Yöntem makalesi

İmmünkompetan Fareleri İntratrakeal Olarak Aşılamak için Agar Boncuğu Gömülü Mycobacterium abscessus'un Hazırlanması

1.7K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/67602

⸱

25 Nisan 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Discovery and Innovation, Hackensack Meridian Health, 2Mycobacteria Research Laboratories, Department of Microbiology, Immunology and Pathology, Colorado State University, 3Department of Biological Sciences, College of Science, University of Tabuk, 4Emerging Bacterial Pathogens Unit, Division of Immunology, Transplantation and Infectious Diseases, IRCCS San Raffaele Scientific Institute, 5Department of Medical Sciences, Hackensack Meridian School of Medicine, 6Department of Microbiology and Immunology, Georgetown University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Fareler genellikle Mycobacterium abscessus enfeksiyonlarına karşı dirençlidir, bu da akciğer enfeksiyonlarına karşı çok ihtiyaç duyulan antibiyotiklerin keşfedilmesini ve geliştirilmesini zorlaştırır. Burada, immünokompetan farelerde sürekli enfeksiyon sağladığı gösterilen bir aşı hazırlama ve intratrakeal enfeksiyon yöntemini açıklıyoruz.

Özet

Tercihen akciğerleri enfekte eden çevresel bir patojen olan Mycobacterium abscessus ile kronik enfeksiyonun sağlam fare modellerine çok ihtiyaç vardır. Yıl boyu süren çoklu ilaç tedavileri, hastalarda %50 civarında kabul edilemez derecede düşük kür oranları sağlar, bu nedenle daha iyi antibiyotikler geliştirmek için öngörücü preklinik araçlara ihtiyaç duyulur. Bununla birlikte, immünokompetan fareler genellikle M. abscessus tarafından akciğer enfeksiyonuna dirençlidir. Literatürde, immün yetmezliği olan farelerde M. abscessus ile sürekli bir enfeksiyon oluşturmak için çok sayıda girişim bildirilmiştir. Bunlar arasında, intratrakeal yolla C57BL / 6 farelerine aşılanan agar boncuğuna gömülü bakterilere dayanan yöntemlerin en umut verici olduğu kanıtlanmıştır. Bu yaklaşımın en büyük sınırlaması, tekrarlanabilir büyüklük ve bakteri sayılarına sahip agar boncuklarının hazırlanması ve ardından intratrakeal inokülasyonun yapılması ile ilgili teknik zorluktur. Burada, ilk olarak, optimum çapta ve tekrarlanabilir bakteri yükünde M. abscessus yüklü agar boncukları sağlayan optimize edilmiş bir protokolün ayrıntılı bir tanımını sunuyoruz. Daha sonra, aşılama cihazlarının yüzeylerine yapışma nedeniyle boncuk ve bakteri kayıplarını önlemek ve agar gömülü M. abscessus'un tekrarlanabilir pulmoner birikimini elde etmek için optimize edilmiş ayrıntılı bir intratrakeal aşılama protokolü sunuyoruz. Amaç, uygulama kolaylığı ve laboratuvardan laboratuvara mükemmel tekrarlanabilirlik sağlamaktır.

Giriş

Mycobacterium abscessus (Mab) akciğer hastalığı için tedavi seçenekleri sınırlıdır ve çoğu optimal bakterisidal aktiviteye sahip olmayan ve önemli toksisite ile ilişkili olan oral, parenteral ve bazen inhale antibiyotiklerle yıl boyu süren çoklu ilaç rejimlerini içerir 1,2,3,4,5 . Daha kısa, daha güvenli ve daha etkili tedavilere acilen ihtiyaç vardır. Mikobakteriyel enfeksiyonların fare modelleri, etkili ilaçların ve ilaç rejimlerinin keşfi ve optimizasyonunda etkili olmuştur 6,7. Bununla birlikte, farelerde ilerleyici ve sürekli akciğer enfeksiyonlarının oluşturulmasının zorluğu nedeniyle Mab enfeksiyonlarına karşı antibiyotiklerin klinik öncesi değerlendirmesinin zor olduğu kanıtlanmıştır 8,9.

