Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Sağlam Bir Pankreas ile Farelerin Damar Sisteminden Perfüzyon Yoluyla Glikozla Uyarılan İnsülin Sekresyonu

1.4K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/67701

⸱

25 Temmuz 2025

 ,  , 
1Joslin Diabetes Center, Harvard Medical School

Bu makalede

Özet

Burada, olası karışıklıkların azaltılması ile endokrin pankreas fonksiyonunu değerlendirmek için ek bir teknik olarak, sağlam bir pankreas ile fare damar sistemi yoluyla perfüzyon yoluyla glikoz ile uyarılan insülin sekresyonu (GSIS) gerçekleştirme hakkında ayrıntılar sunuyoruz.

Özet

Kemirgenlerde glukoz ile uyarılan insülin sekresyonu (GSIS) için mevcut yöntemler, pankreas adacıklarının ve pankreas dilimlerinin ex vivo perifüzyonunu veya statik inkübasyonunu içerir. Ex vivo perfüzyon ve statik inkübasyon, birden fazla numunenin hızlı ve verimli bir şekilde alınmasını sağlar. Bununla birlikte, bu prosedürler adacıkları travmaya, aralıklı hipoksiye ve azalmış parakrin insülin sinyaline maruz bırakır ve bunların tümü GSIS'i etkileyebilir. Bu olumsuz etkiler, farklı GSIS modelleri için başka bir karşılaştırma yöntemi sağlayan sağlam bir pankreas ile fare damar sistemi yoluyla perfüzyon yoluyla en aza indirilebilir. Bu perfüzyon prosedürünün omurgası, i) pankreası izole etmek için damar ligasyonu ve ii) pankreas vaskülatürünün kanülasyonunu içeriyordu. Bu model yedi ligasyon noktası ve iki kanülasyon içeriyordu. Elde edilen perfüze vaskülatür, alt abdominal aort, çölyak ve superior mezenterik arter, dallanan kollar ve portal veni içeriyordu.

Perfüzat, alt abdominal aortu kanüle eden PE-50 tüpüne peristaltik bir pompa yoluyla ~ 2 mL / dk'da vaskülatüre verildi. Perfüzatlar izole vasküler sistemden geçti ve PE-30 tüplü bir kanülasyon yoluyla portal ven yoluyla toplandı. Perfüzat, Krebs-Ringer bikarbonat tamponunda (KRB, 16 mM HEPES ve% 0.1 BSA, pH 7.4) 3-izobutil-1-metilksantin (IBMX) ile 2.6 mM glikoz, 16.8 mM glikoz ve 2.6 mM glikozdan oluşan her bir perfüzat çözeltisi için 30 dakikalık turlar halinde 3 dakikalık aralıklarla toplandı. IBMX çözeltisinden önce, bir yıkama döngüsü olarak normal bir 2.6 mM glikoz çözeltisi getirildi. Cerrahi işlem için toplam süre ~ 1 saat ve perfüzat toplama için 2 saat idi. Perfüzatlar, insülin sekresyonunu ölçmek için bir ELISA yapılana kadar donduruldu.

Bu yöntem listesi, araştırmacıların laboratuvarlarında sağlam pankreas perfüzyonunu başarılı bir şekilde gerçekleştirmelerine olanak tanıyacak olan vasküler sistem sistemi yoluyla pankreas perfüzyonu yoluyla insülin sekresyonu ölçümü için ayrıntılı bir prosedürel temel sağlamayı ummaktadır.

Giriş

Beta hücre fonksiyonunun ölçülmesi ve anlaşılması öncelikle ex vivo perifüzyon, statik inkübasyon ve daha yakın zamanda pankreas dilimleri yoluyla gerçekleştirilmiştir. Bu prosedürler izole adacıkların değerlendirilmesine izin verirken, ilk ikisi adacıkları işlev görme yeteneklerini etkileyen stres faktörlerinden geçirebilir. Rosenberg ve arkadaşları tarafından yapılan bir çalışmada, standart yöntemler kullanılarak izole edilen köpek adacıkları, bazal zarın kaybı, piknotik çekirdeklerin görünümü ve apoptotik cisimlerin ortaya çıkması ile kanıtlanan artmış beta hücre apoptozu göstermiştir1. Bu çalışma, adacık izolasyonundan kısa bir süre sonra apoptozu gösteren morfolojik değişikliklerin gösterildiği insan pankreas adacıklarının izolasyonu ile ilgili başka bir raporla aynı zamana denk gelmektedir 2,3. Artan beta hücre apoptozu, bu adacıklardan insülin salınımının azalmasına yol açarak, adacık izolasyonunun onları hasara ve fonksiyonel bozulmaya yatkın hale getirdiği kavramını destekledi.

