Method Article

Yetişkin Tipi Yaygın Olarak Sızan Gliomada Mikroçevrenin Karakterizasyonu için Dijital Uzamsal Profilleme

DOI:

10.3791/63620

⸱

September 13th, 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, Dartmouth-Hitchcock Medical Center, 2Department of Pathology and Laboratory Medicine, Dartmouth-Hitchcock Medical Center, 3Department of Neurosurgery, Dartmouth-Hitchcock Medical Center, 4Dartmouth Cancer Center, Dartmouth-Hitchcock Medical Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proteomik disregülasyon, yaygın olarak infiltre eden gliomların yayılmasında önemli bir rol oynar, ancak birkaç ilgili protein tanımlanmamıştır. Dijital mekansal işleme (DSP), infiltratif gliomların invazyonu ve göçüne katkıda bulunabilecek aday proteinlerin diferansiyel ekspresyonunu karakterize etmek için verimli, yüksek verimli bir yaklaşım sunar.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diffüz infiltrasyon yapan gliomlar, tümör yayılımının infiltratif doğası nedeniyle yüksek morbidite ve mortalite ile ilişkilidir. Morfolojik olarak kompleks tümörlerdir ve hem tümörün kendisinde hem de heterojen mikro ortamında yüksek derecede proteomik değişkenlik gösterirler. Bu tümörlerin malign potansiyeli, hücresel stabiliteyi koruyan ve mikro çevrenin yapısal bütünlüğünü koruyan süreçler de dahil olmak üzere çeşitli anahtar yollarda yer alan proteinlerin düzensizliği ile arttırılmıştır. Çok sayıda toplu ve tek hücreli glioma analizi yapılmış olmasına rağmen, bu proteomik verilerin uzamsal tabakalaşmasında göreceli bir kıtlık vardır. İntrinsik tümör, invaziv kenar ve mikroçevre arasındaki tümörojenik faktörlerin ve immün hücre popülasyonlarının mekansal dağılımındaki farklılıkları anlamak, tümör proliferasyonu ve yayılımının altında yatan mekanizmalar hakkında değerli bilgiler sunmaktadır. Dijital uzamsal profil oluşturma (DSP), bu önemli çok katmanlı analizlerin temelini oluşturabilecek güçlü bir teknolojiyi temsil eder.

DSP, bir doku örneğinde kullanıcı tarafından belirlenen uzamsal bölgelerdeki protein ekspresyonunu verimli bir şekilde ölçen bir yöntemdir. DSP, birden fazla proteinin ayırt edici bölgeler içindeki ve arasındaki diferansiyel ekspresyonunu incelemek için idealdir ve çoklu seviyelerde nicel ve nitel analiz sağlar. DSP protokolü sistematik ve kullanıcı dostudur ve proteomik verilerin özelleştirilmiş uzamsal analizine izin verir. Bu deneyde, arşivlenmiş glioblastoma çekirdek biyopsilerinden doku mikrodizileri oluşturulmuştur. Daha sonra, numune içindeki ilgili proteinleri hedefleyen bir antikor paneli seçilir. UV-fotobölünebilir DNA oligonükleotidlerine önceden konjuge edilen antikorlar daha sonra bir gecede doku örneği ile inkübe edilir. Antikorların floresan mikroskopi görselleştirmesi altında, protein ekspresyonunun ölçüleceği ilgi alanları (ROI'ler) örneklerle tanımlanır. UV ışığı daha sonra DNA oligonükleotidlerini parçalayarak her ROI'ye yönlendirilir. Oligonükleotidler mikroaspire edilir ve her ROI içinde sayılır, karşılık gelen proteini mekansal olarak ölçer.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diffüz infiltrasyon yapan gliomlar erişkinlerde en sık görülen malign beyin tümörü tipidir ve her zaman öldürücüdür. Glioma hücrelerinin beyinde yoğun bir şekilde göç etme eğilimi büyük bir terapötik zorluktur. Yayıldıkları mekanizma, yönlendirilmiş göç ve kontrolsüz istilayı içerir. İnvaziv glioma hücrelerinin beyaz cevher yolları boyunca tropizm ve migrasyon sergilediği gösterilmiştir1, son araştırmalar bu yolların aktif, protümörojenik bir özellik olarak demiyelinizasyonunu ima etmektedir2. İnvazyona, glioma hücrelerinin hücre dışı matriks proteinlerini ve hücre adezyon moleküllerini kodlayan genlerin ekspresyonunu azaltarak, göçü artırarak ve tümör mikroçevresi yoluyla yayılımı kolaylaştırarak mezenkimal özellikler kazandığı epitel-mezenkimal bir geçiş aracılık eder 3,4,5.

