Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Eski Vivo Ürotelyal Hücrelerde Mekanik Olarak Aktive Edilmiş Ca2+ Geçicilerinin Analizi

1.2K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/64532

⸱

28 Eylül 2022

 ,  , 
1Renal-Electrolyte Division, Department of Medicine, University of Pittsburgh, 2Department of Cell Biology, University of Pittsburgh

Bu makalede

Özet

Bu protokol, floresan Ca2+ sensörü GCaMP5G kullanılarak doğal ürotelyal hücrelerde mekanik olarak aktive edilmiş iyon kanallarının işlevini değerlendirmek için bir metodolojiyi açıklamaktadır.

Özet

Mekanik olarak aktive edilen iyon kanalları, gerilme veya kesme kuvvetleri gibi mekanik uyaranları elektriksel ve biyokimyasal sinyallere dönüştüren biyolojik dönüştürücülerdir. Memelilerde, mekanik olarak aktive edilmiş kanallar, dokunma hissi, işitme, kırmızı kan hücresi hacminin düzenlenmesi, bazal kan basıncı regülasyonu ve idrar kesesi dolgunluğu hissi gibi çeşitli süreçlerde dış ve iç uyaranların tespiti için gereklidir. Mekanik olarak aktive edilmiş iyon kanallarının işlevi, yama-kelepçe tekniği kullanılarak in vitro ortamda kapsamlı bir şekilde incelenmiş olsa da, doğal ortamlarındaki işlevlerini değerlendirmek, genellikle bu kanalların ekspresyon bölgelerine (örneğin, afferent terminaller, Merkel hücreleri, baroreseptörler ve böbrek tübülleri) sınırlı erişim veya yama kelepçesi tekniğinin uygulanmasındaki zorluklar nedeniyle zor bir görev olmaya devam etmektedir. ürotelyal şemsiye hücrelerinin apikal yüzeyleri). Bu protokol, ex vivo ürotelyal preparatta floresan sensör GCaMP5G kullanılarak mekanik olarak uyarlanan Ca 2 + geçicileri değerlendirmek için bir prosedürü açıklamaktadır; bu, diğer doğal doku preparatlarında mekanik olarak uyarlanmış Ca2 + olaylarının incelenmesi için kolayca uyarlanabilecek bir tekniktir.

Giriş

İdrar yollarındaki epitel hücreleri, idrar filtrasyonu nefronlardan geçerken mekanik kuvvetlere maruz kalır ve idrar renal pelvisten dışarı pompalanır ve idrar kesesinde depolanacak üreterlerden geçer. İdrar yolunu kaplayan epitel hücreleri üzerindeki sıvılar tarafından uygulanan mekanik kuvvetlerin (örneğin, kesme stresi ve gerilmesi), proksimal tübüldeki proteinin ve distal nefron 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11'deki çözünenlerin yeniden emilimini düzenlediği uzun zamandır bilinmektedir. 12,13, idrarın idrar kesesinde depolanması ve miksiyon14,15,16,17.

Mekanik uyaranların mekanik ve biyokimyasal sinyallere dönüştürülmesine, mekanotransdüksiyon olarak adlandırılan bir süreç, hücresel yapıların deformasyonuna veya ilişkili hücre dışı matrise yanıt veren proteinler aracılık eder 18,19,20,21. Mekanik olarak aktive edilen iyon kanalları, membran gerilimi, basıncı veya kayma gerilmesindeki değişikliklere yanıt olarak kapalı bir durumdan açık geçirgen bir duruma geçmeleri anlamında benzersizdir 18,19,20,21,22. Ek olarak, Ca 2+ geçicileri integrin aracılı mekanotransdüksiyon veya hücre-hücre kavşaklarında mekanoduyarlı yapışma sistemlerinin aktivasyonu ile başlatılabilir23,24,25,26. İyon kanalı fonksiyonu genellikle hücre zarı ile yama pipeti27 arasında bir gigaohm conta oluşumunu içeren yama-kelepçe tekniği ile değerlendirilir. Bununla birlikte, yoğun bir hücre dışı matrise (örneğin, böbrek tübülleri) sahip derin doku katmanlarında bulunan veya fiziksel bir bariyerle (örneğin, glikokaliks) çevrili hücrelere cam mikropipet ile erişmek zordur. Benzer şekilde, gömülü veya zayıf mekanik stabiliteye sahip dokuların ayrılmaz parçaları olan hücreler (örneğin, ürotelyum) yama-kelepçe tekniği ile kolayca çalışılamaz. Mekanik olarak aktive edilmiş birçok iyon kanalı Ca 2 + 'ya geçirgen olduğundan, alternatif bir yaklaşım, Ca2 + 'ya duyarlı bir boya veya GCaMP gibi genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri (GECI'ler) kullanarak floresan mikroskopi ile aktivitelerini değerlendirmektir. Protein mühendisliğindeki son çabalar, GECI'lerin28,29,30'unun dinamik aralığını, duyarlılığını ve tepkisini önemli ölçüde artırdı ve genetikteki ilerlemeler, belirli hücre popülasyonlarında ekspresyonlarına izin vererek onları mekanotransdüksiyonu incelemek için ideal hale getirdi.