Apoptoza ek olarak, adacık izolasyonu ile damar sistemi kaybolur ve bu da besinlerin, metabolitlerin ve hormonların taşınmasının bozulmasına yol açar 4,5. Bu sınırlama, bir tür damar sistemi ve innervasyonu korumak için adacık hücrelerinin göz içine nakli gibi alternatiflere yol açmıştır6. Adacık izolasyonu sırasında damar sistemi mimarisindeki değişiklik, in vivoolarak beklenenden farklı olarak daha kompakt bir adacık da oluşturur 7,8.

Anatomik farklılıklara ek olarak, statik olarak inkübe edilmiş adacıkların davranışı, izole edilmiş perfüze pankreastan farklıdır. Düşük glikozda statik olarak inkübe edilmiş adacıklar için, salınan toplam insülinin %77'si (toplam 4.34 ng'nin 3.31 ng'si) ilk 30 dakika içinde ve sonraki zaman diliminde çok az mevcut olduğu görülmüştür. Bu, tüm zaman noktalarında neredeyse sıfır insülin salınımının olduğu (toplam insülin <1.8 ng) düşük glikoz konsantrasyonlarında izole edilmiş perfüze pankreasın tam tersidir9. Düşük glikoz konsantrasyonlarında bu farkı tam olarak aydınlatmak için daha fazla araştırma yapılması gerekmekle birlikte, verilerdeki bu fark, adacık hücrelerinin tek katmanlarının statik inkübasyonu yoluyla daha fazla incelenen hipoksik ölmekte olan hücrelerden sızıntıyı temsil edebilir. Bununla birlikte, mevcut yöntemler ile in vivo ortamlar arasındaki bu farklılıklar dış geçerliliğin bozulmasına neden olabilir (Tablo 1).

Hipoksiye neden olmanın yanı sıra, hem ex vivo perifüzyon hem de statik inkübasyon, adacıkların pankreastan doku kültürü kaplarına kültürlenmesini ve ayrılmasını ve onları askıda tutmayı içerir. Bu işlem sırasında, kollajenaz tipik olarak pankreas dokusunun ayrışmasına izin vermek için pankreas kanalından perfüze edilir. Kollajenaz, kollajen fibrillerine bağlanır ve nötr proteazlar, jelatinazlar ve endojen pankreas proteazlarının yardımıyla bunları çözer. Birlikte, bu proteazlar, adacıklar hücre dışı matrislerinden ve asiner hücre eklerinden salınana kadar sindirilmeye devam eder. Bu proteaz karışımının dengelenmesi, izole edilmiş adacıkların10 hem saflığı hem de işlevselliği açısından değişen sonuçlar verir. Kollajenazın etkinliği ayrıca suş, yaş, kilo ve diyabet durumu gibi hayvan özelliklerine de bağlıdır. Bu proteazların hayvana özgü özelliklerle birlikte kullanılması, izolasyon işlemi sırasında pankreas adacıklarına zarar verebilir. Kollajenaz uygulanırken, bu proteazlar ayrıca bazal zarın sindirimine yardımcı olan endojen pankreas proteolitik enzimlerini de aktive eder. Bununla birlikte, endojen pankreas enzim aktivasyonunu kontrol etmek henüz mümkün değildir; Bu nedenle, bu yetiştirme sürecinde adacık zararında rol oynayabilir 11,12,13. Edmonton'dan bir rapor, izolasyon için yeterli enzim aktivite seviyesine ulaştığında adacık izolasyon verimini etkileyen endojen proteaz aktivitesinin14,15 olduğunu gösterdi.

