Yöntem makalesi

Bronşiyal Epitel Hücrelerinin Biyobankacılık için Rezeke Akciğer Dokusundan İzole Edilmesi ve İyi Diferansiye Hava-Sıvı Arayüz Kültürlerinin Oluşturulması

DOI:

10.3791/65102

⸱

26 Mayıs 2023

 ,  , 
1PulmoScience Laboratory, Department of Pulmonology, Leiden University Medical Center

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, uzun süreli biyobankacılık için primer bronşiyal epitel hücrelerinin izolasyonu ve genişletilmesi ve hava-sıvı arayüzünde kültür yoluyla farklılaşmış epitel hücrelerinin üretilmesi için tekrarlanabilir, uygun fiyatlı ve sağlam bir yöntem sunulmaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hava yolu epitel hücre tabakası, akciğer dokusu ile dış çevre arasındaki ilk bariyeri oluşturur ve böylece enfeksiyöz ajanlar ve hava kirleticileri de dahil olmak üzere sürekli olarak solunan maddelere maruz kalır. Hava yolu epitel tabakası çok çeşitli akut ve kronik akciğer hastalıklarında merkezi bir rol oynar ve bu epiteli hedef alan çeşitli tedaviler inhalasyon yoluyla uygulanır. Patogenezde epitelin rolünün ve tedavi için nasıl hedeflenebileceğinin anlaşılması sağlam ve temsili modeller gerektirir. İn vitro epitel kültürü modelleri giderek daha fazla kullanılmaktadır ve kontrollü bir ortamda deneyler yapmanın, hücreleri farklı uyaranlara, toksik maddelere veya enfeksiyöz ajanlara maruz bırakmanın avantajını sunmaktadır. Ölümsüzleştirilmiş veya tümör hücre hatları yerine birincil hücrelerin kullanılması, bu hücrelerin kültürde, hücre hatlarına kıyasla epitelin daha iyi bir temsili ile psödostratifiye polarize epitel hücre tabakasına farklılaşması avantajına sahiptir.

Burada, hava yolu epitel hücrelerinin akciğer dokusundan izolasyonu ve kültürü için son on yılda optimize edilmiş sağlam bir protokol sunulmaktadır. Bu prosedür, hava-sıvı arayüzünde (ALI) kültürlenerek primer bronşiyal epitel hücrelerinin (PBEC'ler) başarılı bir şekilde izole edilmesine, genişlemesine, kültürüne ve mukosiliyer farklılaşmasına izin verir ve biyobankacılık için bir protokol içerir. Ayrıca, bu kültürlerin hücreye özgü belirteç genleri kullanılarak karakterizasyonu tanımlanmıştır. Bu ALI-PBEC kültürleri, tüm sigara dumanına veya enflamatuar mediatörlere maruz kalma ve virüs veya bakterilerle ko-kültür / enfeksiyon dahil olmak üzere bir dizi uygulama için kullanılabilir.

Bu makalede verilen ve prosedürü adım adım gösteren protokolün, bu tür kültür sistemlerini laboratuvarlarında uygulamak veya uyarlamak isteyenler için bir temel ve / veya referans sağlaması beklenmektedir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hava yolu epitelinin çeşitli akut ve kronik akciğer hastalıklarındaki rolü çeşitli derlemelerde tanımlanmıştır 1,2,3,4,5,6,7. Hava yolu epitel hücrelerinin iyi farklılaşmış kültürleri, hava yolu epitelinin rolünü çözmek için önemli bir araçtır. Hava-sıvı arayüzü (ALI) hava yolu epitel hücre kültürü, hava yolu bazal epitel hücrelerinin farklılaşmasını teşvik etmek ve böylece hava yolu epitelini in vitro 8,9 güvenilir bir şekilde incelemek için geniş çapta uygulanır. Geçtiğimiz yıllarda, COVID-19 pandemisi ile ilgili yeni araştırma girişimleri ve dünya çapında hayvansız araştırmalara geçişin bir sonucu olarak bu tür modellerin kullanımı daha da artmıştır. Bu nedenle, bu model hücre hattının artan kullanımı, sağlam sonuçlar elde etmek için prosedürlerin ve deneyimlerin paylaşılması ihtiyacını vurgulamaktadır. Bu aynı zamanda araştırma grupları arasında sonuçların karşılaştırılmasına da izin verecektir. Prosedürün sağlamlığı temel özelliktir ve bu nedenle kalite kontrolüne tabi tutulması gerekir. Birkaç laboratuvar, ALI'deki birincil hava yolu epitel hücrelerini kültürlemek için protokoller geliştirmeye yatırım yapmıştır. Bu prosedürler ayrıntılı olarak paylaşıldığında zaman, çaba ve gerekli bütçe azaltılabilir. Bu ayrıntılar, örneğin, çeşitli üreticiler tarafından sağlanan hücre kültürü plastikleri ve ortamlarının seçimini içerir, çünkü bunun elde edilen kültürlerin özelliklerini etkilediği bulunmuştur10,11,12. Bu, kültür prosedürlerinin deneyimlerinin ve ayrıntılarının paylaşılmasının önemini vurgulamaktadır, çünkü bu tür içgörülerin yokluğunda, sonuçlar etkilenebilir ve / veya çeşitli laboratuvarlardaki doğrulama çabaları engellenebilir.

İnsan akciğer epiteli, bazal hücreler, siliye hücreler, kadeh hücreleri ve kulüp hücreleri gibi ana tipler de dahil olmak üzere çeşitli hücre tiplerini içerir. Epitel hücre tabakasını in vitro hava yollarında güvenilir bir şekilde taklit etmek için, bu hücre tiplerinin kültür modellerinde temsil edilmesi ve polarizasyonlarının ve işlevlerinin 13,14,15,16 olarak korunması gerekir. Donör özelliklerinin (hastalık durumu dahil) ve hücrelerin anatomik kökeninin (yani nazal, trakeal, büyük ve küçük hava yolları) hücre kültürünün hücresel kompozisyonunu ve fonksiyonel yanıtlarını etkileyebileceğinin anlaşılması da aynı derecede önemlidir. İlgili uzmanlık ve uygulama, primer hava yolu epitel hücrelerini başarılı bir şekilde kültürlemek ve kültürün kalitesini hem sezgisel olarak (kültür sırasında görsel muayene yoluyla) hem de nicel olarak değerlendirmek için bir ön koşuldur. Bu katkının amacı, trakeal ve küçük hava yolu epitel hücrelerinin kültürüne de uygulanabilen primer insan bronşiyal epitel hücrelerinin (PBEC'ler) izolasyonu ve kültürü için maliyet ve zaman açısından etkili bir yöntem sağlamaktır. Bu tür hücrelerin rezeke edilmiş akciğer dokusundan izole edilmesine yönelik bir yöntemin tanımlanmasına ek olarak, genişleme ve biyobankacılık için bir yöntem ve son olarak makul bir maliyet ve zaman dilimi içinde iyi farklılaşmış bir ALI kültürünün kurulması ve karakterizasyonu için bir yöntem sunulmakta ve tartışılmaktadır.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücreler, Hollanda'daki Leiden Üniversitesi Tıp Merkezi'nde akciğer kanseri nedeniyle rezeksiyon ameliyatı geçiren hastalardan elde edilen makroskopik olarak normal akciğer dokusundan izole edildi. Bu akciğer dokusunun türetildiği hastalar, bu dokunun kodlanmış anonim olarak daha fazla kullanılması için itirazsız bir sistem aracılığıyla biyobankaya kaydedildi (www.coreon.org). Bununla birlikte, 01-09-2022 tarihinden itibaren hastalar, kurumsal tıbbi etik kurul (B20.042/Ab/ab ve B20.042/Kb/kb) onayı ile LUMC biyobankasının yerel düzenlemelerine uygun olarak aktif bilgilendirilmiş onam kullanılarak biyobankaya kaydedilmiştir.

NOT: Tüm prosedürler, aksi belirtilmedikçe, biyolojik bir güvenlik kabininde, yerel biyolojik güvenlik kurallarına göre ve cerrahi eldiven ve laboratuvar önlüğü giyerken steril çalışma koşulları altında gerçekleştirilir. Protokolde kullanılan tüm medya, reaktifler ve diğer çözümler için lütfen Malzeme Tablosu ve Ek Tablo 1'e bakın. Ayrıntılı protokol adımları için lütfen Şekil 1'e bakın

1. Bronşiyal epitel hücrelerinin insan akciğer dokusundan izolasyonu

NOT: Bronşiyal epitel hücre izolasyonu için optimal bir başarı oranı elde etmek için, eksize edilen bronşiyal halka, Primosin eklenmiş fosfat tamponlu salin (PBS) içinde maksimum 24 saat boyunca 4 ° C'de suya batırılmış halde tutulmalıdır.