İdrar kesesinin içini kaplayan tabakalı epitel olan ürotelyum, idrar solutlarının mesane interstisyumuna difüzyonunu önleyen bir bariyer olarak işlev görür, aynı zamanda bir dönüştürücü olarak işlev görür, mesane dolgunluğunu algılar ve bu olayları altta yatan sinirlere ve kas sistemineiletir16. Önceki çalışmalar, ürotelyum ve altta yatan dokular arasındaki iletişimin mekanik olarak aktive edilmiş iyon kanalları Piezo1 ve Piezo231'i gerektirdiğini göstermiştir. Ürotelyal hücrelerde mekanik olarak indüklenen Ca 2+ geçicileri değerlendirmek için, ürotelyal hücrelerde Ca2+ sensörü GCaMP5G'yi eksprese etmek için adenoviral gen transferini kullanan yeni bir teknik geliştirilmiştir. Bu teknik, en dıştaki şemsiye hücre tabakasına kolay erişim sağlayan bir mukozal tabaka preparatı ve kapalı bir cam mikropipet ile bireysel hücrelerin eşzamanlı mekanik uyarımı ve zaman içinde floresandaki değişikliklerin kaydedilmesi için bilgisayar destekli bir sistem kullanır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Hayvanların bakımı ve bakımı, Pittsburgh Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi'ne uygun olarak gerçekleştirildi. Bu çalışmada dişi, 2-4 aylık C57Bl/6J fareler kullanıldı. Fareler ticari olarak elde edildi (bakınız Malzeme Tablosu).