Moleküler düzeyde, hücresel stabilite sağlayan ve immünojenik bileşenlerle arayüz oluşturan çeşitli proteinlerin bozulması gösterilmiştir6. İnfiltratif gliomların, anti-apoptotik (örneğin, PTEN) özelliklere sahip proteinlerin baskılanmasına maruz kaldığı bilinmektedir7. Ayrıca, konakçı immün yanıtından kaçınmayı teşvik eden proteinleri aşırı eksprese ederler (örneğin, PD1 / PDL1)8. Bu kompleks yolakların düzensizliği tümörojenisiteyi arttırır ve malign potansiyeli arttırır.

İnvaziv glioma örneklerinde amaç, hücre büyümesi, sağkalım ve proliferasyon için anahtar proteinlerin diferansiyel ekspresyonunu ve invaziv ve invaziv olmayan bileşenler arasındaki mikroçevre yapısal bütünlüğünü değerlendirmekti. Ek olarak, aktif immünojenik role sahip proteinlerin diferansiyel regülasyonunu incelemeye çalıştık ve tehlikeye giren konakçı immün savunmasının gliomların proliferatif ve invaziv potansiyelini artırabileceği mekanizmaya dair fikir vermeye çalıştık. Bu, özellikle malignitede immün belirteçlerin ve disregülasyon sürücülerinin immünoterapinin hedefleri olarak nasıl hizmet edebileceğini gösteren son araştırma genişliği göz önüne alındığında önemlidir. İmmünsüveyans ve reaktivitede rol oynayan birçok protein arasında uygulanabilir terapötik hedeflerin belirlenmesi, oldukça hassas ve kapsamlı bir yaklaşım gerektirir.

İncelenebilecek çok çeşitli aday proteinler göz önüne alındığında, immünohistokimyaya benzer, ancak gelişmiş veri işleme verimliliğine sahip bir yöntem aradık. Kanser biyolojisi alanında DSP, proteomik analiz ve niceleme için alternatif araçlara göre önemli avantajlara sahip güçlü bir teknoloji olarak ortaya çıkmıştır. DSP'nin ayırt edici özelliği, bir numune içindeki birkaç farklı proteinin aynı anda incelenmesine izin veren ve immünohistokimya (IHC) 9,10 gibi standart ancak daha düşük pleks teknolojilerden önemli bir ayrım yapan yüksek verimli çoklama yeteneğidir. DSP'nin multipleks özelliği, DSP'yi IHC ile karşılaştıran çalışmaların gösterdiği gibi, nicel ve analitik bir araç olarak sadakatinden ödün vermez. Örneğin, küçük hücreli olmayan akciğer kanseri örneklerinin proteomik nicelleştirilmesi için kullanıldığında, DSP'nin IHC11'e benzer sonuçlara sahip olduğu gösterilmiştir. Ek olarak, DSP, kullanıcıların proteomik analiz gerçekleştirecekleri bölgeleri manuel olarak tanımlayabilecekleri özelleştirilebilir bölgesel spesifikasyonlar sunar. Bu, tüm kesitli çoklama yöntemlerine göre bir avantaj sunar10,12. DSP, tek bir işleme turunda, birden fazla ilgi alanındaki çeşitli protein hedeflerini inceleyerek birden fazla analiz katmanı sunar.

DSP'nin birkaç farklı patolojik ortamda uygulamaları vardır. DSP, onkolojik analizde özellikle avantajlıdır, çünkü uzamsal varyasyon hücresel transformasyon ve diferansiyel protein ekspresyonu ile ilişkili olabilir. Örneğin, DSP, meme kanserinin proteomik profilini bitişik tümör mikro ortamıyla karşılaştırmak için kullanılmıştır. Bu, bu tümörün doğal geçmişini ve progresyonunu ve ayrıca tedaviye potansiyel yanıtı anlamak için önemli sonuçlar doğurur13. DSP'nin çok yönlülüğünü gösteren ek bağlamlar arasında prostat kanserinde protein çeşitliliğinin mekansal nicelleştirilmesi14, baş ve boyun skuamöz hücreli karsinomda immün hücre belirteci ekspresyonunun hastalık progresyonu ile ilişkisi 15 ve metastazı primer berrak hücreli yumurtalık kanserinden ayıran protein ekspresyonunun epitelyal-mezenkimal gradyanının gösterilmesi16 . DSP'yi uygulayarak, tümörigenezi ve gliomların invazyonunu etkileyebilecek proteinlerin mekansal topografyasını karakterize ediyoruz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aşağıda özetlenen protokol, Dartmouth-Hitchcock İnsan Araştırmaları Etik Komitesi'nin yönergelerini takip etmektedir. Bu çalışmaya doku örnekleri alınan hastalardan bilgilendirilmiş onam alındı. Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler, reaktifler, ekipman ve yazılımlarla ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosu bölümüne bakın.

