Bu protokol, geçici olarak bağışıklığı baskılanmış zebra balığı embriyolarında hücre hatlarından ve taze hasta materyalinden insan akut lenfoblastik lösemi (ALL) ksenogreftlerinin oluşturulması ve sorun giderilmesi için adım adım talimatların yanı sıra akış sitometrisi kullanılarak ilaç yanıtı değerlendirmesi için kılavuzlar sağlar. Deneysel boru hattı katı tümörler için de uyarlanabilir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Zebra Balığı Embriyolarında Lösemi Hücre Greftleri Kullanılarak Hızlı İn Vivo İlaç Yanıtı Tahmini
Bu makalede
Özet
Özet
Zebra balığı ksenotransplantasyonu, insan kanseri patogenezini araştırmak ve bireysel ilaç yanıtlarını tahmin etmek için çok önemli bir tekniktir. Bu belge, tedavi yanıtlarının yüksek çözünürlüklü tek hücreli analizi için akış sitometrisini kullanan, geçici olarak bağışıklığı baskılanmış zebra balığı embriyolarında primer B hücresi öncüsü akut lenfoblastik lösemi (BCP-ALL) hasta örneklerini veya ölümsüzleştirilmiş hücre hatlarını genişletmek için kolaylaştırılmış bir protokol (ZefiX) sunar. Katı tümör aşılamaları ile karşılaştırıldığında, lösemi hücreleri, tahlil sırasında makrofaj ve nötrofil farklılaştırıcı faktörlerin morfolino antisens oligonükleotid bazlı baskılanmasından önemli ölçüde fayda sağlar. Ayrışmış greft hücrelerinin akış sitometrisi analizi, hücre başına tedavi sonrası hücre sayısının, proliferasyon hızının ve canlılığın hassas bir şekilde değerlendirilmesini sağlar. Bu yaklaşım, venetoklaks ve dasatinib gibi hedefe yönelik terapötikler kullanılarak, ilgili hasta örneklerinin klinik kayıtları ve geleneksel 2D kültür kontrolleriyle karşılaştırılan tedavi sonuçları ile doğrulanmıştır. Özellikle, protokol klinik karar verme zaman çizelgelerine uygun olarak 7 gün içinde tamamlanır. Metodoloji, katı tümörler de dahil olmak üzere çeşitli kanser türlerinde seçilen ilaçları test etmek için uyarlanabilir ve böylece kişiselleştirilmiş terapötik stratejileri destekler. Bununla birlikte, muhtemelen zebra balığı embriyolarındaki farmakokinetik kısıtlamalar nedeniyle değerlendirilebilecek ilaç sayısındaki sınırlamalar dikkate alınmalıdır.
Giriş
Zebra balığı ksenotransplantasyonu, kanser patogenezini anlamak ve ilaç yanıtlarını tahmin etmek için çok önemli bir in vivo model haline gelmiştir 1,2,3,4,5. Hayvan modelleri, klinik öncesi ilaç testleri için kritik olmaya devam etmektedir ve zebra balığı modeli, yüksek verim ve maliyet verimliliği dahil olmak üzere diğer in vivo sistemlere göre önemli avantajlar sunmaktadır 6,7,8
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm zebra balığı deneyleri, Charité-Universitätsmedizin Berlin Deneysel Tıp Araştırma Enstitüleri yönergelerine ve resmi makamlara uygundur. Tüm çalışmalar, döllenmeden 6 gün Danio rerio), standart protokollere göre Charité-Universitätsmedizin Berlin, Berlin, Almanya'daki hayvan tesisinde yetiştirildi ve bakımı yapıldı. 14 saat aydınlık ve 10 saat karanlık döngü ile 28 ° C'ye yerleştirildiler. Tüm deneyler için AB veya TüLF suşlarının yabani tip balıkları kullanılmıştır.
NOT: Zef....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Taze dondurulmuş, birincil BCP-ALL hücre örneklerinin ksenogreft ve ilaç tedavisi de dahil olmak üzere ZefiX protokolünün ayrıntılı bir bilimsel değerlendirmesi için lütfen daha önce yayınlanmış makale21'e bakın. Klinik öncesi ilaç testi için yapılan araştırmalarda hasta örneklerinin kullanımına ilişkin onay, yerel tıbbi araştırma etik kurulları tarafından ALL-REZ BFM 2002 denemesine (NCT00114348) ve ALL-REZ BFM kayıt ve biyobankasına (EA2/055/12) ve ayrıca ulusal otorite tarafından yapılan IntReA.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Zebra balığı embriyoları, yüksek verim kapasiteleri ve maliyet etkinlikleri nedeniyle ilaç taraması ve kanser araştırmaları için giderek daha popüler bir ksenogreft modeli haline geldi. Bu ksenogreftler, translasyonel tıbbın kritik bir ayağı olarak umut vaat ediyor ve klinik öncesi araştırmalara ve karar vermeye yardımcı oluyor 9,21. Bununla birlikte, insan lösemi hücre genişlemesi ve tedavisi için zebra balığı ksenogreft modelle.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Tüm yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmez.