1. Ekipman montajı ve kurulumu

  1. Yüksek çözünürlüklü bir kamera ve sabit bir ışık kaynağı ile donatılmış dik bir mikroskopla Ca2+ görüntüleme gerçekleştirin (bkz.
    1. Görüntüleri, bir USB dijital I/O cihazı aracılığıyla kameranın, ışık kaynağının ve piezo aktüatörünün doğrudan kontrolüne izin veren mikroskop uyumlu bir yazılımla elde edin (bkz.
      NOT: Şekil 1 , kurulumun bir şemasını temsil eder. GCaMP5G, 470 nm pik uyarma dalga boyuna ve 497 nm28 pik emisyon dalga boyuna sahiptir. GCaMP5G görüntüleme için uygun bir filtre küpü kullanın.
  2. Mesane mukozası preparasyonunda bireysel ürotelyal hücrelerin uyarılması için ( bkz. adım 2), tek kanallı açık döngülü piezo kontrolörü tarafından kontrol edilen bir piezoelektrik aktüatör kullanın (bkz. Piezoelektrik aktüatörü bir mikromanipülatöre monte edin.
    1. Cam mikropipetleri piezoelektrik aktüatöre yapıştırılmış bir pipet tutucuya monte edin (Şekil 1). Piezo kontrolörünü, bir elektrofizyoloji veri toplama ve analiz programı tarafından kontrol edilen bir analog / dijital dönüştürücü ile uzaktan çalıştırın (bkz.
      NOT: Piezoelektrik aktüatörü hareket ettiren elektrofizyoloji veri toplama ve analiz yazılımında stimülasyon protokolünü tetiklemek için görüntüleme yazılımı tarafından başlatılan bir transistör-transistör mantığı (TTL) sinyali şeklinde harici bir tetikleyici kullanılır (Şekil 1).
  3. Görüntüleme yazılımının (bkz. Malzeme Tablosu) dijital G/Ç cihazıyla arayüz oluşturduğundan emin olun. TTL sinyalini analog/dijital dönüştürücüye iletmek için USB dijital G/Ç cihazında bir dijital çıkış kanalı yapılandırın, bu da piezoelektrik aktüatörü hareket ettiren elektrofizyoloji yazılımındaki protokolü başlatacaktır.
    1. Analog/dijital dönüştürücüdeki Start BNC bağlantı noktasını toprağa (GND) ve USB dijital G/Ç aygıtındaki vidalı terminali bağlamak için bir kablo kullanın.
  4. Görüntüleme yazılımında kayıt protokolünü ayarlayın.
    NOT: Aşağıdaki adımlarda, TTL sinyali gönderecek ve belirtilen zaman aralıklarında görüntü toplamaya başlayacak bir protokolün nasıl oluşturulacağı açıklanmaktadır.
    1. Deneme Yöneticisi'ne tıklayıp Yeni Deneme'yi seçerek görüntüleme yazılımında edinme protokolünü ayarlayın. Yeni bir pencere açılacaktır.
    2. Hızlandırılmış Döngü simgesini seçin ve yeni açılan pencereye sürükleyin; döngü sayısını 2'ye, aralığı ise kurulumda izin verilen en hızlı ayara ayarlayın.
    3. İletilen Deklanşör/Manuel Deklanşör simgesinden NI USB-6501 simgesini seçin ve Hızlandırılmış Döngü penceresine sürükleyin ve ardından NI USB-6501'i kapalı olarak ayarlayın. İletilen Deklanşör/Manuel Deklanşör'den Zaman Atlamalı Döngü penceresine ek bir NI USB-6501 sürükleyin ve açık olarak ayarlayın. İki NI USB-6501 simgesini bağlamak için NI USB-6501 kapalı simgesinin yanındaki ok ucunu sürükleyin ve NI USB-6501 açık simgesine dokunana kadar çekin. Her iki simgeyi birbirine bağlayan bir çizgi görünecektir.
    4. Başka bir Zaman Atlamalı Döngüyü Deneme Yöneticisi penceresine sürükleyin ve ok ucunu çekerek ilkine bağlayın. Kayıt parametrelerini ayarlayın. Yeni Hızlandırılmış Döngünün döngü sayısını 2400 olarak ayarlayın.
    5. Görüntü Alma simgesinden, GFP filtresini yakın zamanda açılan Hızlandırılmış Döngüye sürükleyin ve pozlama süresini 100 ms'ye ayarlayın.
    6. Kamera görüntü türünü 8 bit, çözünürlüğü 576 x 576 (Bölme 4 x 4), piksel saatini 480 MHz ve Sıcak piksel düzeltmesini standart olarak ayarlayın.
      NOT: Parametreler, floresan sensörün ifade seviyesine, kamera hassasiyetine ve kurulum yapılandırmasına bağlı olarak ayarlanabilir.
  5. Elektrofizyoloji yazılımında Laboratuvar Tezgahını kurun (bkz.
    NOT: Bu, çıkış sinyalini analog/dijital dönüştürücünün mV cinsinden tanımlayacaktır.
    1. Elektrofizyoloji yazılımında Yapılandır menüsüne gidin ve Lab Bench'i seçin. Ortaya çıkan Çıkış Sinyalleri penceresinde, Analog Çıkış #1'i seçin, Sinyal ekle'ye basın ve adlandırın (örneğin, "Piezo"). Sinyal Birimi'ni mV'ye, Ölçek Faktörü'nü (mV/V) ise 1 olarak ayarlayın.
  6. Aşağıdaki adımları izleyerek elektrofizyoloji yazılımında bir stimülasyon protokolü oluşturun.