1. Slayt hazırlama17

  1. Formalin sabit, parafin gömülü dokuyu insan yetişkin tipi yaygın olarak sızan gliomlardan alın veya hazırlayın.
    NOT: Bu deneyde, glioblastomlu üç hastadan parafine gömülü biyopsi blokları kullanılmıştır.
  2. Bir doku mikroarray (TMA) bloğu oluşturun. Her biyopsiden birkaç 2 mm'lik çekirdek alın ve bunları tek bir TMA bloğuna koyun (Şekil 1, üstte). TMA bloğundaki bölümleri 4 μm'de kesin ve cam slaytlara monte edin. Her slaytı slayt tutucu contanın içine yerleştirin. Slaytı 30 dakika boyunca 60 ° C'de inkübe edin.

2. Yarı otomatik IHC sistem hazırlığı ve yazılım yapılandırması (slaytların yüklenmesi ve çalıştırılması için)17

  1. Reaktifleri ayarlayın. Reaktif Kurulumu düğmesine tıklayın. Kurulum sekmesinde Ekle'ye tıklayın.
    1. Ad alanına bir ad yazarak bir yıkama tamponu kaydedin. Type (Tür) alanında Anhelperlary'yi (Tür) seçin. Kaydet'e tıklayın.
    2. Yukarıdakiyle aynı adımları tekrarlayarak (örneğin Ad alanında, uygun şekilde değiştirilmiş), ancak Tür alanında Birincil Antikor'u seçerek bir blokaj çözeltisi kaydedin. Varsayılan Boyama Protokolü ve Varsayılan HIER Protokolü için açılan kutularda istediğiniz protokolleri seçin. İsterseniz bir Varsayılan Enzim Protokolü seçeneği belirleyin (bu kutu geçerli protokolde boş bırakılmıştır). Kaydet'e tıklayın.
  2. Barkodlu bir Reaktif Konteyner Tepsisinden oluşan Algılama Sistemini kaydedin. Barkodu tarayın.
    1. Araştırma Reaktifi Sistemi Ekle penceresinde reaktif sistemi ayrıntılarını girmeye başlayın. Algılama sistemi için bir Ad yazın.
    2. Bir Son Kullanma Tarihi yazın. Reaktifler grafiğinin ilk satırını vurgulayın ve yeni bir 30 mL Reaktif Kabının Barkodunu tarayın, bu sırada barkod satır 1'i dolduracaktır.
    3. Kabı Algılama Sistemi'nin 1. konumuna yerleştirin. Reaktif sütununun açılır kutusundan yıkama tamponunun adını seçin ve Ekle'ye tıklayın. Engelleme çözümü de dahil olmak üzere sonraki satırlara ek reaktifler eklemek için bu adımları yineleyin.
  3. IHC için Protein Protokolünü kurun. Protokol Kurulumu'na tıklayın. İstediğiniz protokole karşılık gelen satırı vurgulayın ve Kopyala'ya tıklayın. Adı girin ve Protokol Özelliklerini Düzenle penceresindeki diğer ilgili alanları doldurun.
    1. Yıkama Adımlarını Göster kutusunu seçin. Inc (min) ve DispenseType alanlarının her bir reaktif için doğru olduğunu onaylayın (Blokaj Çözeltisi için 10 dakika, Yıkama Tamponu için 0 dakika ve her DispenseType için 150 μL). Kaydet'e tıklayın.
  4. Çalışmayı hazırlayın. Kabı 1. konumda bir Yıkama Tamponu ile doldurun. Slayt başına 150 μL ve 5 mL ölü hacim doldurun; kapağı açık bırakın. Bir Engelleme Çözeltisi ile doldurulması gereken konum 2'deki kap için bu adımları yineleyin. Bu kap slayt başına 150 μL ve 350 μL ölü hacme sahip olmalıdır.
    1. Reaktif Kapsayıcı Tepsisini makineye yükleyin. Sistemin konteyner tanıma ve hacim onaylama önlemleri gerçekleştirmesine izin verin. Slayt Kurulumu'na | Etüt ekleyin. Çalışma Kimliğini ve Etüt Adı'nı girin ve Dağıtım Hacmi | altında 150 μL'yi seçin Hazırlık Protokolü açılır menüsünde istenen protokol (Bake ve Dewax önerilir). Etüdü vurgulayın ve Slayt Ekle'ye tıklayın.
    2. Doku Tipi altında Test Dokusunu seçin | Dağıtım Hacmi | altında 150 μL Boyama Modu açılır kutularından Tek ve Rutin. Bir Süreç (geçerli etüt için IHC) seçin | İşaretçi alanının açılır kutusundaki Engelleme Çözüm Adı | Protokoller sekmesinin Boyama alanındaki IHC DSP Protokolü | *Hazırlık için Pişir ve Balmumu Temizle | *HIER için ER1 ile 20 dakika HIER. Enzim alanını boş bırakın.
    3. Bu işlemi her slayt için tekrarlayın. Tamamlandığında Kapat'a tıklayın ve ardından Etiketleri Yazdır'a tıklayın. Geçerli çalışma için Henüz Yazdırılmamış Tüm Slayt Etiketlerini kontrol edin ve Yazdır'a tıklayın. Slaytların üst kısımlarına etiketler yapıştırın.
  5. Slaytları yükleyin ve çalıştırın. Slaytları slayt tepsisine yükleyerek numunenin ve etiketin yukarı bakmasını sağlayın. Kapak kutucuklarını slaytların üzerine yerleştirin ve slaytların alttaki tırnaklarla yönlendirildiğinden emin olun. Sürgü tepsilerini cihazın üzerine takın.
    1. Tepsiyi indirmek ve cihazın slaytları taramaya ve tanımaya başlamasına izin vermek için LED düğmesine basın. Denemeye başlamak için Başlat düğmesine tıklayın.
  6. Denemeyi bitirin. Çalıştırmanın tamamlandığını gösteren yeşil yanıp söndüğünde LED düğmesine basın. Tepsiyi cihazdan çıkarın ve kapak karolarını her slayttan dikkatlice kaldırın. Slaytları 1x fosfat tamponlu salin (PBS) içine yerleştirin, fazla tamponu çıkarın ve hidrofobik bir bariyer oluşturmak için her doku bölümünü hidrofobik bir kalemle ana hatlarıyla çizin.

