPSC'lerden türetilen 3D beyin organoidlerinin kullanımı14 , araştırmacıların ek önemli bilgiler edinmelerine ve böylece mitokondriyal hastalıkların sinir sisteminin gelişimini ve işlevini nasıl etkilediğinin incelenebilmesine yardımcı olabilir15. Mitokondriyal hastalıkları araştırmak için iPSC türevi beyin organoidleri kullanan çalışmalar, mitokondriyal hastalıkların nörogelişimsel bileşenlerini ortaya çıkarmaya başlıyor.

Mitokondriyal hastalık, mitokondriyal ensefalopati, laktik asidoz ve inme benzeri atak sendromu (MELAS) ile ilişkili mutasyonlar taşıyan omurilik organoidleri, kusurlu nörogenez ve gecikmiş motor nöron farklılaşması gösterdi16. Mitokondriyal hastalığı olan Leigh sendromu olan hastalardan elde edilen kortikal organoidler, küçültülmüş boyut, nöral epitel tomurcuk neslinde kusurlar ve kortikal mimari kaybı gösterdi17. Leigh sendromu hastalarından beyin organoidleri, hastalık kusurlarının mitokondriyal metabolizmaya bağlanamayan nöral progenitör hücreler düzeyinde başlatıldığını, anormal nöronal dallanma ve morfogenez18'e neden olduğunu göstermiştir. Bu nedenle, nöral progenitörler mitokondriyal hastalıklar için hücresel bir terapötik hedefi temsil edebilir ve mitokondriyal fonksiyonlarını teşvik eden stratejiler sinir sisteminin fonksiyonel gelişimini destekleyebilir.

Beyin organoidlerinin kullanımı mitokondriyal hastalıkların nörogelişimsel bileşenlerini ortaya çıkarmaya yardımcı olabilir. Mitokondriyal hastalıklar esas olarak erken başlangıçlı nörodejenerasyon olarak kabul edilir5. Bununla birlikte, gelişimsel gecikme ve bilişsel bozukluk da dahil olmak üzere mitokondriyal hastalıklardan etkilenen hastalarda nörogelişimsel kusurlar da mevcuttur19. Hastaya özgü beyin organoidleri bu yönleri ele almaya yardımcı olabilir ve mitokondriyal hastalıkların insan beyin gelişimini nasıl etkileyebileceğini aydınlatabilir. Mitokondriyal disfonksiyon, Alzheimer hastalığı, Parkinson hastalığı ve Huntington hastalığı4 gibi diğer daha yaygın nörolojik hastalıklarda da patogenetik bir rol oynayabilir. Bu nedenle, mitokondriyal kusurların beyin organoidlerini kullanarak nörogelişimdeki etkisinin aydınlatılması da bu hastalıkların incelenmesinde etkili olabilir. Bu makalede, mitokondriyal hastalıkların hastalık modellemesi için kullanılabilecek tekrarlanabilir beyin organoidleri üretmek için ayrıntılı bir protokol açıklanmaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

NOT: İnsan iPSC'lerinin kullanımı etik bir onay gerektirebilir. Bu çalışmada kullanılan iPSC'ler, yerel etik onayı takiben sağlıklı kontrol kişilerinden türetilmiştir (#2019-681). Tüm hücre kültürü prosedürleri steril bir hücre kültürü başlığı altında yapılmalı, kaputun altına aktarılmadan önce tüm reaktifler ve sarf malzemeleri dikkatlice dezenfekte edilmelidir. Farklılaşma için kullanılan insan iPSC'leri, geniş kültür üzerinde oluşabilecek potansiyel genomik sapmaları önlemek için 50'nin altında bir geçiş numarasına sahip olmalıdır. Hücrelerin pluripotent durumu organoid oluşturmadan önce, örneğin NANOG veya OCT4 gibi pluripotency ile ilişkili belirteçlerin ekspresyosu izlenerek doğrulanmalıdır. Mikoplazmasız kültürleri sağlamak için haftalık olarak mikoplazma testleri yapılmalıdır.

1. Beyin organoidlerinin üretimi

  1. İnsan iPSC'lerinin kültürü
    1. iPSC ortamında besleyici içermeyen koşullar altında insan iPSC'lerini kültüre edin ( Malzeme Tablosuna bakın) kaplamalı 6 kuyulu plakalarda ve bunları 37 °C ve% 5 CO2'de nemlendirilmiş bir doku kültürü inkübatöründe tutun.
      NOT: Besleyici hücrelerin taşınması organoid farklılaşmasına engel olabilir. Besleyici içermeyen koşullarda hücreleri en az bir kez geçiş.
    2. 1:4 ile 1:12 arasında değişen oranlarda enzimsiz kopma ortamını kullanarak iPSC'leri %80 iklüziyette geçiştirin. Hücre sağkalımini artırmak için, her bölünmeden sonra 10 μM Rho ilişkili protein kinaz (ROCK) inhibitörü (Y27632) ekleyin.
  2. iPSC'leri ayrıştırın (%80 izdiah)-Gün 0.