    1. Elektrofizyoloji yazılımında yeni bir stimülasyon protokolü oluşturmak için, Al menü öğesine gidin ve Yeni Protokol'ü seçin.
    2. Mod/Hız'ı epizodik stimülasyon, Çalıştır/Deneme ayarını 1, Süpür/Çalıştır'ı 1'e ve Süpürme Süresi'ni (süre)sini 150'ye ayarlayın.
    3. Çıkışlar menüsünde, Kanal #1 Piezo'yu Analog çıkış olarak seçin.
    4. Tetikleyici menüsünde, tetikleyiciyi Sayısallaştırıcı Başlangıç Girişi ve Dahili Zamanlayıcı olarak ayarlayın.
    5. Dalga Formu menüsünde, kanal #1 ve Analog Dalga Formu ile Epochs'u seçin. Adım A'yı Adım, Birinci Düzey 0, Delta düzeyi 0, İlk süre 10000 ve Delta süresini 0 olarak ayarlayın.
    6. Adım B'yi Adım, İlk düzey 10, Delta Düzeyi'ni 0, İlk Süre'yi 1000 ve Delta Süresi'ni 0 olarak ayarlayın. Adım C'yi Adım, İlk Düzey 0, Delta Düzeyi 0, İlk Süre 130000 ve Delta Süresi'ni 0 olarak ayarlayın.
    7. Protokolü kaydedin ve Stimülasyon protokolü olarak adlandırın.
  7. Analog/dijital dönüştürücüdeki Analog Çıkış #1'i, tek kanallı açık döngülü piezo denetleyicisinin önündeki EXT GİRİŞ'e bağlamak için bir BNC kablosu kullanın (bkz.
  8. Aşağıdaki adımları izleyerek kılcal cam borulardan şemsiye hücrelerinin mekanik olarak uyarılması için cam mikropipetler üretin.
    1. Kılcal camı bir çektirmeye yerleştirin (bkz. Malzeme Tablosu) ve kılcal tutucu düğmelerle ayarlayın.
    2. Isıtıcı ünitesini tam yüksekliğinde konumlandırın. Çektirmenin ilk çekme sonlandırma konumu kaydırıcısını 5'e ayarlayın.
    3. İlk ısıtıcı düğmesini 76,7'ye ve ikinci düğmeyi 52,7'ye ayarlayın.
    4. Başlat düğmesine basarak cam kılcal damarı iki adımda çekin.
    5. Mikropipetin ucunu bir mikroforge ile kapatın (bkz. Malzeme Tablosu) ısıtıcı ayar düğmesi 60 olarak ayarlanmışken.
      NOT: Mevcut protokol için, tek tek hücreleri dürtmek için kullanılan mikropipet ucunun son çapı ~ 1-3 μm'dir.
  9. Uyarıcı mikropipetin, stimülasyon protokolünde belirtilen mesafeyi hareket ettirdiğini doğrulayın.
    NOT: Aşağıdaki adımlar, elektrofizyoloji yazılımında stimülasyon protokolünü başlattıktan sonra 12,5 s'nin, piezoelektrik aktüatörün 20 μm hareket etmesini sağlayarak 1 s süreli bir voltaj darbesinin üretilmesini sağlamaktır.
    1. Tutucuya bir mikropipet takın ve piezoelektrik aktüatöre takın.
    2. Piezoelektrik aktüatörü ve bağlı mikropipeti mikroskop aşamasının merkezine paralel olarak ve görüş alanına yerleştirin.
    3. Pipetin ucuna odaklanın ve piezoelektrik montaj çubuğunu (bkz. Malzeme Tablosu) bantla hareketsiz hale getirin. Parlak alan aydınlatması altında, pipet ucunun net bir görüntüsünü elde etmek için kamera parametrelerini ayarlayın.
    4. Elektrofizyoloji yazılımındaki Stimülasyon protokolünü açın ve oynatacak şekilde ayarlayın.
      NOT: Elektrofizyoloji protokolü, görüntüleme yazılımından gönderilen TTL sinyali alınana kadar başlamaz.
    5. Veri toplamayı başlatmak için görüntüleme yazılımındaki Deneme Yöneticisi'nden Başlat'a basın.
      NOT: Bu, piezoelektrik aktüatörü çalıştıracak olan elektrofizyoloji yazılımındaki protokolü tetikleyecektir. Görüntüleme yazılımındaki protokol, deneyin görüntülerini içeren bir dosya oluşturacaktır.
  10. Aşağıdaki adımları izleyerek pipetin kat ettiği mesafeyi doğrulayın.
    1. Stimülasyon protokolü sırasında pipetin kat ettiği mesafeyi ölçmek için, görüntüleme yazılımında Say ve Ölçün öğesini seçin.
    2. Hesaplama menüsünden, Ölçüm ve YG seçeneğini belirlediğinizde, film penceresinin altında yeni bir pencere açılır.
    3. Ölçü menüsünden, Rasgele Çizgi'yi seçin.
    4. Film penceresinde, pipetin ucundan başlayarak rastgele bir çizgi çizin. Rasgele satırın sonunun daha sonra ayarlanacağını unutmayın.
    5. Çizgiyi tüm film karelerinde görülebilecek bir ilgi alanına (ROI) dönüştürmek için rastgele çizgiye sağ tıklayın.
    6. Filmi inceleyin ve rastgele çizginin (ROI) ucunu, uyarana yanıt olarak pipet tarafından kat edilen son konuma ayarlayın.
      NOT: Pipetin μm cinsinden kat ettiği mesafe Ölçüm ve YG penceresinde görünür. Stimülasyon protokolü kullanıcı ihtiyaçlarına göre değiştirilebilir.

