Bu protokol, aynı numunelerden metabolomik analizler için toplu sitozolik fraksiyonu korurken, tek çekirdekli eşzamanlı RNA dizilimi ve ATAC dizilemede kullanılmak üzere donmuş insan olmayan primat pankreas adacıklarından yüksek kaliteli çekirdekleri izole etme prosedürlerini açıklar.
Yöntem makalesi
Kombine Tek Çekirdekli RNA Dizileme ve ATAC-Dizileme ve Toplu Metabolomikler için Donmuş İnsan Olmayan Primat Fetal Adacıklarının Hazırlanması
Bu makalede
Özet
Özet
Birden fazla kohorttan toplanan dokuları kullanan çalışmalardaki bir zorluk, kombine tek hücreli RNA dizilimi ve metabolomik gibi büyük ölçekli multi-omik deneylere hazırlanırken toplu etkilerden kaçınmaktır. Bu çalışmadaki yöntem, tek çekirdekli RNA dizilimi ve ATAC dizileme deneylerine girdi için iki yıllık bir süre boyunca toplanan fetal insan olmayan primatlardan flaşla donmuş pankreas adacıklarını kullanır. Nükleer ekstraksiyon sırasında üretilen sitozolik fraksiyon, aşağı akış kılcal elektroforez-kütle spektrometresi ve müteakip metabolit miktar tayini için tutuldu. Bu yöntem, deneysel koşullar içinde değişen transkriptomik ve epigenomik manzaralara katkıda bulunan metabolitlerin toplu analizine izin verir. Birçok doku tipine uygulanabilir ve kolayca bulunamayan örneklerden çıkarılabilecek bilgi miktarını en üst düzeye çıkarır. Metabolizmanın epigenetik modifikasyonlar yoluyla hücresel kimliğin kurulmasına katkısı daha fazla takdir edildikçe, belirli hücre tiplerinde metabolitlerin katkısını tanımlamaya izin veren teknikler zamanında ve gereklidir.
Giriş
Langerhans'ın pankreas adacıkları, yaşam boyu glukoz toleransının yönetimi için kritik öneme sahiptir. Glikoz düşürücü hormon, insülin veya glikoz yükseltici hormon olan glukagon yoluyla kan şekeri seviyelerinin uygun şekilde ayarlanmaması, Diabetes Mellitus1 ile sonuçlanır. Diyabet riskini en aza indirmek için değiştirilebilir risk faktörleri arasında egzersiz ve diyet yer alır. Ek olarak, hamilelik sırasında anne diyetinin de yetişkinlikte yavruların diyabete duyarlılığı üzerinde bir etkisi olduğu ortaya çıkmaktadır 2,3. Bu nedenle, anne diyetinin ve hamilelik sırasında kullanılan ilaçlar gibi diğer maruziyetlerin, gelişim sırasında model organizmalarda insülin üreten beta hücreleri üzerindeki etkilerini analiz etmek için yöntemlere ihtiyaç vardır. Örneğin, fetal insan olmayan primat (NHP) yavrularından elde edilen adacıklar, gelişimsel maruziyetlerin etkileri açısından değerlendirilebilir. İnsanlara benzer şekilde, NHP'ler tipik olarak tekil doğumlara sahiptir ve Batı tarzı diyetle beslenmeye fizyolojik tepkilerinde farklılık gösterir4. NHP'lerin gebelik ve fetal gelişimi insanlarla birçok benzerliği paylaşırken, onları metabolik programlama çalışmaları için oldukça ilgili bir tür haline getirirken, NHP yavruları üzerinde karşılaştırmalı biyoinformatik tahliller yapmanın zorlukları arasında kısıtlı bir çiftleşme mevsimi ve aralıklı numune toplama yer alır. Bu nedenle, numune işleme ve analizinden önce uzun süreli depolamaya izin veren yaklaşımlar idealdir. Bu protokol, tek çekirdekli RNA dizilimi, ATAC dizilimi ve toplu sitoplazmik metabolomikler için numunelerin hazırlanmasını açıklar.