    1. Kortikal Farklılaşma Ortamı I (CDMI) Hazırlayın (Tablo 1). Hücrelere eklemeden önce oda sıcaklığında (22-25 °C) ön ısıtma CDMI ortamı.
    2. Ölü hücreleri ve döküntüleri gidermek için iPSC'leri içeren kuyuları fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın.
    3. Her kuyuya 500 μL önceden ısıtılmış Reaktif A (Malzeme Masası) ekleyin ve 37 °C'de 5 dakika kuluçkaya yatırın. Hücre müfrezesini sağlamak için mikroskobun altına bakın.
    4. Aktivitesini nötralize etmek için reaktif A'yı seyreltmek için 1 mL iPSC ortamı ekleyin.
    5. Yukarı ve aşağı pipetleme yaparak hücreleri ayrıştırmak ve hücre süspansiyonu 15 mL santrifüj tüpüne aktarmak için 1000 μL pipet kullanın.
    6. IPSC'leri oda sıcaklığında (22-25 °C) 5 dakika boyunca 125 x g'da hafifçe santrifüjlayın.
    7. Hücre peletini rahatsız etmemek için süpernatantı dikkatlice emiş edin.
    8. Tek hücreli süspansiyon elde etmek için peletin 1 mL CDMI ile yeniden kullanın ve hücre numarasını sayın.
    9. 20 μM KAYA inhibitörü, 3 μM WNT-catenin inhibitörü (IWR1) ve 5 μM SB431542 ile desteklenmiş CDMI'da 100 μL başına 9.000 iPSC ile tohumlama ortamını hazırlayın.
    10. 96 kuyu v-alt plakaya kuyu başına 100 μL tohumlama ortamı ekleyin.
    11. Plakayı 37 °C ve %5 CO2'de nemlendirilmiş bir doku kültürü inkübatöründe tutun.
  3. Nörosfer üretimi
    1. 1. günde, tanımlanmış pürüzsüz kenarlıklara sahip yuvarlak hücre agregalarının (nörosferler) oluştuğunu gözlemleyin. Agregaların etrafındaki ölü hücrelere dikkat edin. 37 °C ve %5 CO2'de inkübatörde kültüre devam edin.
    2. 3. günde, ölü hücreleri ayırmak için yanlara üç kez dokunarak plakayı ajite edin.
    3. Her kuyuya 20 μM KAYA inhibitörü, 3 μM IWR1 ve 5 μM SB431542 ile desteklenmiş 100 μL CDMI ekleyin.
    4. Plakayı 37 °C ve %5 CO2'de inkübatöre geri verin.
    5. 6. günde, her kuyudan 80 μL'lik süpernatan ortamı dikkatlice çıkarın. Kuyunun dibine dokunmaktan kaçının.
    6. Her kuyuya 3 μM IWR1 ve 5 μM SB431542 ile desteklenmiş 100 μL CDMI ekleyin. Plakayı 37 °C ve %5 CO2'de inkübatöre geri verin.
    7. 5. ve 6.
  4. Nörosferlerin transferi
    1. 18. günde Kortikal Farklılaşma Orta II (CDMII) (Tablo 1) hazırlayın ve 100 mm ultra düşük ek hücre kültür plakasına 10 mL ekleyin.
    2. Yuvarlak nörosferleri 96 kuyu plakasından 100 mm ultra düşük ek hücre kültür plakasına aktarmak için ucu kesilmiş 200 μL pipet kullanın.
      NOT: Ucun açılmasının yeterince geniş olduğundan ve agregaların çok hızlı emişli olmadığından emin olarak nörosferlere zarar vermekten kaçınmak için nazik olun.
    3. Nörosferleri içeren plakadan 5 mL orta çıkarın ve 5 mL taze CDMII ekleyin.
      NOT: Bu prosedür, nörosferlerin transferinden taşınmış olabilecek CDMI ortamının miktarını azaltmaya yardımcı olur.
    4. Plakayı 37 °C ve %5 CO2'de nemlendirilmiş bir doku kültürü inkübatörünün içinde 70 rpm'de bir orbital çalkalayıcıya yerleştirin.
      NOT: Ertesi gün nörosferleri görsel olarak inceleyin. Nörosferler birbirine topaklanmışsa veya plakanın altına tutturulmuşsa yörüngesel çalkalayıcının hızını artırın.
    5. Her 3 günde bir, süpernatant ortamı dikkatlice emiş ve yeni CDMII ile değiştirin. Nörosferlerin kurumasını önlemek için az miktarda ortam bırakın.
    6. 35. günde Kortikal Farklılaşma Orta III (CDMIII) (Tablo 1) hazırlayın.
      NOT: Matris bileşeni soğuk CDMIII'de çözülmelidir.
    7. Ortamı plakadan epire edin ve 10 mL soğuk CDMIII ekleyin.
      NOT: Matris bileşeninin kümeler oluşturmadan organoidleri kaplayabilmesi için soğuk ortam kullanmak daha etkilidir.