2. Mesane mukozasının in situ transdüksiyonu ve izolasyonu

  1. Dişi fare mesanelerini, virüs transdüksiyon protokolü31'de açıklanan prosedüre göre CGaMP5G'nin cDNA'sını kodlayan bir adenovirüs ile yerinde dönüştürün.
    1. Ca 2 + görüntüleme deneyleri için ürotelyal hücreleri dönüştürürken, mesaneleri2 x 107 bulaşıcı viral partikül (IVP) içeren çözeltinin 50 μL'si ile aşılayın.
      NOT: Bu teknik, CGaMP5G'nin ekspresyonunu şemsiye hücre katmanına kısıtlama eğilimindedir. Alternatif olarak, ürotelyal hücrelerde CGaMP5G'yi eksprese eden transgenik farelerden toplanan idrar keseleri (yani, bir üroplakin-2 promotoru tarafından tahrik edilen GCaMP5G ekspresyonu) veya başka herhangi bir hücre tipi ile deneyler yapılabilir.
  2. Transdüksiyondan 24-72 saat sonra, fareleri CO2 boğulması ile ötenazi yapın ve akciğerlerin çökmesine neden olmak için göğüs boşluğunu makasla açarak torakotomi yapın.
  3. Üretrayı 24 G kateter ile kanüle edin. Mesaneyi, deri ve kas boyunca ~ 1.5 cm'lik bir karın kesisi ile maruz bırakın ve kateteri üretraya sabitlemek için 6.0 dikiş kullanın (bkz.
  4. Mesane ve üretra 32'yi toplayın ve aşağıdakileri içeren (mM cinsinden) kayıt çözeltisinde yıkanmış bir silikon kauçuk tutucu pedine yapıştırın (bkz. Malzeme Tablosu): 135 NaCl, 5.0 KCl, 1 MgCl 2,2.5 CaCl2, 10 glikoz, 10 HEPES, pH 7.4 ve% 100O2 ile kabarcıklanmış (Şekil 2A).
  5. Mesane mukozasını, daha önce yayınlanmış raporlar32'yi takiben ince forseps ile altta yatan kas tabakasından ayırın (Şekil 2B).
  6. Mesane mukozasını kesin ve ürotelyum 35 mm çapında doku kültürlü bir kabın dibinde silikon elastomer bir eke bakacak şekilde sabitleyin (Şekil 2C).

3. Bireysel ürotelyal hücrelerin mekanik olarak uyarılması ve Ca2+ görüntüleme

  1. Doku kültürlü çanağı, rezistif ısıtma elemanlarına sahip bir kültür çanağı inkübatörü ile donatılmış mikroskop aşamasında sabitlenmiş mesane mukozası ile monte edin (Şekil 2E). Perfüze (üreticinin talimatlarını izleyerek, Malzeme Tablosuna bakınız) hücre kültürü kabı, sıralı bir ısıtıcı ile ~ 37 ° C'de ısıtılan kayıt çözeltisi ile sürekli olarak 1,7 mL / dak hızında bulunur.
  2. Çift kanallı bipolar sıcaklık kontrol cihazı modeli ile doku kabı inkübatörünün ve çözeltilerinin sıcaklığını ~ 37 ° C'de tutun (bkz. Daha fazla deneysel prosedür uygulamadan önce odadaki dokuyu en az 15 dakika boyunca sürekli perfüzyonla dengeleyin.
  3. Mekanik olarak indüklenen Ca2+ geçicileri kaydetmek için, mikropipeti doku kabındaki sabitlenmiş mesane mukozasını yıkayarak çözeltiye batırın. Parlak alan aydınlatması kullanarak düşük büyütmeli tarama hedefi (4x) yardımıyla mikropipeti alanın merkezine taşıyın.
    1. Mikropipeti, mikromanipülatörü dikey düzlemde koordineli olarak hareket ettirerek ve odağı ayarlayarak ürotelyal dokunun yüzeyine yakın bir yere hareket ettirin.
    2. Hedefi, yüksek sayısal açıklığa (NA) sahip immünofloresan için uygun, daha yüksek büyütmeli (20x) bir hedefe geçin.
    3. Mikromanipülatörü İnce olarak ayarlayın ve mikropipeti hedef hücrenin üst kısmına yakın bir yere getirin.
    4. Görüş alanını fotoğraf makinesi olarak değiştirin ve görüntüleme yazılımında Canlı yayına basın.
      NOT: Bu, yansıyan deklanşörü açmalı ve bilgisayardaki dokudan yayılan floresan sinyalin gözlemlenmesine izin vermelidir.
    5. Hücrenin üst kısmını görselleştirmek için odağı ayarlayın ve gerekirse pipetin konumunu ayarlayın.
    6. Elektrofizyoloji yazılımındaki Stimülasyon protokolünü açın ve oynatacak şekilde ayarlayın.
      NOT: Elektrofizyoloji yazılımındaki protokol, görüntüleme yazılımından gönderilen TTL sinyali alınana kadar başlamaz.
    7. Veri toplamayı başlatmak için görüntüleme yazılımındaki Deneme Yöneticisi'nden Başlat'a basın. Bu, piezoelektrik aktüatörü çalıştıracak ve deneyin görüntülerini içeren bir dosya oluşturacak olan elektrofizyoloji yazılımındaki protokolü tetikleyecektir. Stimülasyon protokolü kullanıcının ihtiyaçlarına göre değiştirilebilir.