  1. Prosedürün başlamasından önceki hazırlıklar
    1. Ek Tablo 1'de açıklandığı gibi PBS'de bir kaplama çözeltisi hazırlayın ve kuyu başına 1,5 mL kaplama çözeltisi ile uygun sayıda 6 delikli plakayı kaplayın. Bir hücre kültürü inkübatöründe 37 ° C'de ve% 5 CO 2'de2 saat inkübe edin.
      NOT: Kaplanacak kuyucuk sayısı, eksize edilen dokunun boyutuna bağlıdır. Kaba bir kılavuz olarak, eksize edilen bronşiyal halka 10 mm çapında ve 4 mm genişliğinde olduğunda dört adet 6 delikli plaka kaplanır.
    2. Ek Tablo 1'de açıklandığı gibi komple keratinosit serumsuz ortam (c-KSFM) hazırlayın; 6 delikli bir plakanın kuyucuğu başına 2 mL ortam kullanın.
      NOT: Bu c-KSFM, 7 gün boyunca 4 °C'de saklanabilir. c-KSFM, kirletici fibroblastların büyümesini inhibe ederken hava yolu epitel hücrelerinin genişlemesi için kullanılan düşük kalsiyumlu bir ortamdır.
  2. Halkayı 10 cm'lik bir Petri kabında 10 mL steril PBS içinde nazikçe durulayarak bronşiyal halkayı temizleyin. Halkayı dikkatlice tutmak için cımbız kullanın (sadece dışarıya dokunun) ve fazla bağ dokusunu ve kan kalıntılarını çıkarmak için küçük makas kullanın. Daha fazla işlem için, halkayı ikiye bölün.
    NOT: İşlemde kullanılan tüm aletler kullanılmadan önce sterilize edilmelidir.
  3. Bronşiyal halkanın iki yarısını, kapalı bir steril kapta Primosin de dahil olmak üzere Hank'in dengeli tuz çözeltisinde (HBSS) önceden ısıtılmış bir proteaz XIV (1.8 mg / mL) çözeltisinin 10 mL'sine batırın ve bir hücre kültürü inkübatöründe 37 ° C'de tam olarak 2 saat inkübe edin.
    NOT: HBSS, 2 saatlik bir inkübasyon süresi boyunca hücreleri dokudan ayırmak için proteaz XIV için bir seyreltici olarak kullanılır. HBSS, kısa süreli inkübasyonlar sırasında hücre canlılığının korunmasını sağlayan dengeli bir izotonik çözümdür.
  4. İnkübasyondan sonra, doku parçalarını 10 mL ılık PBS içeren bir Petri kabına aktarın ve bir hücre çözeltisi elde etmek için bükülmüş cımbız kullanarak halkanın içini kazıyın.
    NOT: Doku daha yumuşak ve biraz genişlemiş görünür.
  5. Halkayı atın, hücre çözeltisini 50 mL'lik bir tüpe aktarın ve 50 mL'lik son bir hacim elde etmek için ılık PBS ekleyin. 230 x g'de ve oda sıcaklığında (RT) 7 dakika boyunca santrifüj.
  6. Süpernatantı aspire edin ve peletleri 10 mL sıcak PBS'de yeniden askıya alın. Ayrıca, sıcak PBS ile 50 mL'ye kadar ses seviyesini yükseltin. RT'de 230 x g'de 7 dakika boyunca santrifüj.
  7. Süpernatantı aspire edin ve hücre peletini Primosin içeren uygun miktarda sıcak c-KSFM içinde yeniden askıya alın.
    NOT: Primosin, dokuda bulunabilecek herhangi bir bakteri, mantar veya (daha da önemlisi) mikoplazmayı ortadan kaldırmak için en az 7 gün boyunca kullanılır; 7 gün sonra, ortama sadece penisilin / streptomisin ilavesi yeterlidir.
  8. Kaplama çözeltisini 6 delikli plakalardan aspire edin ve kuyucuk başına 2 mL hücre süspansiyonu ekleyin.
  9. Hücrelerin% 80 ila% 90 akıcılığa ulaşana kadar büyümesine izin verin ve ortamı haftada üç kez değiştirin (örneğin, her Pazartesi, Çarşamba ve Cuma). İstenilen akıcılık derecesine genellikle 7 ila 14 gün arasında ulaşılır; İstenilen akıcılığa ulaşmak için gereken süre 14 günü aşarsa, hücreleri atın.
    NOT: İlk birkaç günde, sadece az sayıda hücre çoğalmaya başlar; hücre grupları birkaç gün sonra fark edilir.

2. İnsan primer bronşiyal epitel hücrelerinin (PBEC'ler) kriyoprezervasyonu

NOT: -80 °C ve -196 °C sıcaklıklarda çalışırken, koruma için kriyo-eldivenler kullanılır ve dondurulmuş şişeleri aktarmak için cımbız kullanılır. Sıvı azotla çalışırken, kişisel koruma için kriyo-eldivenler ve bir yüz kalkanı kullanılır.

  1. Ortamı aspire edin ve kuyucukları bir kez kuyucuk başına 2 mL ılık PBS ile yıkayın.
  2. Kuyu başına 0.5 mL yumuşak tripsin ekleyerek hücreleri tripsin yapın (yumuşak tripsin çözeltisinin bileşimi için Ek Tablo 1'e bakınız). Hücreleri 37 ° C'de 5 ila maksimum 10 dakika boyunca inkübe edin. Tripsin çözeltisini plakada döndürün ve plakaya hafifçe dokunarak hücreleri serbest bırakın.
  3. Ayrılmış hücreleri, penisilin / streptomisin ile KSFM'de çözünmüş 1.1 mg / mL soya fasulyesi tripsin inhibitörü (SBTI; tripsin aktivitesini inhibe etmek için) içeren 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. SBTI'nin hacmi, toplam yumuşak tripsin hacminin iki katı olmalıdır (yani, kuyucuk başına 1 mL).
    NOT: SBTI'yi doğrudan kuyucuklara eklemeyin, çünkü hücreler dakikalar içinde yeniden bağlanacaktır.
  4. RT'de 230 x g'de tüpü 7 dakika boyunca santrifüjleyin.
  5. Süpernatantı atın ve peletlenmiş hücreleri penisilin / streptomisin içeren ancak başka hiçbir katkı maddesi içermeyen 10 mL RT KSFM'de yeniden askıya alın. Bir hemositometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak hücreleri sayın. 1: 1 oranında tripan mavisi ekleyerek canlı/ölü hücre sayımı gerçekleştirin veya alternatif bir canlı/ölü hücre sayma prosedürü kullanın.
  6. Kriyoproteksiyon hücrelerini mL dondurma ortamı başına 400.000 hücre konsantrasyonunda koruyun (bileşim için Ek Tablo 1'e bakın) ve kriyoviyal başına bu süspansiyonun 1 mL'sini ekleyin. Kriyovyalleri bir soğutma hücresi kabına aktarın ve -80 ° C'ye yerleştirin. 24 saat sonra, şişeleri uzun süreli depolama için -196 ° C sıvı azota aktarın.
    NOT: Hücreleri dondurma ortamına aktarmak için iki seçenek mümkündür, her ikisi de iyi çalışır: 1) Hücreleri santrifüjleme yoluyla tekrar pelet haline getirin ve gerekli hücre konsantrasyonunda soğuk dondurma ortamında tekrar askıya alın; veya 2) soğuk dondurma ortamı ekleyin ve hücrelerin bulunduğu KSFM hacmine bağlı olarak kriyopreservin (dimetil sülfoksit [DMSO]) konsantrasyonunu ayarlayın.

3. Kriyo-korunmuş PBEC'lerin çözülmesi ve kesici uçlarda kültür için büyütülmesi

  1. Bir T75 hücre kültürü şişesini, kapakları sıkıca kapatılmış olarak PBS'de 10 mL kaplama çözeltisi ile gece boyunca kaplayın. Şişeyi bir hücre kültürü inkübatöründe 37 ° C'de ve% 5 CO2'de inkübe edin.
  2. Kriyokorunmuş PBEC'leri çözmeden önce, kaplama çözeltisini şişeden çıkarın ve 10 mL c-KSFM ile doldurun. Bir hücre kültürü inkübatöründe 37 ° C'ye kadar ısınmasına izin verin, inkübatörün havalanmasını sağlamak için hafifçe açılmış kapakları vardır.
  3. Hücreleri 37 ° C'lik bir su veya boncuk banyosunda hızla çözün.
    NOT: Daha düşük kontaminasyon riski ve daha düşük enerji tüketimi nedeniyle boncuk banyosu su banyosu yerine tercih edilir.
  4. Kriyoviyalin tüm içeriğini önceden ısıtılmış T75 şişesine orta (adım 3.2) ile ekleyin ve hücreleri eşit olarak dağıtın.
    NOT: Bu aşamada hücreleri santrifüj yapmayın, çünkü santrifüjleme adımında hayatta kalamazlar.
  5. Yaklaşık 4 saat sonra, hücrelerin yeterince bağlandığından emin olun. Ortamı 10 mL taze, ılık c-KSFM ile değiştirin.
    NOT: Bu şekilde, dondurucu ortamdaki DMSO çıkarılır. Bu adım, şişedeki hücrelerin tohumlanmasından sonra 4 saat ile 24 saat arasında gerçekleşmelidir.
  6. Hücreleri% 80 ila% 90 akıcılığa ulaşana kadar büyütün, ortamı her pazartesi, çarşamba ve cuma günleri değiştirin.

4. Primer bronşiyal epitel hücreleri (ALI-PBEC) ile hava-sıvı arayüz kültürünün oluşturulması

NOT: Aşağıdaki prosedür, 11,9 mm iç çaplı kesici uçlardaki PBEC'lerin kültürü içindir.

