Yöntem makalesi

Glioblastomun Lazer İnterstisyel Termal Tedavisi için İmmünkompetan Bir Murin Modeli

1.4K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/67381

⸱

15 Kasım 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Human Anatomy and Cell Sciences, University of Manitoba, 2Department of Pathology, University of Manitoba, 3Department of Medical Microbiology & Infectious Diseases, University of Manitoba, 4CancerCare Manitoba

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Glioblastom, primer beyin kanserinin yıkıcı bir şeklidir ve lazer interstisyel termal terapi, ameliyat edilemeyen glioblastom için geleneksel cerrahi rezeksiyona umut verici bir alternatif olarak ortaya çıkmaktadır. Bu protokol, tedavi etkilerini veya adjuvan ve kombinatoryal tedavileri incelemek için kullanılabilecek optimize edilmiş bir klinik öncesi fare modelini tanımlar.

Özet

Primer beyin kanserinin en agresif formu olan glioblastoma (GB), yetişkinlerdeki tüm yüksek dereceli primer beyin tümörlerinin yaklaşık yarısını oluşturur ve tedavisi yoktur. Lazer interstisyel termal tedavi (LITT), GB için Gıda ve İlaç Dairesi (FDA) onaylı bir tedavidir ve konvansiyonel cerrahi rezeksiyon için aday olmayan hastalarda kullanılır. LITT'nin klinik etkinliği belirlenmiş olsa da, klinik vaka çalışmaları ve vaka serilerinin ötesindeki araştırmalar sınırlıdır ve yerleşik bir hayvan modelinin olmaması nedeniyle engellenmektedir. Bu protokol, insan GB'sini yakından özetlemek için C57BL / 6 fareleri ve sinjeneik CT2A glioma kanser hücre hattını kullanır ve aynı zamanda 1064 nm Neodimyum katkılı İtriyum Alüminyum Garnet (Nd: YAG) lazer, örneğin iki FDA onaylı LITT sisteminden birinde kullanılır ve mükemmel klinik öncesi alaka düzeyi sağlar. Bu LITT fare modelinin başarılı bir şekilde kurulması, LITT ablasyonunun benzersiz özelliklerini ve tümör mikroçevresi üzerindeki etkilerini araştırmak için değerli bir platform sağlayacak ve potansiyel olarak gelişmiş terapötik stratejilere yol açacaktır.

Giriş

Kanser, Kanada'da bir numaralı önde gelen ölüm nedenidir. Agresif beyin tümörünün en yaygın formu olan glioblastoma (GB), yetişkinlerde tüm yüksek dereceli primer beyin tümörlerinin %48 ila %60'ını oluşturur1. GB için prognoz, cerrahi rezeksiyon, kemo- ve radyoterapidahil olmak üzere geleneksel tedavilerle 5 yıllık net sağkalım% 4.8 ile özellikle acımasızdır 1,2.

Lazer İnterstisyel Termal Terapi (LITT), ameliyat edilemeyen beyin tümörleri olan hastalarda hipertermik in-situ tümör ablasyonu için lazer kullanan FDA onaylı bir prosedürdür ve geleneksel cerrahi rezeksiyon3'e çekici bir terapötik alternatif sağlar. Bununla birlikte, GB'nin LITT tedavisi için ayrıntılı ve iyi karakterize edilmiş bir fare modeli eksiktir ve bu da klinik öncesi araştırmaları engellemektedir.

Bu protokol, LITT ile GB tedavisi için optimize edilmiş bir klinik öncesi fare modelini sergilemeyi amaçlamaktadır. Bu model için C57BL / 6 farelerini ve sinjeneik glioma hücre hattı CT2A'yı kullanmayı seçtik, çünkü CT2A, benzer histolojik özelliklere, invazivliğe, kemo- ve radyo-rezistansa ve kök benzeri özelliklere sahip insan yüksek dereceli GB'yi yakından özetler ve kendini yenileme ve tümörlerin yeniden kurulması ile4. Bu özellikler, bağışıklık tepkilerini veya yeni terapötik stratejileri içeren çeşitli çalışmalar için mükemmel bir platform sağlar. Ayrıca, bu LITT protokolünün teknik yönleri, daha fazla tartışılacak olan diğer allo- ve ksenogreft murin modelleri 4,5,6 için de kolayca uyarlanabilir.

Bu protokolün avantajları, basit ama etkili bir LITT tedavi paradigması ile tutarlı sonuçlar içerir. Kullanılan 1064 nm Neodimyum katkılı İtriyum Alüminyum Garnet (Nd: YAG) lazer, şu anda FDA onaylı iki sistemden birinde klinik olarak kullanılanla aynıdır ve yüksek dereceli glioma tedavisi için LITT'nin klinik uygulamasına yakından paralel deneylere izin verir. Bu protokolün birincil dezavantajı, tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için hem tümör hücresi implantasyonu hem de LITT tedavisi sırasında alınması gereken aşırı özendir. Ek olarak, CT2A hücre hattının agresif doğası nedeniyle, protokol zamana oldukça duyarlıdır. Çoğu deneyin en fazla 20 gün içinde sonuçlandırılması gerekecektir, bu da bazı adaptif bağışıklık tepkilerinin veya daha uzun bir süre boyunca meydana gelen diğer hücresel ve moleküler mekanizmaların araştırılmasını sınırlayabilir.

