Yinelemeli Ağartma, Çekirdek Tesisler için Boyama Otomasyonu Kullanımıyla Çeşitliliği Artırıyor

Anna E. Tseng; Aoife O'Connell; Aaron Benhamou; Shivraj Yabaji; Igor Kramnik; Nicholas A. Crossland; Emily Speranza

doi:10.3791/67853

Yöntem makalesi

Yinelemeli Ağartma, Çekirdek Tesisler için Boyama Otomasyonu Kullanımıyla Çeşitliliği Artırıyor

DOI:

10.3791/67853

⸱

6 Ağustos 2025

Anna E. Tseng¹^,² , Aoife O'Connell¹ , Aaron Benhamou¹^,³ , Shivraj Yabaji¹^,² , Igor Kramnik¹^,² , Nicholas A. Crossland¹^,²^,³ , Emily Speranza⁴

¹National Emerging Infectious Diseases Laboratories (NEIDL), Boston University, ²Department of Pathology and Laboratory Medicine, Boston University Chobanian and Avedisian School of Medicine, ³Department of Virology, Immunology and Microbiology, Boston University Chobanian and Avedisian School of Medicine, ⁴Florida Research and Innovation Center, Cleveland Clinic Foundation

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, ticari olarak temin edilebilen, otomatik doku boyalayıcıları ve tiramid sinyal amplifikasyonu bazlı reaktiflerin kullanımı için optimizasyon hususlarını kullanan Yinelemeli Ağartma Çokluğu Uzatır (IBEX) yönteminin uygulamasını açıklıyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yinelemeli Ağartma Çeşitliliği Uzatır (IBEX), tekrarlanan ağartma, yeniden boyama ve görüntü ortak kaydı yoluyla tek bir doku örneğinde çok sayıda protein biyomolekülünün ayrıntılı olarak incelenmesini sağlayan, oldukça hassas tiramid sinyal amplifikasyonu (TSA) tabanlı çok turlu bir floresan görüntüleme tekniğidir. Yüksek oranda çoğullanmış immün boyama oluşturmak için artan benimsenmesine rağmen, IBEX'in çekirdek tesislerde konuşlandırma yoluyla otomatik bir şekilde uygulanması, artan verim, tekrarlanabilirlik ve laboratuvar personelinin genel verimliliği dahil olmak üzere çok sayıda fayda sağlar. Burada, IBEX'in yaygın olarak kullanılan iki otomatik boyama platformunda başarılı bir şekilde uygulandığını gösteriyoruz ve formalinle sabitlenmiş, parafine gömülü (FFPE) doku örnekleri için TSA bazlı reaksiyonları kullanan panel tasarımı için önemli optimizasyon hususlarını tartışıyoruz. Bu, antikor geliştirme sırasını belirlerken IBEX panel tasarımı için önemli bir husus olan antikor-antijen alma duyarlılığını test etme metodolojisini içerir. Ek olarak, ticari olarak temin edilebilen tam slayt tarayıcıları kullanarak aşağı akış görüntüleme yaklaşımlarını sergiliyoruz ve ticari olarak mevcut hücre fenotipleme yazılımını kullanarak kalite hizalamasını ve analizini gösteriyoruz. Bu metodolojilerin ayrıntılı açıklamaları ve beraberindeki videolar aracılığıyla, IBEX'in çok yönlülüğünü ve kolaylığını vurgulamayı ve temel patoloji tesislerinin IBEX'i mevcut otomatik boyama platformlarına entegre etmeleri için pratik rehberlik sunmayı amaçlıyoruz.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yinelemeli Ağartma Çeşitliliği Uzatır (IBEX), tek bir doku örneğinde çok sayıda biyomolekülün ayrıntılı olarak görüntülenmesine ve miktarının belirlenmesine olanak tanıyan, son derece hassas TSA bazlı, çok yönlü floresan immünohistokimyada önemli bir gelişmedir. IBEX, tekrarlanan ağartma ve yeniden boyama döngüleri kullanarak, karmaşık hücresel ortamların benzersiz derinlik ve netlikle incelenmesini sağlar ve bu da onu immün boyama ve çoğullanmış görüntüleme alanında güçlü bir araç haline getirir ^1,2.

Birçok akademik, hükümet ve endüstri kuruluşu, kalitatif ve kantitatif morfomoleküler veri kümeleri oluşturmayı amaçlayan çeşitli doku bazlı araştırma metodolojilerini desteklemeye adanmış temel patoloji tesislerine ev sahipliği yapmaktadır. Bu çekirdekler, araştırma laboratuvarlarının karmaşık ve emek yoğun moleküler patoloji süreçlerini dışarıdan temin etmesine ve çalışma tasarımı, tahlil geliştirme ve veri yorumlamada doğrudan patologlara danışmasına olanak tanıyan özel doku tabanlı hizmetler sağlayan kritik kaynaklardır. Deneyler arasında tutarlılığı sağlamak ve değişkenliği azaltmak için, bu temel tesisler rutin olarak, yüksek tekrarlanabilirlik ve verimlilikle standartlaştırılmış boyama protokollerini gerçekleştirmek için tasarlanmış, ticari olarak temin edilebilen otomatik boyama makinelerine otomatik aletlere güvenir³.