  1. Uygun sayıda hücre kültürü kesici ucunu, kesici uç başına 0,4 mL kaplama çözeltisi ile kaplayın. Bir hücre kültürü inkübatöründe 37 ° C'de gece boyunca inkübe edin.
  2. Ek Tablo 1'de açıklandığı gibi komple BD ortamını (cBD ortamı) hazırlayın.
    NOT: cBD besiyeri, bronşiyal epitel hücrelerinin büyümesini daha uzun süre desteklemek için formüle edilmiş kompozit bir ortamdır (Ek Tablo 1'e bakınız), aynı zamanda adım 4.10'da belirtildiği gibi, ALI'deki retinoik asit (RA) konsantrasyonunda ve kültüründe bir artışı takiben farklılaşmalarına izin verir.
  3. Şişe başına 2 mL yumuşak tripsin kullanarak T75 şişesindeki PBEC'leri deneyin. Hücrelerin ayrılmasına izin vermek için hücreleri 5 ila 10 dakika boyunca inkübe edin (görsel incelemeye dayanarak). 5 dakikalık inkübasyondan sonra, tripsini şişede döndürerek ve şişeye hafifçe dokunarak hücrelerin ayrılmasını kolaylaştırın (gerekirse tekrarlayın).
  4. Şişeye 4 mL SBTI ekleyin ve hücre süspansiyonunu doğrudan 25 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.
    NOT: Hücreler dakikalar içinde yeniden eklenir. Bu nedenle, birden fazla şişe ile çalışırken, adım 4.4'te elde edilen hücre süspansiyonu, SBTI'yi ikinci bir şişeye eklemeden önce doğrudan bir santrifüj tüpüne aktarılmalıdır. Prosedürde, aynı anda en fazla beş şişe işlenir.
  5. Tüpleri RT'de 230 x g'de 7 dakika boyunca santrifüjleyin.
  6. Hücreleri 6 mL cBD ortamında yeniden askıya alın ve bir hemositometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak hücreleri sayın. Örneğin, 1:1 oranında tripan mavisi ekleyerek veya başka bir canlı/ölü hücre sayma prosedürü kullanarak canlı/ölü hücre sayımı gerçekleştirin.
  7. Kaplama çözeltisini hücre kültürü eklerinden çıkarın.
  8. Adım 4.6'da üretilen hücre süspansiyonunu, 1 nM EC 23 ile takviye edilmiş cBD ortamı ile mL başına 80.000 hücre konsantrasyonuna kadar seyreltin ve kesici uçtaki membranın üstüne 0,5 mL ekleyin. Kesici ucun altındaki kuyucuğa 1 nM EC 23 ile desteklenmiş 1,5 mL cBD ortamı ekleyin.
  9. Kültürler havaya maruz kalmaya hazır olana kadar (yani,% 100 akıcılığa ulaşıldıktan 2 gün sonra) haftada üç kez 1 nM EC 23 ile desteklenmiş cBD ortamı ile ortamı değiştirin. Her seferinde, kesici ucun içine (hücreler üzerinde) 0,5 mL ortam eklenir ve alt bölmeye (kuyu) 1,5 mL eklenir.
    NOT: Genel olarak, hücre katmanı, PBEC'lerin ekler üzerine tohumlanmasından yaklaşık 5 gün sonra% 100 akıcılığa ulaşır. Hücrelerin akıcılığının görsel incelemesine dayanarak, hücrelerin 2 gün sonra ALI aşamasına aktarılmasına karar verilir.
  10. Hücreler ALI'ye transfer için hazır olduğunda (yani,% 100 akıcılığa ulaştıktan 2 gün sonra), ortamı eklerden ve kuyudan çıkarın, kesici ucun içine yeni ortam eklemeyin ve yalnızca kuyuya yeni ortam (50 nM EC 23 ile desteklenmiş 1 mL cBD ortamı) ekleyin. Kuyulardaki ortamı haftada üç kez değiştirin.
  11. Fazla mukus ve hücresel kalıntıları gidermek için, kesici ucun içindeki hücre tabakasının apikal tarafına yavaşça 200 μL ılık PBS ekleyin (tercihen kesici ucun yan tarafından ve doğrudan hücrelere pipetleme yaparak değil) ve 37 ° C'de bir hücre kültürü inkübatöründe 10 dakika boyunca inkübe edin. Ardından, aşırı mukus ve hücresel kalıntıları gidermek için PBS'yi aspire edin.
    NOT: Bu noktadan itibaren (ALI kültürünün başlangıcı), alt bölmenin ortamını değiştirmeden önce, hücrelerin apikal tarafını her seferinde PBS ile yıkayın.
  12. Tüm ana hücre tiplerinin temsil edildiğinden emin olmak için ALI'deki hücreleri en az 2 hafta boyunca kültürleyin.

5. Karışık bir donör popülasyonundan bir ALI-PBEC kültürü oluşturmak

  1. PBEC kültürlerini karışık bir popülasyondan başlatmak için beş adede kadar bireysel donörden alınan hücreleri kullanın.
  2. Uç başına toplam 150.000 hücreye ulaşmak için adım 4.7'de üretilen hücreleri kullanarak donör başına eşit sayıda hücreyi karıştırın (yani, beş donör kullanırken donör başına 30.000 hücre). Bu, ekteki proliferasyonun minimumda tutulmasını ve kültürde bireysel donörlerden eşit sayıda hücrenin bulunmasını sağlayacaktır.
  3. ALI-PBEC kültürüne adım 4.9-4.12'de açıklandığı şekilde devam edin.

6. ALI-PBEC kültürünün kalite kontrolü

  1. Hücre kültürü sırasında trans epitelyal elektrik direncinin (TEER) izlenmesi
    NOT: Bir voltohmmetre kullanımına dayanan elektriksel direnç ölçümü, ALI-PBEC kültürü sırasında herhangi bir zamanda gerçekleştirilebilir ve elektriksel direnç ölçümü elektrot konumu, sıcaklık, ortam ve kullanım dahil olmak üzere çeşitli değişkenlerden etkilendiğinden, her seferinde aynı koşullar altında aynı protokole göre gerçekleştirilir. TEER, Ohm yasasına dayanan aşağıdaki formülü uygulayarak ölçülen elektrik direnci kullanılarak hesaplanabilir:burada Rm, ölçülen elektrik direncidir, Rb, figure-protocol-1kaplama ve hücreler içermeyen bir kesici ucun temel elektrik direncidir ve SA, kesici uç17'nin zarının yüzey alanıdır.
    1. Hücrelerdeki mukus ve kalıntıları gidermek için hücre tabakasının apikal tarafına yavaşça 200 μL ılık PBS ekleyin. Kesici ucu 37 °C'de bir hücre kültürü inkübatöründe 10 dakika boyunca inkübe edin ve PBS'yi tekrar çıkarın.
    2. Hücre tabakasının apikal tarafına yavaşça 700 μL sıcak PBS ekleyin ve ölçümler için sıcaklığın dengelenmesini sağlamak için kesici ucu RT'de 10 dakika boyunca inkübe edin.
    3. 1.000 Ω test direncini kullanarak voltohmetreyi kalibre edin, voltohmetreyi Ohm'ları ölçecek şekilde ayarlayın ve "R ADJ" kalibrasyon vidasını 1.000 Ω'ye ayarlanana kadar ayarlamak için bir tornavida kullanın.
    4. Elektrodu steril suda (RT) ve ardından steril PBS'de (RT) birkaç kez yukarı ve aşağı hareket ettirerek durulayın.
    5. Eklerdeki hücre tabakasının elektriksel direncini ölçün. Bu amaçla, elektrotun uzun kolu plakanın dibine temas edecek şekilde elektrodu kuyuya dikey bir konuma yerleştirin. Bu şekilde, kısa kol kesici ucun içindeki hücre tabakasının üzerindedir. Voltohmmetrede görüntülenen değeri okuyun.
      NOT: Görüntülenen değer tam olarak stabilize olmaz; Değer aralıklı olduğu anda değeri okuyun.
    6. Ölçümler arasında, elektrodu steril PBS'de (RT) birkaç kez yukarı ve aşağı hareket ettirerek temizleyin.
    7. Ölçümler bittiğinde elektrodu steril su (RT), steril PBS (RT) ve% 70 etanol (RT) içinde birkaç kez yukarı ve aşağı hareket ettirerek temizleyin. Elektrodu kuru saklayın.
    8. Kesici ucun içine 700 μL sıcak PBS ve kuyuya 1 mL sıcak PBS ekleyerek ve diğer kesici uçların yanında elektrik direncini ölçerek bir kesici uç (kaplamasız) ve hücrelerin taban çizgisi ölçümünü gerçekleştirin.
  2. ALI-PBEC kültürünün hücresel bileşiminin değerlendirilmesi
    1. ALI aşamasında, dayak kirpiklerini görsel olarak değerlendirerek farklılaşmayı kontrol edin. Bunlar, hücrelerin apikal tarafında havaya maruz kaldıktan 9 gün sonra standart parlak alan mikroskobu ile gözlemlenebilir.
      NOT: Dövülen kirpikler en iyi apikal yüzeyi yıkadıktan hemen sonra görülebilir. Kadeh hücreleri mukus üretir ve bu nedenle apikal yüzeyin yıkanması sırasında gözlenen mukus varlığı, kadeh hücrelerinin oluştuğunun bir işaretidir. Bununla birlikte, kadeh hücrelerinin seviyesi ve üretilen mukus miktarı oldukça donöre bağımlıdır. Mukus varlığı, hücre tabakasının apikal yüzeyini kesici uçta yıkadıktan sonra PBS'yi aspire ederken görülebilir; Bu durumda, aspire edilen PBS daha viskozdur ve aspire ederken mukus iplikleri gözlenebilir.
    2. İmmün boyamalar ve floresan mikroskobu veya floresan ile aktive hücre sıralama (FACS) kullanılarak hücresel bileşimin değerlendirilmesi veya gerçek zamanlı-kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR) ile gen ekspresyon analizi, kültürün farklılaşma durumu hakkında önemli bilgiler sağlar, ancak tanımı bu katkının kapsamı dışındadır.

