Bu protokol, aynı numunelerden metabolomik analizler için toplu sitozolik fraksiyonu korurken, tek çekirdekli eşzamanlı RNA dizilimi ve ATAC dizilemede kullanılmak üzere donmuş insan olmayan primat pankreas adacıklarından yüksek kaliteli çekirdekleri izole etme prosedürlerini açıklar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Kombine Tek Çekirdekli RNA Dizileme ve ATAC-Dizileme ve Toplu Metabolomikler için Donmuş İnsan Olmayan Primat Fetal Adacıklarının Hazırlanması
Bu makalede
Özet
Özet
Birden fazla kohorttan toplanan dokuları kullanan çalışmalardaki bir zorluk, kombine tek hücreli RNA dizilimi ve metabolomik gibi büyük ölçekli multi-omik deneylere hazırlanırken toplu etkilerden kaçınmaktır. Bu çalışmadaki yöntem, tek çekirdekli RNA dizilimi ve ATAC dizileme deneylerine girdi için iki yıllık bir süre boyunca toplanan fetal insan olmayan primatlardan flaşla donmuş pankreas adacıklarını kullanır. Nükleer ekstraksiyon sırasında üretilen sitozolik fraksiyon, aşağı akış kılcal elektroforez-kütle spektrometresi ve müteakip metabolit miktar tayini için tutuldu. Bu yöntem, deneysel koşullar içinde değişen transkriptomik ve epigenomik manzaralara katkıda bulunan metabolitlerin toplu analizine izin verir. Birçok doku tipine uygulanabilir ve kolayca bulunamayan örneklerden çıkarılabilecek bilgi miktarını en üst düzeye çıkarır. Metabolizmanın epigenetik modifikasyonlar yoluyla hücresel kimliğin kurulmasına katkısı daha fazla takdir edildikçe, belirli hücre tiplerinde metabolitlerin katkısını tanımlamaya izin veren teknikler zamanında ve gereklidir.
Giriş
Langerhans'ın pankreas adacıkları, yaşam boyu glukoz toleransının yönetimi için kritik öneme sahiptir. Glikoz düşürücü hormon, insülin veya glikoz yükseltici hormon olan glukagon yoluyla kan şekeri seviyelerinin uygun şekilde ayarlanmaması, Diabetes Mellitus1 ile sonuçlanır. Diyabet riskini en aza indirmek için değiştirilebilir risk faktörleri arasında egzersiz ve diyet yer alır. Ek olarak, hamilelik sırasında anne diyetinin de yetişkinlikte yavruların diyabete duyarlılığı üzerinde bir etkisi olduğu ortaya çıkmaktadır 2,3. Bu nedenle, anne diye....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Adacık alımı, Oregon Ulusal Primat Araştırma Merkezi (ONPRC) ve Oregon Sağlık ve Bilim Üniversitesi'nin Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) yönergelerine uygun olarak gerçekleştirildi ve ONPRC IACUC tarafından onaylandı. ONPRC, Amerika Birleşik Devletleri Tarım Bakanlığı (USDA) tarafından uygulanan Hayvan Refahı Yasası ve Yönetmeliklerine ve İnsani Bakım ve Laboratuvar Kullanımına İlişkin Halk Sağlığı Hizmeti Politikasına uyar. Buradaki protokol, 145. gebelik gününde (Rhesus makak gebeliği tipik olarak 173-175 gündür) nekropsi yapılan fetal Rhesus makaklarından elde edilen adacıklara uygulanmıştır. Bu çalışma için kul....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Sıralama çıktılarının kalitesi büyük ölçüde nükleer girdinin kalitesine bağlıdır. Nükleer kanama ve dış nükleer zarın hasar görmesi, analizde ortam RNA ve DNA kontaminasyonuna neden olacak ve bu da verilerde gürültüye neden olacaktır. Saf bir nükleer ekstrakt, sitoplazmik bileşenlerle kapsüllenmiş çekirdekler (Şekil 2A) veya patlayan çekirdeklerle kanıtlanan aşırı sindirim (Şekil 2B) hakkında minimum kanıta sahip olacaktır. İdeal bir nükleer girdi, sağlam çekird.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Tarihsel olarak, tek çekirdekli RNA ve ATAC dizilimi için nükleer izolasyon yöntemleri, metabolit miktar tayini için kullanılan yaygın bir teknik olan sıvı kromatografi-kütle spektrometresi (LC-MS) ile uyumlu olmayan deterjanlar içeren tamponlar kullanmıştır16,17. Mevcut protokol, hücresel fraksiyonlama için nazik bir deterjan kullanarak ve bu fraksiyonlamayı takiben kılcal elektroforez ile aynı numune hazırlığından transkriptomi.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.