Otomatik boyalayıcılar, çekirdek tesislerde immün boyamanın bel kemiği haline gelerek yüksek verimli ve tutarlı sonuçlar sağlarken, henüz IBEX gibi daha yeni gelişmelere uyum sağlayacak şekilde uyarlanmamıştır. Ayrıca, özellikle tiramid sinyal amplifikasyonu (TSA) bazlı reaktifler⁴ kullanıldığında, panel tasarımında özel bilgiye duyulan ihtiyaç, rutin araştırma iş akışlarında IBEX'in daha geniş çapta benimsenmesini sınırlayan ek bir karmaşıklık katmanı ekler. Sonuç olarak, IBEX'in yüksek çözünürlüklü, çoğullanmış görüntüleme yeteneklerinden yararlanmak isteyen araştırmacılar, genellikle çekirdek tesislerinin mevcut ekipmanı ile sınırlı olabilir. Yenilikçi görüntüleme teknikleri ile temel tesis operasyonlarının pratik gerçekleri arasındaki bu boşluk, IBEX'in akademik araştırmalarda daha geniş çapta benimsenmesinin önündeki bir engeli vurgulamaktadır. Bu çalışma, formalinle sabitlenmiş, parafine gömülü (FFPE) dokular kullanılarak TSA bazlı reaktiflerin kullanımına odaklanarak, IBEX'in yaygın otomatik boyama platformlarında başarılı bir şekilde uygulandığını göstererek bu engeli ele almayı amaçlamaktadır. İlk olarak, TSA bazlı boyalar kullanarak bir IBEX paneli oluşturmak için gerekli adımları ve bu panellerin piyasada bulunan iki farklı otomatik boyayıcıya kapak uygulamasını tartışıyoruz. Birlikte, bu, antikor-antijen alma duyarlılık testi hakkında pratik rehberlik sunar, panel tasarımını optimize etmek için temel hususları tartışır ve mevcut olabilecek ticari yazılımları kullanarak ve çekirdek patoloji laboratuvarları aracılığıyla panel hizalaması için alternatif bir yöntem sağlar.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. TSA esaslı boyalar ile IBEX panellerin yapımı

NOT: Her zaman taze bir antikor ve boya preparatı kullanın ve kullanılmadığı zaman 4 °C'de saklayın.

Antijen geri kazanım duyarlılık testi
1. Slaytların hazırlanması
  1. Aynı FFPE gömülü dokudan üç ayrı, pozitif yüklü slayt üzerine test etmek üzere her antikor için üç seri bölüm toplamak için bir mikrotom kullanın.
  2. Test edilecek antikor ve test edilecek antijen alma döngülerinin sayısı ile slaytları etiketleyin: 1 döngü, 3 döngü ve 6 döngü.
  3. Slaytları gece boyunca oda sıcaklığında kurutun. Yalnızca yüzey işaretleyicilerle çalışıyorsanız, balmumu yumuşatmak için slaytları 60 ^oC'de en az 20 dakika pişirin. Nükleer işaretleyicilerle çalışıyorsanız, slaytları gece boyunca 60 ^°C'de pişirin.
2. Programı otomatik boyayıcıda farklı döngü sayıları için hazırlayın ve her adım arasında üç yıkama adımı olduğundan emin olun. 1, 3 ve 6 döngü testleri için örnek protokoller için Tablo 1'e bakın.
  NOT: Her bir antikor için, antikor adımı ve TSA boya uygulaması için tutarlı bir süre sağlayın.
  TSA bazlı boya uygulaması için, boyanın oda sıcaklığında 3-10 dakika bekletilmesine bir alternatif, boyanın 37 °C'de 20 dakika inkübe edilmesine izin vermektir.
3. Örnekleri otomatik boyayıcıya yükleyin ve ilgili döngü sayısı için protokolü çalıştırın.
4. Doğrulanacak ve test edilecek her bir antikor için bu işlemi 1.1.1'den 1.1.3'e kadar olan adımlardan tekrarlayın.
5. Slaytları otomatik boyayıcıdan çıkarın ve PBS'ye yerleştirin.
6. Optimum görüntüleme için kızakları sulu montaj ortamı (IBEX turu ile aynı) ve #1.5 lamel ile monte edin.
7. TSA boyası ve DAPI için 1 döngü slaytını görüntülemek için bir epifloresan mikroskobu kullanın ve sinyali görselleştirmek için gereken maruz kalma süresini not edin.
8. TSA boyasını görselleştirmek için gereken maruz kalma süresine dikkat ederek bunu 3 döngü ve 6 döngü slaytları için tekrarlayın.
9. Farklı döngü sayılarındaki maruz kalma sürelerini karşılaştırın. Örnekler için Şekil 1'e bakın. Tüm adımlar arasında üç yıkama döngüsü olduğundan emin olun.
  1. Maruz kalma süresi artan döngülerle azalırsa, bu antikoru yerleştirin ve daha sonraki bir adımda boyayın.
  2. Maruz kalma süresi artan döngülerle artarsa, bu antikoru daha erken bir adıma yerleştirin.
  3. Maruz kalma süresinde büyük bir değişiklik yoksa, bu antikoru herhangi bir adımda yerleştirin.
  4. IBEX panellerinde ilk geçiş için döngü gereksinimlerine göre antikorları gruplandırın.