İmmünkompetan fare suşlarının Mab ile enfeksiyonu büyük ölçüde geçici kolonizasyona ve ardından patojenin hızlı bir şekilde temizlenmesine neden olur10,11. Klinik olarak gözlemlendiği gibi kronik enfeksiyon elde etmek için, immün yetmezliği olan farelerde Pseudomonas aeruginosa veya Haemophilus influenza gibi fırsatçı patojenlerin kalıcılığını ve bunlara karşı immünopatolojik yanıtları teşvik etmek için agaroz veya agar gibi immobilize edici ajanlar kullanılmıştır 12,13,14. Bu model yakın zamanda immünokompetan C57BL / 6N farelerinde 15,16,17,18 Mab ATCC 19977 ile kronik solunum yolu enfeksiyonu elde etmek için uyarlanmıştır. Yöntem, ~ 1 ×10 4 ila 1 × 106 koloni oluşturan birimler (CFU) ile intratrakeal inokülasyondan sonra 45 güne kadar kalıcı enfeksiyona neden oldu, enfekte fareler arasında kronik enfeksiyon insidansı %90-10019 ve parçalanan agar boncuğu18 çevresinde organize granülom oluşumu. Mab'ın boncuklara gömülmesinin, doğuştan gelen bağışıklık sistemi tarafından hızlı bir şekilde temizlenmesinden koruduğu ve bakteri yüklü boncukların, granülom oluşumuna ve kronik enfeksiyonun oluşumuna yol açan bağışıklık hücrelerinin toplanması için odaklar oluşturduğu görülmektedir18. Agar/agaroz boncukları, minimal inflamatuar yanıtları indükleyen nispeten inert bir biyomateryal oluşturur. Ek olarak, boncuklar yavaşça parçalanır ve yabancı cisim alerjik reaksiyonları veya indüklenmiş fibroz sorunlarından kaçınır. Mikropüskürtme cihazı olsun veya olmasın intratrakeal enfeksiyon, aşının akciğerlere etkili bir şekilde birikmesini sağlar 8,20,21 ve klinik maruziyeti ve enfeksiyonu intravenöz veya intranazal aşılamadan daha iyi çoğaltır.

Bu nedenle model birçok avantaj sunuyor. Bununla birlikte, (i) tekrarlanabilir boncuk boyutuna ulaşmak, (ii) tekrarlanabilir boncuk bakteri yükü elde etmek ve (iii) aşılamanın tutarlı intratrakeal iletimini sağlamak gibi teknik nitelikte birkaç zorlukla birlikte gelir. Burada, bu hedeflere güvenilir bir şekilde ulaşmak ve laboratuvardan laboratuvara tekrarlanabilirliği sağlamak için ayrıntılı protokoller sunuyoruz.

Protokol

Tüm hayvan çalışmaları, Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na uygun olarak, NIAID (NIH), Bethesda, MD Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi'nin onayı ile gerçekleştirilmiştir. Tüm prosedürler Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır. M. abscessus ile ilgili tüm çalışmalar, biyogüvenlik muhafaza seviyesi 2 olan bir laboratuvarda gerçekleştirilmiştir.

1. Agar boncuğu gömülü M. abscessus inoculum'un hazırlanması

  1. 1.5 mL optik yoğunluk (OD600) 1 (bir spektrofotometre kullanarak) kültürünü 200 mL Middlebrook 7H9 ortamına aşılayarak bir ön kültür hazırlayın M. abscessus ATCC 19977% 0.05 (h / h) Tween 80,% 0.5 (h / h) gliserol ve% 10 (h / h) Middlebrook albümin-dekstroz-katalaz zenginleştirme (ADC).
  2. Kültürleri bir Rulo Şişede 37 ° C'de 24 saat boyunca orta log fazına ulaşana kadar inkübe edin (OD600 = 0.4-0.6).
  3. 1.2 g Triptik Soya Suyunu (TSB) 40 mL ultra saf suda askıya alın ve %1.5'lik bir nihai konsantrasyona kadar 0.6 g Difco Agar ekleyin.
  4. 60 mL ağır mineral yağı 500 mL'lik bir Erlenmeyer şişesine aktarın ve hem mineral yağı hem de Triptik Soya Agarını (TSA) 121 °C'de 15 dakika sterilize edin, ardından 50 °C'de bir fırında dengeleyin.
  5. Kültürden 1 mL numune alın ve OD600'ü ölçün.
  6. Hücreleri 4 ° C'de 15 dakika boyunca 3700 g'da santrifüjleme ile hasat edin. Yaklaşık 30'luk bir OD600 elde etmek için hücreleri 4 mL 1x Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salin (DPBS) içinde yeniden süspanse edin.
  7. 3 mL bakteri süspansiyonunu 50 mL'lik bir santrifüj tüpünde 50 ° C'de önceden dengelenmiş 27 mL erimiş TSA ile karıştırın. Vorteksleme veya pipetleme ile hızlı bir şekilde karıştırın.
  8. Bakteri-agar karışımını (30 mL) dikkatlice 60 mL mineral yağa dökün ve şişeyi ikincil bir kaba koyun. Karışımı, manyetik bir karıştırma çubuğu kullanarak 420 °C'ye ayarlanmış bir manyetik karıştırıcıda orta hızda (50 rpm) hızla dönecek şekilde ayarlayın. Yağ-agar karışımında görünür bir girdap oluştuğundan emin olun. Oda sıcaklığında (RT) 6 dakika karıştırın.
  9. İkincil kaba buz koyarak karışımı soğutun ve 35 dakika karıştırmaya devam edin.
  10. Karıştırmayı durdurun ve agar-boncuk bulamacını 20 dakika dinlendirin (gerektiği kadar buzu doldurun).
  11. Bulamaç karışımını iki adet 50 mL'lik santrifüj tüpüne aktarın ve yağı ve serbest bakterileri uzaklaştırmak için bir hacim DPBS ile 10 kez yıkayın (ilk 5 döngü için 3700 g, 6 dakika, 4 °C).
    1. Üçüncü yıkamada agar boncuk süspansiyonlarını tek bir tüpte birleştirin. İlk 5 yıkama döngüsü sırasında, boncukları nazikçe yeniden süspanse etmek için serolojik bir pipet kullanın.
    2. Sonraki 5 yıkama döngüsü için aşağıdaki santrifüj parametrelerini kullanın: 5 dakika boyunca 2000 g , ardından sırasıyla 4, 3, 2 ve 2 dakika boyunca 1000 g .
  12. DPBS'deki agar boncuklarını 40 mL'lik nihai hacme yeniden süspanse edin, 125 mL'lik steril bir şişeye aktarın ve 120 mL DPBS ekleyerek 4x'i seyreltin.
  13. Süspansiyonu 200 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirin.
    1. Süzgeci steril 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne takın. Ardından, süzgecin üzerine numune materyali ekleyin ve boncuk süspansiyonunu süzün.
    2. Filtrasyon işlemini kolaylaştırmak için, bir hücre süzgeci, bir huni, bir bağlantı halkası ve 50 mL'lik bir tüpü bir ünitede birleştirin. Parçaları huni, hücre süzgeci, konektör halkası ve 50 mL tüp sırasına göre birleştirin ve konektör halkasına bağlı 30 mL'lik bir şırınganın pistonunu yavaşça çekin.
  14. Gerekirse, kalan daha büyük boncukları yıkamak için süzgeci karşı taraftan DPBS ile durulayın. Seyreltilmiş süspansiyonu 1000 g'da 2 dakika döndürerek veya boncukların yerçekimi ile çökelmesine izin vererek konsantre edin. Hasattan sonra agar taneciklerini 4 °C'de 1 haftaya kadar saklayın. Her deney grubu için taze hazırlık önerilir.
  15. Boncuk süspansiyonunun 5 μL'sini bir cam slayt üzerine pipetleyin, bir kapak fişi ile örtün ve 10× objektif lensli bir ışık veya floresan mikroskobu kullanarak birkaç rastgele konumda görüntü alın. Görüntüleri kaydedin ve ImageJ ile damla çapını ölçün (istenen boyut aralığı: 200 ± 50 μm).