Protokol

Bu protokol için hayvan etiği, Kanada Hayvan Bakımı Konseyi (CCAC) tarafından belirlenen etik yönergelere uygun olarak Manitoba Üniversitesi Hayvan Bakım Komitesi tarafından onaylanmıştır. Bu protokol, histolojik analiz, immünolojik değişiklikler veya kombinatoryal terapötik müdahalelere odaklanan deneyler dahil olmak üzere geniş bir uygulama yelpazesine sahip klinik öncesi bir model için 8-12 haftalık C57BL / 6 immünokompetan fareler ve sinjeneik glioma hücre hattı CT2A kullandı. Protokol, deneysel gereksinimlere bağlı olarak diğer fare türlerine veya hücre hatlarına kolayca uyarlanabilir.

figure-protocol-1
Şekil 1: Temel deney tasarımının grafik şeması. Şununla oluşturuldu BioRender.com Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

1. Kısaca hücre hazırlığı (Gün 0)

  1. Hücre kültürüne başlamadan önce, kabinin ve gerekli tüm pipetlerin UV ve etanol ile tamamen sterilize edildiğinden emin olun.
  2. DMEM / F12'yi bir su banyosu kullanarak% 10 FBS ortamı, fosfat tamponlu salin (PBS) ve tripsin ile oda sıcaklığına (RT) ısıtın.
  3. Ortamı T25 şişesinden pipetleyin ve hücreleri PBS ile kısa bir süre durulayın. Hücrelere 1 mL tripsin ekleyin ve hücreler şişeden ayrılana kadar 30-60 s inkübe edin.
  4. Ayrılan hücreleri bir ışık mikroskobu altında onaylayın ve tripsin enzimatik aktivitesini durdurmak için 4 mL ortam ekleyin.
  5. Otomatik bir hücre sayacı kullanarak hücreleri sayın.
    1. 10 μL hücre süspansiyonunu 10 μL tripan mavisi ile karıştırın, ardından hücre sayma slaydına 10 μL ekleyin.
    2. Slaytı hücre sayma makinesine yerleştirin ve toplam hücre sayısını, canlı hücre sayısını ve canlı hücrelerin yüzdesini kaydedin.

NOT: Otomatik bir hücre sayma makinesi mevcut değilse, bir hemositometre kullanılarak manuel sayım yapılabilir.

  1. Planlanan tüm enjeksiyonlar için gerekli hücreleri hesaplayın.
    NOT: CT2A için, enjekte edilen hacimde 1.5 μL başına 5000 hücre ve her preparat için minimum 100 μL toplam hacim önerilir.
  2. Hücreleri pelet yapmak ve mümkün olduğunca fazla ortamı aspire etmek için hücreleri 5 dakika boyunca 134 x g'da döndürün.
  3. Bir mikrosantrifüj tüpünde ihtiyaç duyulan hacim için PBS'de %5 bazal membran özütü ile hücre peletini yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunu hazırlamak için daha küçük tüpler en uygun olsa da, hücrelerin daha yuvarlak tabana topaklanma ve hafif bir fiske ile kolayca yeniden dağılma olasılığı daha düşük olduğundan, 2 mL'lik bir tüp ameliyat sırasında depolama için daha iyidir.
  4. Hücreleri enjeksiyon için buz üzerinde tutun, gerektiğinde her 4-5 saatte bir taze hücre süspansiyonları hazırlayın.