3. Antikor inkübasyonu ve çekirdek boyama17

  1. İlgilenilen antijenleri lokalize etmek için bir antikor paneli seçin (bu deneyde kullanılan antikorlar için Tablo 1'e bakınız).
    NOT: Her antikor, kendisini benzersiz bir şekilde tanımlayan UV-fotobölünebilir bir segmente (PC-oligo) sahip bir DNA oligonükleotidine zaten konjuge edilmiştir (indeksleme oligoları, Şekil 2).
  2. Panele her slaytın 8 μL'sini (seyreltilmiş 1:40) ekleyerek çalışan bir antikor-PC-oligo çözeltisi yapın. Her slayt için 200 μL'lik son hacme ulaşmak üzere bloke edici reaktifi seyreltici olarak kullanın. Gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin (Şekil 3, Adım 1).
    NOT: Morfoloji belirteçleri, biyolojik boyalar veya floresan olarak etiketlenmiş antikorlar da bu adımda çözeltiye eklenebilir.
  3. Ertesi gün, slaytı bir Coplin kavanozuna yerleştirin ve 1x TBS-T'de 3 x 10 dakika yıkayın. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca %4 paraformaldehit içinde postfix, ardından 1x TBS-T'de 2 x 5 dakika.
  4. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca SYTO13 nükleer lekesini (1x TBS'de 1:10 seyreltilmiş) ekleyin. 2x'i 1x TBS-T ile yıkayın ve ardından slaytı 1x TBS-T'de saklayın.