figure-protocol-2
Şekil 1: Primer bronşiyal epitel hücrelerinin izolasyonu, genişlemesi ve kültür prosedürüne şematik genel bakış . (A) Kanser rezeksiyon cerrahisi sırasında akciğer dokusu elde edilir ve patolog makroskopik olarak normal ve tümörsüz olan bronşiyal halka dokusunu uyarır. (B) Bronşiyal halka temizlenir ve hücre tabakasını ayırmak ve ayrıştırmak için enzimatik tedaviye maruz bırakılır. (C) Alınan hücre süspansiyonu yıkanır ve hücreler genişleme için 6 delikli bir plakanın kuyucuklarına dağıtılır. (D) c-KSFM'de izole edilmiş hücrelerin Primosin ile yeterli genişlemesi üzerine, hücre katmanları tripsinizasyon ile ayrıştırılır ve hücreler kriyoprezervasyon için dondurucu ortamda yeniden askıya alınır. Gerektiğinde, kriyokorunmuş hücreler çözülür ve hücre kültürü şişelerinde penisilin / streptomisin ile c-KSFM kullanılarak tekrar genişletilir. Genişlemeden sonra, hücre kültürü ekleri üzerinde cBD ortamında tohumlanırlar; (Ea) ALI-PBEC kültürü iki ana aşamada gerçekleşir: cBD ortamındaki batık aşama, hücreler tam birleşmeye ulaşana kadar 1 nM EC 23 ile desteklenir, ardından farklılaşmaya izin vermek için ALI'de apikal ortamın ve kültürün çıkarılması; Bu ALI fazında, hücreler 50 nM EC 23 ile desteklenmiş cBD ortamında kültürlenir. (EB) Batık kültür sırasında kesici ucu kaplayan bazal hücrelerin grafiksel gösterimi. (EC) EC 23'ün artmış konsantrasyonlarının varlığında ALI'de kültürü takiben elde edilen farklılaşmış epitel hücre tabakasının grafiksel gösterimi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Batık kültürü kullanarak genişletme
Burada sunulan yöntemi kullanarak, sıvı azotta uzun süreli depolama için bir 6 delikli plakadan 400.000 hücre/kriyoviyal içeren ortalama sekiz kriyoyal elde edilebilir (Şekil 2A). Bunu başarmak için, izole PBEC'ler, mikrobiyal (özellikle mikoplazma) kontaminasyonu dışlamak için Primosin varlığında en az 7 gün ve en fazla 14 gün boyunca 6 kuyucuklu plakalarda kültürlenir (Şekil 2B). Şekil 2A, B, çeşitli donörlerden farklı izolasyonlar arasında elde edilen hücre sayıları ve gerekli kültür süresi hakkında fikir vermektedir. Hücreleri sıvı azotta depolanmak üzere tripsinizasyon yoluyla toplamadan önce, akıcılık% 80'in üzerinde olmalıdır. Bu 14 gün içinde sağlanamazsa, hücreler kriyoprezerve edilmemelidir. Önemli olarak, depolama ve geçiş için hasat yaparken, hücre tabakasının akıcılığı ~% 95'i geçmemelidir (Şekil 2C). Sıvı azotta depolandıktan sonra, hücreler ALI kültürleri için yeterli hücre sayısı elde edilene kadar genişleme için çözülebilir ve kültürlenebilir. Bu aşamada hücrelerin genişlemesi için kullanılan ortam, bronşiyal halka18'den hasadı takip eden ilk kültürde olduğu gibi c-KSFM'dir. Bununla birlikte, bu aşamada Primosin'e gerek yoktur, çünkü akciğer dokusundan kaynaklanan ek mikrobiyal kontaminasyon riski yoktur ve bu nedenle Primosin, penisilin / streptomisin için değiştirilebilir. Bu ortam, epitel hücrelerini fibroblastlara göre tercih eder ve bu nedenle fibroblastları daha hızlı çoğaltarak kültürün olası aşırı büyümesini önler 19,20,21. c-KSFM ortamı kullanılarak, hücreler şişeye yayılır ve birbirlerine bağlanmaz, bu da bu aşamada cBD ortamına batırılmış kültürlenmiş hücrelerin morfolojisinden belirgin şekilde farklıdır (Şekil 2D, E). Çözülmüş hücrelerin bir T75 şişesinde kültürlenmesinden 5 veya 6 gün sonra, hücre tabakası% 80 -% 95 oranında birleşik olmalıdır, bu da toplamda yaklaşık 3 x 106 hücreye karşılık gelir (Şekil 2F). Bundan, ALI kültürü için yaklaşık 75 kesici uç (12 delikli plaka boyutu) üretilebilir.

Bu katkıda açıklanan izolasyon ve kültür yöntemi, başlangıç materyali olarak bronşiyal biyopsiler veya bronşiyal fırçalarla kullanılmak üzere de uyarlanabilir.

figure-results-1
Şekil 2: Kriyoprezervasyon öncesi ve sonrası bazal hücre genişlemesi. Hücreler tarif edilen protokole göre izole edildi ve c-KSFM kullanılarak kültürlendi. Donör başına üretilen hücre sayısı izlendi, canlı hücre sayımları otomatik bir hücre sayacı kullanılarak gerçekleştirildi (A) 6 kuyucuklu plakalardan geçiş 0 (P0) hücrelerini toplarken (protokolün 2. adımı), n = 123 donör, hücre sayısı kuyu başına toplanan hücre sayısı olarak sunuldu; Her nokta bir donörü temsil eder ve medyan yatay bir çubukla gösterilir. (B


figure-results-2

figure-results-3

figure-results-4

figure-results-5

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada sunulan protokol, insan bronşiyal epitel hücrelerinin rezeke edilmiş akciğer dokusundan izolasyonunu, farklılaşma potansiyeli kaybı olmadan hücrelerin optimal genişlemesi için bir yöntem, bir kriyoprezervasyon prosedürü ve iyi diferansiye ALI-PBEC kültürleri üretmek için bir prosedürü açıklamaktadır. Ayrıca, kalite kontrolün bir tanımının yanı sıra farklılaştırılmış ALI-PBEC'lerin izlenmesi ve değerlendirilmesi için talimatlar da verilmektedir.

Tarif edilen protokol, akciğer kanseri tanısı ile ilgili ameliyat geçiren hastalardan akciğer lobundan rezeke edilen makroskopik olarak normal, tümörsüz bir bronşiyal halka ile başlar. Bu nedenle, bu halkaların kesinlikle sağlıklı doku olarak kabul edilemeyeceğine ve bu nedenle hücre kültürü özelliklerini etkileyebileceğine dikkat edilmelidir. Bronşiyal epitel hücrelerini elde etmek için alternatif kaynaklar, bronşiyal biyopsilerin, bronşiyal fırçalamaların veya bir nakil donöründen veya alıcı akciğerlerden doku kullanılmasını içerir. Kaynağı ne olursa olsun, akciğer dokusu kullanılırken, mikrobiyal kontaminasyon riski göz önünde bulundurulmalıdır ve bu nedenle hücre kültürünün mikrobiyal kontaminasyon riskini azaltmak için farklı kültür ortamlarında antibiyotikler kullanılır. Özellikle, mikoplazma, hücre kültürü üzerindeki çok çeşitli etkileri, hücre kültüründe yaygın olarak kullanılan antibiyotiklere direnci ve mikoplazma kontaminasyonunun sadece mikoplazma tespit testleri ile doğrulanabilmesi nedeniyle hücre kültüründe yüksek ve yaygın bir risktir. Bu nedenle, hücrelerin akciğer dokusundan izole edilmesini takiben hücre kültürünün ilk aşamasında, geniş spektrumlu antimikrobiyal formülasyon Primosin kullanılır ve kültür işlemi sırasında, rastgele seçilen örnekler mikoplazmanın varlığı için test edilir.