2. Ortotopik implantasyon (Gün 0)

  1. Cerrahi alanı hazırlayın ve gerekli tüm aletlerin steril ve kullanıma hazır olduğundan emin olun.
  2. Solunum hızını izlerken (hedef 60 bpm) bir odada izofluran (1 L / dak O2'de %3 buharlaştırılmış) kullanarak fareyi uyuşturun.
  3. İlaç dozu için hayvan ağırlığını elde edin ve kaydedin.
  4. Gözleri, kulakları ve bıyıkları önlemek için cerrahi bölgeyi dikkatlice tıraş edin.
  5. Hayvanı stereotaktik bir çerçeveye aktarın.
    1. Kesici dişleri ısırma çubuğunun deliğine yerleştirin ve sabitlemek için tutma vidasını sıkarak nosekonu tam oturana kadar ayarlayın.
    2. Anestezi derinliğini iki taraflı arka bacak ayak parmaklarıyla kontrol edin ve uygunsa kafatasını kulak iğneleri kullanarak sabitleyin ve hayvanın kafasını nötr, düz düzlem pozisyonuna ayarlayın.
    3. Yağlanmış bir rektal sıcaklık probu kullanarak hayvan çekirdek sıcaklıklarını izleyin ve bir vücut altı ısıtma yastığı kullanarak 37 ° C'de ek ısıtma sağlayın.
      DİKKAT: Burun kemiği üzerindeki hafif basınç bile solunum durmasına neden olabileceğinden, burun konisini aşırı sıkmamaya dikkat edin. Elektrikli bir ısıtma yastığı kullanılıyorsa (örneğin, bir teraryum için bir ısıtma yastığı), sıcaklık ayarlarının doğru olduğundan ve ayarlanan sıcaklığın sabit kaldığından emin olun.
  6. Kurumayı önlemek için her iki göze de bolca oftalmik merhem sürün.
  7. Profilaktik enjeksiyonları uygulayın ve anestezik derinliği kontrol edin.
    1. 28 G x 1/2 "şırınga kullanarak yerel hayvan tesisi yönergelerine göre (örneğin, 5.0 mg / kg meloksikam) deri altı (sc) meloksikam veya diğer uzun etkili ağrı kesici ilaçları enjekte edin.
    2. Daha uzun prosedürler sırasında profilaktik sıvı desteği için 20 mg / kg sc önceden ısıtılmış normal salin enjeksiyonu uygulayın.
    3. Hedef solunum hızını korumak için anestezik% 1.5 -% 2.0 izoflurana düşürün.
  8. Aseptik bir teknik kullanarak hayvanı örtün ve cerrahi alanı hazırlayın.
    1. Steril bir pamuklu çubuk kullanarak povidon-iyot veya klorheksidin dezenfekte edici solüsyon uygulayın. Kesi bölgesinde medial olarak başlayarak ve her geçişten sonra swabı döndürerek dışa doğru çalışın, ardından taze steril bir pamuklu çubuk kullanarak bölgeye benzer şekilde% 70 etanol uygulayın.
    2. İyot ve ardından p etanol ile fırçalamayı iki kez daha tekrarlayın (her biri toplam 3 kez).
  9. Cerrahi maruziyete devam etmeden önce anestezik derinliği tekrar kontrol edin. İşlem boyunca solunum hızını yakından izleyin ve anesteziyi gerektiği gibi ayarlayın.
  10. Orta hattan başlayarak ve gözlerin biraz arkasında, #15 bıçaklı bir neşter kullanarak kaudal yönde 1-1,5 cm'lik bir orta sagital kesi yapın. Alternatif olarak, iris makası ile kısa bir neşter kesisi uzatın.
    NOT: İnsizyonlar orta hatta başlamalıdır, ancak tek taraflı enjeksiyonlar için, Bregma ve çapak deliği konumunun eşzamanlı görselleştirmesini ve erişimini kolaylaştırmak için hafifçe yanal olarak açılı olabilir.
  11. Steril bir pamuklu çubuk kullanarak, kafatasını görselleştirmek için yara kenarlarını yansıtın ve bölgedeki bağ dokusunu nazikçe ovalayın.
    1. Gerekirse, kafatası yüzeyini temizlemek ve kraniyal dikişleri görselleştirmek için hidrojen peroksite batırılmış steril bir pamuklu çubuk kullanın.
  12. Sol ve sağ koronal sütürlerin sagital sütür ile orta hatta birleştiği yerde Bregma'yı bulun (bkz. Şekil 2).
    1. Toksik olmayan renkli bir akrilik reçine ve steril bir tahta kürdan veya benzeri bir şey kullanarak Bregma üzerinde çok küçük bir işaret bırakın.
      NOT: Bazı durumlarda, sol ve sağ koronal sütürler birbirini yansıtmaz; Bu gibi durumlarda, orta sagital düzlem boyunca nerede kesişmeleri gerektiğini yaklaşık olarak belirlemek için bir 'en uygun çizgi' kullanın.
  13. Hayvanın baş pozisyonunun eğilmediğinden veya döndürülmediğinden emin olun (yani düz bir düzlemde).
    1. Bregma'da sıfır stereotaktik koordinatlar. X koordinatı, medial-lateral (ML) düzlemdeki hareketi, ön-arka (AP) düzlemdeki y koordinatını ve dorsal-ventral (DV) düzlemdeki z koordinatını ifade eder.
    2. Lambda'nın Bregma ile aynı DV düzleminde olduğundan emin olun (yani, her iki yer işaretinde de z = 0). Benzer şekilde, Bregma'nın yanlarında +2.0 mm (x = 2) ve -2.0 mm'de (x = -2.0), kafatasının aynı düzlemde olduğundan ve DV / z koordinatının kabaca eşit olduğundan emin olun. Kafatasının sağlam olduğundan ve herhangi bir ayarlamadan sonra hareket etmediğinden emin olun.
  14. Bregma'dan +2.0 mm (ML) ve +0.5 mm (AP) çapak deliği açın (Şekil 3).
    1. Stereotaktik bir matkap ataşmanı kullanarak, ucun ucunu Bregma ile temas edene kadar dikkatlice indirin ve koordinatları sıfırlayın.
    2. Ucu hafifçe kaldırın ve matkabı uygun AP ve ML koordinatlarına ayarlayın.
    3. Matkabı yavaşça indirin, sadece kafatasından çapak almamaya dikkat edin.
    4. Alternatif olarak, stereotaktik çerçevede mikrolitrelik bir şırınga kullanarak, iğne ucunu Bregma ile temas edene kadar indirin ve koordinatları sıfırlayın.
    5. İğneyi hafifçe kaldırın ve uygun AP ve ML koordinatlarına ayarlayın.
    6. Ucu kafatasına değene kadar indirin ve tam yerini not edin.
    7. İğneyi hafifçe kaldırın ve cerrahi bir işaretleyici ile hedef yerde küçük bir işaret yapın.
    8. İğne taşıyıcıyı yoldan kaldırın veya döndürün ve bir el matkabı kullanarak kafatasına çapak alın, altındaki beyne zarar vermemeye dikkat edin. DİKKAT: Genel olarak, yaşlı erkek fareler nispeten daha kalın kafataslarına sahiptir ve daha kapsamlı delme gerektirir. Kafatasındaki ani kırılmalar altta yatan meninkslere ve/veya beyne zarar vereceğinden, elle delme işlemi dikkatli bir şekilde yapılmalı, minimum basınç uygulanmalıdır.
      NOT: LITT prosedürü sırasında termokupl probunu yerleştirmek için çapak deliğinin bir uzantısı gereklidir. Bu, ilk enjeksiyon ameliyatı sırasında daha kolay yapılabilir ve daha hızlı ve daha akıcı bir LITT ameliyatını kolaylaştırır. Alternatif olarak, LITT ameliyatı sırasında çapak deliği aynı şekilde uzatılabilir, bu da ekstrakraniyal tümör büyümesi riskini azaltabilir.
  15. Termokupl için +3.0 mm ML ve +0.5 mm AP'de (enjeksiyon bölgesinin 1.0 mm yanal) ikinci bir çapak deliği oluşturun.
    1. Önceki adımda belirtildiği gibi delme prosedürünü izleyin.
    2. Kemik büyümesi ile ilgili zorlukları önlemek için, iki delik arasındaki kemiği çıkarın.
      NOT: Tümör implantasyonu için koordinat olarak Bregma'dan +2.0 mm ML, +0.5 mm AP ve -2.5 mm DV kullanılması önerilir. Üst striatumdaki bu konum, hayvanlar tarafından iyi tolere edilen tutarlı tümör büyümesi sağlar - ancak protokol diğer yerlere uyarlanabilir.
  16. CT2A fare glioma hücre süspansiyonunu mikrolitre şırıngada (1.5 μL'de 5000 hücre) hazırlayın.
    1. Önceden hazırlanmış mikrosantrifüj hücre tüpünü buzdan çıkarın ve yeniden askıya almak için parmak ucunuzla hafifçe vurun.
    2. Kabarcıkları önlemek için 5 μL veya 10 μL'lik bir şırıngaya 2 μL'yi nazikçe çekin.
    3. Havayı çıkarmak ve iğnenin astarlandığından ve doğru çalıştığından emin olmak için 0,5 μL'yi eksprese edin.
    4. Eksprese edilen sıvıyı ve dış yüzeydeki hücreleri (leptomeningeal tümör büyümesine neden olabilir) çıkarmak için iğne milini alkollü bir çubukla silin.
  17. Şırıngayı bir mikroenjektör şırınga pompasına (veya manuel stereotaktik eke) yükleyin ve iğneyi yavaşça indirin.
    1. İğneyi yavaşça derinliğe (z = -3.0 mm) indirin ve 1 dakika bekleyin.
    2. İğneyi yavaşça 0,5 mm (z = -2,50 mm) geri çekin ve hücreleri enjekte edin (≤ 0,5 μL/dak). İğneyi bozmamaya dikkat ederek mikrocerrahi sünger mızrak kullanarak şırınganın etrafındaki alanı kuru tutun.
    3. Enjeksiyon tamamlandıktan sonra en az 2 dakika bekleyin, ardından şırıngayı 3-4 dakikalık bir süre boyunca yavaşça geri çekin. Hücrelerin orijinal enjeksiyon bölgelerinden çıkmasını önlemek için ilk 4-5 geri çekme aralığının geri çekme başına 100 μm olduğundan emin olun.
    4. Alkollü bir bez kullanarak, iğnenin dışını nazikçe silin ve herhangi bir kan veya sıvıdan arındırın ve şırıngayı üreticinin yönergelerine göre yıkayın ve temizleyin. İğnenin tıkanmadığından emin olmak için enjeksiyonlar arasında PBS ve damıtılmış su kullanın. Enjeksiyonlar tamamlandığında, iğneden kalan hücreleri çıkarmak için iğneyi p etanol ile cömertçe yıkayın.
      DİKKAT: Her enjeksiyondan sonra iğneyi yıkamamak tıkanıklığa neden olabilir. Birden fazla hücre tipine enjekte ediliyorsa, olası çapraz kontaminasyonu önlemek için her tip için ayrı bir iğne kullanın.
  18. Altta yatan dermisin temas etmesi için yara kenarlarını hafifçe kesmeye dikkat ederek insizyonu yeniden yaklaştırın. Yarayı bir yara klipsi veya 5-0 dikişle 3 kesikli dikiş kullanarak kapatın. Kapalı yaraya povidon-iyot çözeltisi uygulayın.
  19. Hayvanı stereotaktik çerçeveden çıkarın ve 37 °C'ye ayarlanmış bir ısıtma pedi üzerine kağıt kaplı bir kurtarma kafesine yerleştirin. Kafes tabanında bulunan küçük bir tabak ıslak yemek ile hayvanı ev kafesine geri transfer etmeden önce sternal yaslanmanın sağlandığından emin olun.
  20. Hayvanı, ameliyat gününden başlayarak sonraki 2 gün boyunca günde en az iki kez izleyin. Meloksikamı 24 saat, 48 saat ve 72 saat sonra veya kurum yönergelerine göre okuyun.