4. DSP cihazında floresan görselleştirme, ROI tanımlama ve UV fotobölünmesi17

  1. Fareyi Denetim Merkezi'ndeki Veri Toplama'nın üzerine getirdikten sonra Yeni/Çalışmaya Devam Et'i seçin.
  2. Slaytı, etiket kullanıcıya doğru gelecek şekilde slayt tutucuya yerleştirin. Doku uzun pencerede görülebildiğinden emin olmak için kaydırma tepsisi kelepçesini indirin. 6 mL Tampon S ekleyin.
  3. Denetim Merkezi'ndeki istemleri izleyin. Tarama için bir bölgeyi tanımlamak üzere X ve Y kaydırıcılarıyla farklı eksenler arasında yakınlaştırma yapın. Tara'yı seçin. Tanımlanan hedef alanın tamamı görüntülenene kadar taramanın devam etmesine izin verin.
  4. 20x görüntü oluşturun. Yatırım getirilerini otomatik veya manuel olarak tanımlayın (Şekil 3, Adım 2). Bu protokolü takip etmek için, her doku çekirdeği için eşit büyüklükte, dairesel üç ROI (250 μm çapında) seçin (Şekil 4, alt).
    NOT: YG'ler boyut ve şekil olarak özelleştirilebilir. Her bölümde birkaç yatırım getirisi seçilebilir. Bu deneyde, dairesel yatırım getirileri manuel olarak tanımlanmıştır.
  5. Tarama Çalışma Alanından Çık düğmesine tıklayarak YG'leri onaylayın. UV ışığının oligoları antikorlardan ayırmasını bekleyin.
  6. Temizleme Cihazı işlemi tamamlandığında, geçerli slaytlara veya plakaya devam etmek için Yeni Veri Toplama'yı seçin. Aksi takdirde, Slaytları ve Mikro Plakayı Kaldır'ı seçin.
  7. Kontrol Merkezi'nin sağ alt köşesindeki plaka simgesi alanına çift tıklayarak Plakayı Sonlandır penceresini açın. Hibridizasyon (Hyb) Kod Paketi lot numarası (#) biliniyorsa, numarayı girin ve Güncelle'ye tıklayın (bu adımda isteğe bağlıdır). Sonlandır'a tıklayın.
  8. İstemleri izleyerek slayt tutucuyu ve toplama plakasını çıkarın. Slaytları TBS-T'de depolayın. Slaytlar uzun süre kullanılmayacaksa, sulu bir ortamla örtün ve örtün.

5. Protein okuması17

  1. Geçirgen bir conta kullanın ve aspiratları 65 ° C'de üstü açık bir termal bisikletçide kurutun. 7 μL dietil pirokarbonatla muamele edilmiş su ekleyin ve karıştırın. RT'de 10 dakika boyunca inkübe edin ve ardından hızla aşağı doğru dönün.
  2. Prob/tampon karışımının oluşturulmasına rehberlik etmek için Tablo 2'den uygun Prob R ve Prob U denklemlerini seçin. Bu deneyde hibridizasyon için gerekli Hyb Kodlarının sayısına dayanarak, denklem (1)'i aşağıdaki gibi uygulayın. Karıştırın ve hızlıca aşağı doğru döndürün.
    # Hyb Kodları Prob R Çalışma Havuzu Probu U Çalışma Havuzu Hibridizasyon Arabelleği n = ____ (n × 8 μL) = _____ μL + (n × 8 μL) = ____ μL + (n × 80 μL) = _____ μL (1)
  3. Kullanılacak her Hyb Kodu Paketine 84 μL Prob/Arabellek Karışımı ekleyin. Karıştırmak ve döndürmek için hafifçe vurun. Yeni bir 96 kuyucuklu Hibridizasyon plakasında, belirtilen sıranın 12 kuyucuğuna her Hyb Code Master Mix'ten 8 μL ekleyin.
  4. DSP toplama plakasından Hibridizasyon plakasındaki ilgili kuyuya 7 μL aktarın. Yavaşça karıştırın. Isıl yapışma yapın ve hızlı bir dönüş yapın. Daha sonra, gece boyunca 67 ° C'de inkübe edin. Plakayı buz üzerinde soğutun ve hızlı bir dönüş yapın.
  5. Her bir kuyucuktan hyb ürünlerini bir şerit tüpünde toplayın, karıştırmak için her bir kuyucuğa 5 kat yavaşça boru çekin. Şerit tüpünü kapatın ve aşağı doğru döndürün. Kalan havuzlanmamış hyb ürünlerini -80 °C'de dondurun. Şerit tüpleri analiz sistemine yükleyin.
  6. CDF dosyasını bir USB sürücüsüne kaydedin ve ardından verileri DSP cihazından Dijital Çözümleyici'ye aktarın. Aşağıdaki adımları uygulayarak kurulumu tamamlayın.
    1. Sarf malzemelerini ve havuza alınmış numuneleri hazırlık istasyonuna yükleyin. Ekranda, İşlemi Başlat'a basın. Yüksek Hassasiyet'i ve ardından İleri'yi seçin. Numune | kuyu sayısı için Tümünü Seç'e basın Bitirme | Sonraki e-posta bildirim | Başlat.
    2. Hazırlık istasyonu tamamlandıktan sonra, kartuşu kapatın ve dijital analizöre aktarın. Saymayı Başlat'a basın, Sahne Alanı Konumu'nu seçin, Mevcut CDF dosyasını yükle'ye basın ve önceden yüklenmiş dosyayı seçin. Bitti'ye basın, sahne alanı konumunu tekrar seçin, Bitti'ye basın | Programı çalıştırmayı başlatın.
  7. Raportör sayısı dönüştürme dosyalarının sıkıştırılmış dosyasını analiz sisteminden bir USB sürücüsüne kaydedin ve ardından sürücüyü DSP makinesine takın. DSP Denetim Merkezi'nde, fareyle Veri Toplama'nın üzerine gelin ve ardından Yükleme Sayıları'na tıklayın. İlgili sıkıştırılmış dosyayı seçin.