Adacık biyolojisi alanındaki diğer kişiler tarafından yapılan çalışmalar, tek hücreli RNA Dizilimi ve tek çekirdekli RNA dizilimi yoluyla hazırlanan örneklerde gözlemlenen genetik imzalarda örtüşme olduğunu göstermiştir 5,6. Her iki yöntem de adacık popülasyonu içindeki çeşitli hücre tipleri arasında ayırt edici özelliklere katkıda bulunan transkriptlerin tanımlanmasına izin verir. Flaşla donmuş doku üzerinde nazik deterjanların kullanılmasıyla, sağlam çekirdekler aynı anda ATAC dizilimi için kullanılabilir, bu da erişilebilir kromatin bölgelerinin belirlenmesine izin verir. Tek çekirdekli RNA diziliminin ATAC dizilimi ile birleştirilmesi, gen düzenleyici ağların daha iyi karakterizasyonuna izin verir7.
Metabolomikler için numunelerin hazırlanması, geleneksel olarak sıvı kromatografisi için yüksek numune hacmi girişine duyulan ihtiyaç ile sınırlandırılmıştır. Ek olarak, kütle spektrometrik verilerde yanlış NMR piklerini önlemek için numune hazırlama sırasında kullanılan tamponlara dikkatli bir şekilde dikkat edilmelidir. Primat çalışmalarında elde edilmesi zor ve maliyetli olan düşük örnek sayısı göz önüne alındığında, farklı yavrulardan adacıkların transkriptomik ve metabolomik deneylere tahsisi zor olabilir. Bu nedenle, bu protokol, tek çekirdekli deneyler için hücresel fraksiyonlama sırasında üretilen normal olarak atılan sitozolik fraksiyonu kullanır. Bu yöntem, adacıklar içinde üretilen metabolitleri kantitatif olarak ölçerken, fetal adacıklardaki hücresel alt kümeleri tanımlayan transkriptlerin ve açık kromatin bölgelerinin eşzamanlı karakterizasyonuna izin verir (Şekil 1). Bu protokol, flaş donmuş embriyonik fare beyin dokusundan çekirdeklerin izolasyonu için 10x genomics tarafından yayınlanan gösterilmiş bir protokolden uyarlanmıştır (sürüm CG000366 Rev D8)7.
Protokol
Adacık alımı, Oregon Ulusal Primat Araştırma Merkezi (ONPRC) ve Oregon Sağlık ve Bilim Üniversitesi'nin Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) yönergelerine uygun olarak gerçekleştirildi ve ONPRC IACUC tarafından onaylandı. ONPRC, Amerika Birleşik Devletleri Tarım Bakanlığı (USDA) tarafından uygulanan Hayvan Refahı Yasası ve Yönetmeliklerine ve İnsani Bakım ve Laboratuvar Kullanımına İlişkin Halk Sağlığı Hizmeti Politikasına uyar. Buradaki protokol, 145. gebelik gününde (Rhesus makak gebeliği tipik olarak 173-175 gündür) nekropsi yapılan fetal Rhesus makaklarından elde edilen adacıklara uygulanmıştır. Bu çalışma için kullanılan reaktiflerin ve ekipmanın detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.
1. Adacık izolasyonu
- Fetal pankreamayı çevre dokulardan9 kesin ve buz gibi soğuk fosfat tamponlu tuzlu su içine yerleştirin.
- Pankreası PBS'den çıkarın ve 33 G kemirgen beyin kanülü enjektörü kullanarak pankreas kanalının kanülasyonu yoluyla kollajenaz P (0.6 mg / mL) ile şişirin.
- Pankreası steril cerrahi makasla altı bölüme ayırın ve kollajenaz solüsyonunda 37 °C'de 27-30 dakika sindirin.