2. Agar boncuğu gömülü M. abscessus inoculum'un titrasyonu

  1. Bir M Tüpüne 1 mL boncuk süspansiyonu ekleyin ve önceden tanımlanmış RNA.02.01 programına ayarlanmış bir ayrıştırıcı kullanarak boncuklara gömülü bakterileri serbest bırakmak için aseptik olarak homojenize edin.
  2. 100 μL homojenat alın ve seri olarak 1:10 ila 1 × 10-5 seyreltme ile seyreltin. %10 Oleik Asit-Albümin-Dekstroz-Katalaz (OADC) ve %2 gliserol ile desteklenmiş 7H10 agar üzerine seyreltmeler yayın. 3 ila 5 günlük inkübasyondan sonra CFU'yu numaralandırın.
  3. Aşı titresini gerektiği gibi ayarlayın. Örneğin, her fare 10 fareye 1 × 105 CFU içeren 100 μL boncuk süspansiyonu alırsa, şırıngalardaki kayıpları hesaba katmak için 1 × 106 CFU/mL içeren toplam 2 mL süspansiyon artı ~%25 hazırlanır.

3. Şırınga ve iğne yoluyla boncuk dağıtımının test edilmesi

NOT: Boncukların şırınga veya iğnenin yüzeylerine yapışmamasını sağlamak için aşağıdaki adımlar dahil edilmiştir. Plastik yüzeylere yapışma nedeniyle boncuk kaybını önlemek için cam şırınga ve 24 G metal besleme iğnesi kullanmanın önemli olduğu tespit edilmiştir.

  1. 1.25 mL steril Tween 80 ila 500 mL steril PBS ekleyerek PBST'yi hazırlayın.
  2. Besleme iğnesinden geçen agar boncuklarının test edilmesi için beş M tüpüne 900 μL PBST ve ayrıca her itme numunesinin -2 ila -6 dilüsyonunu hazırlamak için 2 mL steril tüplere 900 μL PBST ekleyin.
  3. Tüm boncukların eşit şekilde dağıldığından emin olmak için daha önce hazırlanmış agar boncuğu gömülü M. abscessus'u bir P1000 pipeti kullanarak karıştırın.
  4. Cam şırıngaya 24 G'lik bir metal besleme iğnesi takın ve hava kabarcıklarının oluşmasını önlemek için agar boncuk süspansiyonunu aspire edin.
  5. Şırınga hava kabarcıkları olmadan dolduğunda, klipsler arasında boşluk kalmayacak şekilde şırınganın pistonuna naylon klipsler veya tıpalar yerleştirin. Tıpalar, 50-100 μL'lik doğru dağıtıma izin verir. Piston boyunca 6 adede kadar klips takmak mümkündür.
  6. 100 μL boncukları ("itme") M tüplerine kendi sıralarına göre dağıtın.
  7. 5 itme toplandıktan sonra, donmuş organlardan RNA hazırlığı için yeterli olan ve hücre canlılığını etkilemeden boncuklardan M. abscessus'u etkili bir şekilde serbest bıraktığı bulunan RNA.02.01 ayarına ayarlanmış doku ayrıştırıcıyı kullanarak boncukları homojenize edin.
  8. Homojenatlar için -1 ila -6 aralığında seri seyreltme yapın. Seyreltmeleri OADC ile desteklenmiş 7H11 agar plakaları üzerine koyun. 5 gün sonra CFU'yu sayın.