Mevcut kollajenaz infüzyon tekniklerinin (intraduktal) adacık iç kısmına da nüfuz ettiği, olası adacık parçalanmasına ve dolayısıyla düşük adacık verimine yol açtığı gösterilmiştir16. Balamurugan ve arkadaşları tarafından yapılan bir çalışmada, kollajenazın infüzyon fare pankreasındaki adacıklarda ve asiner dokuda lokalize olduğu, bunun da yoğun iltihaplanmaya ve apoptotik yolların aktivasyonuna yol açtığı görülmüştür17. İzolasyon aşamasından kurtulan adacıklar, insülin salma yeteneğinin de azaldığını gösterdi.

Ek olarak, adacık hazırlığı sırasındaki mekanik stres ve kültür sırasında hipoksiye bağlı nekroz gibi diğer faktörlerin tümü adacık işleyişinde rol oynar18. Bu özellikler, pankreası izole ederken adacığın canlılığını ve dolayısıyla ortaya çıkan işlevi etkileyebilir.

Ex vivo perifüzyon ve statik inkübasyon yoluyla adacık izolasyonu ve değerlendirmesinin yanı sıra, canlı pankreas dilimlerindeki adacıklar, endokrin hücre yanıtlarını ölçmek için kullanılan başka bir ex vivo yöntemdir19. Bu sistemde, adacık izolasyon prosedürlerinden kaynaklanan kimyasal stres önlenir. Ek olarak, adacık mikro çevresi bozulmadan kalır ve adacık fizyolojisinin in vivo durumu20'ye daha yakın bir şekilde çalışılmasına izin verir. Ex vivo perifüzyon ve statik inkübasyona benzer şekilde, bu pankreas hakkında bilgi edinmede önemli bir rol oynamaya devam edecek bir yöntemdir. Bununla birlikte, bazı sınırlamalar, dilim üretimi sırasındaki mekanik stresin yanı sıra, patoloji ve fizyoloji için sağlam bir pankreasın genel bütünsel bir görünümünün olmamasını içerir. Dilim, pankreas içindeki belirli bir bölgeyi temsil eder, bu da azalan örneklem boyutu ve sınırlı görüş nedeniyle genelleştirilebilirliğini azaltır21.

Bu adacık izolasyonu ve diğer yöntemlere, adacıklara uygulanabilecek çeşitli stres faktörleri eşlik eder. Mekanik stres, hipoksi, proteaz aşırı aktivitesi ve sınırlı görüş, sonuçta ortaya çıkan adacık veriminde ve genel dış geçerlilikte rol oynar. Bu faktörler, pankreasın fare damar sistemi yoluyla perfüzyonu yoluyla azaltılabilir, bu da yukarıdaki stres faktörlerinin tümünü en aza indirirken, aynı zamanda hücresel bütünlüğün korunması nedeniyle vücutta bulunan diğer sekretagogların ve farmakolojik ajanların etkilerinin incelenmesine izin verir22. Önceki çalışmalar, adacık kan akışının plazma insülin seviyeleri üzerindeki etkisini göstermiştir23; Buna karşılık, adacık kan akışını değiştiren anjiyotensin peptitleri ve sempatik agonistler gibi vazoaktif moleküller, adacık fonksiyonunu ve insülin salınımını değiştirir24,25. Pankreas perfüzyonu, bu ve diğer farklı moleküllerin endokrin hücre yanıtını nasıl etkileyebileceğinin daha fazla değerlendirilmesine izin verecektir. Bu sistem, endokrin pankreas biyolojisi hakkındaki anlayışımızın, sağlam bir damar sistemi ve innervasyon ile doğal mikro ortamında çapraz konuşmanın varlığında daha fazla kavramsal ilerlemesine izin vermeyi ummaktadır. Ek olarak, bu protokolde sağlam pankreasın perfüzyonu, organın izolasyonuna izin vererek, tüm farenin perfüzyonuna kıyasla insülini dolaşımdan temizleyen karaciğer gibi diğer organlardan gelen potansiyel karışıklıkları azaltır. Tüm farenin perfüzyonu, cerrahi tekniğin azalmasına izin verecektir; Bununla birlikte, yine de perfüzatın pankreastan sonra ve karaciğere ulaşmadan önce bir damar yoluyla toplanmasını gerektirecektir - muhtemelen portal ven. Portal ven toplanması kanülasyon gerektirmeye devam edecektir. Tüm fare perfüzyonu, azaltılmış cerrahi adımların faydasını sağlarken, anjiyotensin peptitleri üreten böbrekler ve akciğerler gibi organların yarattığı karışıklıklar nedeniyle sınırlamalar olacaktır. Bununla birlikte, bu, diğer organlardan üretilen vazoaktif moleküllerin birincil öncelik olan pankreas adacıkları üzerindeki etkilerini incelerken yararlı olabilecek yeni bir yaklaşım olacaktır.