- % 10 FBS ve 100 U / mL penisilin / streptomisin'i RPMI 1640'a birleştirerek RT ortamını hazırlayın.
- Kollajenazı dökün ve 10 mL RT ortamı ekleyin.
- Kalan bağ dokusunu bozmak için 1 dakika hafifçe çalkalayın.
- Sindirilmemiş materyali 500 μm'lik bir filtreden süzerek çıkarın.
- Adacıkları 50 mL RT ortamı ile iki kez yıkayın.
- Adacıkları sığır DNaz I'de (0.8 U/mL) 37 °C'lik bir su banyosunda 10 dakika inkübe edin.
- Adacıkları gece boyunca RT ortamında sığır DNaz I (0.4 U/mL) ile 37 ° C'de% 5 CO2 ile kültürleyin.
- Adacıkları, sıcaklık kontrollü jel paketleri ile ortam sıcaklığında özel ambalajlarda gönderin.
2. Uzun süreli depolama için örnek bankacılık
- Ölçekli bir retikül kullanarak adacıkları boyut açısından değerlendirin ve hazırlıktaki asiner ve duktal doku derecesini not edin.
- Otomatik bir pipet ile 5 mL 2,8 mM glikoz DMEM içeren 60 mm'lik bir tabağa adacıkları elle seçin.
NOT: Son adacık hazırlığında depolanacak asiner doku ve duktal doku miktarını en aza indirmek zorunludur. Kullanım için ideal adacıkların detayları önceki bir protokol9'da rapor edilmiştir. - Adacıkları 1.5 mL'lik bir tüpe toplayın ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca ~ 300 x g'da döndürün.
- Adacıkları kalsiyum ve magnezyum içermeyen 1x PBS'de yeniden askıya aldı.
- 4 ° C'de ~ 300 x g'de 5 dakika döndürün. Süpernatanı atın.
- 2.3-2.5 adımlarını iki kez daha tekrarlayın.
- Flaş adacıkları 1.5 mL'lik bir tüpte 10 saniye boyunca sıvı nitrojen içinde dondurun.
- Peletleri nükleer izolasyon gününe kadar -80 °C'de saklayın.
3. Çekirdek ve sitoplazmik fraksiyonun izolasyonu için hücresel fraksiyonlama
- Çekirdek ekstraksiyonu için tamponların hazırlanması (Tablo 1).
- Tezgahın, pipetlerin ve reaktiflerin RNaz içermediğinden emin olun.
- Yıkama, konsantre lizis, lizis seyreltme ve seyreltilmiş çekirdek tamponlarını Tablo 1'e göre hazırlayın.
- Konsantre lizis tamponunu seyreltmek için lizis seyreltme tamponunu kullanarak 5 mL'lik bir tüpte 0.1x lizis tamponu hazırlayın.
- Doku homojenizasyonu
- Numuneleri -80 °C dondurucudan çıkarın ve hemen buzun üzerine koyun.
- Doku peletlerine 500 μL 0.1x lizis tamponu ekleyin ve buz üzerinde 3 dakika inkübe edin.
- Tek kullanımlık RNaz içermeyen bir pelet tokmağı kullanarak, dokuyu buz üzerinde 15 kez nazikçe homojenize edin.
- Numuneleri buz üzerinde 10 dakika inkübe edin.
- Homojenata 500 μL yıkama tamponu ekleyin ve buz üzerine nazikçe pipetleyin.
- 5 mL'lik bir tüp üzerine filtreye 300 mL yıkama tamponu ekleyerek 30 μm'lik bir ön ayırma filtresini astarlayın.
- 30 μM ön ayırma filtresini kullanarak 1 mL hücresel homojenatı 5 mL'lik tüpe süzün.
- Filtrelenmiş homojenatı 500 x g'da 5 dakika boyunca sallanan bir kova santrifüjünde 4 °C'de döndürün.