figure-protocol-2
Şekil 2: Bir fare kafatasının ve stereotaktik cerrahi için önemli anatomik işaretlerin grafiksel gösterimi. Şununla oluşturuldu BioRender.com Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-protocol-3
Şekil 3: Çapak deliklerinin ve lazer cihazlarının konumlarını gösteren grafiksel çizim. Bregma yer işaretinin göreceli konumlarını, (A) (A') lazer fiberi için ilk çapak deliğini ve (B) (B') termokupl probu için ikinci veya uzatılmış çapak deliğini gösteren çizim. Lazer fiber ve termokupl problarının kesik bir tasviri sağda gösterilmiştir, bu da probların istenen boyut ve aralıkta önceden delinmiş deliklerle stereotaktik bir uç ayak içinde nasıl stabilize edildiğini göstermektedir. BioRender.com ile oluşturuldu Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

3. LITT öncesi tümör yükünün izlenmesi (9. Gün)

  1. LITT'den önceki gün tümör büyümesini değerlendirmek için kurumsal yönergeleri izleyerek T2 ağırlıklı manyetik rezonans görüntüleme (MRI) gerçekleştirin.
    NOT: Tümörlerin çapı ~ 1.5-2.0 mm olmalıdır.
    1. Aşağıdaki parametreleri kullanarak tüm fare beyninin uygun bir koronal taramasını elde edin: hızlı dönüş yankı dizisi, TR = 5000 ms, TE = 45 ms, yankı trenleri = 7, FOV = 30 x 30 mm2, matris boyutu = 250 x 256, toplam dilimler = 18, dilim kalınlığı = 0,3 mm, ortalamalar = 2.
      NOT: Ayrıca, başarılı allogreftlemeyi doğrulamak ve özellikle ilk deneyler sırasında tümör büyümesini izlemek için implantasyondan yaklaşık 6. günden başlayarak periyodik MRG yapılması önerilir, çünkü prosedürdeki ince değişiklikler bile zaman çizelgesini değiştirebilir. CT2A oldukça agresiftir ve hayvanların yakından izlenmesi gerekir. T2 ağırlıklı bir koronal tarama bu amaç için iyi çalışır. Floresan etiketli veya lusiferin etiketli CT2A hücrelerinin in vivo görüntüleme sistemi (IVIS) ile birlikte kullanılması, küçük bir hayvan MRG'sine erişimin olmadığı durumlarda da uygun olabilir. Bununla birlikte, büyüme kinetiği ve diğer tümör özellikleri bu protokolden farklı olacaktır.