    NOT: En iyi sonuçları elde etmek için, bu doğrulamayı belirli bir IBEX paneli için istenen tüm işaretleyicilerde gerçekleştirin. Doku tipleri her değiştiğinde veya benzersiz lot numaralarına sahip poliklonal primer antikorlarla çalışırken bu doğrulamayı gerçekleştirin.
Sinyal gücünün değerlendirilmesi ile spektral olarak yakındaki boyadan gelen sinyalin sızmasını ele alın.
1. Antikorları, yukarıdan 1, 3 veya 6 döngü grubuna belirlendiği gibi, optimal geri alma döngüsü sayısına dayalı olarak potansiyel IBEX panellerine gruplandırın.
2. Slaytların hazırlanması
  1. Tek bir IBEX panelinde kullanılacak her antikor için bir tane olmak üzere bir FFPE örneğinden seri kesitler oluşturmak için bir mikrotom kullanın.
  2. Her slaydı IBEX panelinde kullanılacak antikorlardan biriyle etiketleyin.
  3. Slaytları gece boyunca oda sıcaklığında kurumaya bırakın. Yalnızca yüzey işaretleyicilerle çalışıyorsanız, balmumu yumuşatmak için slaytların 60 ^°C'de en az 20 dakika pişmesine izin verin. Nükleer işaretleyicilerle çalışıyorsanız, slaytları gece boyunca 60 ^°C'de pişirin.
3. 1, 3 ve 6 döngü grubu için Tablo 1'deki tek döngü kurulumunu kullanın. Tüm adımlar arasında üç yıkama olduğundan emin olun
  1. Optimal boyama süresi ile kullanılacak her antikor için protokolü değiştirin.
  2. Tüm antikorlar için aynı TSA süresini kullanın.
4. Numuneleri otomatik boyayıcı üzerinde boyayın.
5. Örnekleri çıkarın ve slaytları PBS'ye yerleştirin.
6. Optimum görüntüleme için kızakları sulu montaj ortamı (IBEX turu ile aynı) ve #1.5 lamel ile monte edin.
7. Her görüntü için en uygun pozlama süresini kullanarak slaytları bir epifloresan mikroskobunda görüntüleyin.
8. Sinyal gücünü belirleyin. Kısa pozlama sürelerine sahip slaytlar çok yüksek sinyal gücüne sahipken, uzun pozlama süresine sahip slaytlar düşük sinyal gücüne sahiptir.
9. IBEX panelleri geliştirmek için döngü numarasıyla birlikte sinyal gücünü kullanın.
  1. Antikorları döngü numarasına göre gruplandırın.
  2. Belirli bir döngü numarasına sahip belirli bir antikor grubu için, sinyal yayılmasını en aza indirmek için güçlü bir sinyalin optik olarak zayıf bir sinyale yakın olmadığından emin olun.
Her panelin istenen sonucu üretebilmesini sağlamak için IBEX panellerini ayrı ayrı doğrulayın.
1. Slaytları hazırlayın.
  1. Her multipleks IBEX paneli için bir tane olmak üzere seri bölümler oluşturmak için bir mikrotom kullanın ve kullanılacak IBEX panel sırasını ekleyin.
  2. Slaytları gece boyunca oda sıcaklığında kurumaya bırakın. Yalnızca yüzey işaretleyicilerle çalışıyorsanız, balmumu yumuşatmak için slaytların 60 ^°C'de en az 20 dakika pişmesine izin verin. Nükleer işaretleyicilerle çalışıyorsanız, slaytları gece boyunca 60 ^°C'de pişirin.
2. Otomatik lekeleyiciyi ayarlayın.
  1. İlk panel için, ek antijen alma adımları olmadan otomatik boyama programını ayarlayın.
  2. İkinci panel için, ilk antikordan önce, birinci paneldeki denatürasyon adımlarının sayısına eşit ek denatürasyon adımları ekleyin. Beş antikorlu örnek bir panel 1 için Tablo 2'ye ve dört antikorlu örnek bir panel 2 için Tablo 3'e bakın. Tüm adımlar arasında üç yıkama adımı olduğundan emin olun.
  3. Ek IBEX panelleri için gerektiği kadar tekrarlayın ve daha fazla denatürasyon adımı ekleyin.
3. Slaytları otomatik boyayıcıdan çıkarın ve montaja hazır olana kadar PBS'ye yerleştirin.
4. Optimum görüntüleme için kızakları sulu montaj ortamı (IBEX turu ile aynı) ve #1.5 lamel ile monte edin.
5. Her görüntü ve her TSA boyası için en uygun pozlama süresini kullanarak slaytları bir epifloresan mikroskobunda görüntüleyin.
6. Tüm panellerin düzgün görüntülenip görüntülenmediğini değerlendirin. Eğer öyleyse, IBEX görüntülemeye geçin. Değilse, sinyal dengeleme ve alma döngülerini yeniden adresleyin.
  NOT: Sinyali optimize etmek ve "şemsiye etkisini" önlemek için tek bir panelde bazı ayarlamalar yapılabilir. Bazı yüksek miktarda sinyal, aşağı akış sinyallerinin lekelenmesini engelleyebilir. Önce daha seyrek bulunan lekeleri kullanmak için belirli bir panelin içine bakın (bkz. Şekil 2).