    8. Ortamı değiştirdikten sonra, plakayı 37 °C ve% 5 CO2'de nemlendirilmiş bir doku kültürü inkübatörünün içinde 70 rpm'de bir yörüngesel çalkalayıcıya geri yerleştirin.
    9. Ortamın renginde belirtildiği gibi, büyüme hızına bağlı olarak her 3-5 günde bir ortamı değiştirin.
    10. 70. günde Kortikal Farklılaşma Orta IV (CDMIV) (Tablo 1) hazırlayın. Organoidlerin istenilen yaşına gelene kadar CDMIV ortamını kullanın. Bu süre zarfında, plakayı nemlendirilmiş bir doku kültürü inkübatörünün (%37 °C ve %5 CO2) içinde 70 rpm'de ayarlanmış bir yörünge çalkalayıcı üzerinde tutun.
    11. Büyüme hızına bağlı olarak ortamı her 3-5 günde bir değiştirin.

2. Beyin organoidlerinin immünostaining

  1. Doku hazırlama
    1. %4 paraformaldehit (PFA) çözeltisi hazırlayın ve bir emniyet başlığının altına yerleştirin.
      NOT: PFA kullanırken kişisel güvenlik ekipmanlarını giyin.
    2. Beyin organoidlerini toplayın ve künt uçlu 3 mL plastik Pasteur pipetle pfa ile dolu 6 kuyulu bir plakaya hafifçe aktarın.
      NOT: Daha yüksek hücresel karmaşıklığa sahip yapıların görselleştirilmesine izin vermek için 40 günden eski organoidleri kullanın.
    3. Organoidleri oda sıcaklığında 1 saat pfa çözeltisinde tutun.
    4. PFA'yı 3 mL plastik Pasteur pipetle dikkatlice çıkarın ve sabit organoidleri PBS kullanarak üç kez yıkayın.
    5. Sabit organoidleri bir sonraki kullanıma kadar PBS'de 4 °C'de saklayın.
  2. Beyin organoid dilimlerinin hazırlanması
    1. % 3 agar çözeltisi hazırlayın ve sıvılanıncaya kadar yavaşça ısıtın.
    2. Kalıbı (10 mL şırıngırın kesilmiş ucu) bir emici filtre kağıdı parçasına (pürüzsüz yan yukarı) yerleştirin. Üzerine bir damla agar yerleştirin.
    3. 6 kuyulu plakadan tek bir organoidi spatula ile hızla çıkarın ve filtre kağıdı ile aşırı PBS'yi çıkarın.
      NOT: Organoide doğrudan filtre kağıdı ile dokunmamaya dikkat edin.
    4. Organoidi agar damlasının üzerine yerleştirin.
    5. Bu işlemi en fazla üç organoid ile tekrarlayın.
      NOT: Bu adım sırasında agarın katılaşmasını önlemek için hızlı çalışın.
    6. Tüm organoidler tamamen kaplanana kadar kalıbı agar ile doldurun.
    7. Agar katılaşmaya başlayana kadar bekleyin ve ardından emici filtre kağıdı da dahil olmak üzere organoidleri içeren tüm kalıbı hafifçe bir soğutma elemanına aktarın.
      NOT: Bir soğutma elemanı kullanılamıyorsa, organoidleri 4 °C'de bir buzdolabında birkaç dakika saklayın.
    8. Bu arada, dilimleme prosedürüne hazırlanın: vibratozun tutucusuna bir jilet (asetonla temizlenmiş ve çift damıtılmış suyla yıkanmış) yerleştirin, banyoya monte edin ve PBS ile doldurun.
    9. Kalıbı (katılaşmış) agardan çıkarın ve bir küp oluşturmak için kırpmak için bir neşter kullanın.
    10. Vibratomu taşıyıcı plakasına organoidleri içeren agar küpünü yapışkan jel ile takın ( Malzeme Tablosuna bakın) ve PBS içeren banyoya yerleştirin.
    11. Vibratomu ( Malzeme Tablosuna bakın) 150 μm kalınlığında dilimleri kesecek şekilde ayarlayın.
      NOT: Vibratom ayarları (bıçağın uygun açısı, genliği, sıklığı ve hızı) erken doğum sonrası hayvanlardan elde edilen sabit beyin dokusunu dilimlemede kullanılanlara benzer olabilir. Bununla birlikte, ideal ayarlar vibratomun türüne güçlü bir şekilde bağlıdır ve kesim yaparken dokunun bozulmasını ve hatta yırtılmasını önlemek için ilk adımda belirlenmelidir.
    12. Kesme işlemine başlayın. Taze kesilmiş her dilimi PBS ile dolu 24 kuyulu bir tabağa hafifçe aktarmak için bir cam pipet veya spatula kullanın.
    13. Dilimler içeren plakayı bir sonraki işleme kadar 4 °C'de (birkaç güne kadar) saklayın.
    14. Dilimleri bir cam pipet veya spatula ile plakadan mikroskop slaytlarına aktarın. Slayt başına en az 2 dilim kullanın.