Tüm pankreas perfüzyonu geçmişte başkaları tarafından başarıyla gerçekleştirilmiştir 7,22,26. Bu güncellenmiş protokolde, farelerin kullanımı, sıçanlara kıyasla daha küçük anatomileri nedeniyle artan bir teknik zorluk teşkil etmektedir. Bununla birlikte, bu prosedür, 3 bağımsız farenin sağlam pankreasından iyi karakterize edilmiş bir insülin salgı profili göstererek bu protokolün fizibilitesini başarılı bir şekilde göstermektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Kemirgenler üzerinde yapılan tüm araştırmalar Joslin Diyabet Araştırma Merkezi yönergelerine (onay numarası 22-01) uygundur.

1. Başlangıç

  1. Anestezi uygulayın.
    1. Açlıklı, normoglisemik farelere (deneylerde kullanılan Flox / Cre 53-74 haftalık M / F) ketamin / ksilazin karışımı (~ 75 mg / kg ketamin HCl karışımı) enjekte edin, ötenazi için 28 G iğne ile arka uyluklardan birinden intramüsküler olarak uygulanır.
      NOT: Normoglisemik, açlık farelerin kullanımı ketaminin etkilerini azaltmak için önemlidir; Bununla birlikte, bir anestezik ikame edilebilir.
    2. Refleksi kontrol etmek için arka ayağı forseps ile sıkıştırarak farenin uygun şekilde uyuşturulduğundan emin olun.
      NOT: Refleks eksikliği, sıkışmış bacağın hareket eksikliği ile gösterilir.
    3. Anestezi altındayken kuruluğu önlemek ve kornea ülserlerini önlemek için gözlere steril oftalmik merhem sürün.
  2. Konuyu emniyete alın.
    1. Bu deneyin, manyetik bir tahtaya bağlı mıknatıslarla uzuvlara bağlanan lastik bantlara bağlı mıknatıslar aracılığıyla tamamladığı prosedür sırasında farenin güvenli olduğundan ve yerinde kalacağından emin olun.
  3. Kesi bölgesini temizleyin.
    1. Farenin kılından kaynaklanan kontaminasyonu önlemek için fareye %70 etanol püskürtüldüğünden emin olun,
      NOT: Fareyi tıraş etmek, kürkten daha az kirlenme şansı sağlar.
  4. Kesi yapın.
    1. Forseps/cımbız kullanarak anüsten 2-3 cm uzakta sıkıştırın ve karın zarını kavisli makasla delerken yukarı doğru kesin.
    2. Orta hattan kaburgalara ve farenin yan kısmına çapraz bir kesi oluşturun.
    3. Karşı tarafta aynı kesi oluşturun.
      NOT: Amaç, rektumun yakınından diyaframa kadar karın boşluğunun yeterli görüşünü oluşturmaktır