6. Veri analizi17

  1. DSP Kontrol Merkezi'ndeki Kayıtlar'a tıklayın. Kuyruktaki taramaları görüntülemek için Seçili Tadımları Kuyruğa Ekle'yi seçin | Analiz Kuyruğum. Kontrol Merkezi'ndeki Veri Analizi seçeneğinin üzerine geldikten sonra Kuyruktan Yeni Etüt'ü seçin.
  2. Görev çubuğu seçeneklerinden QC'yi seçin. Varsayılan değerlerle devam edin veya isterseniz ayarlayın. QC'yi Çalıştır'ı seçin ve Sonuç Kılavuzu'nu gözden geçirin. Devam etmek ve değerleri pozitif hibridizasyon kontrollerine normalleştiren yeni bir veri kümesi oluşturmak için QC'yi Çalıştır'a tıklayın.
  3. Yeni etiketleri bir XLSX dosyasına aktarın. Taramalar bölmesinde Ek Açıklamaları Yönet'i seçin ve ardından bir şablon indirin, etiketleri ekleyin ve dosyayı içe aktarın.
  4. İSTEĞE BAĞLI: QC'yi çalıştırdıktan sonra, diğer araç çubuğu seçeneklerini kullanarak verileri daha da ayarlayın. Dönüştürülen verileri çizmek için Görselleştirmeler bölmesindeki araçları kullanın.
  5. Görselleştirmeler bölmesindeki her grafiği oluşturmak için parametrelerin gri açılır kutusuna gidin. Taramalar bölmesinde karşılık gelen vurgulanan segmentleri görselleştirmek için bir grafik içinde belirli bir bölge seçin ve etiketler veya gruplar oluşturmak için sağ tıklatın. Veri Kümesi Özeti içinde, Normalleştirme, Ölçeklendirme ve analiz ve görüntüleme için diğer seçeneklerden grafikleri gözden geçirin.
  6. Kaydedilecek simgeyi seçerek görselleştirmeyi kaydetme; Özet altında zaten kaydedilmiş görselleştirmeleri gözden geçirin. Bir görselleştirmeyi .svg biçimde dışa aktarmak için Dışa Aktar (.svg) düğmesini seçin. Görselleştirmenin temel aldığı verileri Dışa Aktar (.xlsx) düğmesine tıklayarak dışa aktarın. İmleci ikinci bölmedeki veri kümesi adının üzerine getirip dışarı aktarma simgesini tıklatarak belirli bir veri kümesinde bulunan tüm verileri dışarı aktarın .