    15. Agar ve fazla PBS'yi bir şırıngarla dikkatlice çıkarın.
    16. Dilimlerin slaytlara yapışana kadar kurumasını bekleyin.
      NOT: Mikroskop kaydıraklar PBS ile dolu plastik odalarda 4 °C'de saklanabilirken, dilimleme işleminden sonra mümkün olan en kısa sürede boyanmalıdır.
  3. İmmünohistokimyasal lekeleme
    1. Engelleme çözümünü hazırlayın (Tablo 1).
    2. Slaytlardaki tüm çözümlerin kalmasına yardımcı olmak için slayttaki dilimlerin etrafına hidrofobik bir kenarlık çizmek için pap kalem kullanın.
    3. Engelleme solüsyonlarını slayda dikkatlice ekleyin ve oda sıcaklığında (22-25 °C) 1 saat kuluçkaya yatırın. Dokuyu yok etmekten kaçınmak için çözeltiyi doğrudan dilimlerin üzerine eklemeyin.
    4. Blokaj çözeltisini epire edin ve istenen birincil antikoru blokaj çözeltisinde seyreltilmiş olarak uygulayın.
    5. Slaytı 4 °C'de nemlendirilmiş bir odada gece boyunca kuluçkaya yatırın.
    6. Slaydı her biri 10 dakika boyunca 1x PBS ile üç kez durulayın.
    7. Dilimleri blokaj çözeltisinde seyreltilmiş spesifik ikincil antikorla kuluçkaya yatırın ve karanlıkta oda sıcaklığında 1 saat boyunca Hoechst lekeleme (1:2.500) gerçekleştirin.
      NOT: Spesifik olmayan bağlama veya otomatik floresan olmadığını onaylamak için negatif denetimler gerçekleştirmeyi unutmayın.
    8. Karanlıkta her biri 10 dakika boyunca 1x PBS ile üç kez durulayın.
    9. Dilime bir damla montaj ortamı ekleyin, damlanın kenarına bir kapak ucu yerleştirin ve hava kabarcıklarını önlemek için örtü kapağını yavaşça dilime doğru yerleştirin.
    10. Kaydırağın oda sıcaklığında gece boyunca dinlenmesine izin verin. Slaydı daha fazla mühürlemek için kapak kapağının sınırına oje sürün. Uzun süreli depolama için 4 °C'de saklayın.
  4. Boyama belgeleri
    1. Büyük görüntüleri dikiş için taramak için, yüksek kaliteli bir amaç ile donatılmış motorlu bir dik geniş alan mikroskobu (ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın) yararlanın; DAPI filtre seti (örneğin, ekscitasyon (EX): 340-380 nm, dikroik ayna (DM): 400 nm, bariyer filtresi (BA): 435-485 nm); floresan izotiyosiyanat filtre seti (örneğin, EX: 465-495 nm, DM: 505 nm, BA: 515-555 nm); Alexa594 filtre seti (örneğin, ET 575/40; T 600 LPXR; HC 623/24); dijital kamera; otomatik dikişlere ve yığın işlemlerine izin sağlayan yüksek performanslı alım yazılımı.
    2. Görüntü işleme için, 8 bit tif dosyaları oluşturabilen, dikişleri kırpabilen, kontrastı ve parlaklığı ayarlayabilen, kanalları (örneğin mavi, yeşil ve kırmızı) birleştirebilen ve ölçek çubukları ekleyebilen bir görüntü işleme programı kullanın.
    3. Ayrıntıları taramak için, yüksek kaliteli bir amaç, bir UV lazer (EX: 408 nm), bir Argon lazer (EX: 488 nm), bir Helyum-Neon lazer (EX: 543), konfokal mikroskop için görüntüleme yazılımı ile donatılmış motorlu bir konfokal lazer tarama mikroskobu kullanın.
    4. Ayrıntıların görüntü işlemesi için, konfokal z yığınlarının maksimum yoğunluklu projeksiyonlarını (örneğin, her biri 0,6 μm optik bölümler) oluşturabilen, 8 bit tif dosyaları oluşturabilen, kontrastı ve parlaklığı ayarlayabilen, kanalları (örneğin, mavi, yeşil ve kırmızı) birleştirebilen, ölçek çubukları ekleyebilen bir görüntü işleme programı kullanın.
    5. Şekilleri düzenlemek için bir grafik düzenleyici kullanın.

3. Beyin organoidlerinin biyoenergetik profillenerek

  1. Biyoenergetik profilleme için organoidlerin hazırlanması
    1. Üreticinin protokolüne uyarak papain ve DNase çözümünü hazırlayın.
    2. 3-5 organoidi 6 kuyulu bir tabağa aktarın. Önceden ısıtılan PBS ile iki kez yıkayın.
    3. DNase içeren 2 mL önceden ısıtilmiş aktif papain çözeltisi ekleyin. Bir bıçak kullanarak organoidleri küçük parçalara ayırın.