4. Farelerin intratrakeal aşılanması

  1. 6 ila 8 haftalık CD-1 fareleri hazırlayın.
  2. Fareleri, daha önce tarif edildiği gibi% 1-5'lik bir akış hızında bir izofluran aerosol maruz kalma sistemi kullanarak sakinleştirin1.
  3. Üç boyutlu (3 boyutlu) baskılı eğik stand (özel olarak tasarlanmış ve üretilmiştir) kullanarak fareleri dizginleyin. Standın ortasındaki çubuk, fareyi kesici dişlerinden dikey olarak tutan ve fareyi başı kaldırılmış olarak ventral yaslanmış bir pozisyona yerleştiren bir dikiş ipine sahiptir.
  4. 24 G'lik metal bir hayvan besleme iğnesini, agar boncuğu gömülü M. abscessus ile doldurulmuş bir cam şırıngaya takın. Her fareyi 50 μL aşı ile enfekte etmek için şırınganın pistonuna naylon klipsler veya tıpalar yerleştirin.
  5. Sedasyonlu fare dikiş iğnesi üzerinde tutulduktan sonra, bir pamuklu çubuk aplikatörü kullanarak dili ağzın yan tarafına hareket ettirin.
  6. Ağzın arkasındaki beyaz bölümü net bir şekilde tanımlamak ve farenin soluk borusunu hedeflemek için farenin ağzının arkasını görselleştirin.
  7. Metal gavaj iğnesini farenin üzerine dikey olarak eğin ve soluk borusunun üst kısmına yerleştirin. Epiglotis'ten geçerken hafif direnç olabilir.
  8. Gavaj iğnesini trakeaya kaydırın, naylon klipsi veya tıpayı çıkarın ve 50 μL agar boncuğu gömülü M. abscessus dağıtın.
  9. Fareyi 5 dakika dinlendirin ve 4.2-4.8 arasındaki adımları ikinci kez tekrarlayın. İki aşamalı bir aşılama prosedürünün amacı, tam aşının akciğerde tekrarlanabilir ve derin bir şekilde birikmesini sağlamaktır.
  10. Enfeksiyonun 24 saat ilerlemesine izin verin, ardından fareye akciğerlerde bakteri birikimini saymak için ötenazi yapılır.

Sonuçlar

Boncuk boyutu ve yükü
Agar boncuklarını ve bakteri yüklerini görselleştirmek için, mCherry kırmızı floresan proteini, Mab tipi ATCC 19977 suşunda kurucu Hsp60 promotörü altında eksprese edildi ve bu suşu yukarıda tarif edildiği gibi agar boncuklarına gömdü. Şekil 1A , boncuk boyutu aralığını göstermektedir (ölçek çubuğu = 200 μm). Şekil 1B , 6 bağımsız boncuk preparatının yükünü göstermekte ve prosedürün tarif edildiği gibi tekrarlanabilirliğini göstermektedir.

İntratrakeal inokülasyonu takiben şırınga itme ve bakteri implantasyonunun kaplanması
İntratrakeal inokülasyon iki aşamada optimize edildi. CFU / mL, boncuklar şırıngadan ve bağlı tüpten geçerken herhangi bir boncuk veya bakteri kaybı meydana gelmediğinden emin olmak için cam şırıngadan geçmeden önce ve sonra aşıda numaralandırıldı. Tablo 1 , iki bağımsız boncuk preparatının (deneme 1 ve 2) ilk bakteriyel titresini ve tek bir şırınga yükünden 100 mL 'itilmiş' numune başına geri kazanılan CFU sayısını göstermektedir. Boncuk ve bakteri kayıplarını önlemek için, metal bir tüpe bağlı bir cam şırınga gereklidir. Agar boncukları plastik yüzeylere yapışma eğilimindedir.

Boncuk hazırlamada zaman içinde yapılan CFU sayımı, boncukların bakteri yükünün 1 hafta boyunca 4 ° C'de sabit kaldığını, 2 haftada ~ 2 kat bakteri yükü kaybı ve bozulmamış akciğer birikimi olduğunu gösterdi. Daha sonra, 5 ila 8 fareden oluşan gruplar, intratrakeal aşılama prosedürünün tekrarlanabilirliğini test etmek için üç bağımsız boncuk preparatı ile enfekte edildi. Tablo 2 , tarif edildiği gibi enfeksiyondan 24 saat sonra numaralandırılan fare başına akciğer CFU'larının sayısını göstermektedir.