2. Ligasyon

  1. Gastrik arteri bağlayın.
    1. Bağırsakları künt forseps/parmaklarla hayvanın sağına doğru hareket ettirin. Mide arterini ve damarını bulmak için mideyi kaldırın.
      NOT: Alt yemek borusundan üst mideye uzanan damarların görüntülenmesi ile tanımlanan gastrik arter ve ven.
    2. 7-0'lık bir sütür alın (iğnesiz) ve ligasyona hazırlanırken künt forseps kullanarak mide arterinin altına yerleştirin.
    3. Bir cerrah düğümü oluşturun ve sağlam bir düğüm ile yeterli ligasyonu sağlayın.
      NOT: Düğüm türü önemli değildir; Kan akışının önlenmesi, bağlanan organın renginin daha soluk bir görünüme dönüştürülmesi veya organın çıkarılması ve ligasyon noktasından kan çıkışının izlenmesi yoluyla belirlenebilir. Gastrik arterin bağlanması, mide içeriğinden etkilenmez. Bu aynı zamanda mide damarlarına sızıntıyı azaltır ve perfüzatı çölyak arterine yönlendirir.
  2. Ligate sol böbrek damarları.
    1. Sol böbrek damarları için 2.1.1-2.1.3 adımlarını tekrarlayın.
      1. Sol böbreğe bağlanan parlak kırmızı ve koyu mor damarları görselleştirerek sol böbrek damarlarını tanımlayın. Bu adım, böbrek damarlarına sızıntıyı önler ve perfüzatı çölyak arterine yönlendirir.
  3. Üst abdominal aortu bağlayın.
    1. 2.1.1-2.1.3 adımlarını tekrarlayın.
      1. Çölyak arter, superior mezenterik arter ve sol böbrek damarlarının dallanan damarları ile orta hat parlak kırmızı damarı görselleştirerek üst abdominal aortu tanımlayın. Üst abdominal aorttan sızıntıyı azaltmak ve çölyak artere ve nihayetinde pankreasa akışı sağlamak için çölyak arterden üstün ligasyon gerçekleştirin.
  4. Sağ böbrek damarlarını bağlayın.
    1. Bağırsakları hayvanın soluna doğru hareket ettirin. Doğru böbrek damarlarını tanımlamak için sağ böbreği çevreleyen doku/yağı kaldıraç olarak sıkıştırın.
    2. 2.1.1-2.1.3 adımlarını tekrarlayın.
      1. Hem inferior vena kava hem de abdominal aorta ile bağlantılı olarak sağ böbreğe bağlı mor / koyu kırmızı damarları (altında görünmeyen bir arter bulunan her iki sağ böbrek damarı) görselleştirerek sağ böbrek damarlarını tanımlayın. Bu adım, pankreasın daha fazla izolasyonuna izin vererek, sol böbrek damarları ile adım 2.2'ye paraleldir; Bununla birlikte, bu damarın inferior vena kava'ya yakınlığına karşı dikkatli olun.
  5. İnferior vena kavanın abdominal kısmını bağlayın.
    1. Sağ renal ven ile dallanma bağlantısı olan daha büyük bir mor damarın görselleştirilmesi yoluyla inferior vena kavanın abdominal kısmını tanımlayın.
    2. 2.1.1-2.1.3 adımlarını tekrarlayın.
      NOT: Bu adım, perfüzatın toplanacağı portal vene giden kandan kaynaklanan olası karışıklıkları azaltır.
  6. Bifurkasyondan önce alt abdominal aortu bağlayın (Şekil 1)
    1. 2.1.1-2.1.3 adımlarını tekrarlayın.
    2. Bifurkasyondan hemen önce bağladıktan sonra, aortun altına, ilk düğümün 0,5 cm kadar yukarısına bir dikiş ipliği yerleştirin. Kanülasyonu yerine bağlamak için bu dikiş ipliğini kullanın.
    3. Tüpü kanülasyon için yerleştirmek için dikiş ipliği ile bağlı sütür arasındaki boşluğu kullanın. Bu ligasyon, perfüzatın alt abdominal aorttan çölyak artere doğru ilerlemesini sağlar.
  7. Portal veni bağlayın (Şekil 2)
    1. Portal venin düzgün bir şekilde görüntülenmesini sağlamak için bağırsakları hayvanın soluna doğru hareket ettirin.
    2. Portal veni görüntülemek ve ligasyon ve kanülasyon için uygun çekiş için gerektiğinde daha fazla alan yaratmak için diyafram ve kaburgalarda bir kesi oluşturun.
    3. Daha sonra kanülasyon için yer sağlamak için damarı mümkün olduğunca üstün (karaciğere daha yakın) bağlayın.
    4. İlkinden daha düşük, ancak pankreasın üzerine ikinci bir sütür yerleştirin. Adım 2.7.2, konunun geçmesine neden olacaktır. Ek olarak, bu adım, perfüzatın toplanmasına izin vermek ve kanülasyon noktasından daha üstün potansiyel geri akışı önlemek için önemlidir.