    4. Plakayı bir hücre kültürü inkübatörünün içinde (37 °C, %5 CO2'de) 27 rpm'de ayarlanmış bir yörünge çalkalayıcıya yerleştirin ve 15-20 dakika kuluçkaya yatırın.
      NOT: Kuluçka süresi organoid evreye bağlıdır. Erken evre organoidler olduğu gibi kullanılabilir. 3 aydan büyük organoidler için, organoidlerin ayrışmadan önce 2-3 parçaya kesilmesi ve parçaların 37 ° C'de 15-20 dakika boyunca 27 rpm'de ayarlanmış bir sallanma hızında kuluçkaya yatması önerilir. Bu prosedür, ileri evre organoidlerde bulunabilecek nekrotik dokunun giderilmesine yardımcı olabilir.
    5. Sindirilen dokuları 15 mL'lik bir tüpe toplayın ve 5 mL organoid kültürü orta CDMIV ekleyin (Tablo 1).
    6. 10-15 kez yukarı ve aşağı pipetleme ile 10 mL plastik pipet ile dokuyu üç katına çıkın. Bozulmamış dokunun tüpün dibine yerleşmesine izin verin.
    7. Hücre süspansiyonu, herhangi bir ayrışma dokusu parçasından kaçınarak 15 mL'lik bir tüpe dikkatlice aktarın. Çözeltiyi 40 μm hücre süzgeçten (örneğin, hücre süzgeç kapaklı polistiren yuvarlak dip tüpleri) filtreleyin.
    8. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleme yaparak hücreleri peletin.
    9. Trypan mavisi kullanarak hücre numarasını ve kalitesini değerlendirin.
    10. Kaplamalı 96 kuyulu mikro plakalar üzerine istediğiniz sayıda (~20.000/well) plakalayın. Kaplamadan sonra orta 6-8 saat ortasını Nöronal Orta olarak değiştirin (Tablo 1).
    11. Kaplanmış 96 kuyulu mikro plakayı 4 gün boyunca bir CO2 inkübatörde (37 °C, % 5 CO2) kuluçkaya yatırın.
  2. Biyoenergetik profil oluşturma
    1. Ayrışmış hücreleri yeniden biriktikten sonra 3. günde, 96 kuyulu mikro plakanın alt kısmının her kuyusuna 200 μL kalibrasyon çözeltisi ekleyin ve üst yeşil sensör kartuşunu hidratlı mikro plakanın üzerine yerleştirin.
      NOT: Sensör kartuşunu mikro plakanın üzerine doğru yönde yerleştirin ve kalibrasyon çözeltisinin tüm sensörleri kapsadığından emin olun.
    2. Hidratlı 96 kuyulu mikro plakayı bir gecede 37 °C'de CO2 olmayan bir inkübatörde kuluçkaya yatırın.
    3. Cihazın bir gecede 37 °C'de stabilize olmasını sağlamak için analizörü açın.
    4. Yeniden kaplamadan sonraki 4. günde, hücrelerin birleştirilmiş monolayer olarak göründüğünden emin olmak için mikroskop altındaki 96 kuyulu mikro plaka üzerindeki ilişkisiz organoid kültürünü inceleyin.
    5. Tahlil Orta Hazırlanın (Tablo 1).
    6. Hücre hasarını önlemek için kuyunun dibine dokunmadan nöronal ortamı bir pipetle tüm kuyulardan çıkarın. Alternatif olarak, tüm plakayı dikkatlice ters çevirin ve ardından temiz kağıt üzerinde kurulayın. Hücre ölümünü önlemek için hızlı bir şekilde çalışın.
    7. Hücreleri önceden ısıtılan 200 μL Assay Medium ile iki kez yıkayın. Kuyu başına 180 μL'lik son hacme Assay Medium ekleyin. 96 kuyulu mikro plakayı 1 saat boyunca 37 °C'de CO2 olmayan bir inkübatörde kuluçkaya yatırın.
    8. Tahlil ortamında mitokondriyal inhibitörlerin 10 μM çözeltilerini hazırlayın. Enjeksiyondan sonraki son konsantrasyonun 1 μM olduğunu unutmayın.
    9. Hidratlı mikro plakaya yerleştirilen sensör kartuşunu mitokondriyal inhibitörlerin 10x çözeltileriyle yükleyin.
      1. A portuna 18 μL mitokondriyal inhibitör 1 ekleyin.
      2. B portuna 19,8 μL mitokondriyal inhibitör 2 ekleyin.
      3. C portuna 21,6 μL mitokondriyal inhibitör 2 ekleyin.
      4. D portuna 23,4 μL mitokondriyal inhibitör 3 ekleyin.
    10. Yüklü kartuşu hidratlı mikro plakaya, test başlayana kadar 37 °C'de CO2 olmayan bir inkübatöre yerleştirin.
    11. Cihazın yazılımında çalışan bir protokol ayarlayın (Tablo 2).
    12. START tuşuna basın. Yüklü kartuşu CO2 olmayan inkübatörden alın ve kalibrasyon için analizöre yerleştirin.
      NOT: Plakanın doğru yönde ve kapaksız olarak yerleştirildiğinden emin olun.