- Metabolomikler için süpernatantın toplanması ve depolanması
- Bir pipet ile adım 3.2.8'den 1 mL süpernatanı çıkarın ve buz üzerinde 1.5 mL'lik bir kriyoviyal ekleyin.
- Süpernatanı hemen -80 °C'de dondurun. Bu süpernatant metabolomikler için kullanılacaktır.
- Tek çekirdekli RNA ve ATAC dizilimi için çekirdeklerin hazırlanması
- Peletin üzerine damla damla 1 mL yıkama tamponu ekleyerek çekirdek peletini nazikçe yeniden süspanse edin. Yavaşça 5 kez pipetleyin.
- Yıkanmış peleti 1000 °C'de sallanan bir kova santrifüjünde 5 dakika boyunca 4 x g'da döndürün.
- 3.4.1 ve 3.4.2 adımlarını bir kez daha tekrarlayın.
- Son yıkamadan sonra, çekirdekleri 1 mL yıkama tamponunda tekrar süspanse edin. Nükleer hazırlığı buz üzerinde tutun.
- 10 μL çekirdek süspansiyonunu bir pipetle aspire edin ve hafifçe pipetleyerek 10 μL %0,4 Tripan mavisi ile karıştırın.
- 10 μL çekirdek ve Tripan mavisi karışımını bir pipet ile otomatik bir hücre sayacına kaydırın ve cihaza yerleştirin.
- Çekirdek/μL'deki çekirdek konsantrasyonunu belirleyin.
NOT: Tek hücreli RNA dizilimi için hücresel preparatların aksine, otomatik hücre sayaçları çekirdekleri ölü hücreler olarak algılayacaktır. Bu hazırlığın %95'inden fazlası otomatik hücre sayaçlarında canlı olmamalıdır. Nükleer popülasyonun %5'inden fazlası canlıysa, çekirdek süspansiyonu 30 μm ön ayırma filtresinden ek bir süre süzülebilir ve 4 °C'de 1000 x g'da 5 dakika döndürülebilir. Çekirdek konsantrasyonu daha sonra adım 3.4.6'da belirtildiği gibi yeniden hesaplanabilir. - İstenen hedeflenen çekirdek geri kazanımına bağlı olarak, 1x çekirdek tamponu kullanarak çekirdekleri gerekli konsantrasyona yeniden süspanse edin ve tek çekirdekli RNA ve ATAC dizileme kitaplığı hazırlığınadevam edin 10.
4. Kapiler elektroforez-kütle spektrometresi (CE-MS) için sitozolik fraksiyonun hazırlanması
- Adım 3.3.1'de toplanan 80 μL sitozolik fraksiyonu, içselleştirilmiş standartlar içeren 20 μL nano saf su ile birleştirin.
- CE-MS ile devam edin ve daha önce açıklandığı gibianaliz yapın 11,12,13.
Sonuçlar
Sıralama çıktılarının kalitesi büyük ölçüde nükleer girdinin kalitesine bağlıdır. Nükleer kanama ve dış nükleer zarın hasar görmesi, analizde ortam RNA ve DNA kontaminasyonuna neden olacak ve bu da verilerde gürültüye neden olacaktır. Saf bir nükleer ekstrakt, sitoplazmik bileşenlerle kapsüllenmiş çekirdekler (Şekil 2A) veya patlayan çekirdeklerle kanıtlanan aşırı sindirim (Şekil 2B) hakkında minimum kanıta sahip olacaktır. İdeal bir nükleer girdi, sağlam çekirdekler içerecektir (Şekil 2C).
Tek çekirdekli RNA ve ATAC dizileme verilerinin analizinin ayrıntıları, başka bir yerde kapsamlı bir şekilde sağlanmaktadır 5,14. Bir fetal NHP nükleer preparatından hücresel popülasyonların temsili kümeleri, Şekil 3A'da UMAP aracılığıyla gösterilmektedir. Metabolomik veriler, daha önce açıklandığı gibi açık kaynaklı yazılım kullanılarak kolayca analiz edilir15. Oluşturulan spektrumlar görselleştirilebilir ve WSD ile beslenen bir barajdan alınan bir fetüsün adacıklarındaki zenginleştirilmiş metabolitler, CD ile beslenen bir barajdakilerle karşılaştırılabilir (Şekil 3B-F).