3. Kanülasyon

  1. Alt abdominal aortu kanül edin.
    1. Alt abdominal aort içine alt düğüm ile üst sütür arasında makasla 0,5-1,5 mm'lik bir kesi oluşturun.
    2. En düşük düğümü kaldıraç olarak kullanarak, tüpü daha üstün dikişe ulaşana kadar çentik yoluyla aort içine yerleştirin; Yırtmamaya dikkat edin.
    3. Tüpü yerine kilitlemek için daha üstün sütürü bir düğüme bağlayın.
      NOT: Bu adım, perfüzatın kapalı sisteme girmesine izin verir. Ligasyonlar yerindeyken, perfüzat, alt abdominal aorttaki giriş noktasından çölyak artere, daha sonra pankreas damarlarına gitmeli ve perfüzatın toplanabileceği hepatik portal ven ile bitmelidir.
  2. Portal veni kanüle edin.
    1. Portal ven pankreastan ayrıldıktan hemen sonra portal ven içine 0,5-1 mm'lik bir kesi oluşturun.
    2. Bir elinizle künt forseps ile üst düğümü kaldıraç olarak tutarak, diğer elinizle tüpü kavramak için forseps kullanarak tüpü portal damara yerleştirin.
    3. Mümkünse tüpü yerine bağlamak için ikinci dikişi kullanın.
      NOT: Bu adım, pankreasın mevcut sıvı üzerindeki etkisiyle perfüzatın çıkması gereken kapalı sistemin son noktasıdır.

4. Koleksiyon

  1. Perfüzyon gerçekleştirin.
    1. Alt abdominal aort tüpünü yerleştirmeden önce, perfüzyon sisteminin perfüzat istenen hızda (~ 2 mL / dak) akarken başladığından emin olun.
      NOT: Perfüzat, portal ven kanülasyonundan ve bir toplama tüpüne boşalmalıdır. Daha kolay saklama için bir polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) tüpü kullanılabilir. Burada kullanılan perfüzat çözeltileri, 1.2 mM 3-izobutil-1-metilksantin (IBMX) ile 2.6 mM glikoz ve 16.8 mM glikoz ve Krebs-Ringer bikarbonat tamponunda (KRB, 16 mM HEPES ve %0.1 BSA, pH 7.4) 3-izobütil-1-metilksantin (IBMX) ile 2.6 mM glikozdur. Perfüzat çözeltisi, düşük glikozlu bir çözelti ile yüksek glikoza, tekrar düşük glikoza başladı ve kontrol için bir IBX çözeltisi ile sona erdi.
  2. Perfüzatı toplayın.
    1. Perfüzatı 30 dakikalık aralıklarla PCR tüplerine toplayın (her 3 dakikada bir tüpler değiştirilir).
    2. Her 30 dakikalık aralıktan sonra çözümü değiştirin.
    3. Numunelerle enzime bağlı bir immünosorbent testi (ELISA) gerçekleştirin. Bu, uygun şekilde saklanırsa daha sonraki bir noktada yapılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

ELISA sonrası sonuçlar, fare pankreasından insülin sekresyonunu, perfüzat glikoz seviyelerine bağlı olarak bir dereceye kadar göstermelidir. Farelerde bu prosedürün yeniliği nedeniyle, sonucun ve başarısının analiz edilmesi, perfüze edilmiş bir fare pankreasının diğer birçok denemesi ile karşılaştırmaya bağlıdır. Yüksek glikoz konsantrasyonuna bifazik insülin yanıtı, insan deneklerde ve adacık perifüzyon yöntemleriyle değerlendirildiği gibi fizyolojik olarak kabul edilir. Sunulan sonuçlar...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Yukarıda özetlenen protokol, sağlam pankreas, iki giriş (çölyak ve superior mezenterik arter) ve bir çıkıştan (hepatik portal ven) oluşan kapalı bir sistem oluşturmayı amaçlamaktadır. Diğer tüm damarlar, perfüzat içinden geçtiğinde sızıntıyı önlemek ve ayrıca pankreasın kendisinin mikro çevresi ile izolasyonunu sağlamak için bağlanır. Bu protokoldeki ligasyon adımları, anjiyotensin peptitlerini salgılayabilen veya insülini dolaşımdan hızla temizleyebilen böbrekler, karaciğer veya akciğer...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması bildirmemiştir.