Bir bronşiyal halka ile başlayan izolasyon prosedürü, farklılaşma kapasitesinden ödün vermeden ALI'de kültürleri başlatmak için gereken bu birincil hücrelerin genişleme derecesine izin vermek için yeterli başlangıç materyali sağlar. Bununla birlikte, izole edilmiş epitel hücrelerinin sınırlı sayıda hücre ile genişlemesine başlanması, ALI kültürü için tohumlanabilecek yeterli sayıda hücreye sahip yeterli sayıda ekin elde edilmesinde sorunlara neden olabilir. Genişletilmiş kültür ve primer hücrelerin tekrar tekrar geçmesi, replikatif yaşlanmaya neden olabilir. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için çeşitli çözümler önerilmiştir. Horani ve ark., Rho kinaz inhibitörü (ROCK) Y-27632'nin bazal hücrelerin proliferasyonunu arttırdığını göstermiştir 30, Mou ve ark. farklılaşmış epitel hücre tabakası31'in özelliklerini korurken bazal kök hücreleri genişletmek için ikili Smad inhibisyonu kullanmışlardır ve Sachs ve ark. hava yolu epitel hücrelerini genişletmek ve çoklu pasajlar boyunca farklılaşma potansiyellerini korumak için kullanılabilecek bir hava yolu organoid sistemi geliştirmişlerdir 32. İkinci yöntem ayrıca, burada tarif edildiği gibi ALI kültürüne aktarılmadan önce, preterm bebeklerden (<28 haftalık gebelik yaşı) trakeal aspiratlar (TA'lar) ve bronkoalveoler lavaj (BAL) sıvısı gibi çok düşük hücre sayısına sahip kaynaklardan hücreleri genişletmek için de kullanılmıştır33. BAL ve TA'lardan izole edilen hücrelerin, bronşiyal dokudan üretilen hücrelere benzer bir farklılaşma kapasitesi gösterdiği bulunmuştur, ancak farklılaşma, Çentik sinyal inhibisyonu veya Th2 sitokin IL-1333 kullanılarak daha siliyer veya daha fazla kadeh hücresi içeren kültürlere doğru çarpıtıldığında farklılıklar gözlenmiştir. Bu nedenle, ALI-PBEC'ler benzer yaklaşımlar kullanılarak düşük epitel hücre sayısına sahip bir başlangıç materyalinden kültürlenirse, protokolün 6. bölümünde tartışıldığı gibi, kültürleri her zaman temel kalite kriterleri açısından kontrol etmeleri önerilir. Önemli olarak, besleyici hücrelerin kullanımı, zamanın ve hücre numarasının gerekli olduğu nakledilebilir iskele mühendisliği için gerekli olan daha büyük hücre sayılarının elde edilmesine de yardımcı olabilir. Bu, otolog epitel hücrelerinin trakea hastalığı olan bir hastadan türetilen biyopsilerden kültürlendiği ve hücrelerin bir murin embriyonik besleyici tabakası (mitotik olarak inaktive edilmiş 3T3-J2 fibroblastları) ve yukarıda belirtilen Rho / ROCK yolunun inhibitörü (Y-27632) varlığında hızla genişlediği bir çalışma ile gösterilmiştir (Y-27632)34. Elde edilen hücre kültürünün, trakea iskelelerinin yeniden popülasyonu için yararlı olduğu bulundu ve bu nedenle bu, bir nakil modeli için uygun bir protokol olarak görülebilir.

Bu katkıda açıklanan protokolü kullanırken, aynı zamanda diğer kültür protokollerini kullanırken, kaçınılmaz olarak bir seçim yanlılığı ortaya çıkar. Kültürleri başlatmak için kullanılan hücrelerin kökeni, orta bileşim ve diğer protokol detayları gibi protokol detaylarındaki farklılıkların, kültürlerin hücresel bileşiminde değişikliklere ve dolayısıyla ALI kültürünün yanıtında değişikliklere yol açabileceğini anlamak önemlidir33,35. Ek olarak, hava yolu hücrelerini ayırt etmek için farklı ortamları karşılaştırırken hücre özelliklerinde farklılıklar da gözlenmiştir10,11. PneumaCult ve cBD besiyeri karşılaştırıldığında, kadeh hücresi ve kulüp hücresi mRNA belirteçleri, TEER değerleri ve hücre tabakası kalınlığında farklılıklar gözlendi. Bu gözlemlere dayanarak, istatistiksel dayanak eksikliğine rağmen, kullanılan donör sayısının düşük olması, ortam bileşiminin müşteriler tarafından bilinmemesi ve PneumaCult ortamının daha yüksek maliyetleri nedeniyle, laboratuvarımızda cBD ortamını kullanma kararı alınmıştır.

Tartışıldığı gibi, hücreler başlangıçta organoid kültür kullanılarak genişletilebilir ve daha sonra 2D ALI insert sistemine aktarılabilir. Bu önemlidir, çünkü hava yolu epitel organoidleri havadaki maddelere maruz kalmak için uygun değildir, oysa ALI 2D sisteminin kullanımı, sigara dumanı23,36 gibi havadaki maddelerin kültürlenmiş hava yolu epitel hücreleri üzerindeki etkisinin değerlendirilmesine izin verir. ALI hava yolu epitel hücre kültürlerini oluşturmak için farklı bir yaklaşım, insan pluripotent kök hücrelerinin (hiPSC'ler) farklılaşmasıyla hava yolu epitel hücreleri üretmektir37. Bu tür protokollerde, proksimal hava yolu progenitörlerine farklılaşmadan sonra farklılaşma protokolünün son aşamasında, hücreler burada tarif edilenlere benzer prosedürler kullanılarak kültürle ALI'ye ayırt edilebilir.

Mevcut protokolde, cBD ortamı ALI'de kültür için kullanılmaktadır. cBD ortamı, Fulcher ve ark.38'den ve diğer çalışmalardan esinlenen farklı takviyelerin bir karışımı eklenerek hazırlanan serumsuz bir ortamdır. Ek çözelti 52 μg / mL sığır hipofiz ekstresi (BPE), 0.5 μg / mL hidrokortizon, 0.5 ng / mL insan EGF, 0.5 μg / mL epinefrin, 10 μg / mL transferrin, 5 μg / mL insülin, 6.5 ng / mL triiyodotironin ve 0.1 ng / mL RA39 içerir. BPE bir doku ekstresi olduğundan ve partiye göre varyasyona maruz kaldığından, ortam tam olarak tanımlanmış bir ortam olarak kabul edilemez ve hayvansız değildir. Tamamen tanımlanmış hücre kültürü ortamı, toplu işlemden partiye farklılıkları en aza indirmek için tercih edilir. Hayvansız araştırmaya geçiş göz önüne alındığında, hayvansal ürünler içermeyen ve bilimsel topluluk için uygun fiyatlı tanımlanmış medya üretmek için çaba gösterilmesi önemlidir.

Araştırma sorusuna bağlı olarak ALI modeline dayalı olarak çeşitli deney düzenekleri kullanılabilir. Örneğin, farklılaşma sürecini etkileyebilecek bileşiklerin etkisini araştırmak için, bu, batık kültürün farklı aşamalarında, farklılaşma sırasında veya iyi farklılaşmış aşamada bileşikleri kültüre ekleyerek ele alınabilir. ALI-PBEC kültürünün hücresel bileşimi, spesifik bileşiklerin eklenmesiyle etkilenebilir; Örneğin, IL-13 varlığında ALI-PBEC'leri ayırt etmek, daha fazla kadeh hücresi ve daha az siliye hücreli bir kültür üretirken, farklılaşma sırasında γ-sekretaz inhibitörü DAPT (Çentik sinyalini bloke etmek için kullanılır) ile tedavi, kadeh hücreleri pahasına daha siliyer hücrelere sahip bir kültürle sonuçlanır 23,40,41,42.

Ayrıca, hücreleri uyarmak veya belirli süreçleri bloke etmek için kullanılan ajanlar ya bazal bölmeye ya da (çok küçük bir hacimde) kültürün apikal bölmesine uygulanabilir. Hücreler ayrıca apikal taraftan havadaki maddelere de maruz kalabilir. Bu tür maruz kalma tasarımları, dizel egzozunun veya tam sigara dumanının PBEC'ler üzerindeki etkisini incelemek için kullanılmıştır 23,43,44. Ortam, bazal tarafta salgılanan proteinleri izlemek için ortam her değiştirildiğinde hasat edilebilir; aynısı, bazal ortamı yenilerken PBS ile yıkanan hücrelerin apikal tarafı için de geçerlidir. Apikal yıkama adı verilen yıkama hasat edilir ve kadeh hücreleri tarafından üretilen mukusun daha verimli bir şekilde ayrışması için isteğe bağlı ditiyoeritritol (DTE) eklenir. Hücre lizatları, toplam protein, RNA ve kromozomal ve mitokondriyal DNA'nın izolasyonu için elde edilebilir. Hücreler, polietilen tereftalat (PET) membranını plastik uçtan keserek ve bu zarı çoklu immünofloresan boyamaları için daha küçük parçalara ayırarak spesifik belirteçler için antikorlar kullanılarak daha fazla çalışılabilir45. Ayrıca, akış sitometrisi veya FACS, eklerdeki hücrelerin tripsinizasyonunu takiben de kullanılabilir. ALI aşamasında, hücresel bariyerin gelişimi, elektrik direncini ölçerek ve daha sonra elektrik direncinin membran ekinin yüzey alanıyla ters orantılı olduğu TEER'i hesaplayarak izlenebilir. Hesaplama, aşağıdaki formülü kullanarak Ohm yasasına dayanır: buradaRm, ölçülen elektrik direncidir, Rb, figure-discussion-1kaplama ve hücreler içermeyen bir kesici ucun temel elektrik direncidir ve SA, kesici ucun zarının yüzey alanıdır. EVOM2 ve STX / çubuk elektrotları kullanarak elektrik direncini ölçmek basittir, ancak kuyuya sokulduğunda taşıma prosedürlerine büyük ölçüde bağlıdır. Ayrıca, elektrotun şeklinin, nispeten geniş yüzey alanının bariyer fonksiyonunun ölçümünü etkilediği öne sürülmüştür17.