Şekil 1: Çekirdek ve sitozolik fraksiyonun izolasyonu için protokole genel bakış. Fetal pankreas adacıkları bankaya yatırıldı ve test gününe kadar -80 °C'de saklandı. Çekirdekler izole edildi ve tek çekirdekli RNA ve ATAC dizilimi için kullanıldı. Çekirdek izolasyonunun ilk yıkamasını takiben sitozolik fraksiyon, kılcal elektroforez-kütle spektrometresi için tutuldu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Tek çekirdekli multiomik teste uygun çekirdek girişinin gösterilmesi. (A) Sitoplazma ile kapsüllenmiş çekirdek, (B) Riskli nükleer zara sahip patlayan çekirdek ve (C) Yuvarlak morfolojiye sahip sağlam çekirdek örnekleri. Ölçek çubukları: 10 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Kombine tek çekirdekli multiomik ve toplu metabolomiklerden elde edilen temsili veriler. (Bir) Gen ekspresyonuna dayalı olarak izole fetal NHP adacıkları içinde hücresel alt tiplerin UMAP kümelenmesi. Baraj bir WSD (mWSD) veya bir CD (mCD) ile beslendiğinde izole edilmiş fetal NHP adacıklarından sitozolik fraksiyondaki glikolitik metabolitlerin, (B) Dihidroksiaseton fosfat ve (C) Gliserol-3-fosfatın kantitatif tahmini. Maternal diyet ayrıca (D) sitrik asit döngüsü (2-oksoglutarat), (E) amino asit metabolizması (kreatin) yoluyla ve fetal adacıklarda (F) hücresel redoks durumunu (glutatyon) değiştirerek metabolizmayı farklı şekilde düzenleyebilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 1: Çekirdeklerin izolasyonu için tampon formülasyonları. Çekirdek, lizis, lizis seyreltme ve yıkama tamponlarının ayrıntılı bileşenleri gösterilmiştir. Gerekirse, tamponu hazırlamadan önce reaktifleri stok konsantrasyonuna seyreltin. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Tartışma
Tarihsel olarak, tek çekirdekli RNA ve ATAC dizilimi için nükleer izolasyon yöntemleri, metabolit miktar tayini için kullanılan yaygın bir teknik olan sıvı kromatografi-kütle spektrometresi (LC-MS) ile uyumlu olmayan deterjanlar içeren tamponlar kullanmıştır16,17. Mevcut protokol, hücresel fraksiyonlama için nazik bir deterjan kullanarak ve bu fraksiyonlamayı takiben kılcal elektroforez ile aynı numune hazırlığından transkriptomik ve metabolomik tekniklerin kombinasyonuna izin verir ve bu, metabolitlerin ayrılması için sıvı kromatografisine göre daha küçük bir numune girişi gerektiren bir teknik olan kapiler elektroforez ile18.
Bu protokolün en kritik yönü, genetik materyalin bozulmasını önlemek ve ortam nükleotidleri ve makromoleküller tarafından kontaminasyonu azaltmak için nükleer izolasyon sırasında nükleer zarın korunmasıdır. Numunenin lizis tamponuna maruz kalma süreleri, dokuların aşırı sindirimini ve çekirdek hasarını önlemek için modüle edilebilir. Ek olarak, genetik materyal ve metabolitlerin bozulmasını önlemek için numune bankacılığı sırasında adacıkların ve sitozolik fraksiyonu içeren süpernatantın hızlı bir şekilde dondurulması zorunludur. Kültür ortamındaki besin mevcudiyeti nedeniyle değişen metabolizmanın karıştırıcı etkisinden kaçınmak için tüm numuneler aynı ortam formülasyonundan (bu çalışmada 2.8 mM glikoz DMEM) toplanmalıdır.
