Yöntem makalesi

iNEXT-Discovery ve Instruct-ERIC: Yapısal Biyolojide Translasyonel Araştırmalar için Üst Düzey Hizmetleri Entegre Etme

DOI:

10.3791/63435

⸱

16 Kasım 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Biochemistry and Oncode Institute, The Netherlands Cancer Institute, Amsterdam, 2CERM/CIRMMP, University of Florence, 3Instruct-ERIC, Oxford University, 4MISTRAL beamline, Alba Light Source, 5Center for Biomolecular Magnetic Resonance (BMRZ), Goethe University Frankfurt, 6Division of Structural Biology, Oxford University, 7Macromolecular Crystallographyy, Helmholtz-Zentrum Berlin

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TARTIŞILAN MAKALELER:

Ahmad, M. U. D. et al. Parça tabanlı kurşun keşfinde tarama için nano diferansiyel taramalı florimetri. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi: JoVE. (171), E62469 (2021).

Barbieri, L., Luchinat, E. Yüksek hücre yoğunluklu bir biyoreaktör kullanarak gerçek zamanlı kantitatif hücre içi NMR ile insan hücrelerinde protein-ligand etkileşimlerinin izlenmesi. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi: JoVE. (169), E62323 (2021).

Berg, H. et al. Minimum örneklem ancak maksimum otomasyon modunda NMR tabanlı parça taraması. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi: JoVE. (172), E62262 (2021).

Beriashvili, D., Schellevis, R. D., Napoli, F., Weingarth, M., Baldus, M. Katı hal NMR ile doğal zarlardaki proteinlerin yüksek çözünürlüklü çalışmaları. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi: JoVE. (169), E62197 (2021).

Cornaciu, I. et al. Grenoble'daki EMBL HTX tesisindeki otomatik kristalografi boru hatları. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi: JoVE. (172), E62200 (2021).

Crawshaw, A. et al. VMXm ışın hattındaki mikro kristaller için bir numune hazırlama boru hattı. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi: JoVE. (172), E62306 (2021).

Douangamath, A. et al. XChem tesisinde elmas ışık kaynağında verimli parça taraması elde etmek. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi: JoVE. (171), E62414 (2021).

Groen, J. et al. Cryo Soft X-ışını tomografisi ile hücrenin 3 boyutlu kartografik tanımı. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi: JoVE. (169), E62190 (2021).

Horrell, S. et al. Elmas ışık kaynağında sabit hedef seri veri toplama. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi: JoVE. (168), E62491 (2021).

Jiménez-Moreno, A. et al. Cryo-EM ve scipion ile tek parçacık analizi. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi: JoVE. (171), E62261 (2021).

Moravcová, J., Pinkas, M., Holbová, R., Nováček, J. CryoElectron tomografisi için Saccharomyces cerevisiae'nin hazırlanması ve CryoFIB mikro işlemesi. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi: JoVE. e62351 (2021).

Vyas, N. et al. Kriyojenik olarak korunmuş hücrelerden kriyo yapılı aydınlatma mikroskobik veri toplama. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi: JoVE. (171), E62274 (2021).

Weis, F., Hagen, W. J. H., Schorb, M., Mattei, S. Kriyojenik elektron tomografisi veri toplamasının optimizasyonu için stratejiler. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi: JoVE. (169), E62383 (2021).

White, J. B. R. et al. Tek parçacıklı kriyo-elektron mikroskobu: Numuneden yapıya. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi: JoVE. (171), E62415 (2021).

Wollenhaupt, J. et al. Helmholtz-zentrum Berlin'de kristalografik parça taraması için iş akışı ve araçlar. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi: JoVE. (169), E62208 (2021).

Editöryal

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yapısal biyoloji alanı, biyomoleküler yapıların atomik detayları aracılığıyla biyolojiyi anlamak için güçlü bir sistem haline gelmiş, biyokimyasal yollar ve hastalıkların moleküler temelleri hakkındaki anlayışımızı zenginleştirmiş ve translasyonel araştırmalar için vazgeçilmez bir araç sunmuştur.