4. LITT ameliyatı (10. gün)

  1. Yukarıdaki bölüm 2'de olduğu gibi, hayvanı LITT'ye hazırlamak için 2.1-2.13 adımlarını tekrarlayın.
    NOT: Önceki ameliyattan kaynaklanan yara iyileşmesi, deneysel zaman çizelgesindeki türlere ve varyasyonlara bağlı olarak farklı aşamalarda olabilir. İnsizyonu yeniden yaparken daha ince veya daha hassas dokuya dikkat edin.
  2. Steril pamuk uçlu bir bez kullanarak kafatasını nazikçe temizleyin, Bregma'yı veya önceden yapılmış çapak deliğini gizleyen dokuları temizleyin. Gerekirse, çapak deliğini yeniden delin, ancak CT2A tümör oluşumunun hızı nedeniyle, herhangi bir kemik büyümesi bekleniyorsa çok azdır.
  3. LITT eki stereotaktik çerçevede yerindeyken, lazer fiberinin ucu için Bregma'daki koordinatları sıfırlayın.
    DİKKAT: Lazer fiberi çok kırılgandır ve bükülürse çatlar. Lazer fiberin ucu kafatasına temas ettiği anda durmaya dikkat edin.
  4. Ucu hafifçe kaldırın ve istenen ML ve AP koordinatlarına hareket edin, ardından hedefe ulaşmak için probları yavaşça hedef DV koordinatına indirin (2,0 mm ML, 0,5 mm AP, -2,0 mm DV).
  5. LITT tedavi parametrelerini ayarlayın: Mod: sürekli; Güç: 1 W
  6. Lazeri Bekleme modundan Aktif duruma getirin ve ayak pedalını kullanarak lazeri 60 saniye boyunca devreye alın. Sıcaklık 46 °C'nin üzerine çıkarsa, kısa bir süre duraklayın, ardından sıcaklığı mümkün olduğunca 46 °C'ye yakın tutmaya çalışarak yeniden devreye girin.
  7. Lazer aksamını yavaşça geri çekin ve lazer fiberini ve termokupl'u alkollü bir bezle nazikçe silerek temizleyin. Probların çerçeveye temas etmemesine dikkat ederek düzeneği yoldan döndürün.
  8. Yarayı kapatın ve yukarıdaki tümör implantasyonunu takiben 2.18-2.20 adımlarında anlatıldığı gibi hayvanı kurtarın.

5. LITT sonrası değerlendirme (11. gün)

  1. Yukarıdaki adım 3.1'deki sıra ve parametreleri kullanarak başarılı LITT tümör ablasyonunu değerlendirmek için LITT tedavisinden sonraki gün LITT sonrası T2 ağırlıklı MRG gerçekleştirin.
    NOT: Ek olarak, sıvı ile zayıflatılmış bir inversiyon kurtarma (FLAIR) dizisi de ameliyat sonrası ödemin değerlendirilmesinde yardımcı olabilir.
  2. Tedavi sonrası değişiklikleri veya tümörün yeniden büyümesini izlemek için çalışma bitiminden önce takip taramaları yapın.

6. Öğrenim sonu (Gün 11 / Gün 15 / Gün 20)

  1. Kurumun yönergelerine göre seçilen deneysel uç noktalarda hayvanları ötenazi yapın.
    NOT: 20. günden sonraki uç noktalar, son derece düşük hücre sayılı aşılamalarda bile CT2A ile mümkün değildir, çünkü kontrol hayvanları (yani, sahte cerrahi veya tedavi yok) ve bazı tedavi grubu hayvanları can çekişiyor olabilir ve ötenazi gerektirebilir. Daha uzun deneyler için alternatif fare glioma hücre modellerini düşünün.
  2. Fiksasyon ve işleme için dokuları toplayın.
    1. % 4 paraformaldehit (PFA) ile kardiyak perfüzyon yapın ve ilgilenilen dokuları toplayın.
    2. Beyin dokusunu gece boyunca 4 ° C'de% 4 PFA'ya daldırarak düzeltin.
    3. Formalinle sabitlenmiş parafine gömülü (FFPE) veya sabit-donmuş analiz için standart uygulamaları kullanarak numuneleri işleyin.

7. Analiz

  1. T2 ağırlıklı MRI kullanarak başarılı LITT ablasyonunu doğrulayın ve hematoksilen ve eozin boyası gibi temel histolojik teknikleri kullanarak doğrulayın.
  2. Deneyler için gerekli ek analizleri yapın (ör., immünohistokimya, immünofloresan).

Sonuçlar

Başarılı CT2A tümör implantasyonu ve LITT tedavileri, Şekil 4, Şekil 5 ve Şekil 6'da gösterildiği gibi T2 ağırlıklı MRG kullanılarak karakterize edilebilir. MR görüntüleri, yukarıdaki protokolde belirtilen dizi parametreleri kullanılarak 17 cm delikli ve dörtlü fare kafası bobinine sahip 7T kriyojen içermeyen süper iletken bir mıknatıs kullanılarak elde edildi. Bu yönteme dikkatli bir şekilde uyulması, Şekil 4'te gösterildiği gibi% 100'e yaklaşan alma oranları, tutarlı tümör lokalizasyonu ve kabaca küresel tümör oluşumu ile sonuçlanmalıdır. Bu özellikler, sonraki LITT tedavileri ve diğer analizler için en uygun temeli sağlar. Benzer şekilde, Şekil 5'te görüldüğü gibi, LITT ablasyonları da hem boyut hem de konum açısından tutarlı olmalıdır. Ablasyonlu dokunun merkezi çekirdeği, pıhtılaştırıcı ve sıvılaştırılmış nekrozdan oluşacak ve T2 ağırlıklı MRG'de hipo-yoğunluk (yani siyah) olarak kolayca görselleştirilecektir. LITT tedavisinden hemen sonraki günlerde, yapılan LITT tedavisine bağlı olarak, peri-operatif ödemlere karşılık gelen lezyonun içinde ve çevresinde hiper-yoğun (yani beyaz) bir alan görmek de tipiktir. Şekil 6 , kötü bir sonucu göstermekte ve bu protokolü gerçekleştirirken bazı olası tuzakları vurgulamaktadır.