4. Veri analizi

  1. Aşağıdaki adımları izleyerek zaman içindeki floresan yoğunluğunu ölçün.
    1. Görüntü dosyasını görüntüleme yazılımında açın ve Say ve Ölç penceresini seçin. Poligon aracını seçin ve dürtülen hücrenin sınırlarına bir yatırım getirisi çizin.
    2. Hesaplama penceresine gidin, Yoğunluk Profili'ni seçin, ölçümü Zaman içinde, Sonuçlar Ortalama, Arka Plan Çıkarma Hiçbiri olarak ayarlayın ve ardından Yürüt'e basın. Ortalama floresan yoğunluğu zaman içinde hesaplanacaktır (Şekil 3).
    3. Yoğunluk profili verilerini dışa aktarmak için, Yoğunluk Profili Sonuçları penceresindeki Excel simgesine tıklayın. Bu, kullanıcının hedef klasörü ve dosya adını seçmesine ve verileri .xlsx biçiminde kaydetmesine olanak tanır.
  2. Bilimsel grafik ve veri analizi yazılımı kullanarak veri analizi yapın (bkz.
    NOT: Dürtme ile uyarılan Ca2+ zirvesinin genliği, floresan yoğunluğundaki (ΔF / F) değişim olarak ifade edilir; burada F, 0 zamanında GCaMP5G'nin floresan yoğunluğudur ve ΔF, floresan yoğunluğu maksimumu ile 0 zamanındaki bazal arasındaki farktır. Ca2+ yanıtının bozunumu da hesaplanabilir (gösterilmez).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Mevcut protokol, floresan Ca 2+ sensörü GCaMP5G kullanılarak şemsiye hücrelerinde mekanik olarak uyarılan Ca2+ geçicileri değerlendirmek için bir teknik tanımlamaktadır. Adenoviral transdüksiyon, ürotelyal hücrelerde GCaMP5G'yi yüksek etkinliği ve yüksek bir ekspresyon seviyesi üretmesi nedeniyle eksprese etmek için kullanıldı. Transdüktif bir mesaneden lekeli kriyoseksiyonların floresan görüntüleri Şekil 2D'de gösterilmiştir. Bu deneyler için, GCaMP5G ekspresyonu şemsi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Tüm organizmalar ve görünüşte çoğu hücre tipi, mekanik uyaranlara cevap veren iyon kanallarını eksprese eder 20,33,34,35,36,37. Mekanik olarak aktive edilen bu kanalların işlevi ağırlıklı olarak yama-kelepçe tekniği ile değerlendirilmiştir. Bununla birlikte, erişilebilirlik sorunları nedeniyle, mekanik olarak aktive edilmiş i...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, NIH hibeleri R01DK119183 (G.A. ve MDC'ye) ve S10OD028596 (GA'ya) ve Pittsburgh Böbrek Araştırma Merkezi'nin Hücre Fizyolojisi ve Model Organizmaları Böbrek Görüntüleme Çekirdekleri (P30DK079307) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
20x objektifOlympusUMPlanFL N
24 G ¾ ” kateterMedline Suresite IV slaytı 
4x ObjektifOlympusUPlanFL N
Analog/dijital dönüştürücüMoleküler CihazlarDigidata 1440A
Anti-GFP antikoruAbcam Ab6556
Işın ayırıcıChromaT495lpxr
Bipolar sıcaklık kontrolörü ve nbsp;Warner InstrumentsTC-344B
CaCl2>Fluka21114-1L1 M çözüm
cellSens yazılımı OlympusGörüntüleme yazılımı
CMOS kameraHamamatsuORCA füzyon
Eşek anti-tavşan Alexa Fluor 488 ile konjuge &Jackson ImmunoResearch711-545-152
ExcelMicrosoft Corporation
Filtresi Kroma ET470/40X
Cam kılcal damarlar Corning 8250 camWarner Instruments G85150T-4
GlikozSigmaG8270
HEPES SigmaH4034
Hat içi ısıtıcı Warner InstrumentsSH-27B
KClSigma793590
Işık kaynağıSutter InstrumentsLambda XL 
Manifold pompa hortumuFisherbrand14-190-510ID 1.52 mm
Manifold pompa hortumuFisherbrand14-190-533ID 2.79 mm
MgCl2SigmaM9272
Fareler Jackson Lab6642-4 aylık dişi C57BL/6J
MicroforgeNarishige MF-830
MikromanipülatörSutter InstrumentsMP-285
MikroskopOlympusBX51W
DAPIInvitrogenS36964 ile montaj ortamı DAPI ile Slowfade Pırlanta Antifade
NaCl SigmaS7653
pClamp yazılımıMoleküler CihazlarSürüm 10.4Yama kelepçesi elektrofizyolojisi veri toplama ve analiz yazılımı
Peristaltik pompaGilsonMinipuls 3
Piezoelektrik aktüatörThorlabsPAS005
Pipet tutucuWorld Hassas Aletler
Pipet çektirmeNarishigePP-830
Perfüzyon ve adaptör halkası kiti ile hızlı değişim ısıtmalı tabanWarner InstrumentsQE-1Hızlı değiştirme platformu 35 mm çanak ve nbsp;  
Rodamin-phalloidin InvitrogenR415
Sigma-PlotSystat Software IncSürüm 14.0Bilimsel grafik ve veri analizi yazılımı   
Silikon elastomerDowSylgard 184
Tek kanallı açık döngü piezo denetleyiciThorlabsMDT694B
Kare ızgara tutucu pedTed Pella10520
SütürAD CerrahiS-S618R136-0 Sylk
Teflon montaj çubuğuÖzel yapımPiezoelektrik aktüatörü mikromanipülatöre monte etmek için kullanın
BoruFisher Scientific14171129Tygon S3 ID 1/16 IN, OD 1/8 IN
USB Dijital G/Ç cihazı Ulusal AletlerNI USB-6501