    13. Kalibrasyon adımı sona erdiğinde kalibrasyon plakasını çıkarın. 96 kuyulu mikro plakayı CO2 olmayan inkübatörden alın ve analizöre yerleştirin. Ölçümleri başlatmak için DEVAM'a tıklayın.
    14. Çalışma bittiğinde, 96 kuyulu hücre kültürü mikro plakasını analizörden çıkarın ve hücreleri rahatsız etmeden ortamı tüm kuyulardan toplayın.
      NOT: Ortam -20 °C'de saklanabilir ve daha sonra uygun bir laktat tahlil kiti kullanılarak ortamdaki hücreler tarafından salınan laktat miktarını ölçmek için kullanılabilir.
    15. Hücreleri her kuyuda 200 μL 1x PBS ile yıkayın.
    16. PBS'yi çıkardıktan sonra plakayı -20 °C'de dondurun.
      NOT: Donmuş plaka, mikro plakanın her kuyusundaki hücreleri, proteinleri veya DNA'yı ölçmek için kullanılabilir. Elde edilen biyoenergetik oranları normalleştirmek için bu niceleme gerekli olacaktır. Hücre, protein veya DNA nicelleştirme tahlilleri için üreticinin yönergelerini izleyin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Burada açıklanan protokol, yuvarlak organoidlerin sağlam bir şekilde üretilmesini kolaylaştırır (Şekil 1A). Oluşturulan organoidler, aksonlara (SMI312) ve dendritlere (mikrotübül ilişkili protein 2 (MAP2)) özgü protein belirteçleri kullanılarak görselleştirilebilen olgun nöronlar içerir (Şekil 1B). Olgun organoidler sadece nöronal hücreler (MAP2-pozitif) değil, aynı zamanda glial hücreler (örneğin, astrosit beli...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu makale, insan iPSC türevi beyin organoidlerinin tekrarlanabilir neslini ve mitokondriyal hastalık modellemesi için kullanımlarını açıklamaktadır. Burada açıklanan protokol, önceden yayımlanmış bir çalışma20 temel alınarak değiştirilir. Mevcut protokolün en büyük avantajlarından biri, her organoidin bir iskele matrisine manuel olarak gömülmesini gerektirmemesidir. Aslında, matris çözeltisi hücre kültürü ortamına basitçe çözülür. Ayrıca, organoidler standart doku kültüründe kültürlendirilebildiği...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar rakip finansal veya finansal olmayan menfaatler beyan etmemektedir.

Teşekkürler

Teknik destek için Miriam Bünning'e teşekkür ederiz. Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (PR1527/5-1 to A.P.), Spark ve Berlin Sağlık Enstitüsü (BH) (BH Doğrulama Fonları A.P.), Birleşik Mit'ten destek kabul ediyoruzOchondrial Disease Foundation (UMDF) (Leigh Syndrome International Consortium Grant to A.P.), University Hospital Duesseldorf (Forschungskommission UKD to A.P.) ve Almanya Federal Eğitim ve Araştırma Bakanlığı (BMBF) (e: Bio genç araştırmacı A.P.'ye AZ 031L0211 verir). C.R.R. laboratuvarındaki çalışmalar DFG tarafından desteklendi (FOR 2795 "Synapses under stress", Ro 2327/13-1).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
2-merkaptoetanolGibco31350-010
Affinity DesignerSerif (Europe) LtdDüzen yazılımı; Vektör grafik editörü
Alexa Fluor 488 eşek anti-kobaySigma AldrichSAB4600033-250UL1:300
Alexa Fluor 488 eşek anti-fareThermo Fisher ScientificA-315711:300
Antimisin ASigma Aldrich1397-94-0
Anti-β-Tubulin III (TUJ-1)Sigma AldrichT85781:2000
Argon LazerMelles GriotDiğer herhangi bir Lazer, örneğin 488 yayan diyot lazerler de iyidir,
Askorbik asitSigmaA92902
B-27 A VitaminiGibco17504044
Bacto AgarBecton DickinsonPBS'de% 3, çözeltiyi -20 °C'de saklayın; C
BDNFMiltenyi Biotec130-093-0811
cAMPSigmaD0627
Hücre Yıldızı hücre kültürü 6 kuyulu plakaGreiner-Bio-One657160
Kimyasal Olarak Tanımlanmış Lipid KonsantresiGibco11905031
