Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Limbal Niş Hücrelerin İzolasyonu ve Tanımlanması

1.9K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/65618

⸱

27 Ekim 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, 2Institute of Medicine Nursing, Hubei University of Medicine, 3Department of Ophthalmology, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology

Bu makalede

Özet

Burada, insan limbal niş hücrelerini izole etmek ve tanımlamak için bir protokol sunuyoruz.

Özet

Burada limbal niş hücrelerin (LNC'ler) izolasyonu ve tanımlanması için standart bir prosedür sunuyoruz. LNC'lerin izolasyonu için göz bankasından elde edilen limbus dokusu kullanıldı. Doku, aseptik koşullar altında 12 parçaya bölündü ve LNC'ler ve limbal epitelyal progenitör hücreler ile hücre kümeleri elde etmek için kollajenaz A kullanılarak hücre kültürü inkübatöründe 37 °C'de 18 saat sindirildi. Hücre kümeleri, tek hücreler elde etmek için% 0.25 tripsin-EDTA kullanılarak 37 ° C'de 15 dakika boyunca sindirildi ve daha sonra% 5 Matrigel ile kaplanmış plastik bir yüzey üzerinde modifiye embriyonik kök hücre ortamında (MESCM) kültürlendi. Hücreler %70 birleşme üzerine geçirildi ve LNC'ler immünofloresan, gerçek zamanlı kantitatif PCR (qPCR) ve akış sitometrisi kullanılarak tanımlandı. Birincil LNC'ler izole edildi ve 12 defadan fazla geçti. LNC'lerin P4'ten P6'ya proliferasyon aktivitesi en yüksekti. LNC'ler, BMMSC'lerden (SCF, Nestin, Rex1, SSEA4, CD73, CD90, MSX1, P75NTR ve PDGFRβ) daha yüksek kök hücre belirteçleri ifade etti. Ayrıca, sonuçlar, P4 LNC'lerin VIM, CD90, CD105 ve PDGFRβ'yi tekdüze olarak eksprese ettiğini, ancak LNC'lerin tanımlanması için bir belirteç olarak kullanılabilecek Pan-CK'yi eksprese etmediğini gösterdi. Akış sitometrik analizi, LNC'lerin yaklaşık %95, %97, %92 ve %11'inin sırasıyla CD73, CD90, CD105 ve SCF eksprese ettiğini, BMMSC'lerde ise %68, %99, %20 ve %3 olduğunu gösterdi. LNC izolasyonu ve tanımlanması için standart süreç, LNC'lerin yaygın kullanımı için güvenilir bir laboratuvar temeli sağlayabilir.

Giriş

Limbal kök hücre eksikliği (LSCD)1 olarak da adlandırılan kornea epitelyal kök hücre eksikliği (CESD) ve kornea epitel rejenerasyonu (CES) insidansı, kornea enfeksiyonu ve yaralanması nedeniyle giderek daha acil hale gelmektedir. Uygun şekilde tedavi edilmezse, CESD kornea nakli gerektiren körlüğe yol açabilir. Sonuç olarak, CES rejenerasyonu daha önemli hale geliyor. CES işlevi için gerekli desteği sağlayan limbal niş hücreler (LNC'ler) adı verilen bir grup destekleyici hücre vardır. Limbal stromal kök hücreler ilk olarak Polisetty ve ark.2 tarafından izole edilmiş ve Xie ve ark.3 tarafından limbal epitel, subjacent ve limbusun stromasında lokalize olan LNC'ler olarak tanımlanmıştır. LNC'ler, kornea kenarının anahtar destekleyici kök hücresidir ve kemik iliği kaynaklı MSC'nin (BMMSC'ler) işlevi ile kornea epitel hücrelerine ve kornea stromal hücrelerine vb. dönüşmeye teşvik edilebilir.3,4,5,6,7. Önceki çalışmalar, LNC'lerin kök hücre özelliklerinin, klinikte zaten yaygın olarak kullanılan BMMSC8'den daha ilkel olduğunu göstermiştir. LNC'ler, özellikle CESD tedavisi için MSC'den sonra bir sonraki uygun seçenek haline gelebilir. CES için önemli destekleyici hücreler olan LNC'ler aynı zamanda limbusun "niş" yapısından türetilen kök hücrelerdir. LNC'ler, olgun kornea epitel hücrelerinin (MCEC) CES9'a farklılaşmasında önemli bir rol oynayabilir. Bununla birlikte, LNC'ler ile ilgili çalışmalar hala nispeten yetersizdir ve LNC'lerin terminolojisi, izolasyonu, saflaştırılması, tanımlanması ve özellikleri konusunda bir fikir birliği yoktur. Bazı araştırmacılar LNC'leri limbal biyopsiden türetilmiş stromal kök hücreler10, limbal mezenkimal kök hücreler11, limbal fibroblast kök hücreler12 ve limbal mezenkimal stromal hücreler13 olarak adlandırmışlardır. LNC'lerin büyüme özellikleri ayrıntılı olarak tanımlanmadığından, umut verici bilimsel ve klinik uygulamaları nedeniyle ve gelecekte en önemli klinik araçlardan biri olabileceğinden, LNC'lerin izolasyonu, saflaştırılması, tanımlanması ve özelliklerini özetlemek gerekir.