Kaynaklar

  1. Kunau, R. T., Webb, H. L., Borman, S. C. Characteristics of the relationship between the flow rate of tubular fluid and potassium transport in the distal tubule of the rat. Journal of Clinical Investigation. 54 (6), 1488-1495 (1974).
  2. Engbretson, B. G., Stoner, L. C. Flow-dependent potassium secretion by rabbit cortical collecting tubule in vitro. American Journal of Physiology. 253 (5), 896-903 (1987).
  3. Satlin, L. M., Sheng, S., Woda, C. B., Kleyman, T. R. Epithelial Na(+) channels are regulated by flow. American Journal of Physiology Renal Physiology. 280 (6), 1010-1018 (2001).
  4. Woda, C. B., et al. Ontogeny of flow-stimulated potassium secretion in rabbit cortical collecting duct: functional and molecular aspects. American Journal of Physiology Renal Physiology. 285 (4), 629-639 (2003).
  5. Malnic, G., Berliner, R. W., Giebisch, G. Flow dependence of K+ secretion in cortical distal tubules of the rat. American Journal of Physiology. 256 (5), 932-941 (1989).
  6. Khuri, R. N., Strieder, W. N., Giebisch, G. Effects of flow rate and potassium intake on distal tubular potassium transfer. American Journal of Physiology. 228 (4), 1249-1261 (1975).
  7. Good, D. W., Wright, F. S. Luminal influences on potassium secretion: sodium concentration and fluid flow rate. American Journal of Physiology. 236 (2), 192-205 (1979).
  8. Wong, K. R., Berry, C. A., Cogan, M. G. Flow dependence of chloride transport in rat S1 proximal tubules. American Journal of Physiology. 269 (6), 870-875 (1995).
  9. Garvin, J. L. Glucose absorption by isolated perfused rat proximal straight tubules. American Journal of Physiology. 259 (4), 580-586 (1990).
  10. Malnic, G., Klose, R. M., Giebisch, G. Micropuncture study of renal potassium excretion in the rat. American Journal of Physiology. 206 (4), 674-686 (1964).
  11. Malnic, G., Klose, R. M., Giebisch, G. Micropuncture study of distal tubular potassium and sodium transport in rat nephron. American Journal of Physiology. 211 (3), 529-547 (1966).
  12. Cabral, P. D., Garvin, J. L. Luminal flow regulates NO and O2(-) along the nephron. American Journal of Physiology. 300 (5), 1047-1053 (2011).
  13. Raghavan, V., Rbaibi, Y., Pastor-Soler, N. M., Carattino, M. D., Weisz, O. A. Shear stress-dependent regulation of apical endocytosis in renal proximal tubule cells mediated by primary cilia. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8506-8511 (2014).
  14. Lewis, S. A., de Moura, J. L. Apical membrane area of rabbit urinary bladder increases by fusion of intracellular vesicles: an electrophysiological study. The Journal of Membrane Biology. 82 (2), 123-136 (1984).
  15. Fowler, C. J., Griffiths, D., de Groat, W. C. The neural control of micturition. Nature Reviews Neuroscience. 9 (6), 453-466 (2008).
  16. Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. The urothelium: life in a liquid environment. Physiological Reviews. 100 (4), 1621-1705 (2020).
  17. Khandelwal, P., Abraham, S. N., Apodaca, G. Cell biology and physiology of the uroepithelium. American Journal of Physiology Renal Physiology. 297 (6), 1477-1501 (2009).
  18. Sachs, F. Stretch-activated ion channels: what are they. Physiology. 25 (1), 50-56 (2010).