Son olarak, enfeksiyonun operatörler arası tekrarlanabilirliği, her biri farklı bir operatör tarafından gerçekleştirilen 10 CD-1 faresinden oluşan üç grubun enfekte edilmesiyle değerlendirildi. Enfeksiyondan 24 saat sonra numaralandırılan akciğer CFU'ları Şekil 2'de gösterilmiştir.

figure-results-1
Şekil 1: Boncuk boyutunu değerlendirmek, M. abscessus bakteri yükünü görselleştirmek ve ölçmek için pilot deney. (A) M. abscessus ATCC 19977 suşu içeren agar boncukları, kurucu hsp60 promotörü altında mCherry kırmızı floresan proteinini eksprese etmek için tasarlanmıştır. Beş μl boncuk süspansiyonu bir cam slayt üzerine yayıldı ve bir kamera (10x objektif) ile donatılmış bir floresan mikroskobu ile görüntülendi. Her kırmızı nokta, ~ 70-250 μm arasında değişen çaplarda agar boncukları içine alınmış bir floresan bakteri hücresidir. (B) Yöntemin tekrarlanabilirliğini gösteren 6 ayrı boncuk preparatının CFU / mL cinsinden bakteri yükü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Enfeksiyonun operatörler arası tekrarlanabilirliği. 10 CD-1 dişi fareden oluşan gruplar, aynı boncuk preparatını kullanarak, tarif edildiği gibi üç bağımsız operatör tarafından intratrakeal olarak enfekte edildi. Enfeksiyondan 24 saat sonra numaralandırılan akciğer CFU'ları gösterilmiştir. O1, O2, O3: operatörler 1, 2 ve 3. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

CFU/100 μL
Boncuk hazırlamaDeneme 1Deneme 2
1.13E+052.40E+05
Şırınga itme örneği
11,14E+055.10E+05
21,36E+054.10E+05
39.30E+043.90E+05
49.80E+043.60E+05
51,14E+05
Ortalama1.11E+054.18E+05
SD1.69E+04 ()6.50E+04 ()

Tablo 1: Cam şırınga ve metal besleme iğnesinden geçtikten sonra 100 μL'lik numune başına koloni oluşturan birimler (CFU).

Deneme 1Deneme 2Deneme 3
Fare KimliğiAkciğer CFU/fareFare KimliğiAkciğer CFU/fareFare KimliğiAkciğer CFU/fare
M-1 Serisi6.50E+03M-6 Serisi2.20E+05M-11 Uçağı6.80E+04
M-2 Serisi1.10E+04M-7 Serisi2.70E+05M-12 Serisi1.70E+05
M-3 Serisi1.40E+04M-8 Serisi8.10E+04M-13 Uçağı2.10E+05
M-4 Serisi3.20E+03M-9 Serisi1.40E+05M-14 Uçağı4.40E+04
M-5 Serisi4.50E+03M-10 Serisi1.30E+05M-15 Uçağı7.50E+04
M-16 Uçağı1.01E+05
M-17 Zırhlı Uçaklar7.00E+04
M-18 Radarı5.80E+03
Ortalama7,84E+03Ortalama1,68E+05Ortalama9.30E+04
SD4.54E+03 (X)SD7.57E+04 (E)SD6.67E+04 (r)

Tablo 2: Aşılamadan 24 saat sonra fare akciğerlerine agar boncuğu gömülü M. abscessus implantasyonu

Tartışma

Agar boncuklarındaki bakterilerin eşit dağılımını sağlamak için, erimiş agar-bakteri karışımını yağ fazına eklemeden önce eşit şekilde süspanse etmek önemlidir. Yağ-agar-bakteri hacim oranı, boncuk boyutunun kontrolünde kritik öneme sahiptir. Daha yüksek bir yağ-agar oranı, daha küçük agar boncuklarının oluşumuna yol açar. Agar-bakteri süspansiyonunu yağ fazı ile karıştırırken, sıcaklık kontrolü kritik öneme sahiptir. Yağ-agar karışımı, emülsifikasyon ve damlacık oluşumuna izin verecek kadar sıcak, ancak bakterilere zarar vermeyecek kadar soğuk olmalıdır. Karışımı oda sıcaklığına veya altına soğuturken sürekli karıştırmak, agar damlacıklarının oluşmasına ve katılaşmasına izin verir.