Daha önceki bir çalışmayagöre 14, LNC'ler esas olarak limbal epitelin subjacent ve limbusun stromasında bulunur. Bu protokol, limbus dokusunun kollajenaz A kullanılarak işlenmesini, LEPC ve LNC'lerden oluşan bir küme elde edilmesini ve %0.25 tripsin-EDTA (TE) ile tek hücrelere sindirilmesini içerir. LNC'ler daha sonra saflaştırılmak üzere modifiye edilmiş bir embriyonik kök hücre ortamında (MESCM) seçici olarak kültürlendi. Bu yazıda bildirilen protokol basittir ve büyük miktarlarda insan LNC'lerinin elde edilmesinde yüksek verimliliğe sahiptir.

LNC izolasyonu, kültürü ve tanımlanmasının ayrıntılı prosedürü, LNC çalışmasıyla ilgilenen bilim adamları için videoya kaydedildi ve gerektiğinde rahatlıkla tekrarlanabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

50 ila 60 yaşları arasındaki donörlerden alınan limbus dokusu, Tongji Hastanesi (Wuhan, Çin) Kızıl Haç Göz Bankası'ndan elde edildi. Protokol, Tongji Etik Komitesi tarafından onaylandı ve Helsinki Bildirgesi'ne uygun olarak yürütüldü.