Teşekkürler
Yazarlar, Oregon Sağlık Bilimleri Üniversitesi'ndeki tüm ekibe, insan olmayan primat kolonisine baktıkları ve doku edinimi için teşekkür eder. Ek olarak, Vanderbilt Technologies for Advanced Genomics, teknik uzmanlık ve deneysel tasarım tavsiyesi sağladı. DTC, NIH / NIDK'den (1F31DK135164) bir F31 doktora öncesi bursu ile desteklenmiştir. PK, NIH/NIDDK (1R01DK128187) tarafından desteklenmiştir. MG, VA Başarı ödülü (I01 BX005399), NIH/NIDDK (1R01DK135032, 1R01DK128187) ve JDRF (2-SRA-2024-1455-SB) tarafından desteklenmiştir. Oregon Ulusal Primat Araştırma Merkezi'ndeki (ONPRC) çalışmalar, Merkezin operasyonel desteği için P51OD011092 t....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 33 G sıçan beyin kanülü enjektörü | Protech International | 8IC315IS5SPC | Kanal kanülasyonu ve pankreas şişirme için |
| Penisilin / Streptomisin | Fisher | 15-140-122 | RT ortamı için |
| FBS | Millipore / Sigma | F4135-500ML | RT ortamı için |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 11-875-135 | RT ortamı |
| için Kollajenaz P | Sigma Aldrich | 11213865001 | Pankreasın sindirimi için |
| Sığır Dnase I | Sigma Aldrich | 11284932001 | RT ortamı ve izolasyon için |
| Dekstroz | Fisher | D16-1 | Nihai konsantrasyon 2,8 mM olacaktır |
| Kalsiyum Klorür | Fisher | C4901-500G | Nihai konsantrasyon 0,5 mM olacaktır |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | Final konsantrasyon 10 mM olacaktır |
| Sığır Serum Albümini (BSA) Fraksiyon 5 | Araştırma Ürünleri Uluslararası | A30075100 | Nihai konsantrasyon 0.5 mg / mL olacaktır |
| Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı | Gibco | 11966025 | Adacıkları elle toplamak için |
| 20x Çekirdek Tamponu | 10X Genomik | 2000153/2000207 | |
| Digitonin (%5) | Thermo Fisher Scientific | BN2006 | Digitonin'in 65 ° C'ye ısıtılması gerekebilir; Beyaz çökeltiyi çözmek için C |
| MACS SmartStrainers (30 & mikro; M) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| MACS BSA Stok Çözeltisi (%10) | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| IGEPAL CA-630 | Sigma Aldrich | i8896 | MilliQ su kullanarak %10'luk bir stok hazırlayın |
| Trizma Hidroklorür Çözeltisi, pH 7.5 | Sigma Aldrich | T2319-1L | |
| Sodyum Klorür Çözeltisi, 5 M | Sigma Aldrich | S6546-1L | |
| Magnezyum Klorür Çözeltisi, 1 M | Sigma Aldrich | M1028-100mL | |
| Sigma Koruyucu Rnaz inhibitörü | Sigma Aldrich | 3335402001 | |
| DTT | Araştırma Ürünleri Uluslararası | D11000-5.0 | |
| Rnase İçermeyen Tek Kullanımlık Pelet Havaneli | Fisher Scientific | 12-141-368 | |
| Tween 20 | Fisher Biyoreaktifleri | BP337-500 | MilliQ su kullanarak %20'lik bir stok hazırlayın |
| Nükleaz İçermeyen Su | Promega | PR-P1193 | |
| DNA LoBind Tüpleri (5 mL) | Eppendorf | 30108310 | |
| Kriyoviyaller (1,5 mL) | VWR | 20170-225 | |
| Posi-Click Tüpler (0,6 mL) | Denville | C-2177 | |
| Tripan Mavisi (%0,4) | Thermo Fisher Scientific | T-10282 | |
| Çift Odacıklı Hücre Sayma Slaytları | Bio-Rad | 1450011 | |
| MiiliQ Ultra Saf Su Sistemi | Millipore/Sigma | 7003/05/10/15 | |
| 5 kDa kesme filtresi | HMT Metabolome Teknolojileri | ||
| İç Standartlar | HMT Metabolome Teknolojileri | ||
| P10, P20, P200 ve P1000 Pipetleri | Eppendorf | 2231000602 | |
| Pipet Uçları, 10 & L | VWR | 76322-528 | |
| Pipet Uçları, 1000 ve mikro; L | Thermo Fisher Scientific | 21-236-2A | |
| Pipet Uçları, 20 & L | Genesee Scientific | 23-404 | |
| Pipet Uçları, 200 & L | USA Scientific | 1120-8810 | |
| Faz Kontrast Mikroskobu | Olympus | BX41-PH-B | |
| Kontes II Otomatik Hücre Sayacı | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| DPBS (1x) | Gibco | 14190-144 | |
| Allegra X-30R Santrifüj | Beckman-Coulter | B06315 | |
| RNase-ZAP | Sigma Aldrich | R2020 |
Kaynaklar
- Christensen, A. A., Gannon, M. The beta cell in type 2 diabetes. Curr Diab Rep. 19 (9), 81(2019).
- Elsakr, J. M., Gannon, M. Developmental programming of the pancreatic islet by. Trends Dev Biol. 10, 79-95 (2017).
- Salzberg, L.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