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Şekil 4 , glioblastoma örnekleri üzerinde gerçekleştirilen bir DSP deneyinin temsili sonuçlarını göstermektedir. DSP yazılımını kullanarak verileri görsel olarak yakalama yöntemlerinden birini gösteren bir ısı haritası sunulur. Satırlar protein hedeflerini temsil eder ve her sütun bir ilgi alanına karşılık gelir. Maviden kırmızıya kadar olan renk aralığı, sırasıyla düşük ila yüksek ifadeyi gösterir. Bir sıra içindeki renk değişkenliği, bölgesel protein heterojenliğini yansıtır ve diferansiye...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gliomların saldırganlığını potansiyel olarak etkileyebilecek proteinlerin çeşitliliği ve bu proteinlerin birçoğunun keşfedilmemiş olduğu fikri göz önüne alındığında, yüksek verimli bir protein nicelleştirme yöntemi ideal bir teknolojik yaklaşımdır. Ek olarak, onkolojik örneklerdeki uzamsal verilerin genellikle diferansiyel ekspresyon18 ile ilişkili olduğu göz önüne alındığında, mekansal profillemenin protein nicelleştirme yaklaşımına dahil edilmesi daha etkili analizlere izin verir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, Dartmouth Hitchcock Sağlık Sistemi Patoloji ve Laboratuvar Tıbbı Bölümü'ndeki Klinik Genomik ve İleri Teknoloji Laboratuvarı'nın desteğini kabul etmektedir. Yazarlar ayrıca NCI Kanser Merkezi Destek Hibe 5P30 CA023108-37 ile Dartmouth Kanser Merkezi'ndeki Patoloji Paylaşılan Kaynağını da kabul etmektedir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
BOND Araştırma Tespit SistemiLeica Biosystems, Wetzlar, AlmanyaDS9455Bir reaktif tepsisinde açık kaplar içeren açık algılama sistemi
BOND WashLeica Biosystems, Wetzlar, AlmanyaAR950yıkamak için 10X konsantre tampon çözeltisi
Şirketle iletişime geçinEngelleme reaktifi
Cy3 konjugasyon kitiAbcam, Cambridge, Birleşik KrallıkAB188287Cy3 floresan antikor konjugasyon kiti
GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP)NanoString, Seattle, WAile iletişime geçinProtein ve RNA hedeflerini görüntüleme ve karakterize etme sistemi
GeoMx DSP Enstrüman Tampon KitiNanoString, Seattle, WAGeoMXDSP için 100471 Tampon kiti (numune işleme ve hazırlama için tamponlar dahil)
GeoMX DSP deneyimlerini çalıştırmak için GeoMx Hyb Code Pack_ProteinNanoString, Seattle, WA121300401Kontroller
GeoMx Bağışıklık Hücresi Paneli (Imm Cell Pro_Hs)NanoString, Seattle, WA121300101İnsan bağışıklık hücreleri ve immüno-onkolojik hedefler için hedefler içeren protein modülü
GeoMx Pan-Tümör Paneli (Pan-Tumor_Hs)NanoString, Seattle, WA121300105Birden fazla insan tümör tipi ve epitelyal-mezenkimal geçiş belirteçleri için hedeflere sahip protein modülü
GeoMx Protein Slayt Hazırlığı FFPENanoString, Seattle, WA121300308GeoMX DSP protein analizi için numune hazırlama reaktifleri
LEICA Bond RXLeica Biosystems, Wetzlar, AlmanyaŞirketle iletişime geçinTam otomatik IHC boyama
Master Kiti - 12 reaksiyonNanoString, Seattle, WA100052nCounter Analiz sistemi ile kullanım için malzemeler ve reaktifler
nCounter Analiz SistemiNanoString, Seattle, WAİletişim ŞirketiMultipleks hedef ifade miktar tayini için otomatik sistem (GeoMx DSP ile kullanılmak üzere)
TMA Master II3DHistech Ltd., Budapeşte, MacaristanDoku mikroarray bloğunu oluşturmak için
Sabit doku Tamponu W NanoString, Seattle, WA