Yıllar geçtikçe, yapısal biyoloji, statik yapılar sağlamanın çok ötesine geçerek, hem çözeltideki hem de hücrelerdeki moleküler etkileşimleri rapor ederek, zaman ölçeklerini ve dinamikleri inceledi. Atomlardan ve tek tek moleküllerden tüm virüs parçacıklarına ve hücrelerine kadar farklı boyut ölçeklerindeki süreçleri açıklamak için bilgi elde edilebilir. Farklı teknolojiler, X-ışınlarına, nötronlara veya elektronlara dayalı saçılma yöntemleri (örneğin, X-ışını kristalografisi (MX) veya küçük açılı X-ışını saçılımı (SAXS); katı hal ve çözelti nükleer manyetik rezonans (NMR); ve kriyo-elektron mikroskobu (kriyo-EM) ile tek parçacık rekonstrüksiyonu. Kriyo-EM tomografi, kriyo-yumuşak X-ışını tomografisi ve hücre içi NMR gibi yöntemler, özellikle diğer görüntüleme araçlarıyla bağlantılı olarak makromoleküler sistemleri incelemeye yönelik bu yaklaşım cephaneliğine katkıda bulunur. Moleküler etkileşimin afiniteleri ve zaman ölçekleri hakkında tamamlayıcı bilgiler sağlayan ek biyofiziksel yöntemlerle birlikte, bütünleştirici yapısal biyoloji günümüzde yaşamı anlamak ve ilaçlar, biyolojik maddeler (antikorlar, nanokorlar, aşılar), biyomalzemeler ve plastiği parçalamak ve çevreye yardımcı olmak için kullanılabilecek enzimler gibi diğer biyolojik ajanları geliştirmek için müthiş bir paket sunmaktadır.

Avrupa Komisyonu (AK), yapısal biyoloji araştırmalarının toplum için sahip olduğu faydaları erkenden fark etti ve 1980'lerden beri Avrupa, pahalı yapısal biyoloji ekipmanlarını daha geniş bilimsel topluluğa ücretsiz olarak açmak için güçlü bir şekilde yatırım yaptı. Milyonlarca Euro'luk tesislere erişimin bu demokratikleşmesi, yapısal biyoloji alanını uluslararası alanda geliştirmek için itici bir güç ve temel taşıydı. Bu, Avrupa'yı alanın en ileri noktasına yerleştirdi, böylece güçlü bir sanayi sektörü sağladı ve yerel ekonomilere katkıda bulundu.

Avrupa Komisyonu, yapısal biyoloji teknolojilerine dış araştırmacıların erişimi ve eğitimi konusunda uzun ve etkileyici bir geleneğe sahiptir. 2019'un sonuna kadar üst düzey tesislere ve tüm Avrupalı araştırmacılara ücretsiz yapısal biyoloji erişimi sağlayan başarılı iNEXT programının (Translasyonel araştırmalar için NMR, EM ve X-ışınları altyapısı) ardından, Horizon2020 projesi iNEXT-Discovery, yapısal biyoloji altyapılarına tamamen finanse edilen dört yıllık bir erişim dönemi için Şubat 2020'de başladı. Buna paralel olarak, Instruct-ERIC, Avrupa ve uluslararası bilim toplulukları için yapısal biyolojide sürdürülebilir bir kale oluşturan Avrupa Araştırma Altyapıları Strateji Forumu'nun bir Dönüm Noktasıdır. Birlikte, yaşam bilimcileri ve diğerlerini yapısal biyoloji araştırmalarına dahil etmeyi amaçlıyorlar ve bunun için hem akademi hem de endüstriden araştırmacılara dünya çapındaki en iyi yapısal biyoloji uzmanlığından, teknolojilerinden ve tesislerinden bazılarına erişim sunuyorlar. Ek ortaklarla birlikte atölye çalışmaları ve uygulamalı eğitimler de düzenliyorlar.