Konfokal lazer tarama mikroskobu C1Nikon Mikroskop ÇözümleriModüler konfokal mikroskop sistem
Corning Matrigel Büyüme Faktörü Azaltılmış (GFR) Bazal membran matrisi, Fenol Kırmızısı içermez, LDEV içermezCorning356231Matrisi bileşeni
CyQUANT Hücre Proliferasyon Test KitiThermo FisherC7026
DMEM/F12ThermoFisher31330038
DMSOSigmaD2660-100ML
Eşek keçi karşıtı Cy3Merck MilliporeAP180C1:300
Eşek anti-fare Cy3Merck MilliporeAP192C1:300
Eşek anti-tavşan Cy3Merck MilliporeAP182C1:300
DPBSGibco14190250
DS-Q1Mc kameraNikon Mikroskop Çözümleri
Eclipse 90i dik geniş alan mikroskobuNikon Mikroskop Çözümleri
Eclipse E 600FN dik mikroskopNikon Mikroskop Çözümleri
Eclipse Ts2 Ters MikroskopNikon Microsope Solutions
EZ-C1 Silver Sürüm 3.91Nikon Mikroskop ÇözümleriKonfokal mikroskop FCCP için görüntüleme yazılımı
Sigma Aldrich370-86-5
Fetal Sığır SerumuGibco10270-106
GDNFMiltenyi Biotec130-096-291
Glasgow MEMGibco11710-035
Cam Pastör pipetMarka747715Ters
GlutamaxGibco35050-061
Helyum-Neon LazerMelles Griottüm Lazerler, örneğin 594 yayan diyot lazerler iyidir, ayrıca
HeparinMerckH3149-25KU
HERACell 240i CO2 İnkübatörThermo Scientific51026331
Hoechst 33342InvitrogenH35701:2500
Image J 1.53cWayne Rasband Ulusal SağlıkGörüntü işleme Yazılımı
Injekt Solo 10 mL/ LuerBraun4606108V
Nakavt Serum DeğiştirmeGibco10828010
Lazer (407 nm)TutarlıDiğer Lazerler, örneğin 407 yayan diyot lazerler de iyidir
Map2Sinaptik SistemlerNo. 1880041:1000
Maxisafe 2030i
MEM NEAAGibco11140-050
mTeSR PlusKök Hücre Teknolojisi85850iPSC orta
Multifuge X3R SantrifüjThermo Scientific10325804
MycoAlert Mikoplazma Tespit KitiLonza# LT07-218
N2 TakviyesiGibco17502-048
Tek kullanımlık iğne (23G x 1" TW)Neoject10016
NIS-Elements Aadvanced Research 3.2NikonGörüntüleme yazılımı
Oligomisin ASigma Aldrich75351
Orbital Shaker Heidolph Unimax 1010Heidolph543-12310-00
PAP PenSigmaZ377821-1EASlaytlarda hidrofobik bariyer çizmek için.
Papain Ayrışma Sistemi kitiWorthingtonLK003150
ParaformaldehitMerckPBS'de %4 818715, solüsyonu -20 °C'de saklayın; C
Pasteur pipeti 7mLVWR612-16813 mL'ye kadar dereceli
Penisilin-StreptomisinGibco15140-122
Plan Apo VC 20x / 0.75 hava DIC N2  ∞/0.17 WD 1.0 NikonMikroskop ÇözümleriKuru Mikroskop Objektif
Planı Apo VC 60x / 1.40 yağ DIC N2 ∞/0.17 WD 0.13Nikon Mikroskop ÇözümleriYağa Daldırma Mikroskobu Objektif
Polistiren Petri kabı (100 mm)Greiner Bio-One664161
Hücre süzgeç kapaklı polistiren yuvarlak tabanlı tüp (5 mL)Falcon352235
Potasyum klorürRoth6781.1
ProLong Cam Antifade MoutantInvitrogenP36980
Kalitatif filtre kağıdıVWR516-0813
Kaya İnhibitörMerckSCM075
RotenoneSigma83-794
S100 ve beta;AbcamAb111781:600
SB-431542Cayman Kimya Şirketi13031
Neşter bıçaklarıHeinz Herenz Hamburq1110918
SMI312Biolegend8379041:500
Sodyum bikarbonatMerck/Sigma31437-1kg-M
Sodyum klorürRoth3957
Sodyum dihidrojen fosfatApplichem131965
Sodyum PiruvatGibco11360070
SOX2Santa Cruz BiyoteknolojiSc-173201:100
StemPro Accutase Hücre Ayrışma ReaktifiGibco/StemProA1110501Reaktif A
Süper Yapıştırıcı JelUHU63261yapışkan jel
SuperFrost PlusVWR631-0108
Tek kullanımlık şırınga (1 mL)BD Plastipak300015
TB2 TermoblokBiometra
TC Plakası 24 KuyuSarstedt83.3922
TC Plaka 6 KuyuSarstedt83.392
TGFbeta3Miltenyi Biotec130-094-007
Doku Kültürü BaşlığıThermoFisher51032711
TOM20Santa Cruz BiyoteknolojiSC-114151:200
Triton-XMerckX100-5ML
UltraPure 0.5M EDTAInvitrogen15575020
Vibratom Mikrom HM 650 VThermo ScientificÜretim sonlandırıldı, diğer ayarlanabilir mikrotomlar da iyidir.