1. İzolasyon

  1. Orta süreli kornea depolama ortamından limbus dokusu elde edin ve ultra temiz bir tezgah üzerinde aseptik koşullar altında çalıştırın.
  2. Steril bir cerrahi yuvarlak bıçak kullanarak korneanın etrafındaki iris ve endotelyumu kazıyın ve çıkarın.
  3. Kornea ve skleranın her iki tarafında 1 mm kalacak şekilde cerrahi bir bıçakla limbus dokusunu eşit büyüklükte on iki parçaya kesin.
  4. Limbus dokularını 3,5 cm'lik bir kültür plakasına aktarın, tüm dokuları sindirim için daldırmak için 1 mL kollajenaz A (DF-12 ortamında 2 mg / mL) ekleyin.
  5. Plakayı 37 ° C'lik hücre inkübatörüne koyun, limbal dokuları 18 saat boyunca sindirin.
    NOT: Takip işlemleri genellikle ikinci gün yapılır.
  6. %5 bazal membran matrisi (Matrigel) kaplı 6 oyuklu kültür plakası hazırlayın.
    1. Kuyu dibinde% 5 bazal membran matrisini (MESCM [Tablo 1] içinde çözülmüş) kaplayın.
    2. Sterilize edilmiş bir torbada 200 μL ve 1 mL uç, bir adet 15 mL santrifüj tüp ve bir adet 6 oyuklu plaka hazırlayın.
    3. Sterilize edilmiş torbayı (uçlar ve santrifüj tüp dahil) ve yeni bir 6 oyuklu plakayı -20 °C veya -80 °C ortamında 20 dakika bekletin. Bazal membran matrisini buzdolabında 4 °C'de çözdürün.
    4. Önceden soğutulmuş uçları, santrifüj boruyu ve 6 oyuklu plakayı -20 °C veya -80 °C ortamından çıkarın ve ardından ultra temiz tezgahta aşağıdaki işlemleri gerçekleştirin.
    5. 200 μL'lik bir uç kullanarak 50 μL %5 bazal membran matrisini 1 mL MESCM'ye aktarın ve nazikçe ve eşit şekilde karıştırın.
    6. Önceden soğutulmuş 1 mL ucu kullanarak %5 bazal membran matrisini (MESCM içinde çözülmüş) 6 oyuklu bir kültür plakasının bir kuyucuğuna aktarın.
    7. 6 oyuklu plakayı hafifçe ve yatay olarak çalkalayın, 6 oyuklu kültür plakasını 37 °C hücre inkübatörüne yaklaşık 1 saat koyun ve ardından bir sonraki adımı gerçekleştirin.
  7. 18 saatlik sindirimden sonra, kollajenaz A-sindirilmiş limbal dokuyu çıkarın, sadece bazı görünür küçük kümeler ve sindirilmemiş skleral dokular kalacaktır.
    NOT: Yüksek büyütmeli mikroskopi, yoğun bir şekilde paketlenmiş birçok hücreden (LNC'ler dahil) oluşan bir kümeyi ortaya çıkarır.
  8. Kümeleri stereomikroskop altında sindirilmemiş skleral dokulardan ayırmak için 200 μL'lik bir pipet ucu kullanın.
  9. Kümeleri 3,5 cm'lik kültür plakasına aktarın ve %0,25 TE'ye daldırın ve ardından plakayı 15 dakika boyunca hücre inkübatörüne yerleştirin.
  10. Hücre sindirimini durdurmak için %10 nakavt serumu ile 1 mL MESCM ekleyin ve 1 mL'lik bir pipet ucu kullanarak kümeleri tek tek hücrelere yeniden süspanse etmek için hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin.
  11. Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir santrifüj tüpe aktarın ve 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin.
  12. Hücre çökelmesini bozmadan süpernatanı dikkatlice çıkarın ve ardından hücreleri yeniden süspanse etmek için 1 mL MESCM ekleyin.
  13. 1 mL pipet ucu kullanarak alt hücre çökelmesi MESCM'de eşit şekilde süspanse edilene kadar 2-3 kez yukarı ve aşağı pipetleyin ve hücre sayımı için 20 μL hücre süspansiyonu alın.
  14. Hücre süspansiyonunu 1 mL pipet ucuna sahip %5 bazal membran matris kaplı 6 oyuklu plakaya aktarın ve MESCM hacmini 2,5 mL'ye yükseltin.
  15. Hücreleri eşit olarak dağıtmak için 6 oyuklu plakayı yatay olarak hafifçe sallayın.
  16. Hücreleri görüntülendikten ve kaydedildikten sonra kültür inkübatörüne aktarın. Hücreleri günlük olarak gözlemleyin ve fotoğraflayın ve ortamı her 3-4 günde bir değiştirin.