Doğru doku temsilini arttırmayı amaçlayan ALI hücre kültürü sistemindeki daha fazla gelişme, lökositler, fibroblastlar veya endotel hücreleri gibi ek hücre tiplerinin kokültürünü içerir46,47,48. ALI-PBEC'in granülosit-makrofaj koloni stimüle edici faktör (GM-CSF) veya M-CSF farklılaşmış makrofajlarla birlikte kültürlenmesinin doğuştan gelen epitel yanıtlarını ve onarımını belirgin şekilde etkilediği gözlenmiştir48. Bu tür kokültür modellerinde, orta uyumluluğun bir sorun olabileceğine dikkat etmek önemlidir. Hava yolu epitel hücre kültürü için kullanılan ortam özellikle PBEC'ler için geliştirildiğinden ve diğer hücre tipleri için en uygun olmayabilir, optimizasyon gereklidir. İzole PBEC'lerin kullanılabileceği hava yolu biyolojisi alanında görülen bir diğer ilerleme türü, Çip Üzerinde Organlar (OoC) teknolojisinin kullanılmasıdır49,50. Bu teknolojiyi kullanarak, gerilme, hava ve orta akış gibi solunum ve kan akışının mekanik kuvvetlerinin etkisi incelenebilir 29.

Çeşitli donörlerden PBEC'ler kullanılırken donörler arası değişkenlik önemli olabilir ve bu nedenle epitel hücre kültürü çalışmalarında bu değişkenliği hesaba katmak için birkaç donörden alınan hücreleri kullanmayı düşünmek önemlidir. ALI-PBEC'lerin kültürü zaman alıcı olduğundan ve önemli maliyetlerle ilişkili olduğundan, farklı donörlerden gelen hücreleri tek bir hücre kültürü ekinde karıştırarak ALI-PBEC kültürleri oluşturma seçeneği incelenmiştir. Bu şekilde, pilot deneyler, çeşitli bireysel donörlerden türetilen kültürlerin tepkilerini analiz etmeden önce birincil hücreler kullanılarak kolayca gerçekleştirilebilir. Ek olarak, farklı özelliklere sahip donörler (örneğin, farklı yaş kategorisi veya cinsiyet) keşif çalışmaları için gruplandırılabilir. Donör karışımlarını kullanırken, bir donörün daha yüksek bir proliferasyon oranının bir sonucu olarak sonuçlara hakim olma olasılığını önlemek için farklı donörlerin eşit hücre sayılarının mevcut olduğundan emin olmak önemlidir. Bu nedenle, bireysel donörlerden gelen hücreler ayrı ayrı genişletilir ve ALI'ye geçişten önce ekteki çoğalmayı en aza indirmek için tek bir donörden gelen tohumlama hücrelerine kıyasla ekte daha yüksek bir yoğunlukta tohumlanır. Donör karışımlarının ve ilgili bireysel donörlerin yanıtları, SARS-CoV-2'nin enfeksiyon kinetiği incelenerek karşılaştırıldı. RT-qPCR ve immünofloresan boyama kullanılarak, donör karışımının, üretilen benzer sayıda virüs partikülünü ve benzer sayıda enfekte olmuş hücreyi göstererek çeşitli bireysel donörlerin iyi bir temsilini sağladığı gözlenmiştir28.

Hayvan modelleri için kabul edilebilir bir alternatif olmak için, kültürlenmiş bronşiyal epitel hücrelerinin gen düzenlemesi uygulanabilir olmalıdır51. ALI-PBEC'lerde küçük enterferan RNA'lar (siRNA'lar) kullanılarak RNA girişim teknolojisi incelenmiştir, ancak kültürün batık fazı sırasında hücrelerin siRNA ile transfekte edilmesi gerektiğinden, kültür sırasında siRNA transfeksiyonu sıklıkla tekrarlanmadığı sürece, uzun kültür süresi nedeniyle ALI kültürü sırasında nakavt yeterince sürdürülmemektedir52. Bununla birlikte, siRNA'lar batık bazal hücrelerde gen ekspresyonunu değiştirmek için başarıyla kullanılabilir. Diğerleri, ribonükleoprotein (RNP) dağıtımı 53 ile primer ALI hava yolu epitel hücre kültürlerinde gen düzenlemeyi başarmak için CRISPR / Cas9 teknolojisini başarıyla kullanmışlardır. Bu tür teknikleri kullanırken, hücrelerin tam farklılaşma kapasitelerini korumaları esastır. Primer hava yolu hücre kültürleri süresiz olarak geçilemediğinden, gen düzenlenmiş hücrelerin klonal genişlemesi kolay değildir ve transfekte hücreleri seçmek için ortamın eklenmesi zahmetlidir. Bu nedenle, tüm kültürlü hücrelerde istenen yıkımı elde etmek zordur. Nakavt klonları üretmenin bir alternatifi, hiPSC54'te nakavt stratejilerinin kullanılması ve bu hücrelerin hava yolu epitel hücreleri üretmek için kullanılmasıdır. Bir diğeri, optimal olmasa da, gen düzenlenmiş hücreleri klonal olarak genişletmek için ölümsüzleştirilmiş bir PBEC hattı oluşturmaktır55.

Burada sunulan protokol, iyi farklılaştırılmış bir psödostratifiye ALI-PBEC üretmenin bir yoludur, ancak diğer protokollerin de sunulan protokole kıyasla daha küçük ve daha büyük farklılıklarla böyle bir kültür oluşturduğu bulunmuştur. Bize göre, ALI-PBEC sisteminin ve hava yolu epitel hücrelerinin benzer kültür sistemlerinin hayvan deneyleri için geçerli bir alternatif haline gelmesi için kültür yöntemlerinin laboratuvar genelinde doğrulanması ve sıkı kalite kontrolü şarttır.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, ilgili çıkar çatışmalarının olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu katkıda açıklanan modeli kullanan çalışmalar, Hollanda Akciğer Vakfı, Hollanda Sağlık Araştırma ve Geliştirme Örgütü (ZonMw, COVID-19 MKMD hibesi), Hollanda Hayvan Testlerinin Değiştirilmesi Derneği (Stichting Proefdiervrij, hibe #114025007) ve Boehringer Ingelheim ve Galapagos gibi şirketlerden araştırma hibeleri de dahil olmak üzere çeşitli finansman kuruluşları tarafından desteklenmiştir. Şekil 1 BioRender.com ile oluşturulmuştur.