Teşekkürler
Bu çalışma, Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Alman Araştırma Vakfı) bünyesindeki Ortak Araştırma Merkezi CRC1588, 493872418 numaralı proje ve Dr. Kleist Stiftung, Berlin'in yanı sıra Deutsche José Carreras Leukämie Stiftung (R03/2016), Berliner Krebsgesellschaft (HEFF201633KK) ve Alman Kanser Konsorsiyumu (DKTK, Ortak Finansman Çağrısı 2016) tarafından desteklenmiştir. Julia Köppke ve Mareike Wolff'a el yazmasını eleştirel okumaları için teşekkür ederiz.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Petri kabı (10 cm) | Greiner | P7237 | |
| 7-AAD canlılık boyama solüsyonu | Invitrogen | 00-6993-50 | |
| Agaroz (LE, analitik derece) | Biozym | ||
| Hava basıncı enjektörü | Narishige | IM400 | harici gaz beslemesi ile |
| Alexa Fluor 488 anti-insan CD19 antikoru | Biolegend | 302219 | |
| Annexin bağlayıcı tampon | Biolegend | 422201 | Veya |
| APC annexin V hazırlanması için çözümlere bakın; | Biolegend | 640941 | |
| Kılcal damarlar (10 cm, OD 1.0 mm, filamentli) | WPIINC | TW100F-4 | 1.0 OD; 0.75 ID |
| Hücre kültürü şişesi (T-175) | Sarstedt | 83,39,12,002 | |
| CellTrace Violet | Invitrogen | C34557 | |
| Dimetil sülfoksit (DMSO) | Roth | A994.1 | |
| Dispase II | Sigma Aldrich | D4693-1g | |
| DNase I | AppliChem GmbH | A3778 | |
| Eppendorf tüpleri (1.5 ml) | Eppendorf | 30120086 | |
| FACS tüpü (Hücre süzgeci Kapaklı Polistiren yuvarlak botton Tüpü, 5 ml) | Falcon | 352235 | |
| Falcon tüpleri (50 ml) | Falcon | 352070 | |
| Fetal buzağı serumu (FCS) | Sigma Aldrich | C8056 | |
| İnce gözenekli filtre ( 10 ve mikro; m) | PluriStrainer | 435001050 | |
| İnce gözenekli filtre ( 20 ve mikro; m) | PluriStrainer | 431002040 | |
| Akış sitometresi | Becton Dickinson | BD LSRFortessa X-20 | |
| Floresan stereomikroskop | Leica | ||
| Kameralı floresan stereomikroskop | Leica | M165 FC | Kamera: DFC7000 T |
| Hank' s Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS, Kalsiyum ve Magnezyum içermez) | Sigma Aldrich | 88284 | |
| Enjeksiyon kalıbı (Zebra balığı MI / Transplant KIT) | World Precision Instruments | Z-MOLDS Enjeksiyon iğneleri | |
| (filamentsiz) | Biyomedikal aletler | VZIPbl-20-10-55 | Zebra balığı enjeksiyon pipeti, künt, OD: 20μ m ± 1, TL: ~ 10mm, PL: 55mm, Cam: BM100T-10P |
| Makro santrifüj | Eppendorf | ||
| Mikro santrifüj | |||
| Morpholino (csf3r) | Gene Tools LLC | csf3r (GAAGCACAAGCGA GACGGATGCCA) | |
| Morpholino (spi1) | Gene Tools LLC | spi1 (GATATACTGATAC TCCATTGGTGGT) | |
| Papain | Sigma Aldrich | P3125 | |
| Penisilin-Streptomisin (Penstrep; 10.000 U/ml) | Gibco | 15140122 | |
| Plakaları (4 kuyulu) | Greiner Bio bir | 657160 | |
| Plakalar (96 kuyulu) | Greiner Bio bir | 657180 | |
| Roswell Park Memorial Enstitüsü (RPMI) 1640 Orta | Gibco | 21875-034 | |
| Trikain (MS-222) | Sigma Aldrich | E10521-50G | Ethy-3 aminobenzoat metansülfenat |
Kaynaklar
- Fontana, C. M., Van Doan, H. Zebrafish xenograft as a tool for the study of colorectal cancer: a review. Cell Death Dis. 15, 1-12 (2024).
- Sturtzel, C., et al. Refined high-content imaging-based phenotypic drug screening in zebrafish xenograft....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