Covid19 salgını nedeniyle, iNEXT-Discovery ve Instruct-ERIC araştırma tesislerine seyahat büyük ölçüde bozuldu ve esasen uygulamalı eğitim fırsatlarını yasakladı. Bunu kısmen telafi etmek için, iNEXT-Discovery ve Instruct-ERIC, web semineri serileri (https://inext-discovery.eu/events/what-can-inext-discovery-do-for-us, https://instruct-eric.eu/content/instructeric-webinar-series-structure-meets-function) ve Journal of Visualized Experiments'in bu özel Yöntemler sayısını düzenledi. Burada, yalnızca ana akım erişim prosedürlerimizin birçoğu için değil, aynı zamanda bütünleştirici yapısal biyoloji alanında geliştirilmekte olan özel rutinler için de ayrıntılı açıklamalar bulacaksınız. Yöntemlerimiz bu sayıda ayrıntılı olarak açıklanırken, bazıları yerel olarak kurulması zor olan uzmanlık ve ekipman gerektirir. Instruct-ERIC ve iNEXT-Discovery tesisleri, yüksek vasıflı yerel personelin yardımı ve gözetimi ile yapısal çalışmalar için gerekli biyomoleküllerin üretimi de dahil olmak üzere bu yöntemleri sağlamak için mevcuttur.

Makromoleküler yapıların belirlenmesi için geliştirilmiş yöntemler
Son on yılda, kriyo-EM, makromoleküler karmaşık yapıları belirlemek için oldukça popüler bir teknoloji haline geldi. Leeds Üniversitesi'nden (İngiltere) ekip, iş akışı sırasında optimize edilebilecek değişkenlere ve yaygın sorunların giderilmesine odaklanarak tek parçacıklı EM analizinde yer alan tüm adımlara genel bir bakış sunmaktadır1. Harici kullanıcılar tarafından çevrimiçi mikroskop çalışmasının standart hale gelmesiyle, verimli uzaktan çalıştırma ve görüntüleme için protokoller gereklidir. Tek parçacık analiziyle, parçacıkları rastgele yönlerde gösteren filmler üretmek için vitrifiye numuneler görüntüleniyor. Bir görüntü işleme iş akışı, incelenen numunenin yeniden yapılandırılması için parametreleri tanımlar. CSIC'den (ES) Scipion yazılımı, bu iş akışını oluşturmak için tüm araçları sağlar ve ayrıca sonuçların doğrudan izlenebilirliğine olanak tanır2.

Çok küçük kristal numuneler üzerinde X-ışını kırınım verilerinin toplanması, teknik zorlukların yanı sıra büyük araştırma fırsatları da sunar. Diamond (İngiltere) ekibi, numuneden önce ve sonra X-ışını yolunda bir vakum içeren özel bir ışın hattı ortamında veri toplamadan önce, düşük gürültülü bir destek üzerinde minimum çevreleyen sıvı ile tek bir ızgara üzerinde yüzlerce mikro kristal hazırlamak için kriyo-EM araçlarının kullanımını sunar3. Senkrotronlarda seri X-ışını verilerinin toplanması, diğer zor kristal sistemleri incelemek için de bir anahtardır. Başka bir katkıda, Diamond, bir dizi örnek aracılığıyla çeşitli kristal dağıtım sistemlerini kullanarak veri toplama için adım adım talimatlar, şekiller ve videolar gösterir4.

İlaç keşfinde modern bütünleştirici yapısal biyoloji
X-ışını kristalografisi, fragman bazlı ilaç keşfi için iyi bir şekilde kurulmuştur ve lider adaylar üzerinde sorunsuz bir şekilde geliştirilebilecek isabetleri belirlemek için zaten yaygın olarak kullanılmaktadır. Diamond5, Helmholtz-Zentrum Berlin (DE) ve MAX IV (SE)6 ve EMBL Grenoble biriminden (FR)7 ekipler, verimli hedef kristalizasyonu, parça ıslatma, kristal montajı, kristalografi güdümlü parça tarama ve yapı biriktirme için iş akışlarını otomatikleştirme konusundaki en son gelişmelerini anlatıyor. Boru hatları oldukça otomatiktir ve dünya çapında harici araştırmacılar tarafından kullanılmaktadır. Daha fazla bileşik tasarım ve yapı destekli potansiyel müşteri geliştirme için isabetleri belirlemek üzere halihazırda 100'den fazla hedefe (genellikle uzaktan) uygulanmıştır.