2. TSA reaktifleri ve tüm slayt görüntüleme platformları kullanılarak otomatik boyalayıcılarla IBEX adaptasyonu (Şekil 3)

NOT: Bu protokolde kullanılan ve tartışılan iki doğrulanmış otomatik boyayıcının karşılaştırılması için Tablo 4'e bakın.

IBEX koşusu için tüm slaytları hazırlayın.
1. Pozitif yüklü bir slaytta FFPE bölümleri oluşturmak için bir mikrotom kullanın. Her deneysel numune için bir slayt, görüntülenecek antijenleri içerdiği bilinen doku bölümlerinin pozitif kontrol slaytları ve tüm primer antikorların yerine PBS'nin kullanıldığı bir negatif kontrol slaytı eklediğinizden emin olun.
  NOT: Gruplar halinde çalışıyorsanız, bir toplu kontrol örneği ekleyin. Bir parti kontrol numunesi, boyama numunelerinin partileri arasındaki deneysel varyasyonun normalizasyonu ve kontrolünde kullanılmak üzere her bir deneysel numune partisine kesitli ve dahil edilmiş tek bir FFPE doku bloğudur. Bu, yalnızca tüm numuneler birlikte işlenmeyecekse gereklidir.
2. Slaytları gece boyunca oda sıcaklığında kurumaya bırakın. Yalnızca yüzey işaretleyicilerle çalışıyorsanız, balmumu yumuşatmak için slaytların 60 ^°C'de en az 20 dakika pişmesine izin verin. Nükleer işaretleyicilerle çalışıyorsanız, slaytları gece boyunca 60 ^°C'de pişirin.
Görüntülenecek ilk IBEX paneli için antikorlar ve boyalar hazırlayın.
Otomatik boyama programını ayarlayın. 5 işaretli panel örneği için Tablo 2'ye bakın. Her adım arasında üç yıkama olduğundan emin olun.
Numuneleri ve antikorları otomatik boyayıcıya yükleyin ve numuneleri boyamak için programı çalıştırın.
Slaytları otomatik boyayıcıdan çıkarın ve multispektral görüntüleme için uygun sulu montaj ortamı ve # 1.5 lamel kullanarak bir lamel uygulayın.
Slaytları boyamadan sonraki 2 gün içinde görüntüleyin
Epifloresan veya floresan slayt tarayıcıda Floresan Görüntüleme
1. İyi kontrol edilen pozitif kontrol numunesinden başlayarak, pozitif kontrol numunesini mikroskoba yükleyin.
  1. Görüntülenecek farklı antijenlerin her biri için numunede pozitif bir sinyal bulun.
  2. Düşük pozlamadan başlayarak ve sinyal mevcut olana kadar pozlama süresini kademeli olarak artırarak arka planı en aza indirirken lekenin dinamik aralığının yakalanmasını sağlamak için pozlama süresini ayarlayın. Bunu her boya için ayrı ayrı yapın.
    NOT: Tam dinamik aralığın yakalandığından emin olmak için işaretçilerin hem yüksek hem de düşük ifadesinin varlığını test edin.
2. Pozitif kontrol numunesi için kullanılan ayarları kaydedin ve bunları diğer tüm görüntüleme adımları için kullanın.
3. Pozitif kontrol numunesi tarafından belirlenen ayarları kullanarak negatif kontrol numunesini ve tüm deneysel numuneleri yükleyin ve görüntüleyin.
4. Sonraki adımlara geçmeden önce görüntülerin en iyi kalitede olduğunu doğrulayın.
Lamel kaldırma
1. Slaytları DI su ile bir Coplin kavanozuna daldırın. Lamelin doğal olarak çıkarılmasını kolaylaştırmak için Coplin kavanozunu 15-20 dakika boyunca 65 °C'ye ayarlanmış bir su banyosuna yerleştirin. Alternatif olarak, su bazlı bir montaj ortamı kullanılıyorsa veya montaj ortamı tamamen sertleşmişse, lamellerin doğal olarak düşmesini sağlamak için gece boyunca fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) veya DI suyuna batırarak lamelleri çıkarın.
LiBH₄ ile Beyazlatma
1. Çeker ocakta, DI suda 1 mg/mL konsantrasyonda taze bir LiBH₄ çözeltisi hazırlayın. Her numuneyi 3 kat kaplayacak kadar yapın.
  NOT: LiBH 10'ün su ile reaksiyonu nedeniyle bir seferde 4 mL'den fazla hazırlamayın. Optimum ağartma aktivitesi için Millipore/nanopure su yerine DI su kullanın.
2. Solüsyonu 20 dakika dinlendirin. Kabarcıklar oluşacak.
3. Çeker ocaktaki bir boyama odasındaki her slayta 1 mL LiBH₄ solüsyonu pipetleyin. Çözeltiyi slayt üzerinde 10-15 dakika dinlendirin.
4. Slayttan pipetleyerek LiBH_4'ü çıkarın ve yeni 1 mL LiBH 4 ile değiştirin_.Solüsyonu 10-15 dakika dinlendirin.
5. Slayttan pipetleyerek LiBH_4'ü çıkarın ve yeni 1 mL LiBH 4 ile değiştirin_.Solüsyonu 10-15 dakika dinlendirin.
6. LiBH_4'ü pipetleyerek slaytlardan çıkarın ve kısa süreli saklama için (en fazla 1 gün) slaytları DI suya veya PBS'ye batırın.
7. Bir gün içinde bir sonraki IBEX boyama turuna geçin.
8. İsteğe bağlı: kızakları ıslak monte edin ve ağartma başarısını doğrulamak için bir epifloresan dürbünü üzerinde hızlı bir görselleştirme gerçekleştirin.
Sürgünün otomatik boyayıcıya ıslak montajı ve ikinci IBEX boyama çalışması
1. Otomatik boyayıcı için tüm antikorları ve TSA boya çözeltilerini hazırlayın.
2. Ventana otomatik boyama makinesi için:
  1. Otomatik boyamaya başlamaya hazır olduğunuzda, ıslak montajın kurumasını önlemek için sürgüye yaklaşık 1 mL otomatik boyama yıkama tamponu pipetleyin.
  2. Islak montajlı kızakları otomatik boyayıcıya yükleyin.
3. Bond Rx için:
  1. Kapak karolarını slaytların üzerine yerleştirin.
  2. Kapağın üst kısmında, çözeltinin numune ile kapak arasındaki boşluğa akmasına izin vermek için 300 μL yıkama tamponu pipetleyin.
  3. Numuneleri otomatik boyayıcıya yükleyin.
4. Tablo 2'deki örneğe göre otomatik boyama programını, N paneldeki antikor sayısına ayarlanmış olarak ayarlayın.
5. Slaytları otomatik boyayıcıdan çıkarın ve multispektral görüntüleme için uygun sulu montaj ortamı ve # 1.5 lamel kullanarak bir lamel uygulayın.
6. Görüntüleme oturumunu ayarlamak ve görüntüleri toplamak için adım 2.7'de açıklanan örnek prosedürü izleyerek slaytları boyamadan sonraki 2 gün içinde görüntüleyin.
7. Görüntülemeden sonra, numune alma işlemlerini 2.8-2.9 adımlarında anlatıldığı gibi ağartın.
İstenilen tüm IBEX panelleri için tekrarlayın.