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pedersen, P. H., et al. Migratory patterns of lac-z transfected human glioma cells in the rat brain. International Journal of Cancer. 62 (6), 767-771 (1995).
  2. Wang, J., et al. Invasion of white matter tracts by glioma stem cells is regulated by a NOTCH1-SOX2 positive-feedback loop. Nature Neuroscience. 22 (1), 91-105 (2019).
  3. Iwadate, Y. Epithelial-mesenchymal transition in glioblastoma progression. Oncology Letters. 11 (3), 1615-1620 (2016).
  4. Tao, C., et al. Genomics and prognosis analysis of epithelial-mesenchymal transition in glioma. Frontiers in Oncology. 10, 183(2020).
  5. Cuddapah, V. A., Robel, S., Watkins, S., Sontheimer, H. A neurocentric perspective on glioma invasion. Nature Reviews Neuroscience. 15 (7), 455-465 (2014).
  6. Barthel, L., et al. Glioma: molecular signature and crossroads with tumor microenvironment. Cancer and Metastasis Reviews. 1 (1), 53-75 (2021).
  7. Ziegler, D. S., Kung, A. L., Kieran, M. W. Anti-apoptosis mechanisms in malignant gliomas. Journal of Clinical Oncology. 26 (3), 493-500 (2008).
  8. Berghoff, A. S., et al. Programmed death ligand 1 expression and tumor-infiltrating lymphocytes in glioblastoma. Neuro-Oncology. 17 (8), 1064-1075 (2015).
  9. Merritt, C. R., et al. Multiplex digital spatial profiling of proteins and RNA in fixed tissue. Nature Biotechnology. 38 (5), 586-599 (2020).
  10. Van, T. M., Blank, C. U. A user's perspective on GeoMxTM digital spatial profiling. Immuno-Oncology Technology. 1, 11-18 (2019).
  11. Garcia-Pardo, M., Calles, A. ROS-1 NSCLC therapy resistance mechanism. Precision Cancer Medicine. , Online (2021).
  12. Ye, L., et al. Digital spatial profiling of individual glomeruli from patients with anti-neutrophil cytoplasmic autoantibody-associated glomerulonephritis. Frontiers in Immunology. 13, 831253(2022).
  13. Bergholtz, H., et al. Best practices for spatial profiling for breast cancer research with the GeoMx digital spatial profiler. Cancers. 13 (17), 4456(2021).
  14. Brady, L., et al. Inter- and intra-tumor heterogeneity of metastatic prostate cancer determined by digital spatial gene expression profiling. Nature Communications. 12 (1), 1426(2021).
  15. Kulasinghe, A., et al. Highly multiplexed digital spatial profiling of the tumor microenvironment of head and neck squamous cell carcinoma patients. Frontiers in Oncology. 10, 607349(2021).
  16. Wang, D. Y. -T., et al. Case study: Digital spatial profiling of metastatic clear cell carcinoma reveals intra-tumor heterogeneity in epithelial-mesenchymal gradient. bioRxiv. , (2021).
  17. GeoMx DSP. Automated slide preparation user manual. GeoMx DSP. , nanoString Technologies. Seattle, Washington. (2022).
  18. Allam, M., Cai, S., Coskun, A. F. Multiplex bioimaging of single-cell spatial profiles for precision cancer diagnostics and therapeutics. NPJ Precision Oncology. 4, 11(2020).
  19. Wolchok, J. D., et al. Overall survival with combined nivolumab and ipilimumab in advanced melanoma. New England Journal of Medicine. 377 (14), 1345-1356 (2017).
  20. Blank, C. U., et al. Neoadjuvant versus adjuvant ipilimumab plus nivolumab in macroscopic stage III melanoma. Nature Medicine. 24 (11), 1655-1661 (2018).
  21. Matthews, R. T., et al. Brain-enriched hyaluronan binding (BEHAB)/brevican cleavage in a glioma cell line is mediated by a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs (ADAMTS) family member. Journal of Biological Chemistry. 275 (30), 22695-22703 (2000).
  22. Paganetti, P. A., Caroni, P., Schwab, M. E. Glioblastoma infiltration into central nervous system tissue in vitro: involvement of a metalloprotease. Journal of Cell Biology. 107, 2281-2291 (1988).
  23. Beliën, A. T., Paganetti, P. A., Schwab, M. E. Membrane-type 1 matrix metalloprotease (MT1-MMP) enables invasive migration of glioma cells in central nervous system white matter. Journal of Cell Biology. 144 (2), 373-384 (1999).
  24. Coulie, P. G., Vanden Eynde, B. J., vander Bruggen, P., Boon, T. Tumour antigens recognized by T lymphocytes: At the core of cancer immunotherapy. Nature Reviews Cancer. 14 (2), 135-146 (2014).
  25. Finn, O. J. Vaccines for cancer prevention: a practical and feasible approach to the cancer epidemic. Cancer Immunology Research. 2 (8), 708-713 (2014).
  26. Sharma, P., Allison, J. P. The future of immune checkpoint therapy. Science. 348 (6230), 56-61 (2015).
  27. Chen, L., Han, X. Anti-PD-1/PD-L1 therapy of human cancer: past, present, and future. Journal of Clinical Investigation. 125 (9), 3384-3391 (2015).
  28. Cai, X., et al. Glioma-Associated stromal cells stimulate glioma malignancy by regulating the tumor immune microenvironment. Frontiers in Oncology. 11, 672928(2021).
  29. Ishii,, et al. Histological characterization of the tumorigenic "peri-necrotic niche" harboring quiescent stem-like tumor cells in glioblastoma. PLoS One. 11 (1), 0147366(2016).
  30. Lewis, C. E., Pollard, J. W. Distinct role of macrophages in different tumor microenvironments. Cancer Research. 66 (2), 605-612 (2006).
  31. NanoString. CosMx Spatial Molecular Imager: True Single-Cell In Situ Solution. NanoString. , (2022).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Digital Spatial ProfilingGlioma MicroenvironmentProtein Expression ProfilingTissue MicroarrayFluorescence MicroscopyRegion Of InterestTumor HeterogeneityImmune Cell ProfilingAntibody Oligonucleotide ConjugatesSpatial Proteomics

Related Articles