Karıştırma plakasının uygun kalibrasyonu, karıştırma çubuğunun boyutu ve şişenin şekli ve boyutu, düzgün bir girdabın önemli belirleyicileridir. Şişenin ortasına yerleştirilmiş bir karıştırma çubuğu, simetrik bir girdap oluşturarak homojen bir karıştırma sağlar. Merkez dışı bir karıştırma çubuğu, kararsız bir girdaba yol açabilir, bu da düzensiz şekilli boncuklara ve boncuklara hava kabarcıklarının girmesine neden olabilir. Karıştırma çubuğunun konumunun gerçek zamanlı olarak izlenmesi ve ayarlanması önerilir. Şişenin hacminin, yağ-agar karışımının hacmi ile orantılı olması gerekir. 500 mL'lik bir şişe, 90 mL'lik bir yağ-agar karışımını eğirmek için idealdir ve görünür bir girdap oluşturur. Daha büyük şişeler kullanırken, etkili karıştırma ve kararlı girdap arasında bir denge sağlamak için yağ-agar karışımının hacmini, karıştırıcının boyutunu ve girdap hızını ayarlamak önemlidir. Proses sırasında ve boncuk hazırlıkları boyunca tutarlı girdap hızının korunması, partiden partiye tekrarlanabilirlik için kritik öneme sahiptir.

Agar boncuğu hazırlama işlemi, özellikle girdap hızı ve yağ-agar oranı, küçük değişikliklerle 16,22'den uyarlanmıştır. Eğirme girdabı içindeki kesme kuvvetleri, doğası gereği farklı boyutlarda boncuklar üretir. Bu boyut değişkenliğini en aza indirmek için, boncuk toplama adımı, küçük boyutlu boncukların (ve serbest bakterilerin) uzaklaştırılmasını sağlamak için azalan santrifüjleme hızı ve süresi gradyanı kullanılarak birkaç yıkama adımı eklenerek değiştirildi. İstenilen boyuttaki boncukları zenginleştirmek, daha büyük boncukları ve rastgele birleşme yoluyla oluşmuş olabilecek boncukları etkili bir şekilde filtrelemek için bir mikro gözenekli filtre kullanıldı. Boncuk bulamacı, farenin intratrakeal aşılanması için şırıngadan ve bağlı tüpten geçerken boncuk veya bakteri kayıplarını önlemek için, bir cam şırınga, 24 G metal besleme iğneleri ve metal bağlantılı bir tüp kullanmak çok önemlidir.

Yöntemin en önemli sınırlaması, tekrarlanabilir boncuk yükü ve akciğer implantasyonu elde etmek için boncuk hazırlığının ve intratrakeal inokülasyonun teknik karmaşıklığıdır. Ayrıntılara dikkat ve sorun giderme yeteneği gereklidir. Ek olarak, model, bakım standardı antibiyotiklerin ve Mab hastalarına uygulanan en sık antibiyotik kombinasyonlarının etkinliğini test ederek tam olarak doğrulanmamıştır.

Şu anda, kronik Mab enfeksiyonunun hiçbir fare modeli, hastalarda tek ajanların ve ilaç kombinasyonlarının etkinliğinin model9 tarafından makul bir şekilde tahmin edilebileceği ölçüde doğrulanmamıştır. Agar boncuğuna gömülü C57BL/6 fare sistemi, antimikrobiyal tedavilerin etkinliğini test etmek için kullanılmıştır 15,19,23. Agar boncuğuna gömülü C57BL/6 fare sistemine en yakın alternatif, dayanıklı bir kronik enfeksiyon elde etmek için deksametazon immünosupresyonuna dayanan C3HeB/FeJ fare modelidir24,25. Burada tarif edilen protokolün avantajları, (i) tamamen immünokompetan ve en uygun fiyatlı C57BL / 6 farelerin kullanılabilmesi, (ii) iyi karakterize edilmiş ATCC 19977 tipi suşu ile üretken ve kronik bir enfeksiyon elde edilebilmesi ve (iii) kimyasal olarak indüklenen immünosupresyon gereksinimi olmamasıdır, günlük deksametazon enjeksiyonlarına olan ihtiyacı ortadan kaldırır, böylece potansiyel ilaç-ilaç etkileşimlerinden ve akciğer immünopatolojisi üzerindeki etkiden kaçınır.

Yeni ilaç adaylarını ve ilaç rejimlerini değerlendirmek için kronik Mab enfeksiyonunun doğrulanmış fare modellerinin eksikliği göz önüne alındığında 8,9, burada açıklanan teknik, alanı ileriye taşıma, klinik öncesi etkinlik verilerinin öngörücü değerini iyileştirme, kalıcı tedavi sağlama potansiyeli en yüksek olan ilaç rejimlerine öncelik verilmesine yardımcı olma ve Mab akciğer hastalığı için ilaç keşfini ve geliştirmeyi genel olarak hızlandırma potansiyeline sahiptir. Yöntem diğer akciğer patojenlerine uygulanabilir ve P. aeruginosa veya Haemophilus influenza için yerleşik bir geçmişe sahiptir. Burada açıklanan protokolün temel amacı, uygulama kolaylığı ve laboratuvardan laboratuvara mükemmel tekrarlanabilirlik sağlamak için yeterli ayrıntı ve öneri sağlamaktır.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmezler

Teşekkürler

Bu çalışma, Kistik Fibrozis Vakfı, TD ve VD'ye DICK24XX0 ve NIH-NIAID'den TD ve VD'ye R01-AI132374 tarafından finanse edildi.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
125 mL şişeCorning8388Steril
3 x 3 Tüp Tutma RafıFisher5972-0030PKKullanmadan önce dezenfekte edilir
3D Baskılı Fare StandıTransworld Marketing özel olarak tasarlanmış ve üretilmiştirKullanımdan önce dezenfekte edilmiş
48 oyuklu seyreltme Plate Celltreat 229192Steril
50 mL santrifüj tüpleriGreiner Bio-One227261Steril
Anestezi MakinesiEZ SistemleriEZ-AF9000 SİSTEMyok
Avanti J-15R Beckman Coulter  B99517Kaldırma Kapaklı
Rafta Santrifüj Bariyer Pipet Uçları 1000GThermo Scientific ART 21-236-2ASteril
Biyolojik Tehlike çantasıFisherbrand22-044561
Bağlantı Halkası ve nbsp;pluriSelect41-50000-03
Pamuk Uçlu AplikatörlerPüriten 22-029-571Steril
Tek Kullanımlık Aşılama Halkaları Sarı Steril 100 kilitli torbadaCole-Parmer Essentials 03-391-562Steril
Tek Kullanımlık Poli-Astarlı Havlu ÖrtüsüDynarex19-310-671Steril
Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Tuzlu SuyuThomas Scientific21-031-CMSteril
HunipluriSelect42-50000Steril
GE Ultrospec 10Sigma-AldrichGE80211630Spektrofotometre
Gentlemacs Doku AyrıştırıcıMiltenyi Biotec130-096-427Isıyla aktive edilmemiş
Hamilton Şırınga Hamilton 80801Kullanmadan önce dezenfekte edilmiş
Ağır Mineral YağSigma-Aldrich330760-1LSteril
İzofluran çözeltisi 250 ml şişeCovetrus29405Cilt Aşınması/Tahrişi: Kategori 2, Ciddi Göz Hasarı/Göz Tahrişi: Kategori 2A, Spesifik hedef organ sistemik toksisitesi (tek maruz kalma): Kategori 3
Uyuşukluk ve baş dönmesine neden olabilir, Ciddi göz tahrişine neden olur, Cilt tahrişine neden olur. Nefes almayın, iyi havalandırılan bir alanda kullanın.
M Tüpleri (gentleMACS)Miltenyi Biotec130-096-335Steril
Manyetik karıştırıcı MR Hei-Connect Heidolph505-40000-13-1
Manyetik karıştırma çubuğuThomas Scientific  1181L08Steril
Mekanik Pipet 100– 1000 ve mikro; L Gilson PİMİNDE L FA10006MKullanmadan önce dezenfekte edilir
Mekanik Pipet 20– 200 ve mikro; L Gilson PİMİNDE L FA10003MGKullanmadan önce dezenfekte edilir
Metal Hayvan Besleme İğnesi 24 GBraintree ScientificN-VP 24G-1SSterilize edilmelidir (otoklavlanmalıdır)
Middlebrook 7H10 AgarSigma-AldrichM0303-500GSterilize (otoklavlanmış)
Middlebrook 7H11 AgarThermo FisherR4554002Sterilize (otoklavlanmış)
Middlebrook 7H9 mediumBeckton Dickinson271310Sterilize (otoklavlanmış)
Fare Standı ParçalarıTriMech Çözümleri SRV-AMS-FDMKullanımdan önce dezenfekte edilmiş
Emilemeyen İpek SütürFisher Scientific18020-50n/a
OADC Middlebrook Media ile kullanım için Sıvı Zenginleştirme 500 mlThermo Scientific Remel R450605Steril
PBS (10x), pH 7.4 Steril Filtreli 500 mLGibco70-011-044Steril
Peroxiguard MendilPeroxigard29221n/a
Şeffaf Kapaklı Petri Kapları Yuvarlak 100mmx 15mmFisherbrand FB0875712Steril
PluriSüzgeç 200 mmpluriSelect43-50200-03Steril; hücre süzgeci
Rulo şişelerCorning430165Steril
Serolojik pipetCorning4489Steril
Spektrofotometre küvetleri 1,5 mLFisher Scientific14955127Sterilize (otoklavlanmış)
Şırınga tıpaları veya klipsler (naylon)Trimech SRV-AMS-MJFKullanımdan Önce Dezenfekte
Edildi Triptik Soya SuyuSigma-AldrichT8907-500GSteril
Tween 80 Fisher170793Filtresi sterilize edildi ve nbsp;
Geniş Delikli Filtreli Pipet Uçları Kaldırma Kapaklı Raf 200G Thermo Scientific ART21-236-1ASteril
:

Kaynaklar

  1. Dartois, V., Dick, T. Drug development challenges in nontuberculous mycobacterial lung disease: Tb to the rescue. J Exp Med. 219 (6), e20220445(2022).
  2. Martiniano, S. L., Nick, J. A., Daley, C. L. Nontuberculous mycobacterial infections in cystic fibrosis. Clin Chest Med. 43 (4), 697-716 (2022).
  3. Maurer, F. P., et al. Lack of antimicrobial bactericidal activity in mycobacterium abscessus. Antimicrob Agents Chemother. 58 (7), 3828-3836 (2014).
  4. Wu, M. L., Aziz, D. B., Dartois, V., Dick, T. Ntm drug discovery: Status, gaps and the way forward. Drug Discov Today. 23 (8), 1502-1519 (2018).
  5. Egorova, A., Jackson, M., Gavrilyuk, V., Makarov, V. Pipeline of anti-mycobacterium abscessus small molecules: Repurposable drugs and promising novel chemical entities. Med Res Rev. 41 (4), 2350-2387 (2021).
  6. Nuermberger, E. Using animal models to develop new treatments for tuberculosis. Semin Respir Crit Care Med. 29 (5), 542-551 (2008).
  7. Nuermberger, E. L. Preclinical efficacy testing of new drug candidates. Microbiol Spectr. 5 (3), (2017).
  8. Nicola, F., Cirillo, D. M., Lore, N. I. Preclinical murine models to study lung infection with mycobacterium abscessus complex. Tuberculosis (Edinb). 138, 102301(2023).
  9. Dartois, V., et al. Preclinical murine models for the testing of antimicrobials against mycobacterium abscessus pulmonary infections: Current practices and recommendations. Tuberculosis (Edinb). 147, 102503(2024).
  10. Obregon-Henao, A., et al. Susceptibility of mycobacterium abscessus to antimycobacterial drugs in preclinical models. Antimicrob Agents Chemother. 59 (11), 6904-6912 (2015).
  11. Lerat, I., et al. In vivo evaluation of antibiotic activity against mycobacterium abscessus. J Infect Dis. 209 (6), 905-912 (2014).
  12. Saliu, F., et al. Chronic infection by nontypeable haemophilus influenzae fuels airway inflammation. ERJ Open Res. 7 (1), (2021).
  13. Rodgers, A. M., et al. Biologically relevant murine models of chronic pseudomonas aeruginosa respiratory infection. Pathogens. 12 (8), 1053(2023).
  14. Hoover, J. L., et al. A robust pneumonia model in immunocompetent rodents to evaluate antibacterial efficacy against s. Pneumoniae, h. Influenzae, k. Pneumoniae, p. Aeruginosa or a. Baumannii. J Vis Exp. (119), e55068(2017).
  15. Lore, N. I., et al. The aminoglycoside-modifying enzyme eis2 represents a new potential in vivo target for reducing antimicrobial drug resistance in mycobacterium abscessus complex. Eur Respir J. 60 (6), 2201541(2022).
  16. Riva, C., et al. A new model of chronic mycobacterium abscessus lung infection in immunocompetent mice. Int J Mol Sci. 21 (18), 6590(2020).
  17. Chang, V., Phillips, P. P. J., Imperial, M. Z., Nahid, P., Savic, R. M. A comparison of clinical development pathways to advance tuberculosis regimen development. BMC Infect Dis. 22 (1), 920(2022).
  18. Yang, S. J., et al. Pathological granuloma fibrosis induced by agar-embedded mycobacterium abscessus in c57bl/6jnarl mice. Front Immunol. 14, 1277745(2023).
  19. Poerio, N., et al. Combined host- and pathogen-directed therapy for the control of mycobacterium abscessus infection. Microbiol Spectr. 10 (1), e0254621(2022).
  20. Pearce, C., et al. Inhaled tigecycline is effective against mycobacterium abscessus in vitro and in vivo. J Antimicrob Chemother. 75 (7), 1889-1894 (2020).
  21. De Groote, M. A., et al. Gm-csf knockout mice for preclinical testing of agents with antimicrobial activity against mycobacterium abscessus. J Antimicrob Chemother. 69 (4), 1057-1064 (2014).
  22. Facchini, M., De Fino, I., Riva, C., Bragonzi, A. Long term chronic pseudomonas aeruginosa airway infection in mice. J Vis Exp. (85), e51019(2014).
  23. Degiacomi, G., et al. The novel drug candidate vomg kills mycobacterium abscessus and other pathogens by inhibiting cell division. Int J Antimicrob Agents. 64 (4), 107278(2024).
  24. Rimal, B., et al. T405, a new penem, exhibits in vivo efficacy against m. Abscessus and synergy with beta-lactams imipenem and cefditoren. Antimicrob Agents Chemother. 66 (6), e0053622(2022).
  25. Maggioncalda, E. C., Story-Roller, E., Ammerman, N. C., Nuermberger, E. L., Lamichhane, G. Progressive mycobacterium abscessus lung infection in c3heb/fej mice associated with corticosteroid administration. bioRxiv. , (2018).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Agar Boncuk Haz rlamantratrakeal nok lasyonKronik Akci er EnfeksiyonuPulmoner Enfeksiyon ModeliAntibiyotik Etkinlik TestiBakteriyel Say mFare Enfeksiyon ProtokolPreklinik la Testi

İlgili makaleler