3. Piyasada bulunan yazılımlarla numunelerin analizi

Hizalamaya devam etmeden önce lekeli slaytların tüm slayt taramalarını tamamlayın.
Yazılım izin veriyorsa, otofloresan spektrumlarının çıkarılması da dahil olmak üzere, tarama işlevlerinde yerleşik olarak bulunan otomatik karıştırma açma işlevi aracılığıyla spektral karıştırma işlemi gerçekleştirin. Bu, kullanılan yazılımın bir işleviyse, karıştırma çözme seçeneğini seçin ve standart ayarları ve önceden ayarlanmış boyaları kullanarak çalıştırın
NOT: Karıştırmanın açılmasına izin veren çoğu yazılımda özel karıştırma çözülebilir. Bir kitaplık oluşturmak için, yazılımın ölçümlerine tek bir florofor ile boyanmış bireysel doku bölümleri eklenir. Otofloresan spektrumunu karakterize etmek için boyanmamış veya otofloresan doku bölgesi de taranır ve bu, otofloresan aracı ile seçilir. Bu spektrumlar, "görüntüyü hazırla" düğmesine basılarak program içinde derlenir ve daha sonra projeye özel bir karıştırma kitaplığına aktarılır. Bu kütüphane daha sonra unmix seçeneğinde unmix kütüphanesi olarak seçilir.
Taranan slaytları, hizalama için piyasada bulunan görüntü analizi yazılımına aktarın.
Birden fazla IBEX turunun slayt kaydı
1. Kaydedilecek iki IBEX turu yinelemesi seçin.
2. İkisine sağ tıklayın ve Kaydol seçeneğini seçin.
3. İlk kayıt denemesi için Yüksek Çözünürlüklü Kayıt ile Varsayılan Kayıt'ı seçin.
4. Alternatif olarak, seçeneklerden Tek Kanal Kaydı'nı seçin ve tüm IBEX çalıştırmalarında tutarlı olan tek bir kanal seçin.
  NOT: Bu seçenek, ağartmaya dirençli boyalar için kullanışlıdır (boyaların ağartıcı olmadığı malzemelere bakın).
Görüntü hizalama
1. Kayıtlı görüntülerden birini açın.
2. Araçlar sekmesinde, Görüntü Kaydı'nın altında, tüm kayıtlı görüntüleri açmak için Kayıt Araçları'nı seçin.
3. Kayıt Araçları sekmesinde, yer işareti işlevini seçin.
4. Tüm slaytların hizalamasında ince ayar yapmak için yer işareti işlevini kullanın.
  1. Bir slayt görüntüsündeki yer işaretlerini manuel olarak işaretleyin.
  2. Diğer IBEX resimlerinde aynı yer işaretini işaretleyin. Program, belirlenen yer işaretini kullanarak hizalamayı iyileştirecektir. Hizalamanın ince ayarı için tekrarlayın.
5. Hizalamadan memnun kaldığınızda, Sigortayı kullanarak kızakları birleştirin | Seri Leke işlevi.
6. Tüm görüntülerin son bir bileşimi tamamlanana kadar bu işlemi herhangi bir ek IBEX görüntüleme turuyla tekrarlayın.
Görüntü analizi
1. Hücrelerin segmentasyonu
  1. Analiz sekmesi altında, HighPlex modülünü seçin ve açın, ardından hücre tanımlaması için fenotipleme modülünü seçin.
    1. Tüm işaretçileri yükleyin ve Highplex modülündeki Nükleer Algılama sekmesini kullanarak tüm çekirdekleri bularak başlayın. Boya Seçimi sekmesindeki işaretçileri yükleyin. DAPI boyasını kullanarak hücreleri tanımlayın.
    2. Analiz sekmesinde, aşağıdaki temel parametreleri kullanarak Gerçek Zamanlı Ayarlama aracını açın: Arka plan sinyalini filtrelemek için ayarlanan Minimum Nükleer Yoğunluk; Genel sinyal görünürlüğünü kontrol etmek için ayarlanan Maksimum Görüntü Parlaklığı; Nükleer Segmentasyon: Tespit edilen çekirdeklerin sınırlarını iyileştirmek için ayarlanan saldırganlık.
    3. Doğru segmentasyonu sağlamak için her parametreyi dikkatli bir şekilde ayarlayın.
2. Sitoplazma ve membran belirteçlerini tespit edin.
  1. Membran ve Sitoplazma Algılama sekmesine gidin.
  2. Minimum Sitoplazma Yarıçapı'nı, hücrelerin beklenen boyutu için numune için uygun bir değere ayarlayın.
  3. Membran Boyaları seçeneği altında, hangi kanalların membran işaretleyicileri olduğunu belirtin.
    NOT: Bu, daha fazla analiz için tek tek hücrelerin daha iyi segmentasyonu ile sonuçlanmalıdır.
3. İşaretleyici eşikleme ve fenotip ataması
  1. Her işaretçi için, pozitif ve negatif sinyaller için eşikleri ayarlayın. Bunu, her işaretçi için oluşturulan sekmelerin altında yapın.
  2. Popülasyonları tanımlamak için her işaretçi için manuel eşikleme yapın.
  3. Alternatif olarak, eşikleme için biyoinformatik tabanlı otomatik bir yaklaşım kullanın. İleri Düzey | Nesne (Hücre) Verilerini Depola, seçeneği Doğru olarak değiştirin. İhracatta | Nesne Verileri, tanımlanan her hücre için işaretçi ifade bilgilerini almak için veri kümesini dışa aktarın.
  4. Daha fazla ve özel analiz için bu verileri ek yazılıma aktarın. Daha fazla analiz için yazılım seçenekleri Tablo 5'te bulunmaktadır.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autostainer 2'de TSA bazlı reaktifler kullanan bir IBEX paneli örneği sunuyoruz (Şekil 4). Her işaretçi net bir şekilde tanımlanabilir ve işaretçiler arasında minimum taşma vardır. Görüntü iki tur boyama ile toplandı. Örnek, Mycobacterium tuberculosis ile enfeksiyonu takiben akciğer dokusudur. İki IBEX boyama paneli, piyasada bulunan örnek yazılım kullanılarak hizalandı. Optimize edilmiş TSA reaktifleri ile IBEX yaklaşımını kullanarak (burada tarif edildiği gibi), bağışıklık hücrelerinin, inflamatuar belirteçlerin ve özel akciğer hücrelerinin mekansal organizasyonu görülebilir ve takdir edilebilir. Doğru optimizasyon, işaretçilerin minimum arka planla kolayca görünmesini sağlar.