  19. Martinac, B. Mechanosensitive ion channels: molecules of mechanotransduction. Journal of Cell Science. 117 (12), 2449-2460 (2004).
  20. Ranade, S. S., Syeda, R., Patapoutian, A. Mechanically activated ion channels. Neuron. 87 (6), 1162-1179 (2015).
  21. Cox, C. D., Bavi, N., Martinac, B. Biophysical principles of ion-channel-mediated mechanosensory transduction. Cell Reports. 29 (1), 1-12 (2019).
  22. Carattino, M. D., Sheng, S., Kleyman, T. R. Epithelial Na+ channels are activated by laminar shear stress. Journal of Biological Chemistry. 279 (6), 4120-4126 (2004).
  23. Ross, T. D., et al. Integrins in mechanotransduction. Current Opinion in Cell Biology. 25 (5), 613-618 (2013).
  24. Dieterle, M. P., Husari, A., Rolauffs, B., Steinberg, T., Tomakidi, P. Integrins, cadherins and channels in cartilage mechanotransduction: perspectives for future regeneration strategies. Expert Reviews in Molecular Medicine. 23, 14(2021).
  25. Huveneers, S., de Rooij, J. Mechanosensitive systems at the cadherin-F-actin interface. Journal of Cell Science. 126, 403-413 (2013).
  26. Sun, Z., Guo, S. S., Fässler, R. Integrin-mediated mechanotransduction. Journal of Cell Biology. 215 (4), 445-456 (2016).
  27. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflügers Archiv. European Journal of Physiology. 391 (2), 85-100 (1981).
  28. Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. The Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).
  29. Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 2(2013).
  30. Sun, X. R., et al. Fast GCaMPs for improved tracking of neuronal activity. Nature Communications. 4, 2170(2013).
  31. Dalghi, M. G., et al. Functional roles for PIEZO1 and PIEZO2 in urothelial mechanotransduction and lower urinary tract interoception. JCI Insight. 6 (19), 152984(2021).
  32. Durnin, L., et al. An ex vivo bladder model with detrusor smooth muscle removed to analyse biologically active mediators released from the suburothelium. The Journal of Physiology. 597 (6), 1467-1485 (2019).
  33. Delmas, P., Coste, B. Mechano-gated ion channels in sensory systems. Cell. 155 (2), 278-284 (2013).
  34. Tavernarakis, N., Driscoll, M. Degenerins. At the core of the metazoan mechanotransducer. Annals of the New York Academy of Sciences. 940 (1), 28-41 (2001).
  35. Peyronnet, R., Tran, D., Girault, T., Frachisse, J. M. Mechanosensitive channels: feeling tension in a world under pressure. Frontiers in Plant Science. 5, 558(2014).
  36. Blount, P., Iscla, I. Life with bacterial mechanosensitive channels, from discovery to physiology to pharmacological target. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 84 (1), 00055(2020).
  37. Booth, I. R., Miller, S., Müller, A., Lehtovirta-Morley, L. The evolution of bacterial mechanosensitive channels. Cell Calcium. 57 (3), 140-150 (2015).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Mekanik Aktivasyonlu KanallarKalsiyum Ge i leriEx Vivo Haz rl kMekanik Stim lasyonFloresan Kalsiyum Sens rGCaMP5G G r nt lemeemsiye H crelerMesane MukozasFloresans Yo unlu u
Eski Vivo Ürotelyal Hücrelerde Mekanik Olarak Aktive Edilmiş Ca2+ Geçicilerinin Analizi
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.