Bu kombine metabolomik yaklaşımın bir sınırlaması, çekirdek izolasyonu için kullanılan deterjan nedeniyle bazı metabolitlerin yakalanamamasıdır. Bu nedenle, daha eksiksiz bir metabolit analizi için bu yaklaşım, donmuş dokulardan elde edilen analizler ve organik olmayan yıkama tamponları ve LC-MS kullanılarak metabolitlerin izole edilmesiyle tamamlanabilir. Önerilen bir ek yaklaşım, organlardaki metabolik değişiklikleri lokalize etmek için MALDI-MS yoluyla hedeflenen mekansal metabolomiktir19. Ek olarak, aynı çekirdek içindeki transkript değişkenliğini ve kromatin erişilebilirliğini değerlendirmek için mevcut teknolojiler, ATAC dizilemesi için sığ dizileme derinliği nedeniyle sınırlıdır. Veri analizlerinde, araştırmacılar veri seti içindeki belirli alt kümeler yerine yalnızca geniş hücresel kümeler içindeki açık kromatin bölgelerini değerlendirebileceklerdir.
Kolayca bulunamayan dokuların, özellikle insanlardan ve insan olmayan primatlardan elde edilen dokuların kullanımı daha sık hale geldikçe, biyolojik bir kopyadan çıkarılabilecek bilgi miktarını en üst düzeye çıkarmak zorunludur. Yukarıda açıklanan multi-omik yaklaşım, araştırmacıların genetik imzaları hücresel kimliğin temel promotorları etrafındaki en yüksek kullanılabilirlik ile ilişkilendirmelerine izin verirken, aynı zamanda hücresel metabolizmanın bu tür değişikliklere nasıl katkıda bulunmuş olabileceğini de göz önünde bulundurur. Hücresel preparatlar içinde daha bol bulunan metabolitlerin tanımlanması, hücresel alt tiplerin spesifikasyonunu belirli bir soya yönlendirecek spesifik epigenetik modifikasyonlara dair ipuçları verecektir. Gerçekten de, farklı doku kaynaklarından da olsa, transkriptomik ve metabolomik deneylerin bulgularını entegre etmek için yeni protokoller oluşturulmuştur20. Bu protokolün önemi, kromatin erişilebilirliğinin, transkripsiyonel değişikliklerin ve metabolit zenginleştirmesinin tek bir numune girdisinden değerlendirilebilmesidir. Bu tekniğin gelecekteki uygulamaları, nadir hastalıkları olan hastalardan alınan dokular gibi seyrek örnek popülasyonlarından elde edilen dokularda hastalık durumlarının daha iyi karakterizasyonuna izin verecektir. Adacık biyolojisi alanında, gen düzenleyici ağların karakterizasyonu ve korelasyon gösteren metabolik imzalar, diyabetin başlamasını önlemek için beta hücre kimliğini ve işlevini koruma mekanizmaları hakkında kritik bilgiler sağlayabilir.
Açıklamalar
Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.