Malzemeler

2

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1.000 ohm test direnciWorld Precision InstrumentsN/AEVOM2 Epitelyal Voltohmmetreyi kalibre etmek için kullanılır
4 - [2- (5,6,7,8-Tetrahidro-5,5,8,8-tetrametil-2-naftalinil) -benzoik asit (EC 23)Tocris4011cBD ortamında kullanılır
6 kuyulu Şeffaf TC ile muamele edilmiş Çok Kuyulu PlakalarCorning3506Bronşlardan izole edilen hücreleri büyütmek için ilk adımda kullanılır yüzük 
Havayolu Epitel Hücre Büyüme Ortamı KitiPromoCellC-21160cBD ortamı ile karşılaştırmak için kullanılır
Boncuk Banyosu 20 LitreLab Armor74220-720Hücre kültürü çözeltilerini önceden ısıtmak için kullanılır
BEGM Bronşiyal Epitel Hücre Büyüme Ortamı BulletKitLONZACC-3170cBD ortamı ile karşılaştırmak için kullanılır
Sığır albümin fraksiyonu V (BSA)Thermo Fisher Scientific15260037Kaplama çözeltisinde kullanılır
Sığır hipofiz özü (BPE)Thermo Fisher Scientific37000-015c-KSFM
Bronşiyal epitel hücre büyüme takviyesinde (BEpiCGS). ScienCell Research Laboratories3262cBD ortamında kullanılır
Bronşiyal epitel hücre ortamında kullanılır bazal (BEpiCM-b)ScienCell Araştırma LaboratuvarlarıSCC3211-bcBD ortamında kullanılır
Hücre kültürü ekleri; 0.4 ve mikro ile 12 mm Transwell; m gözenekli polyester membran ekiCorning3460Protokolde kullanılan hücre kültürü
ekleri Hücre kültürü ekleri; 12 oyuklu ekler, 0.4 & SABEU tarafından üretilen m PET şeffafCellQART9310412Corning hücre kültürü ekleri ile karşılaştırmak için kullanılan hücre
kültürü ekleri Hücre kültürü ekleri; 12 oyuklu ThinCert Doku kültürü EkleriGreiner Bio-One82050-032Corning hücre kültürü ekleri ile karşılaştırmak için kullanılan hücre kültürü ekleri
CELLSTAR şişesi, TC, PS, 250 ml, 75 cm2Greiner Bio-One658170Hücre sayısını genişletmek için kullanılır
CFX Maestro 1.0Bio-RadN/ACFX384 Sistemi ile oluşturulan qPCR verilerini analiz etmek için yazılım programı
CFX384 Dokunmatik Gerçek Zamanlı PCR Tespit SistemiBio-Rad1855484qPCR algılama sistemi
Çubuk elektrot seti DünyaHassas AletlerSTX2PHCbi'de elektrik direncini ölçmek için kullanılır
MCO-170AICUV-PEMikplazma serbest hücre kültürleri için kullanılan hücre kültürü inkübatörü
CO2< / sub>-İnkübatörHereausHeracell 150Muhtemelen mikplazma ile enfekte hücre kültürleri için kullanılan hücre kültürü inkübatörü
Coolcell KonteynerCorning432006-80 °C'de hücreleri kriyoprezervasyon yapmak için kullanılır; Sıvıya aktarmadan önce C N2
Kontes 3 Otomatik hücre sayacıThermo Fisher ScientificAMQAX2000Hücreleri saymak ve hücre konsantrasyonunu belirlemek için kullanılır
CryovialsNalgene479-3224hücreleri kriyoprezerve etmek için kullanılır
Yumuşak tripsin
Dimetil sülfoksit (DMSO)Avantor VWR0231'dekullanılırHücre dondurma ortamında kullanılır
dNTP (10 mM)PromegaU1515cDNA sentezinde kullanılır
Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) + 4500 mg / l D-GlikozKÖK HÜCRE Teknolojileri36250cBD ortamında kullanılır
Dulbecco'nun Modifiye Eagle's Medium (DMEM) l-glutaminLONZALOBE12-604File 4.5 g / l glikozDiğer üreticilerin DMEM ile karşılaştırmak için cBD ortamında kullanılır 
Dulbecco'nun Modifiye Eagle's Medium (DMEM), yüksek glikoz, piruvatThermo Fisher Scientific41966029Diğer üreticilerin DMEM ile karşılaştırmak için cBD ortamında kullanılır 
Epidermal büyüme faktörü (EGF)Thermo Fisher Scientific37000-015c-KSFM'de kullanılır
Etilendiamintetraasetik asit (EDTA)Avantor VWR BDH CHEMICALS443885JYumuşak tripsin
EVOM2 Epitelyal VoltohmmetreDünyasında kullanılır Hassas Aletler91799çözeltisindeki elektrik direncini ölçmek için çubuk elektrot seti ile birlikte kullanılır
, İnsan PromoCellC-43060Kaplama solüsyonunda kullanılan
GlutamaxThermo Fisher Scientific35050038CBD ortamında kullanılır
Hanks dengeli tuz çözeltisi (HBSS)ScienCell Research LaboratoriesSCC0313Proteaz XIV'ü çözmek için kullanılır;
IQ SYBR Green Super mixBio-Rad170887qPCR reaktifi
İzoproterenol hidroklorür, (-) -Sigma-AldrichI-6504c-KSFM
Keratinosit-SFM'de (KSFM)Thermo Fisher Scientific17005-034c-KSFM
Maxwell RSC CihazındaPromegaAS4500Otomatik RNA izolasyon sistemi
Maxwell RSC simplyRNA Doku KitiPromegaAS1340Maxwell RSC Cihazı M-MLV ile toplam RNA'yı izole etmek için kullanılır
Ters transkriptazPromegaM5301cDNA sentezinde kullanılır
M-MLV Ters transkriptaz 5X reaksiyon tamponuPromegaM531AcDNA sentezinde kullanılır
MycoStripInvivoGenrep-mys-10Hücre kültürü örneklerinde mikoplazma varlığını tespit etmek için kullanılır
N-2-hidroksietilpiperazin-N-2-etan sülfonik asit (HEPES)Thermo Fisher Scientific15630056cBD ortamında kullanılır
Oligo (dT) < sub > 15 < / sub >Qiagen79237cDNA sentezinde kullanılır
Penisilin / Streptomisin çözeltisi (Pen / Strep)ScienCell Araştırma LaboratuvarlarıSCC0513c-KSFM ve cBD ortamında antibiyotik olarak kullanılır
Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS)LUMC eczaneN/AProtokolün farklı aşamalarında kullanılır
Pneumacult-ALI MediumSTEMCELL Teknolojileri05002cBD ortamı ile karşılaştırmak için farklılaşma aşamasında hücreleri büyütmek için kullanılır
Pneumacult-Ex Plus MediumSTEMCELL Teknolojileri05040cBD ortamı ile karşılaştırmak için batık aşamada hücreleri büyütmek için kullanılır
Primer, ATP5B, ileriEntegre DNA TeknolojilerN/ANükleotid dizisi: TCACCCAGGCTGGTTCAGA
Primer, ATP5B, tersEntegre DNA TeknolojileriN/ANükleotid dizisi: AGTGGCCAGGGTAGGCTGAT
Primer, FOXJ1, ileriEntegre DNA TeknolojileriN/ANükleotid dizisi: GGAGGGGACGTAAATCCCTA
Primer, FOXJ1, tersEntegre DNA TeknolojileriN/ANükleotid dizisi: TTGGTCCCAGTAGTTCCAGC
Astar, MUC5AC, ileriEntegre DNA TeknolojileriN/ANükleotid dizisi: CCTTCGACGGACAGAGCTAC
Primer, MUC5AC, tersEntegre DNA TeknolojileriN/ANükleotid dizisi: TCTCGGTGACAACACGAAAG
Primer, MUC5B, ileriEntegre DNA TeknolojileriN/ANükleotid dizisi: GGGCTTTGACAAGAGAGT
Primer, MUC5B, tersEntegre DNA TeknolojileriN/ANükleotid dizisi: AGGATGGTCGTGTTGATGCG Primer
, RPL13A, ileriEntegre DNA TeknolojileriN/ANükleotid dizisi: AAGGTGGTGGTCGTACGCTGTG
Primer, RPL13A, tersEntegre DNA TeknolojileriN/ANükleotid dizisi: CGGGAAGGGTTGGTGTTCATCC
Primer, SCGB1A1, ileriEntegre DNA TeknolojileriYokNükleotid dizisi: ACATGAGGGAGGCAGGGGCTC
Primer, SCGB1A1, tersEntegre DNA TeknolojileriN/ANükleotid dizisi: ACTCAAAGCATGGCAGCGGCA
Primer, TP63, ileriEntegre DNA TeknolojileriN/ANükleotid dizisi: CCACCTGGACGTATTCCACTG
Primer, TP63, tersEntegre DNA TeknolojileriN/ANükleotid dizisi: TCGAATCAAATGACTAGGAGGGG
PrimocinInvivoGenant-pm-2c-KSFM ortamında bakteri, mikoplazma ve mantarlara karşı antimikrobiyal ajan olarak kullanılır
Proteaz XIVSigma-AldrichP5147Bronşiyal halka
RNAsin Rekombinant Ribonükleaz inhibitörününPromegaN2515cDNA
Soya fasulyesi tripsin inhibitörünün sentezinde kullanılır ( SBTI)Sigma-AldrichT9128etkisini inhibe etmek için kullanılır
1861096cDNA sentezinde kullanılır
. DokuSAFE artıMILESTONE MEDICALN/ABiyolojik örnekler için vakum transfer sistemi
Tripan mavisi çözeltisiThermo Fisher Scientific15250061Canlı ve ölü hücreleri saymak için kullanılır 
Tripsin 1:250Thermo Fisher Scientific27250-018Yumuşak tripsin
Tip I kollajen çözeltisinde kullanılır (PureCol)Advanced BioMatrix5005-BKaplama solüsyonunda kullanılır
Üniversal kap, PP, PE vidalı kapaklıAvantor VWR216-2053Bronş halkasının Proteaz XIV tedavisi için protokolde kullanılır
kullanılır ALI-PBEC CO-İnkübatör D-Glucose Avantor VWR BDH CHEMICALS 101174Y'deki ALI-PBEC Fibronektin kullanılır kullanılır enzimatik tedavisi için kullanılır Yumuşak tripsin T100 Termal Döngüleyici Bio-Rad'ın