figure-results-1
Resim 4: İdeal CT2A tümör oluşumunun T2 ağırlıklı koronal MR görüntüleri. İmplantasyondan 12 gün sonra üç C57BL / 6 farede (A, B, C) tümör oluşumunun temsili görüntüleri. Beyaz oklar tümör sınırını gösterir. Tutarlı tümör konumuna ve kabaca küresel oluşumu not edin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 5: İdeal LITT ablasyonunun T2 ağırlıklı koronal MR görüntüleri (LITT'den 1 gün sonra). İmplantasyondan 13 gün sonra üç C57BL / 6 farede (A, B, C) LITT tümör ablasyonunun temsili görüntüleri. Nekrotik lezyon çekirdeğinin tutarlı boyutuna ve konumuna dikkat edin. LITT öncesi MRG'lerin ve LITT ablasyonlarının biraz daha erken gerçekleştirilmesi, lazer hedefleme için optimal tümör boyutu ile daha sonraki tedavi sonrası uç noktalar elde etme yeteneği arasında daha iyi bir denge sağlayacaktır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 6: Önceden optimize edilmiş LITT tedavilerinin T2 ağırlıklı koronal MR görüntüleri. İdeal olmayan bir sonuç örneği olarak, protokol optimizasyonlarından önce aynı lazer parametreleri ve stereotaktik hedeflerle tedavi edilen üç C57BL/6 faresinden (A, B, C) alınan görüntüler. Beyaz oklar tümör sınırını gösterir. Sınırlanmış alanlar ödem bölgesini gösterir. Daha az homojen tümör büyümesi ve tutarsız doku hasarına neden olan zayıf lazer ablasyon hedeflemesi dahil olmak üzere önemli değişkenlik görülür. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

LITT ile ilgili hızla genişleyen bir literatür bulunmaktadır; Bununla birlikte, öncelikle insan klinik vaka çalışmaları veya vaka serileri ile sınırlıdır. Gerçekten de, karşılaştırılabilir progresyonsuz sağkalım sağlarken daha düşük postoperatif komplikasyon oranları ve maliyetler dahil olmak üzere LITT için çeşitli potansiyel faydalar gösterilmiştir 7,8,9,10,11. Nedenleri henüz tam olarak anlaşılamamış olsa da, sistemik ilaç tedavisinin başarısının daha yüksek olması ile lokal nükslerde de azalma söz konusudur12. Ek olarak, GB dışındaki klinik uygulamalar için umut verici sonuçlar arasında metastaz ve diğer tümör tiplerinintedavisi 3,12, radyasyon nekrozu13, refrakter epilepsi14, vasküler malformasyonlar 15 ve hatta obsesif kompulsif bozukluk16 yer alır. Tersine, bir murin modeli kullanan araştırmalar, birkaç önemli istisna dışında, şimdiye kadar çok sınırlıdır ve bunların tekrarlanması zor olabilir. Örneğin, LITT tedavisini takiben kan-beyin bariyeri geçirgenlik değişiklikleri üzerine yakın zamanda yapılan bir çalışmada, klinik kullanım için Avrupa'da satılan bir lazer jeneratörü kullanılmıştır, ancak bu cihaz Kuzey Amerika'da onaylanmamıştır17. Böyle bir sistem araştırmaları için çok uygun görünse de, cihazı elde etmek çoğu araştırmacı için muhtemelen maliyet engelleyicidir ve herhangi bir tescilli veya yüksek mühendislik özelliğinin kopyalanması zordur. Bu nedenle, erişilebilir ve optimize edilmiş bir klinik öncesi hayvan modelinin ayrıntılı bir protokolü, değerli araştırma fırsatları sağlayacaktır.

Protokoldeki kritik adımlar, hem allogreftleme hem de müteakip LITT ablasyon cerrahisi sırasında tekrarlanabilir hedefleme için Bregma'nın doğru bir şekilde tanımlanmasını içerir. Ek olarak, başarılı tümör hücresi greftleri için enjeksiyon adımlarına uygulama hızı ve duraklamalara özellikle dikkat etmek çok önemlidir ve bunun yapılmaması, ekstrakraniyal tümör büyümesi ve daha yüksek tümör değişkenliği riskini büyük ölçüde artırır. LITT ameliyatının, tümör hala nispeten küçükken (yani ~ 1.5-2.0 mm çapında) planlanması gerektiğini vurgulamak da önemlidir. Deneyimlerimize göre, CT2A tümörleri genellikle büyük olduklarında şekil olarak daha değişken hale gelir ve çok büyük tümörler, özellikle tümör kortikal yüzeyden büyümüşse, beynin çıkarılmasının zorluğunu da artırır. Ayrıca, tedavi öncesi MRG ve LITT cerrahisi arasındaki gibi 24 saat kadar kısa bir sürenin, önemli miktarda devam eden CT2A glioma büyümesi için yeterli zaman olduğu da belirtilmelidir.