Teşekkürler

Yazarlar, bu proje boyunca yardımcı danışmanlık, teknik yardım ve mentorluk için Christopher Cahill, Jennifer Hollister-Lock, Dr. Susan Bonner-Weir, Kanako Iwasaki, Francesko Hela ve Priscila Carapeto'ya teşekkür eder. Bu araştırma NIDDK R01 DK132535 hibe ile desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Fiber membran oksijenatörHarvard Aparatı73-3757Oksijenin perfüzyona girmesine izin verir
Isıtma yastığıBeyin ağacı bilimsel39OM
Ketamin/ksilazinPatterson Veteriner78908598
Manyetik tahtaBeyin ağacı bilimsel39OM
Lastik bantlı mıknatıslarBeyin ağacı bilimsel39OM
MikroskopiYOKYOKBelirli bir şirket yok
Oksijen tankıYOKYOKBelirli bir şirket yok
PCR tüpleriThermoFisher/InvitrogenAM12225Perfüzyon toplama için kullanılır
PE-30 tüpüBeyin ağacı bilimselPE30
PE-50 tüpBeyin ağacı bilimselPE50 Serisi
Peristaltik pompaYOKYOKBelirli bir şirket yok
Cerrahi aletlerYOKYOKBelirli bir şirket yok
DikişYOKYOKBelirli bir şirket yok