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Aghapour, M., et al. Role of air pollutants in airway epithelial barrier dysfunction in asthma and COPD. European Respiratory Review. 31 (163), 210112(2022).
  2. de Waal, A. M., Hiemstra, P. S., Ottenhoff, T. H., Joosten, S. A., vander Does, A. M. Lung epithelial cells interact with immune cells and bacteria to shape the microenvironment in tuberculosis. Thorax. 77 (4), 408-416 (2022).
  3. Duchesne, M., Okoye, I., Lacy, P. Epithelial cell alarmin cytokines: Frontline mediators of the asthma inflammatory response. Frontiers in Immunology. 13, 975914(2022).
  4. Hewitt, R. J., Lloyd, C. M. Regulation of immune responses by the airway epithelial cell landscape. Nature Reviews Immunology. 21 (6), 347-362 (2021).
  5. Ruysseveldt, E., Martens, K., Steelant, B. Airway basal cells, protectors of epithelial walls in health and respiratory diseases. Frontiers in Allergy. 2, 787128(2021).
  6. Alysandratos, K. D., Herriges, M. J., Kotton, D. N. Epithelial stem and progenitor cells in lung repair and regeneration. Annual Review of Physiology. 83, 529-550 (2021).
  7. Hammad, H., Lambrecht, B. N. Barrier epithelial cells and the control of type 2 immunity. Immunity. 43 (1), 29-40 (2015).
  8. Hynds, R. E., Bonfanti, P., Janes, S. M. Regenerating human epithelia with cultured stem cells: feeder cells, organoids and beyond. EMBO Molecular Medicine. 10 (2), 139-150 (2018).
  9. Hiemstra, P. S., Tetley, T. D., Janes, S. M. Airway and alveolar epithelial cells in culture. The European Respiratory Journal. 54 (5), 1900742(2019).
  10. Saint-Criq, V., et al. Choice of differentiation media significantly impacts cell lineage and response to CFTR modulators in fully differentiated primary cultures of cystic fibrosis human airway epithelial cells. Cells. 9 (9), 2137(2020).
  11. Leung, C., Wadsworth, S. J., Yang, S. J., Dorscheid, D. R. Structural and functional variations in human bronchial epithelial cells cultured in air-liquid interface using different growth media. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (5), L1063-L1073 (2020).
  12. Morgan, R., et al. A medium composition containing normal resting glucose that supports differentiation of primary human airway cells. Scientific Reports. 12 (1), 1540(2022).
  13. Ghosh, B., et al. Strong correlation between air-liquid interface cultures and in vivo transcriptomics of nasal brush biopsy. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (5), L1056-L1062 (2020).
  14. Pezzulo, A. A., et al. The air-liquid interface and use of primary cell cultures are important to recapitulate the transcriptional profile of in vivo airway epithelia. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 300 (1), L25-L31 (2011).
  15. Dvorak, A., Tilley, A. E., Shaykhiev, R., Wang, R., Crystal, R. G. Do airway epithelium air-liquid cultures represent the in vivo airway epithelium transcriptome. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 44 (4), 465-473 (2011).
  16. Legebeke, J., et al. Temporal whole-transcriptomic analysis of characterized in vitro and ex vivo primary nasal epithelia. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 907511(2022).
  17. Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).
  18. van Wetering, S., et al. Regulation of secretory leukocyte proteinase inhibitor (SLPI) production by human bronchial epithelial cells: increase of cell-associated SLPI by neutrophil elastase. Journal of Investigative Medicine. 48 (5), 359-366 (2000).
  19. Balk, S. D. Calcium as a regulator of the proliferation of normal, but not of transformed, chicken fibroblasts in a plasma-containing medium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 68 (2), 271-275 (1971).
  20. Gail, M. H., Boone, C. W., Thompson, C. S. A calcium requirement for fibroblast motility and prolifertion. Experimental Cell Research. 79 (2), 386-390 (1973).
  21. Dulbecco, R., Elkington, J. Induction of growth in resting fibroblastic cell cultures by Ca. Proceedings of the National Academy of Sciences. 72 (4), 1584-1588 (1975).
  22. van Wetering, S., et al. Epithelial differentiation is a determinant in the production of eotaxin-2 and -3 by bronchial epithelial cells in response to IL-4 and IL-13. Molecular Immunology. 44 (5), 803-811 (2007).
  23. Amatngalim, G. D., et al. Aberrant epithelial differentiation by cigarette smoke dysregulates respiratory host defence. The European Respiratory Journal. 51 (4), 1701009(2018).
  24. Christie, V. B., et al. Retinoid supplementation of differentiating human neural progenitors and embryonic stem cells leads to enhanced neurogenesis in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 193 (2), 239-245 (2010).
  25. Schrumpf, J. A., Ninaber, D. K., vander Does, A. M., Hiemstra, P. S. TGF-β1 impairs vitamin D-induced and constitutive airway epithelial host defense mechanisms. Journal of Innate Immunity. 12 (1), 74-89 (2020).
  26. Schrumpf, J. A., et al. Proinflammatory cytokines impair vitamin D-induced host defense in cultured airway epithelial cells. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 56 (6), 749-761 (2017).
  27. Boei, J. J. W. A., et al. Xenobiotic metabolism in differentiated human bronchial epithelial cells. Archives of Toxicology. 91 (5), 2093-2105 (2017).
  28. Wang, Y., et al. Impact of human airway epithelial cellular composition on SARS-CoV-2 infection biology. bioRxiv. , (2021).
  29. Nawroth, J. C., et al. Breathing on Chip: Dynamic flow and stretch tune cellular composition and accelerate mucociliary maturation of airway epithelium in vitro. bioRxiv. , (2022).
  30. Horani, A., Nath, A., Wasserman, M. G., Huang, T., Brody, S. L. Rho-associated protein kinase inhibition enhances airway epithelial Basal-cell proliferation and lentivirus transduction. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (3), 341-347 (2013).
  31. Mou, H., et al. Dual SMAD signaling inhibition enables long-term expansion of diverse epithelial basal cells. Cell Stem Cell. 19 (2), 217-231 (2016).
  32. Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 100300(2019).
  33. Eenjes, E., et al. Disease modeling following organoid-based expansion of airway epithelial cells. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 321 (4), L775-L786 (2021).
  34. Butler, C. R., et al. Rapid expansion of human epithelial stem cells suitable for airway tissue engineering. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 194 (2), 156-168 (2016).
  35. Amatngalim, G. D., et al. Antibacterial defense of human airway epithelial cells from chronic obstructive pulmonary disease patients induced by acute exposure to nontypeable Haemophilus influenzae: modulation by cigarette smoke. Journal of Innate Immunity. 9 (4), 359-374 (2017).
  36. Plebani, R., et al. 3D lung tissue models for studies on SARS-CoV-2 pathophysiology and therapeutics. International Journal of Molecular Sciences. 23 (17), 10071(2022).
  37. Wong, A. P., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into mature airway epithelia expressing functional CFTR protein. Nature Biotechnology. 30 (9), 876-882 (2012).
  38. Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Methods in Molecular Biology. 107, 183-206 (2005).
  39. Cao, J., Wong, C. K., Yin, Y., Lam, C. W. K. Activation of human bronchial epithelial cells by inflammatory cytokines IL-27 and TNF-alpha: implications for immunopathophysiology of airway inflammation. The Journal of Cellular Physiology. 223 (3), 788-797 (2010).
  40. Tsao, P. N., et al. Notch signaling controls the balance of ciliated and secretory cell fates in developing airways. Development. 136 (13), 2297-2307 (2009).
  41. Laoukili, J., et al. IL-13 alters mucociliary differentiation and ciliary beating of human respiratory epithelial cells. The Journal of Clinical Investigation. 108 (12), 1817-1824 (2001).
  42. Mertens, T. C. J., et al. Cigarette smoke differentially affects IL-13-induced gene expression in human airway epithelial cells. Physiological Reports. 5 (13), e13347(2017).
  43. Zarcone, M. C., et al. Effect of diesel exhaust generated by a city bus engine on stress responses and innate immunity in primary bronchial epithelial cell cultures. Toxicology in Vitro. 48, 221-231 (2018).
  44. vander Does, A. M., et al. Early transcriptional responses of bronchial epithelial cells to whole cigarette smoke mirror those of in-vivo exposed human bronchial mucosa. Respiratory Research. 23 (1), 227(2022).
  45. Wang, Y., Ninaber, D. K., van Schadewijk, A., Hiemstra, P. S. Tiotropium and fluticasone inhibit rhinovirus-induced mucin production via multiple mechanisms in differentiated airway epithelial cells. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 278(2020).
  46. Ronaghan, N. J., et al. M1-like, but not M0- or M2-like, macrophages, reduce RSV infection of primary bronchial epithelial cells in a media-dependent fashion. PLoS One. 17 (10), 0276013(2022).
  47. Gindele, J. A., et al. Opposing effects of in vitro differentiated macrophages sub-type on epithelial wound healing. PLoS One. 12 (9), e0184386(2017).
  48. van Riet, S., et al. Modulation of airway epithelial innate immunity and wound repair by M(GM-CSF) and M(M-CSF) macrophages. Journal of Innate Immunity. 12 (5), 410-421 (2020).
  49. Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
  50. Stucki, A. O., et al. A lung-on-a-chip array with an integrated bio-inspired respiration mechanism. Lab on a Chip. 15 (5), 1302-1310 (2015).
  51. Peters-Hall, J. R., et al. Long-term culture and cloning of primary human bronchial basal cells that maintain multipotent differentiation capacity and CFTR channel function. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 315 (2), L313-L327 (2018).
  52. Bartman, C. M., Stelzig, K. E., Linden, D. R., Prakash, Y. S., Chiarella, S. E. Passive siRNA transfection method for gene knockdown in air-liquid interface airway epithelial cell cultures. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 321 (1), L280-L286 (2021).
  53. Koh, K. D., et al. Efficient RNP-directed human gene targeting reveals SPDEF is required for IL-13-induced mucostasis. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 62 (3), 373-381 (2020).
  54. Bhargava, N., et al. Development of an efficient single-cell cloning and expansion strategy for genome edited induced pluripotent stem cells. Molecular Biology Reports. 49 (8), 7887-7898 (2022).
  55. Angelopoulou, A., Papaspyropoulos, A., Papantonis, A., Gorgoulis, V. G. CRISPR-Cas9-mediated induction of large chromosomal inversions in human bronchial epithelial cells. STAR Protocols. 3 (2), 101257(2022).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Primer H cre K lt rAkci er Dokusu Biyobankac lEpitelyal H cre zolasyonuMukosiliyer DiferansiyasyonTEER l mKriyoprezervasyon ProtokolGen Ekspresyon AnaliziH cre Tipi Karakterizasyonu

İlgili makaleler