Diğer deneysel tasarımlara uyarlamak için bu protokolde kolayca çeşitli değişiklikler yapılabilir. Özellikle, bu protokol bir C57BL / 6 sinjeneik CT2A fare modelinde başarılı ortotopik implantasyon ve LITT ameliyatları için gerekli teknik adımlara odaklanmaktadır. Bununla birlikte, açıklanan model, farklı deneysel hedeflere uyum sağlamak için kolayca ikame edilebilir. K1491 gibi daha az agresif sinjeneik kanser hücre hatları, doğuştan gelen ve adaptif bağışıklık tepkilerini içerenler gibi daha uzun zaman noktaları gerektiren deneyleri gerçekleştirmek için kullanılabilir. Alternatif olarak, adaptif tümör-konak yanıtlarına odaklanmayan deneyler için, bağışıklık sistemi baskılanmış fare modellerinde hastadan türetilmiş hücre hatları veya diğer ksenogreft modelleri başka bir uygun seçenektir. İlgilenen okuyucu için, Haddad ve ark. (2021), birkaç yaygın allogreft ve ksenogreft glioma fare modelinin güçlü yönleri ve sınırlamaları hakkında kapsamlı bir inceleme sağlar4. Kurumsal kullanılabilirliğe ve yönergelere bağlı olarak bir başka basit değişiklik, inhalasyon anestezikinin ketamin ve ksilazin ± asepromazin kombinasyonu gibi enjekte edilebilir alternatiflerle değiştirilmesidir. Bununla birlikte, inhalasyon ajanları ve gerekli ekipman mevcut olduğunda (yani, stereotaktik burun konisi), çeşitli nedenlerle kullanılmalarını öneririz. İlk olarak, inhalasyon anesteziklerinin intraperitoneal enjeksiyon gerektirmedikleri, daha uzun veya daha zorlu ameliyatlar için tekrar dozlama gerektirmedikleri ve geniş bir güvenlik marjı ile kolayca titre edilebildikleri için daha güvenli bir alternatif olduğuna inanıyoruz18. Ek olarak, inhalasyon anestezik, kontrollü maddelerin kullanılmasını gerektirmez ve ameliyat sonrası hızlı bir uyanma ve iyileşme sağlar.

Bu protokol için sorun giderme minimum düzeyde olmalıdır ve çoğu zayıf enjeksiyon tekniğinden kaynaklanan sorunlar düzensiz tümör oluşumu veya ekstrakraniyal büyüme ile sonuçlanır. LITT hedefleme sorunları, yer işaretlerinin uygun şekilde tanımlanması, uygun lazer fiber stabilizasyonu ve çapak deliğinin kenarını etkilememesini ve rotadan çıkmamasını sağlamak için yerleştirme sırasında lazer fiberinin dikkatli bir şekilde gözlemlenmesiyle düzeltilebilir.

Yöntemin sınırlamaları arasında, prosedürleri gerçekleştirmek için gereken orta ila ileri düzey cerrahi ve teknik beceri, küçük hayvan MRI makinesi gibi özel ekipmanlara erişim ve tek bir günde gerçekleştirilebilecek enjeksiyon sayısını sınırlayan uzun bir ortotopik implantasyon protokolü yer alır. Bu protokol, yüksek dereceli gliomun klinik öncesi bir modeli olarak tasarlandığından, CT2A gibi bazı glioma hücre hatlarının daha agresif doğası ile ilgili doğal sınırlamalar da vardır. Düşük hücre sayısı aşıları, striatum içinde derin bir enjeksiyon bölgesi, dikkatli enjeksiyon tekniği ve erken tedavi bu sorunları hafifletmeye yardımcı olacaktır, ancak ara sıra ekstrakraniyal veya düzensiz tümör büyümesi hala meydana gelebilir ve kısa deneysel tasarımlar garanti edilir. Tartışıldığı gibi, bu protokolün daha az agresif bir hücre hattı ile modifikasyonu da kolayca gerçekleştirilir.

Bu protokol, bildiğimiz kadarıyla, GB LITT için klinik öncesi bir fare modelinin tek ayrıntılı açıklaması olduğundan, gelecekteki temel bilim araştırmaları için iyi kurulmuş bir model sağlama yolunda önemli bir adımdır.

Açıklamalar

Lazer ekipmanlarının ayni bağışı da dahil olmak üzere Monteris Medical'in desteği için minnettarız.

Teşekkürler

Bu proje için finansman kaynakları arasında Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Konseyi (NSERC)-İttifakı, Mitacs-Accelerate, Araştırma Manitoba-IPOC, Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri (CIHR) CGS-M ve Manitoba Üniversitesi Lisansüstü Bursu bulunmaktadır. CT2A glioma hücre hattı, Duke Üniversitesi, Durham, NC'de Dr. Peter Fecci tarafından cömertçe bağışlanmıştır. Ayrıca, bu projedeki mükemmel teknik yardımları için Manitoba Üniversitesi'ndeki Histoloji Hizmet Laboratuvarı ve Küçük Hayvan ve Malzeme Görüntüleme Çekirdeği tesisine teşekkür ederiz.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Absorbion MızraklarFST18105-01Hemostatik süngerler.
Adson doku forsepsFST11006-12
C57BL / 6 farelerJackson LaboratuvarlarıSuşu #0006646 ila 12 haftalık erkek ve dişi
Pamuk Uçlu Aplikatörler (6 ")ElektronMikroskobu Bilimleri72308
CT2A glioma hücre hattıDuke Üniversitesi'nden Dr. Peter Fecci'den cömertçe bağışlanmıştır.
Cultrex Azaltılmış Büyüme Faktörü Bodrum Membran Özü, PathClearBiotechne, R& D sistemleri3433-010-01
DMEM/F-12, HEPESGibco, ThermoFisher Scientific11330032
Çift odacıklı slaytlar BIO-RAD1450003
Eppendorf Güvenli Kilitli Tüpler 2.0 mLEppendorf22363352
Etil Alkol SusuzGreenfield GlobalP016EAANddH2O
Fetal Sığır Serumu, nitelikli, KanadaGibco, ThermoFisher Scientific12483020
Glad Press-n-Seal plastik sargıAmazon.ca
Yüksek hızlı matkapKopf InstrumentsModel 1474
K & J Termokupl sıcaklık ölçerOmegaHH509R
Metacam (meloksikam)WDDC114424
Mikroenjeksiyon şırınga pompasıWPIUMP3T-1
Mikrolitre şırınga (700 Serisi)Hamilton87908Özel iğneler mevcuttur. Dik bir iğne eğimi, hassas teslimata yardımcı olur ve daha kısa bir iğne uzunluğu, stabiliteye yardımcı olur.
İğne sürücü/İğne TutucuFST12500-12Sınırlı çalışma alanı nedeniyle ince bir uç en uygunudur, ancak tutamak tercihine göre birçok stil uygundur.
Opixcare Plus oftalmik merhemWDDC135941
Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (10x)Fisher biyoreaktifleriBP399-4ddH2O
Povidon-iyotThermoFisher Scientific3955-16Aliquat ile 1x'e seyreltin, pamuk uçlu aplikatörlerle kullanım için daha küçük tüplere yerleştirin.
Tuzlu (normal)WDDC126588
Neşter, tek kullanımlık (#15 Bıçak)TüyTüy NO15
Makas, ince cerrahiFST91460-11İnce öğrenci makası, İris veya Bonn hepsi uygundur.
Stereotaktik çerçeveKopf InstrumentsModel 940Dijital ekran konsolu ve fare burun konisi ve kulak çubukları ile.
Stereotaktik şırınga tutucuKopf InstrumentsModel 1772-FEnjeksiyon pompası kullanmıyorsanız.
Sütürler (5-0 monofilament)EthiconMCP463GMonocryl menekşe monofilament, ters kesme uçlu
Şırınga, 28 G  (0.5 mL) BDBD 329461BD Lo-Dose U-100 İnsülin Şırıngaları
TC20 Otomatik Hücre SayacıBIO-RAD1450102
Termokupl probu, ince çap (Tip K)OmegaTJM-CA316-IM025G-150
Tripsin-EDTA (%0,25), fenol kırmızısıGibco, ThermoFisher Scientific25200072
3M tarafından Vetbond, veteriner doku yapıştırıcısı WDDC126125
Wahl Fıstık MakasıWDDC/Wahl100963Doğrudan üreticiden de temin edilebilir.
Isıtma pediBensen Medical70308/121873Benzer herhangi bir ürün kullanılabilir.
Webcol Alkol ElektronMikroskobu Bilimleri71005-20Alkol hazırlama mendili, 2 katlı, orta boy.
12587704417