figure-results-1
Şekil 1: 520 nm iki farklı antijen emisyonuna sahip bir florofor ile antijen elde etme testi. RAGE ve CD3e, korunmuş pozlama süreleri kullanılarak görüntülendi. Bu RAGE antikorunun epitopu, müteakip antijen alımları ile test duyarlılığının hızlı bir şekilde düşmesi ile tekrarlayan antijen alımına karşı oldukça hassastır ve hassastır. Tersine, CD3e test duyarlılığı, birden fazla antijen alımı turu ile iyileşir. Ölçek çubukları = 50 μm. Kısaltma: RAGE = İleri Glikasyon Son Ürünleri için Reseptör. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Şemsiye etkisine göre dizi geliştirmenin önemine dair bir örnek. RAGE, AT1 hücrelerinde yüksek oranda eksprese edilen bir belirteçtir ve CD31 ile kombinasyon halinde SARS-CoV-2 immünoreaktivitesini etkili bir şekilde bloke eder. Bununla birlikte, önce SARS-CoV-2 IHC gerçekleştirildiğinde, sinyallerin tümü görselleştirilebilir. Ölçek çubukları = 25 μm. Kısaltmalar: RAGE = İleri Glikasyon Son Ürünleri için Reseptör; AT1 = Alveolar Tip 1; SARS-CoV-2 = Şiddetli akut solunum sendromu koronavirüs 2; IHC = İmmünohistokimya. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: IBEX protokolü için otomatik boyama ekipmanı kullanılarak yapılan işleme genel bakış. Dokunun kurumasını önlemek için boyama işleminin 2. turu veya daha fazlası için ıslak montaj. Kısaltma: IBEX = yinelemeli ağartma çokluğu artırır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: Mycobacterium tuberculosis ile enfekte olmuş bir akciğerde autostainer 2'den TSA bazlı boyalar içeren IBEX örneği. Panel 1 tüm boyaları içerir ve panel 2 ağartmaya uygun boyaları içerir. Akciğer görüntüsünün tam IBEX'i boyunca tüm kanalların birleştirilmiş bir görüntüsü sunulur. Ölçek çubukları = 200 μm. Kısaltmalar: IBEX = yinelemeli ağartma çokluğu artırır; TSA = Tiramid Sinyal Amplifikasyonu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: 1, 3 ve 6 döngü testleri için döngü numarasının antikorlar üzerindeki etkilerini doğrulamak için örnek bir protokol. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 2: Panel validasyonu için IBEX otomatik boyalayıcı için beş antikor içeren örnek bir panel 1. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 3: Panel validasyonu için IBEX otomatik boyayıcı için dört antikorlu örnek bir panel 2. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 4: İki otomatik boyayıcının karşılaştırılması. Ventana Autostainer ve Bond Rx'in artılarını ve eksilerini özetleyen tablo. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 5: Görüntü analizi için yazılım özeti. Segmentasyon sonrası görüntülerin analizi için mevcut olan bazı analiz yaklaşımlarını ve yazılım araçlarını özetleyen tablo. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, otomatik boyama ekipmanının uygulanması ve IBEX protokolünde TSA bazlı reaktiflerin optimizasyonu ile IBEX protokolünün temel patoloji tesislerine uyarlanması için dikkate alınması gereken hususları sunuyoruz. Tekrarlanan antijen toplama turları için en iyi şekilde nasıl optimize edileceğini ve otomatik ekipmana 2. turda veya daha yüksek bir turda uygun yüklemenin nasıl yapılacağını gösteriyoruz. Ek olarak, temel tesislerde bulunabilecek Halo yazılımını kullanarak hizalama gerçekleştirmek için ek bir yöntem gösteriyoruz. Bu yaklaşımların, SARS-CoV-2 enfeksiyonlarını takiben insan olmayan primat dokusundaki akciğer ortamlarındaki farklılıkların belirlenmesinde yararlı olduğu gösterilmiştir⁵.

Bu çalışmanın önemli bir bileşeni, deney dokularının boyanmasından önce IBEX panel tasarımının kapsamlı bir şekilde optimize edilmesi ihtiyacını vurgulamaktır. Özellikle, TSA bazlı reaktiflerin kullanımında, baz IBEX yöntemlerinde görülmeyen bazı hususlar dikkate alınmalıdır. Birincisi, çoklu antijen toplama turlarının antikor duyarlılığı üzerindeki etkisidir. TSA bazlı reaktiflerle, her yeni antikor gelişiminden önce antikor denatürasyonu yapılır. Bazı antikorlar/antijen çiftleri, ek antijen alımı turlarına duyarlı olacak ve test duyarlılığını azaltacak, bazıları ise tekrarlayan denatürasyon/antijen alımı ile gelişmiş duyarlılık elde edecektir. Panelleri tasarlamadan önce hedef dokudaki her bir antikorun dikkatli bir şekilde test edilmesi, en iyi boyama uygulamalarını sağlamak ve hem antikorların hem de floresan boyaların dizi sırasını bilgilendirmek için önemlidir. Hem sitrat bazlı (pH 6.0) hem de Tris-EDTA bazlı (pH 9.0) dahil olmak üzere tamponlar, optimal antijen alma koşullarını belirlemek için tüm antikorlar için test edilir. Bu, hangisinin belirli bir antikor için antijen maruziyetini en üst düzeye çıkardığını belirlemek için her bir tamponun sistematik olarak değerlendirilmesini içerir. Ek olarak, sıcaklık (ör., 20-37 °C), inkübasyon süresi (tipik olarak 30-60 dakika) ve blokaj koşulları, spesifik olmayan arka plan lekelenmesini azaltmak ve gerekirse birincil ve ikincil antikorların spesifik bağlanmasını sağlamak için optimize edilmiştir. Birincil ve ikincil antikorlardan önce bloklama, dokuya özgü otofloresan veya spesifik olmayan etkileşimleri hesaba katmak için ticari olarak mevcut bloke edici reaktiflerin kullanımını içerebilir. IBEX panellerini sonlandırmadan önce optimize edilmesi gereken diğer önemli hususlar arasında, siparişin sorulan spesifik araştırma sorusuna uygun olmaması durumunda epitopların korunmasının meydana gelebileceği şemsiye etkisi yer alır⁶. Floresan sızıntısını önlemek için, daha yüksek eksprese eden antijen hedeflerini, bu floresan boyaların en parlak⁷ olduğu göz önüne alındığında, en iyi sinyal-gürültü oranına sahip olacak olan 480-520 nm aralığında en az kanama ve daha zayıf belirteçlere sahip uzak kırmızı kanallara koymak tipiktir. Bununla birlikte, bu aralıkta en parlak olabilecek yüksek oranda otofloresan doku örneklerine dikkat edilmelidir; Potansiyel otofloresan seviyelerini ele almak için dokuyu herhangi bir boya olmadan görüntüleyerek bu sorunu çözmenizi öneririz. Tipik olarak IBEX ile yapılan tüm normal optimizasyon ve kontrollerle birlikte alınan bu optimizasyon adımları, TSA reaktifleri ile IBEX için uygun panel tasarımını bilgilendirebilir.