NMR ayrıca, çözünür veya zara bağlı proteinleri veya polinükleotidleri hedef alan ilaç geliştirme kampanyalarında parça taraması için yaygın olarak kullanılır. Frankfurt'taki (DE) Goethe Üniversitesi, deney ve analizler sırasında manuel müdahaleyi azaltan optimize edilmiş NMR tarama boru hatları sunar8. Numune değiştiricileri, birkaç gün süren kesintisiz deneyler ve otomatik analizler sırasında tek bir çalışmada yüzlerce NMR örneğini işler.

Ayrıca biyofiziksel yöntemler X-ışını ve NMR'nin tamamlayıcısıdır. Hollanda Kanser Enstitüsü'nden (NL) ekip, parçaların9 eklenmesi üzerine hedef erime sıcaklığındaki değişiklikleri ölçmek için termal kayma deneyleri için nano diferansiyel taramalı kalorimetri kullanan bir iş akışı sunuyor. Protein kalitesi ve konsantrasyonu ile ilgili ön koşulları, deneysel tasarım, veri toplama ve analiz için analitik bir protokol takip eder.

Hücresel yapısal biyolojiye doğru
Kriyo-elektron tomografisi genellikle hücrelerdeki makromoleküler kompleksleri incelemek için tercih edilen yöntemdir. Vitrifiye numunelerden alınan görüntüler farklı eğim açılarında elde edilir ve alt tomogram ortalaması ile daha yüksek çözünürlük sağlamak için alt hacimlerin çıkarıldığı bir 3D tomogram yeniden oluşturulur. Elektronlar madde ile güçlü bir şekilde etkileşime girdiğinden, bu tür çalışmalar 200 nm'den daha az kalınlıkta numuneler gerektirir. CEITEC ekibi (CZ), daldırma dondurmasından sonra hücresel lamellerin hazırlanması için bir protokol10 sunar. Kriyo-ET'de otomasyon etkileyici bir ilerleme kaydetmiş olsa da, eğim serisi alımı gerçekleşmeden önce saatlerce veri toplanması gerekir ve hedefler tipik olarak hala görsel ızgara incelemesi ile belirlenir. EMBL Heidelberg (DE) tarafından ızgaraları ve ızgara karelerini haritalamak, hedefleri seçmek ve eğim serisi edinimini ayarlamak için bir otomasyon protokolü hazırlanmıştır11.

ALBA (ES) ve Diamond senkrotronları birlikte, bozulmamış hücrelerin incelenmesine izin veren kriyo-EM tomografiye bir alternatifin, yani kriyo-yumuşak X-ışını tomografisinin (kriyo-SXT)12 tuzaklarını ve avantajlarını tartışmaktadır. Süper çözünürlük tekniklerinin kriyojenik sıcaklıklara uyarlanması, kriyo-ET ve kriyo-SXT ile bağıntılı görüntülemeye izin verir. Ayrıca, yüksek verimli kriyo yapılı aydınlatma mikroskobu (kriyo-SIM), geleneksel floresansın çözünürlüğünü iki katına çıkararak kalın numunelerdeki moleküllerin veya yapıların spesifik konumlarına yol açar. Bu, hücresel bağlam13 içindeki belirli özellikleri saptamak için kriyo-SXT ile ilişkilendirilebilir.