Kaynaklar

  1. Canadian Cancer Society. Cancer Statistics 2023. , Canadian Cancer Statistics Advisory Committee in collaboration with the Canadian Cancer Society, Statistics Canada and the Public Health Agency of Canada. Toronto, ON. http://cancer.ca/Canadian-Cancer-Statistics-2023-EN (2023).
  2. Glioblastoma Research Organization. Glioblastoma Research Organization. , https://www.gbmresearch.org (2024).
  3. Carpentier, A., et al. Laser thermal therapy: Real-time MRI-guided and computer-controlled procedures for metastatic brain tumors. Lasers Surg Med. 43 (10), 943-950 (2011).
  4. Haddad, A. F., et al. Mouse models of glioblastoma for the evaluation of novel therapeutic strategies. Neurooncol Adv. 3 (1), vdab100(2021).
  5. Chokshi, C. R., Savage, N., Venugopal, C., Singh, S. K. A patient-derived xenograft model of glioblastoma. STAR Protoc. 1 (3), 100179(2020).
  6. Alcaniz, J., et al. Clinically relevant glioblastoma patient-derived xenograft models to guide drug development and identify molecular signatures. Front Oncol. 13, 1129627(2023).
  7. Muir, M., et al. Laser interstitial thermal therapy for newly diagnosed glioblastoma. Lasers Med Sci. 37 (3), 1811-1820 (2022).
  8. Muir, M., Traylor, J. I., Gadot, R., Patel, R., Prabhu, S. S. Repeat laser interstitial thermal therapy for recurrent primary and metastatic intracranial tumors. Surg Neurol Int. 13, 311(2022).
  9. De Groot, J. F., et al. Efficacy of laser interstitial thermal therapy (LITT) for newly diagnosed and recurrent IDH wild-type glioblastoma. Neurooncol Adv. 4 (1), vdac040(2022).
  10. Holste, K. G., Orringer, D. A. Laser interstitial thermal therapy. Neurooncol Adv. 2 (1), vdz035(2020).
  11. Leuthardt, E. C., Voigt, J., Kim, A. H., Sylvester, P. A single-center cost analysis of treating primary and metastatic brain cancers with either brain laser interstitial thermal therapy (LITT) or craniotomy. Pharmacoecon Open. 1 (1), 53-63 (2017).
  12. Bastos, D. C. D. A., et al. Predictors of local control of brain metastasis treated with laser interstitial thermal therapy. Neurosurgery. 87 (1), 112-122 (2020).
  13. Darbinyan, A., Leelatian, N., Fomchenko, E. I. Histological changes associated with laser interstitial thermal therapy for radiation necrosis: illustrative cases. J Neurosurg Case Lessons. 4 (1), CASE21373(2022).
  14. Grant, G. A., Porter, B. E., Li, D., Barros Guinle, M. I., Kaur, H. Approach, complications, and outcomes for 37 consecutive pediatric patients undergoing laser ablation for medically refractory epilepsy at Stanford Children's Health. J Neurosurg Pediatr. 33 (1), 1-11 (2023).
  15. Ogasawara, C., et al. Laser interstitial thermal therapy for cerebral cavernous malformations: A systematic review of indications, safety, and outcomes. World Neurosurg. 166, 279-287.e1 (2022).
  16. Satzer, D., Mahavadi, A., Lacy, M., Grant, J. E., Warnke, P. Interstitial laser anterior capsulotomy for obsessive-compulsive disorder: lesion size and tractography correlate with outcome. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 93 (3), 317-323 (2022).
  17. Salehi, A., et al. Therapeutic enhancement of blood-brain and blood-tumor barriers permeability by laser interstitial thermal therapy. Neurooncol Adv. 2 (1), vdaa071(2020).
  18. Navarro, K. L., Huss, M., Smith, J. C., Sharp, P., Marx, J. O., Pacharinsak, C. Mouse anesthesia: The art and science. ILAR J. 62 (1-2), 238-273 (2021).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Glioblastoma Fare ModeliBeyin T m r AblasyonuStereotaktik CerrahiCT2A Gliyoma H creleriT m r Mikro evresiTermal Doku AblasyonuMRI G r nt lemeT m r mplantasyonuDoku Nekrozu

İlgili makaleler