Teşekkürler
Yazarlar, Oregon Sağlık Bilimleri Üniversitesi'ndeki tüm ekibe, insan olmayan primat kolonisine baktıkları ve doku edinimi için teşekkür eder. Ek olarak, Vanderbilt Technologies for Advanced Genomics, teknik uzmanlık ve deneysel tasarım tavsiyesi sağladı. DTC, NIH / NIDK'den (1F31DK135164) bir F31 doktora öncesi bursu ile desteklenmiştir. PK, NIH/NIDDK (1R01DK128187) tarafından desteklenmiştir. MG, VA Başarı ödülü (I01 BX005399), NIH/NIDDK (1R01DK135032, 1R01DK128187) ve JDRF (2-SRA-2024-1455-SB) tarafından desteklenmiştir. Oregon Ulusal Primat Araştırma Merkezi'ndeki (ONPRC) çalışmalar, Merkezin operasyonel desteği için P51OD011092 tarafından desteklendi.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 33 G sıçan beyin kanülü enjektörü | Protech International | 8IC315IS5SPC | Kanal kanülasyonu ve pankreas şişirme için |
| Penisilin / Streptomisin | Fisher | 15-140-122 | RT ortamı için |
| FBS | Millipore / Sigma | F4135-500ML | RT ortamı için |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 11-875-135 | RT ortamı |
| için Kollajenaz P | Sigma Aldrich | 11213865001 | Pankreasın sindirimi için |
| Sığır Dnase I | Sigma Aldrich | 11284932001 | RT ortamı ve izolasyon için |
| Dekstroz | Fisher | D16-1 | Nihai konsantrasyon 2,8 mM olacaktır |
| Kalsiyum Klorür | Fisher | C4901-500G | Nihai konsantrasyon 0,5 mM olacaktır |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | Final konsantrasyon 10 mM olacaktır |
| Sığır Serum Albümini (BSA) Fraksiyon 5 | Araştırma Ürünleri Uluslararası | A30075100 | Nihai konsantrasyon 0.5 mg / mL olacaktır |
| Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı | Gibco | 11966025 | Adacıkları elle toplamak için |
| 20x Çekirdek Tamponu | 10X Genomik | 2000153/2000207 | |
| Digitonin (%5) | Thermo Fisher Scientific | BN2006 | Digitonin'in 65 ° C'ye ısıtılması gerekebilir; Beyaz çökeltiyi çözmek için C |
| MACS SmartStrainers (30 & mikro; M) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| MACS BSA Stok Çözeltisi (%10) | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| IGEPAL CA-630 | Sigma Aldrich | i8896 | MilliQ su kullanarak %10'luk bir stok hazırlayın |
| Trizma Hidroklorür Çözeltisi, pH 7.5 | Sigma Aldrich | T2319-1L | |
| Sodyum Klorür Çözeltisi, 5 M | Sigma Aldrich | S6546-1L | |
| Magnezyum Klorür Çözeltisi, 1 M | Sigma Aldrich | M1028-100mL | |
| Sigma Koruyucu Rnaz inhibitörü | Sigma Aldrich | 3335402001 | |
| DTT | Araştırma Ürünleri Uluslararası | D11000-5.0 | |
| Rnase İçermeyen Tek Kullanımlık Pelet Havaneli | Fisher Scientific | 12-141-368 | |
| Tween 20 | Fisher Biyoreaktifleri | BP337-500 | MilliQ su kullanarak %20'lik bir stok hazırlayın |
| Nükleaz İçermeyen Su | Promega | PR-P1193 | |
| DNA LoBind Tüpleri (5 mL) | Eppendorf | 30108310 | |
| Kriyoviyaller (1,5 mL) | VWR | 20170-225 | |
| Posi-Click Tüpler (0,6 mL) | Denville | C-2177 | |
| Tripan Mavisi (%0,4) | Thermo Fisher Scientific | T-10282 | |
| Çift Odacıklı Hücre Sayma Slaytları | Bio-Rad | 1450011 | |
| MiiliQ Ultra Saf Su Sistemi | Millipore/Sigma | 7003/05/10/15 | |
| 5 kDa kesme filtresi | HMT Metabolome Teknolojileri | ||
| İç Standartlar | HMT Metabolome Teknolojileri | ||
| P10, P20, P200 ve P1000 Pipetleri | Eppendorf | 2231000602 | |
| Pipet Uçları, 10 & L | VWR | 76322-528 | |
| Pipet Uçları, 1000 ve mikro; L | Thermo Fisher Scientific | 21-236-2A | |
| Pipet Uçları, 20 & L | Genesee Scientific | 23-404 | |
| Pipet Uçları, 200 & L | USA Scientific | 1120-8810 | |
| Faz Kontrast Mikroskobu | Olympus | BX41-PH-B | |
| Kontes II Otomatik Hücre Sayacı | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| DPBS (1x) | Gibco | 14190-144 | |
| Allegra X-30R Santrifüj | Beckman-Coulter | B06315 | |
| RNase-ZAP | Sigma Aldrich | R2020 |
Kaynaklar
- Christensen, A. A., Gannon, M. The beta cell in type 2 diabetes. Curr Diab Rep. 19 (9), 81(2019).