2. LNC'nin Tanımlanması

  1. İmmünofloresan boyama
    1. 37 ° C hücre inkübatörde 5 dakika boyunca 1 mL% 0.25 TE kullanarak LNC'leri plakanın altından sindirin.
    2. 1 mL MESCM (nakavt serumu içeren) ekleyerek sindirimi sonlandırın, hücre süspansiyonunu 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı dikkatlice aspire edin.
    3. Süspansiyondaki hücreleri yeniden süspanse etmek için 1 mL MESCM ekleyin. 4 slayt (20 μL/slayt) için 80 μL hücre süspansiyonu (slayt başına 4 × 103 hücre) hazırlayın ve üreticinin talimatlarına göre hücreleri mikroskop slaytlarına yerleştirmek için santrifüj sistemi kullanın.
    4. Yaklaşık 10 dakika boyunca% 4 paraformaldehit kullanarak hücreleri (3. adımda slaytlara yapıştırılmış) sabitleyin ve ardından 15 dakika boyunca PBS'de% 0.2 Triton X-100 ile slaytlardaki hücreleri geçirgen hale getirin.
    5. Hücreleri primer antikorlarla (Pan-CK [1:1000], Vim [1:100], CD90 [1:100], CD105 [1:200], SCF [1:100], PDGFRβ [1:100]) ile inkübe etmeden önce% 2 sığır serum albümini (BSA) ile 1 saat bloke edin. İnkübasyondan sonra, slaytları PBST (PBS +% 0.1 Tween 20) ile yıkayarak (5 dakika / yıkama, 3x) bağlanmamış primer antikorları çıkarın.
    6. Karşılık gelen ikincil antikorları (eşek anti-fare IgG ikincil antikoru TRITC [1:1000], eşek anti-tavşan IgG FITC [1:500], eşek anti-fare IgG 488 [1:300], eşek anti-tavşan IgG 594 [1:400]) uygun IgG spesifik olmayan IgG antikorları ile 1 saat inkübe edin. PBST (5 dk / yıkama, 3x) kullanarak bağlanmamış ikincil antikoru çıkarın.
    7. Çekirdekleri 5 μg / mL DAPI (4 ', 6-Diamidino-2-Fenilindol) ile boyayın ve slaytları kapatın.
    8. Floresan mikroskobu kullanarak floresan görüntüleme yapın (Büyütme: 400x; Maruz kalma süresi: 50 ms).
  2. Kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR)
    1. Üreticinin talimatlarına göre toplam RNA'yı çıkarmak için RNA İzolasyon Kitini alın.
    2. 1-2 μg toplam RNA'yı cDNA'ya tersine çevirmek için yüksek kapasiteli bir cDNA Transkripsiyon Kiti kullanın.
    3. cDNA (100 ng), TaqMan Gen Ekspresyon Test Karışımı (1 μL), evrensel PCR Master Mix (10 μL) ve ddH 2 O (20 μL'ye kadar) içeren 20 μL'lik bir çözeltide ters transkripsiyon (42 °C,2dk; 50 °C, 85 dk) ve qPCR (95 °C, 5 dk; 95 °C, 10 s, 40 döngü) gerçekleştirin.
    4. Göreceli gen ekspresyonunu incelemek için karşılaştırmalı BT tekniğini (ΔΔCT)4,9 kullanın.

3. LNC'nin Karakterizasyonu

  1. Hücre sayımı (hemositometre)
    1. LNC'leri 37 °C hücre inkübatörde 5 dakika boyunca% 0.25 TE kullanarak plakanın altından sindirin.
    2. 1 mL MESCM (nakavt serumu içeren) ekleyerek sindirimi sonlandırın, hücre süspansiyonunu 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı dikkatlice aspire edin.
    3. Hücreleri yeniden süspanse etmek için 1 mL MESCM ekleyin, ardından 0.5 mL'lik bir santrifüj tüpünde 10 μL hücre süspansiyonu alın. Eşit hacimde% 0.4 Tripan mavisi boyama çözeltisi ekleyin.
    4. Hemositometrenin sayım alanına 10 μL lekeli hücre süspansiyonu yerleştirin ve sayım için bir lamel ile örtün.
      NOT: Ortadaki beş kare alandaki hücre sayısı "A" olarak tanımlanır; 1 mL'deki hücre sayısı 5A × 104 × 2 olarak hesaplanır.
  2. LNC ve BMMSC belirteçlerinin akım sitometrisi ile incelenmesi15
    1. Akış sitometrisi 15 (2-4 × 106 olay/örnek, örneklerin her birinden 2.000 hücre elde edildi, aynı anda kapılı toplam 550.000 hücre) kullanarak LNC'lerde ve BMMSC'lerde SCF, CD73, CD90 ve CD105 ekspresyonunu tespit edin).
    2. Hücreleri 20-30 ° C'de 15 dakika boyunca bir bloke edici tamponda (PBS'de% 3 BSA ve% 0.05 Tween-20) önceden etiketlenmiş antikorlar (SCF [1:50], CD70 [1:50], CD90 [1:50] ve CD105 [1:50]) kullanarak toplayın ve boyayın.
    3. Bir akış sitometresi kullanarak floresanla aktive edilen hücre sıralama (FACS) analizi gerçekleştirin. Bu çalışmada FACS Diva yazılımı ve FlowJo yazılımı kullanılmıştır. Her örnek için 10.000 olay kaydedin ve canlı hücreleri geçit ve analiz edin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