Bu yöntemde, iki yaygın otomatik boyalayıcının kullanımını gösterdik. Bununla birlikte, bu yaklaşımlar diğer otomatik boyama yöntemlerine de uygulanabilir. Buradaki en önemli kısım, lamellerin en iyi şekilde çıkarılması ve ek boyama turları için ıslak yüktür. Ek olarak, herhangi bir özel mikroskop kurulumu belirtmiyoruz. Kitler, optimum slayt taraması için belirli görüntüleme sistemleriyle birlikte kullanılmasını önerebilse de, herhangi bir mikroskop kurulumu, özellikle uyumlu filtre küplerine ve geniş spektrumlu bir LED ışık kaynağına sahip bir epifloresan mikroskobu çalışmalıdır. Bazı boyalar, tüm laboratuvarlarda bulunmayabilecek ve spektral örtüşmeleri nedeniyle standart filtre küpleriyle birlikte kullanıldığında zorluklar yaratabilen multispektral dedektörler veya özel filtre küpleri gerektirir. Bu boyalar, multispektral görüntüleme sistemleri veya oldukça spesifik filtreler kullanılarak daha iyi ayrılır. Bazı floroforlar, geleneksel uzak kırmızı filtrelerin (tipik olarak ~ 700 nm) aralığının dışında kalır ve yakın kızılötesi sinyalleri yakalayabilen özel bir filtre küpü veya dedektör gerektirir. Bu filtrelerle özel mikroskoplar üretilir, ancak alternatifler mevcuttur. Bunlar, boyaların belirli bir mikroskop konfigürasyonunda nasıl performans gösterdiğini belirlemek için ek optimizasyon gerektirecektir.

Multispektral karıştırmanın kaldırılması, gerçek sinyali arka plan gürültüsünden etkili bir şekilde ayırdığı için, özellikle otofloresansa eğilimli dokularla çalışırken, multipleks floresan IHC için şiddetle tavsiye edilir. Genellikle yaygın olarak kullanılan floroforların (özellikle daha yüksek enerjili dalga boyu kanallarında) emisyon spektrumlarıyla örtüşen otofloresan, belirli sinyalleri gizleyebilir veya bunlara müdahale ederek doğruluğu azaltabilir. Spektral karıştırma, çakışan emisyon spektrumlarını matematiksel olarak çözer, istenmeyen otofloresanı "temizlerken" gerçek floresan sinyallerini izole eder. Spektral karıştırma açma, boyama ve görüntüleme işleminin yinelemeli doğası nedeniyle mümkün olan en temiz sinyalleri elde etmenin kritik olduğu IBEX iş akışlarında özellikle değerlidir. IBEX'te, birden fazla boyama turundan gelen sinyaller görüntülenir, ağartılır ve bileşik bir görüntü oluşturmak için üst üste istiflenir. Bir turda çözümlenmeden kalan herhangi bir otofloresan veya sızıntı, yığılmış görüntüler boyunca yayılabilir, bu da aşağı akış analizini karmaşıklaştırabilir ve işaretleyici lokalizasyonuna olan güveni azaltabilir. Spektral karıştırmayı kaldırma, gerçek floresan sinyallerini arka plan otofloresansından etkili bir şekilde izole ederek her bir turda daha temiz, daha doğru sinyal algılaması sağlar. Bu sinyal netliği, birden fazla işaretleyicinin turlar boyunca birlikte analiz edildiği, güvenli fenotipleme ve uzamsal analiz sağlayan güvenilir kompozit görüntüler oluşturmak için gereklidir. Bu protokol için kullanılan görüntüleme platformu, yerleşik karıştırma giderme özelliklerine sahiptir, ancak diğer floresan tam slayt görüntüleme platformlarıyla uyumluluk için daha fazla karıştırma seçeneği gereklidir.

Ek olarak, bu çalışmanın bir sınırlaması, ilişkili reaktifleri ve yıkama tamponları bu sistemler için optimize edildiğinden, otomatik boyalayıcıların tescilli doğasıdır, ancak spesifik formülasyonlar açıklanmamıştır. Ayrıca, tüm slayt görüntü analizi için yalnızca ticari olarak mevcut bir görüntü analiz yazılımına odaklandık ve yazılım lisanslarının maliyetinin bazı laboratuvarlar için finansal bir engel oluşturabileceğini kabul ediyoruz. Ek analiz yazılımı ^8,9 ve R'deki seçenekler umut verici görünüyor; özellikle, IMCDataAnalysis^10'in R'de çoğullanmış görüntü aşağı akış analizinde tekrarlanabilir iş akışı için tasarlandığından, çekirdekler için en uygun görünen bir paket seti oluşturan Bodenmiller Group¹¹. Bununla birlikte, kaynak sınırlı ortamlarda daha geniş bir benimseme sağlamak için tüm slayt IBEX analizi için erişilebilir ve uygun maliyetli alternatifler geliştirmek ve karakterize etmek için gelecekteki çabalara ihtiyaç vardır. Ayrıca, IBEX için otomatik boyalayıcıların kullanımıyla bu yaklaşım, floresan konjuge primer antikorlar dahil olmak üzere IBEX'te daha geleneksel boyama için uyarlanabilir veya doku yeterince yüksek kalitede ve iyi bir sinyale izin vermek için optimal fiksasyon süresine sahipse, TSA bazlı boyalar içermeyen standart ikincil antikorlarla.