Vibratom Wilkinson Klasik Tıraş BıçağıWilkinson Kılıç70517470
Whatman BenchkoteMerck/Sigma28418852
Wnt Antagonisti IEMD Millipore Corp3378738
XF 96 hücre dışı akı analizörüDenizatı Biyobilim100737-101
XF Testi DMEM OrtaDenizatı Biyobilimi103680-100
XF Kalibrant Çözeltisi DenizatıBiyobilimi100840-000
XFe96 FluxPak (96 kuyulu mikroplaka)Denizatı Biyobilimi102416-100
Diğer Enstitüsü

Kaynaklar

  1. Koopman, W. J., Willems, P. H., Smeitink, J. A. Monogenic mitochondrial disorders. New England Journal of Medicine. 366 (12), 1132-1141 (2012).
  2. Gorman, G. S., et al. Mitochondrial diseases. Nature Review Disease Primers. 2, 16080(2016).
  3. Vafai, S. B., Mootha, V. K. Mitochondrial disorders as windows into an ancient organelle. Nature. 491 (7424), 374-383 (2012).
  4. Carelli, V., Chan, D. C. Mitochondrial DNA: impacting central and peripheral nervous systems. Neuron. 84 (6), 1126-1142 (2014).
  5. Russell, O. M., Gorman, G. S., Lightowlers, R. N., Turnbull, D. M. Mitochondrial diseases: hope for the future. Cell. 181 (1), 168-188 (2020).
  6. Weissig, V. Drug development for the therapy of mitochondrial diseases. Trends in Molecular Medicine. 26 (1), 40-57 (2020).
  7. Tyynismaa, H., Suomalainen, A. Mouse models of mitochondrial DNA defects and their relevance for human disease. EMBO Reports. 10 (2), 137-143 (2009).
  8. Ma, H., et al. Metabolic rescue in pluripotent cells from patients with mtDNA disease. Nature. 524 (7564), 234-238 (2015).
  9. Galera-Monge, T., et al. Mitochondrial dysfunction and calcium dysregulation in Leigh syndrome induced pluripotent stem cell derived neurons. International Journal of Molecular Science. 21 (9), 3191(2020).
  10. Zheng, X., et al. Alleviation of neuronal energy deficiency by mTOR inhibition as a treatment for mitochondria-related neurodegeneration. Elife. 5, 13378(2016).
  11. Lorenz, C., et al. Human iPSC-derived neural progenitors are an effective drug discovery model for neurological mtDNA disorders. Cell Stem Cell. 20 (5), 659-674 (2017).
  12. Inak, G., et al. Concise review: induced pluripotent stem cell-based drug discovery for mitochondrial disease. Stem Cells. 35 (7), 1655-1662 (2017).
  13. Chiaradia, I., Lancaster, M. A. Brain organoids for the study of human neurobiology at the interface of in vitro and in vivo. Nature Neuroscience. 23 (12), 1496-1508 (2020).
  14. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocol. 9 (10), 2329-2340 (2014).
  15. Liput, M., et al. Tools and approaches for analyzing the role of mitochondria in health, development and disease using human cerebral organoids. Developmental Neurobiology. , (2021).
  16. Winanto, K. Z. J., Soh, B. S., Fan, Y., Ng, S. Y. Organoid cultures of MELAS neural cells reveal hyperactive Notch signaling that impacts neurodevelopment. Cell Death and Disease. 11 (3), 182(2020).
  17. Romero-Morales, A. I., et al. Human iPSC-derived cerebral organoids model features of Leigh Syndrome and reveal abnormal corticogenesis. bioRxiv. , (2020).
  18. Inak, G., et al. Defective metabolic programming impairs early neuronal morphogenesis in neural cultures and an organoid model of Leigh syndrome. Nature Communications. 12 (1), 1929(2021).
  19. Falk, M. J. Neurodevelopmental manifestations of mitochondrial disease. Journal of Developmental & Behavioral Pediatrics. 31 (7), 610-621 (2010).
  20. Velasco, S., et al. Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature. 570 (7762), 523-527 (2019).
  21. Pfiffer, V., Prigione, A. Assessing the bioenergetic profile of human pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 1264, 279-288 (2015).
  22. Ludikhuize, M. C., Meerlo, M., Burgering, B. M. T., Colman, R. M. J. Protocol to profile the bioenergetics of organoids using Seahorse. STAR Protocols. 2 (1), 100386(2021).
  23. Menacho, C., Prigione, A. Tackling mitochondrial diversity in brain function: from animal models to human brain organoids. International Journal of Biochemestry & Cell Biology. 123, 105760(2020).
  24. Del Dosso, A., Urenda, J. P., Nguyen, T., Quadrato, G. Upgrading the physiological relevance of human brain organoids. Neuron. 107 (6), 1014-1028 (2020).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

İnsan iPSC'leriOrganoid ÜretimiKortikal DiferansiyasyonNörosfer OluşumuBiyoenerjetik ProfillemeKonfokal GörüntülemeOksijen Tüketim HızıMitokondriyal Metabolizma
Mitokondriyal Hastalık Modellemesi için İnsan Beyni Organoidlerinin Üretimi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.