LNC'nin Büyümesi
LNC'ler, yukarıda tarif edildiği gibi, korneoskleral kenar dokusunun kollajenaz A (2 mg/mL) sindirim yöntemine göre başarılı bir şekilde izole edildi (Şekil 1). Daha önce bildirilen bir çalışma3 ile tutarlı olarak, kollajenaz A sindiriminden sonra, mikroskop altında tırtıl benzeri kümeler görüntülendi (Şekil 2). İğsi hücrelerinin oranı, hücre geçişi ile kademeli olarak artmıştır. Mil şeklindeki hücrele...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Kornea şeffaflığı tipik olarak, normal görme keskinliği için çok önemli olan kornea stromasındaki küçük liflerin (25-30 nm çapında) düzenli olarak düzenlenmesi ve dağıtılmasıyla sağlanır16. Dünyada 36 milyonu kör olmak üzere 253 milyon görme engelliinsan var 17. Dünya Sağlık Örgütü (WHO), kornea körlüğünü insan görme duyusuna yönelik en ciddi tehlikelerden biri olarak kabul etmektedir ve dünya çapındaki tüm körlüklerin %5,1'ini oluşturmaktadır16. Nor...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların hiçbirinin ilgili herhangi bir finansal açıklaması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışmayla ilgili rehberlik için Wei Wang, Lingjuan Xu ve Rong Liu'ya, materyalin bir kısmını sağladıkları için Yongyao Tan, Bihui Jin, Chunxiu You ve Li Guigang'a, el yazmasını yazdığı için Guanyu Su'ya, el yazmasını düzelttiği için Xiao Zhou, Yihong Xiong ve Huatao Xie'ye ve tam rehberliği için Guigang Li'ye teşekkürler. Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (No. 82070936, 81470606, 81570819), Hubei Eyaleti sağlık ve aile planlaması bilimsel araştırma projesi (No. WJ2017M073), Tongji Hastanesi'nden İlk On Translasyonel Tıbbi Araştırma Projesi (No.2016ZHYX20), Wuhan Şehrindeki Genç Tıp Öncülerinin Eğitim Projesi (No.2015whzqnyxggrc10), Küresel Yetenekler İşe Alım Programı (G2022154028L), 2022'de Hubei Eyaleti Ulusal Sağlık Komisyonu projesi(WJ2021ZH0005) ve 2022'de Hubei Finans Departmanının Konu İnşaat Vakfı(42000022815T000000102)

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
4 ', 6-Diamidino-2-fenilindolThermoFisherD13065 & mu; g/mL
Amfoterisin BSigmaV9009191.25 μ g / mL
Anti-CD73Abcamab2021221:50
Sığır Serumu AlbüminiMERCKA1933-CD105
Proteintech67075-1-IG1:200
CD105Abcamab1140521:50
CD90Proteintech66766-1-IG1:100
CD90Abcamab3077361:50
Hücre İnkübatörüShanghai LishenK1119K4644HF90 (HT)
Santrifüj sistemiStatSpin StatSpin CytoFuge
ARoche101035780012 mg/mL
Konfokal mikroskopZeiss LSM700-Kültür
plakasıvirya350035635 mm
DME/F-12 1:1 (1x) cytivaSH30023.01%90
Eşek anti-Fare IgG (H+L) İkincil AntikorThermoFisherA160161:1000
Eşek anti-tavşan IgG (H+L) İkincil AntikorThermoFisher315681:1000
FACS Diva yazılımıBD BiosciencesAğaç Yıldız
Akış SitometresiBD BiosciencesBecton Dickinson LSRII-
Floresan mikroskobuolympuscx31 
GentamisinSigmaG191450 μ g/mL
HemositometreMERCKZ359629Bright-Line
Yüksek kapasiteli cDNA Transkripsiyon KitiThermoFisher4374966
Ters faz kontrast mikroskobu  UOPDSZ2000X
ITS (insülin, transferrin, sodyum selenit)SigmaI31465 & mu; g/mL insülin, 5 & mu; g/mL transferrin, 5 ng/mL sodyum selenit
ESC'ler/iPSC'ler için KnockOut SR Serum Değişimigibco10828-028%10
MatrigelBioCoat
356234-Pan-CKAbcamab77531:1000
ParaformaldehitNoninBioNBS0135%4.00
ParaformaldehitMKBioMM-1505%4
PDGFR ve beta;AbclonalA14441:100
Gerçek zamanlı floresan kantitatif PCR cihazıUygulamalı BiyosistemlerBirinci Adım
Artı-Rekombinant İnsan FGF-basicPeprotech100-18B4 ng/mL
Rekominant İnsan Lösemi İnhibitör Faktörü(Lif)Peprotech300-0510 ng/mL
RNeasy Mini RNA İzolasyon KitiQiagen74104-
SCFBiossbs-0545R1:100
SCFAbcamab526031:50
StereomikroskopZEISSSteREO Keşfi. V8
Steril cerrahi yuvarlak bıçakCareforde29500boyut 10
TaqMan Gen Ekspresyon Testi KarışımUygulamalı Biyosistemler4448489
Triton X-100MERCKX100%0.20
Tripan mavisiThermoFisher15250061%0.40
Tripsin-EDTAGenviewGP3108%0.25
Tween 20MERCKP9416-Ultra
Temiz TezgahLaiTeLT20200705SW-CJ-IFDG
Evrensel PCR Master MixUygulamalı Biyosistemler4304437
Vim Abcamab925471:100
12-Kollajenaz