Utrecht Üniversitesi (NL) ekibi, doğal zarlar ve protein-lipid-glikan sistemleri14 dahil olmak üzere zorlu fizyolojik sistemleri incelemek için kullanılabilecek numune hazırlama ve yüksek hassasiyetli katı hal NMR deneylerini rapor ediyor. Ek olarak, hücre içi çözüm NMR, fonksiyonel süreçleri aydınlatmak için hızla gelişmektedir. CERM/CIRMMP (IT) ekibi, yüksek alanlı bir mıknatısın15 çekirdeğindeki NMR probu içindeki canlı hücreler için besin ve oksijenin yenilenmesine izin veren biyoreaktörlerin nasıl monte edileceğini ve çalıştırılacağını açıklar. Bu, örneğin hücre içi protein-ligand etkileşimlerini izlemek için genişletilmiş ölçümlere ve zaman çözümlü deneylere izin verir.

Son sözler
Bu JoVE sayısı tamamen Avrupa araştırma altyapılarındaki son yapısal biyoloji gelişmelerine ve uygulamalarına adanmıştır. iNEXT-Discovery ve Instruct-ERIC birlikte, yapısal biyoloji uzmanlarının yanı sıra giderek artan bir şekilde uzman olmayan yaşam bilimcileri ve diğer araştırmacıların da en son teknolojiye sahip hizmetler sunarak araştırma amaçlarını sürdürmelerine olanak tanır.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu JoVE Yöntemleri Koleksiyonu sayısı, Avrupa Komisyonu'nun Horizon 2020 programı tarafından finanse edilen 871037 numaralı proje olan iNEXT-Discovery tarafından finanse edilmektedir.

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. White, J. B. R., et al. Single particle cryo-electron microscopy: From sample to structure. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62415(2021).
  2. Jiménez-Moreno, A., et al. Cryo-EM and single-particle analysis with scipion. Journal of. Visualized Experiments: JoVE. (171), e62261(2021).
  3. Crawshaw, A., et al. A sample preparation pipeline for microcrystals at the VMXmbeamline. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (172), e62306(2021).
  4. Horrell, S., et al. Fixed target serial data collection at diamond light source. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), e62491(2021).
  5. Douangamath, A., et al. Achieving efficient fragment screening at XChemfacility at diamond light source. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62414(2021).
  6. Wollenhaupt, J., et al. Workflow and tools for crystallographic fragment screening at the helmholtz-zentrum Berlin. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (169), e62208(2021).
  7. Cornaciu, I., et al. The automated crystallography pipelines at the EMBL HTX facility in grenoble. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (172), e62200(2021).
  8. Berg, H., et al. NMR-based fragment screening in a minimum sample but maximum automation mode. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (172), e62262(2021).
  9. Ahmad, M. U. D., et al. Nano-differential scanning fluorimetry for screening in fragment-based lead discovery. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62469(2021).
  10. Moravcová, J., Pinkas, M., Holbová, R., Nováček, J. Preparation and CryoFIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for CryoElectrontomography. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , e62351(2021).
  11. Weis, F., Hagen, W. J. H., Schorb, M., Mattei, S. Strategies for optimization of cryogenic electron tomography data acquisition. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (169), e62383(2021).
  12. Groen, J., et al. A 3D cartographic description of the cell by cryosoft X-ray tomography. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (169), e62190(2021).
  13. Vyas, N., et al. Cryo-structured illumination microscopic data collection from cryogenically preserved cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62274(2021).
  14. Beriashvili, D., Schellevis, R. D., Napoli, F., Weingarth, M., Baldus, M. High-resolution studies of proteins in natural membranes by solid-state NMR. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (169), e62197(2021).
  15. Barbieri, L., Luchinat, E. Monitoring protein-ligand interactions in human cells by real-time quantitative in-cell NMR using a high cell density bioreactor. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (169), e62323(2021).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Nano differential Scanning FluorimetryProtein ligand InteractionsIn cell NMRFragment based Lead DiscoverySolid state NMRAutomated CrystallographyCryo EMSingle particle AnalysisCryo electron TomographyData Acquisition StrategiesHigh resolution Protein StudiesBioreactor Technology

İlgili makaleler