- Elsakr, J. M., Gannon, M. Developmental programming of the pancreatic islet by. Trends Dev Biol. 10, 79-95 (2017).
- Salzberg, L. Risk factors and lifestyle interventions. Prim Care. 49 (2), 201-212 (2022).
- Pound, L. D., Kievit, P., Grove, K. L. The non-human primate as a model for type 2 diabetes. Curr Opin Endocrinol Diabetes Obes. 21 (2), 89-94 (2014).
- Kang, R. B., et al. Single-nucleus RNA sequencing of human pancreatic islets identifies novel gene sets and distinguishes β-cell subpopulations with dynamic transcriptome profiles. Genome Med. 15 (1), 30(2023).
- Basile, G., et al. Using single-nucleus RNA-sequencing to interrogate transcriptomic profiles of archived human pancreatic islets. Genome Med. 13 (1), 128(2021).
- Cabé, C. M., et al. High-quality brain and bone marrow nuclei preparation for single nuclei multiome assays. J Vis Exp. (202), e65715(2023).
- Nuclei from embryonic mouse brain for single cell multiome ATAC + gex sequencing. , Available from: https://www.10xgenomics.com (2022).
- Elsakr, J. M., Deeter, C., Ricciardi, V., Gannon, M. Analysis of non-human primate pancreatic islet oxygen consumption. J Vis Exp. (154), e60696(2019).
- Chromium next gem single cell multiome ATAC + gene expression reagent kits user guide. , Available from: https://www.10xgenomics.com (2022).
- Maruyama, A., et al. Extraction of aqueous metabolites from cultured adherent cells for metabolomic analysis by capillary electrophoresis-mass spectrometry. J Vis Exp. (148), e59551(2019).
- Ooga, T., et al. Metabolomic anatomy of an animal model revealing homeostatic imbalances in dyslipidaemia. Mol Biosyst. 7 (4), 1217-1223 (2011).
- Ohashi, Y., et al. Depiction of metabolome changes in histidine-starved Escherichia coli by CE-TOFMS. Mol Biosyst. 4 (2), 135-147 (2008).
- Chiou, J., et al. Single-cell chromatin accessibility identifies pancreatic islet cell type– and state-specific regulatory programs of diabetes risk. Nat Genetics. 53 (4), 455-466 (2021).
- Pang, Z., et al. Metaboanalyst 6.0: Towards a unified platform for metabolomics data processing, analysis and interpretation. Nucleic Acids Res. , 253(2024).
- Willency, J. A., Lin, Y., Pirro, V. Targeted metabolomics in human and animal biofluids and tissues using liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry. STAR Protoc. 5 (1), 102884(2024).
- Behnke, J. -S., Urner, L. H. Emergence of mass spectrometry detergents for membrane proteomics. Anal Bioanal Chem. 415 (18), 3897-3909 (2023).
- Ouimet, C. M., D'amico, C. I., Kennedy, R. T. Advances in capillary electrophoresis and the implications for drug discovery. Expert Opin Drug Discov. 12 (2), 213-224 (2017).
- Alexandrov, T. Spatial metabolomics and imaging mass spectrometry in the age of artificial intelligence. Annu Rev Biomed Data Sci. 3, 61-87 (2020).
- Ewald, J. D., et al. Web-based multi-omics integration using the analyst software suite. Nat Protoc. 19, 1467-1497 (2024).
Yeniden basım ve izinler