Kaynaklar

  1. Le, Q., Xu, J., Deng, S. X. The diagnosis of limbal stem cell deficiency. Ocular Surface. 16 (1), 58-69 (2018).
  2. Polisetty, N., Fatima, A., Madhira, S. L., Sangwan, V. S., Vemuganti, G. K. Mesenchymal cells from limbal stroma of human eye. Molecular Vision. 14, 431-442 (2008).
  3. Xie, H. T., Chen, S. Y., Li, G. G., Tseng, S. C. Isolation and expansion of human limbal stromal niche cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (1), 279-286 (2012).
  4. Li, G. G., Zhu, Y. T., Xie, H. T., Chen, S. Y., Tseng, S. C. Mesenchymal stem cells derived from human limbal niche cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (9), 5686-5697 (2012).
  5. Li, G. G., Chen, S. Y., Xie, H. T., Zhu, Y. T., Tseng, S. C. Angiogenesis potential of human limbal stromal niche cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (7), 3357-3367 (2012).
  6. Hu, W., Zhang, Y., Tighe, S., Zhu, Y. T., Li, G. G. A new isolation method of human lacrimal canaliculus epithelial stem cells by maintaining close association with their niche cells. International Journal of Medical Sciences. 15 (12), 1260-1267 (2018).
  7. Kumar, A., Xu, Y., Yang, E., Du, Y. Stemness and regenerative potential of corneal stromal stem cells and their secretome after long-term storage: Implications for ocular regeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (8), 3728-3738 (2018).
  8. Xiao, Y. T., Qu, J. Y., Xie, H. T., Zhang, M. C., Zhao, X. Y. A comparison of methods for isolation of limbal niche cells: Maintenance of limbal epithelial stem/progenitor cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 61 (14), 16(2020).
  9. Zhu, H., et al. Limbal niche cells and three-dimensional matrigel-induced dedifferentiation of mature corneal epithelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 63 (5), 1(2022).
  10. Basu, S., et al. Human limbal biopsy-derived stromal stem cells prevent corneal scarring. Science Translational Medicine. 6 (266), 266ra172(2014).
  11. Acar, U., et al. Effect of allogeneic limbal mesenchymal stem cell therapy in corneal healing: role of administration route. Ophthalmic Research. 53 (2), 82-89 (2015).
  12. Katikireddy, K. R., Dana, R., Jurkunas, U. V. Differentiation potential of limbal fibroblasts and bone marrow mesenchymal stem cells to corneal epithelial cells. Stem Cells. 32 (3), 717-729 (2014).
  13. Polisetti, N., Sharaf, L., Reinhard, T., Schlunck, G. Isolation and ex vivo expansion of limbal mesenchymal stromal cells. Bio-Protocols. 12 (14), e4471(2022).
  14. Xie, H. T., Chen, S. Y., Li, G. G., Tseng, S. C. Limbal epithelial stem/progenitor cells attract stromal niche cells by SDF-1/CXCR4 signaling to prevent differentiation. Stem Cells. 29 (11), 1874-1885 (2011).
  15. Li, G., et al. Human limbal niche cells are a powerful regenerative source for the prevention of limbal stem cell deficiency in a rabbit model. Scientific Reports. 8, 6566(2018).
  16. Kumar, A., Yun, H., Funderburgh, M. L., Du, Y. Regenerative therapy for the cornea. Progress In Retinal and Eye Research. 87, 101011(2022).
  17. Pineda, R. World Corneal Blindness. Foundations of Corneal Disease. , Springer, Cham. 299-305 (2020).
  18. Zieske, J. D., Guimarães, S. R., Hutcheon, A. E. Kinetics of keratocyte proliferation in response to epithelial debridement. Experimental Eye Research. 72 (1), 33-39 (2001).