Kaynaklar

  1. Rosenberg, L., Wang, R., Paraskevas, S. Structural and functional changes resulting from islet isolation lead to islet cell death. Surgery. 126 (2), 393-398 (1999).
  2. Paraskevas, S., et al. Apoptosis occurs in freshly isolated human islets under standard culture conditions. Transplant Proc. 29 (1-2), 750-752 (1997).
  3. Bottino, R., et al. Response of human islets to isolation stress and the effect of antioxidant treatment. Diabetes. 53 (10), 2559-2568 (2004).
  4. Burganova, G., Bridges, C., Thorn, P., Landsman, L. The role of vascular cells in pancreatic beta-cell function. Front Endocrinol. 12, 667170(2021).
  5. Jansson, L., Carlsson, P. -O. Graft vascular function after transplantation of pancreatic islets. Diabetologia. 45 (6), 749-763 (2002).
  6. Leibiger, I. B., Berggren, P. -O. Intraocular in vivo imaging of pancreatic islet cell physiology/pathology. Mol Metab. 6 (9), 1002-1009 (2017).
  7. Weir, G. C., Atkins, R. F., Martin, D. B. Glucagon secretion from the perfused rat pancreas following acute and chronic streptozotocin. Metabolism. 25 (11 Suppl), 1519-1521 (1976).
  8. Pisania, A., et al. Quantitative analysis of cell composition and purity of human pancreatic islet preparations. Lab Invest. 90 (11), 1661-1675 (2010).
  9. Weir, G. C., Leahy, J. L., Braunstein, L. P. Characteristics of insulin and glucagon release from the perfused pancreas, intact isolated islets, and dispersed islet cells. Horm Res. 24 (1), 62-72 (1986).
  10. Fathi, I., Goto, M. Collagenases in Pancreatic Islet Isolation. Transplantation, Bioengineering, and Regeneration of the Endocrine Pancreas. , Elsevier Academic Press. (2019).
  11. Heiser, A., Ulrichs, K., Müller-Ruchholtz, W. Isolation of porcine pancreatic islets: low trypsin activity during the isolation procedure guarantees reproducible high islet yields. J Clin Lab Anal. 8 (6), 407-411 (1994).
  12. Basir, I., et al. Improved outcome of pig islet isolation by Pefabloc inhibition of trypsin. Transplant Proc. 29 (4), 1939-1941 (1997).
  13. White, S. A., et al. A preliminary study of the activation of endogenous pancreatic exocrine enzymes during automated porcine islet isolation. Cell Transplant. 8 (3), 265-276 (1999).
  14. Lakey, J. R. T., et al. Serine-protease inhibition during islet isolation increases islet yield from human pancreases with prolonged ischemia. Transplantation. 72 (4), 565-570 (2001).
  15. Rose, N. L., Palcic, M. M., Helms, L. M. H., Lakey, J. R. T. Evaluation of Pefabloc as a serine protease inhibitor during human-islet isolation. Transplantation. 75 (4), 462-466 (2003).
  16. Cross, S. E., et al. Collagenase penetrates human pancreatic islets following standard intraductal administration. Transplantation. 86 (7), 907-911 (2008).
  17. Balamurugan, A. N., et al. Harmful delayed effects of exogenous isolation enzymes on isolated human islets: relevance to clinical transplantation. Am J Transplant. 5 (11), 2671-2681 (2005).
  18. Li, W. Functional analysis of islet cells in vitro, in situ, and in vivo. Semin Cell Dev Biol. 103, 14-19 (2020).
  19. Marciniak, A., et al. Using pancreas tissue slices for in situ studies of islet of Langerhans and acinar cell biology. Nat Protoc. 9 (12), 2809-2822 (2014).
  20. Cohrs, C. M., et al. Bridging the gap: pancreas tissue slices from organ and tissue donors for the study of diabetes pathogenesis. Diabetes. 73 (1), 11-22 (2024).
  21. Panzer, J. K., et al. Pancreas tissue slices from organ donors enable in situ analysis of type 1 diabetes pathogenesis. JCI Insight. 5 (8), e134525(2020).
  22. Wargent, E. T. Measurement of insulin secretion using pancreas perfusion in the rodent. Methods Mol Biol. 2076, 281-297 (2020).
  23. Tamayo, A., et al. Pericyte control of blood flow in intraocular islet grafts impacts glucose homeostasis in mice. Diabetes. 71 (8), 1679-1693 (2022).
  24. Yuan, L., Li, Y., Li, G., Song, Y., Gong, X. Ang(1-7) treatment attenuates β-cell dysfunction by improving pancreatic microcirculation in a rat model of type 2 diabetes. J Endocrinol Invest. 36 (11), 931-937 (2013).
  25. Carlsson, P. -O., Berne, C., Jansson, L. Angiotensin II and the endocrine pancreas: effects on islet blood flow and insulin secretion in rats. Diabetologia. 41 (2), 127-133 (1998).
  26. Penhos, J. C., et al. A rat pancreas-small gut preparation for the study of intestinal factor(s) and insulin release. Diabetes. 18 (11), 733-738 (1969).
  27. Ma, Y. H., et al. Differences in insulin secretion between the rat and mouse: role of cAMP. Eur J Endocrinol. 132 (3), 370-376 (1995).
  28. Aynsley-Green, A., Biebuyck, J. F., Alberti, K. G. Anaesthesia and insulin secretion: the effects of diethyl ether, halothane, pentobarbitone sodium and ketamine hydrochloride on intravenous glucose tolerance and insulin secretion in the rat. Diabetologia. 9 (4), 274-281 (1973).
  29. Chen, H., Li, L., Xia, H. Diabetes alters the blood glucose response to ketamine in streptozotocin-diabetic rats. Int J Clin Exp Med. 8 (7), 11347-11351 (2015).
  30. Lehmann, R., et al. Effects of ketamine sedation on glucose clearance, insulin secretion and counterregulatory hormone production in baboons (Papio hamadryas). J Med Primatol. 26 (6), 312-321 (1997).
  31. Sharif, S. I., Abouazra, H. A. Effect of intravenous ketamine administration on blood glucose levels in conscious rabbits. Am J Pharm Toxicol. 4 (2), 38-45 (2009).
  32. Komatsu, M., Takei, M., Ishii, H., Sato, Y. Glucose-stimulated insulin secretion: a newer perspective. J Diabetes Investig. 4 (6), 511-516 (2013).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Pankreas Perf zyonuFare Vask lat rns lin Salg lanmas l mPankreas Adac klarPerf ze Fare PankreasDamar LigasyonuKan lasyon Tekni iELISA ns lin Analizi
Sağlam Bir Pankreas ile Farelerin Damar Sisteminden Perfüzyon Yoluyla Glikozla Uyarılan İnsülin Sekresyonu
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.