  19. Resnikoff, S., et al. Global data on visual impairment in the year 2002. Bulletin of the World Health Organization. 82 (11), 844-851 (2004).
  20. Tan, Y., et al. Limbal bio-engineered tissue employing 3D nanofiber-aerogel scaffold to facilitate LSCs growth and migration. Macromolecular Bioscience. 22 (5), e2100441(2022).
  21. Aghamirsalim, M., et al. 3D printed hydrogels for ocular wound healing. Biomedicines. 10 (7), 1562(2022).
  22. Sasamoto, Y., Ksander, B. R., Frank, M. H., Frank, N. Y. Repairing the corneal epithelium using limbal stem cells or alternative cell-based therapies. Expert Opinion on Biological Therapy. 18 (5), 505-513 (2018).
  23. Rohaina, C. M., et al. Reconstruction of limbal stem cell deficient corneal surface with induced human bone marrow mesenchymal stem cells on amniotic membrane. Translational Research. 163 (3), 200-210 (2014).
  24. O'Callaghan, A. R., Dziasko, M. A., Sheth-Shah, R., Lewis, M. P., Daniels, J. T. J. A. B. Oral mucosa tissue equivalents for the treatment of limbal stem cell deficiency. Advanced Biosystems. 4 (7), e1900265(2020).
  25. Yu, D., Chen, M., Sun, X., Ge, J. Differentiation of mouse induced pluripotent stem cells into corneal epithelial-like cells. Cell Biology International. 37 (1), 87-94 (2013).
  26. Zeppieri, M., et al. Adipose-derived stem cells for corneal wound healing after laser-induced corneal lesions in mice. Journal of Clinical Medicine. 6 (12), 115(2017).
  27. Kumar, A., Kumar, V., Rattan, V., Jha, V., Bhattacharyya, S. Secretome cues modulate the neurogenic potential of bone marrow and dental stem cells. Molecular Neurobiology. 54 (6), 4672-4682 (2017).
  28. Hayashi, R., et al. Coordinated generation of multiple ocular-like cell lineages and fabrication of functional corneal epithelial cell sheets from human iPS cells. Nature Protocols. 12 (4), 683-696 (2017).
  29. Guo, P., et al. Limbal niche cells are a potent resource of adult mesenchymal progenitors. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 22 (7), 3315-3322 (2018).
  30. Wang, W., et al. Differential gene expression between limbal niche progenitors and bone marrow derived mesenchymal stem cells. International Journal of Medical Sciences. 17 (4), 549-557 (2020).
  31. González, S., Deng, S. X. Presence of native limbal stromal cells increases the expansion efficiency of limbal stem/progenitor cells in culture. Experimental Eye Research. 116, 169-176 (2013).
  32. Funderburgh, M. L., Du, Y., Mann, M. M., SundarRaj, N., Funderburgh, J. L. PAX6 expression identifies progenitor cells for corneal keratocytes. FASEB Journal. 19 (10), 1371-1373 (2005).
  33. Funderburgh, J. L., Funderburgh, M. L., Du, Y. Stem cells in the limbal stroma. Ocular Surface. 14 (2), 113-120 (2016).
  34. Chen, S. Y., Hayashida, Y., Chen, M. Y., Xie, H. T., Tseng, S. C. A new isolation method of human limbal progenitor cells by maintaining close association with their niche cells. Tissue Engineering. Part C, Methods. 17 (5), 537-548 (2011).
  35. Sato, T., Clevers, H. SnapShot: Growing organoids from stem cells. Cell. 161 (7), 1700-1701 (2015).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

LNC zolasyonuLimbal K k H crelerH cre K lt rKollagenaz SindirimiTrypsin EDTAmm nofloresan BoyamaAk SitometrisiK k H cre Mark rleriKantitatif PCR
Limbal Niş Hücrelerin İzolasyonu ve Tanımlanması
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.