Genel olarak, bu çalışmanın, IBEX'i bu ortamlara daha yaygın bir şekilde uyarlamak için rutin olarak kullanılan patoloji çekirdek tesis ekipmanını kullanarak TSA bazlı multipleks floresan IHC'nin uygulanmasına yardımcı olacağını umuyoruz. Bu tür bir uygulama, IBEX protokolünün çok yönlülüğünü gerçekten vurgular ve zor doku örneklerinde veya büyük parti yaklaşımlarında bile kullanışlılığını gösterir.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların beyan edebilecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Emily Speranza, Cleveland Clinic Foundation'ın başlangıç fonları tarafından desteklenmektedir. Bu çalışmada NIH SIG hibelerinden (S10OD026983 & S10OD030269 to N.A.C.) elde edilen araçlar kullanılmıştır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Boyama reaktifi Alexa TSA kitleri	ThermoFisher		Opal mikroskopi filtreleri mevcut değilse alternatif TSA boyaları. Bunlar arasında Alexa Fluor 488 (mavi/yeşil kanal), Alexa Fluor 555 veya 568 (kırmızı kanal), Alexa Fluor 647 (uzak kırmızı kanal), Alexa Fluor 750 (uygun filtrelerle donatıldığında yakın kızılötesi) yer alır.
Antikor Arg1	Hücre Sinyalizasyonu	93668	Şekil 4'te 1:100'de kullanılmıştır
Malzeme Bıçakları	Leica Biosystems		Benzer şekilde, yüksek veya düşük profil doku tipine bağlı olur
Antikor CD11b	Abcam	AB133357	Şekil 4'te 1:2000'de kullanılmıştır
Antikor CD163	Abcam	AB182422	Şekil 4'te 1:500'de kullanılmıştır
Antikor CD31	Hücre Sinyalizasyonu	77699S	Şekil 2'de 1:100'de kullanılmıştır
Antikor CD3e	Dako	A045201-2	Şekil 1'de 1:100'de kullanılmıştır
Tool Coplin Jar	Fischer Scientific	01-816-21	Ya da benzeri
Materyal Kapak Slipleri	VWR	v48393-026	Ya da benzeri
Antikor CX3CR1	Abcam	ab308613	Şekil 4'te 1:450'de kullanılmıştır
Stain DAPI	Akoya	FP1490
Software FIJI			Sinyal yoğunluğunu ölçmek için kullanılır
Slide Fisher Superfront Kaydırakları	Fisher Scientific	22-037-246	Ya da benzeri
Software HALO	Indica Laboratuvarları		Ticari olarak kullanılabilir görüntü analiz yazılımı örneği. Görüntüleri hizalamak ve analiz etmek için kullanılır.
Antikor Iba1	Hücre Sinyalizasyonu	17191	Şekil 4'te 1:800'de kullanılmıştır
Software inForm	Akoya		Sinyal yoğunluğunu ölçmek için kullanılır
Antikor iNOS	Abcam	AB283655	Şekil 4'te 1:400'de kullanılmıştır
Instrument Leica Bond Rx (veya RXm)	Leica Biosystems	21.2201	Metinde "Autostainer 1" olarak adlandırılır. Tüm ilgili reaktiflerin de mevcut olduğundan emin olun, boyama kutuları ve toplu çözümler dahil.
Reagent LiBH4	Sigma-Aldrich	62460-5G-F	Susuz bir ortamda kalın
Instrument Mantra Snap	Akoya		Boyaları ayırt etmek için çok spektral florscent mikroskop gereklidir. Opal boyalarını tespit etmek için kullanılabilen örnek mikroskop.
Tool Microtome	Leica Biosystems		Veya fırça gibi tercih edilen aksesuarlarla benzer
Boyama reaktifi Opal IHC 480 Kiti	Akoya	FP1500001KT	Şekil 4'te Kullanılanlar
Boyama reagenti Opal IHC 6-plex Plex Kit	Akoya	NEL821001KT	520 ve 620 ağartmaz, Şekil 1, 2 ve 4'te kullanılmıştır
Boyama reaktifi Opal IHC 780 Kiti	Akoya	FP1501001KT	Şekil 4'te Kullanılanlar
Tool Fırın	Millipore Sigma	Z683329	Ya da benzer, otomatik boyama ile de yapılabilir
Antikor Pansitokeratin	Abcam	ab9377	Şekil 4'te 1:50'de kullanılmıştır
Reagent PBS (isteğe bağlı)	Fisher Scientific	AAJ61196AP
Instrument PhenoImager	Akoya		Yazılımda yer alan çoklu spektral tam slayt görüntüleme ve gemi spektral karıştırmama
Reagent ProLong Gold Antifade	Fisher Scientific	P36961	Ya da benzer sulu montaj malzemeleri
Antibody ProSP-C n-terminal (ProSPC)	Yedi Tepe Biyoreagentleri	WRAB-9337	Şekil 4'te 1:250'de kullanılmıştır
Antikor REJİ	R& D	MAB1179	Şekil 1 ve 2'de 1:50'de kullanılmıştır
Reagent Reaksiyon tamponu	Roche	NC1895692	Ventana autostainer ile kullanım için
Antikor SARS-CoV-2-N	Hücre Sinyalizasyonu	68344	Şekil 2'de 1:1000'de kullanılmıştır
Slide TOMO Adhezion CC Mikroskop Slaytları-WH	Avantik	SKUSL6519-1	Eğer doku yapışması endişe kaynağıysa,
Instrument Ventana Discovery Ultra	Roche		Metinde "Autostainer 2" olarak anılır. Tüm ilgili reaktiflerin de mevcut olduğundan emin olun, boyama kutuları ve toplu çözümler dahil.
Reagent Yıkama tamponu	Leica Biosystems	AR9590	Leica Bond otomatik boyama cihazı ile kullanım için
Reagent Su	Fisher Scientific	15-230-147	DI en iyisidir, millipore değil
Tool Su Banyosu	Leica Biosystems	140607020C1	Ya da benzeri

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Radtke, A. J., et al. IBEX: an iterative immunolabeling and chemical bleaching method for high-content imaging of diverse tissues. Nature Protoc. 17 (2), 378-401 (2022).
Radtke, A. J., et al. IBEX: A versatile multiplex optical imaging approach for deep phenotyping and spatial analysis of cells in complex tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (52), 33455-33465 (2020).
Prichard, J. W. Overview of automated immunohistochemistry. Arch Pathol Lab Med. 138, 1578-1582 (2014).
Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70, 46-58 (2014).
Speranza, E., et al. Age-related differences in immune dynamics during SARS-CoV-2 infection in rhesus macaques. Life Sci Alliance. 5, 4(2022).
Parra, E. R., et al. Procedural requirements and recommendations for multiplex immunofluorescence tyramide signal amplification assays to support translational oncology studies. Cancers (Basel). 12 (2), 255(2020).
Hoyt, C. C. Multiplex immunofluorescence and multispectral imaging: forming the Basis of a clinical test platform for immuno-oncology. Front Mol Biosci. 8, 674747(2021).
Bankhead, P., et al. QuPath: Open source software for digital pathology image analysis. Sci Rep. 7, 16878(2017).
Feng, Y., et al. Spatial analysis with SPIAT and spaSim to characterize and simulate tissue microenvironments. Nat Commun. 14, 2697(2023).
Meyer, L., Eling, N., Bodenmiller, B. cytoviewer: an R/Bioconductor package for interactive visualization and exploration of highly multiplexed imaging data. BMC Bioinformatics. 25, 9(2024).
Windhager, J., et al. An end-to-end workflow for multiplexed image processing and analysis. Nat Protoc. 18 (11), 3565-3613 (2023).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

oklu mmunboyama Tiramid Sinyal Amplifikasyonu Otomatik Boyama FFPE Doku Antijen Geri Kazan m T m Slayt G r nt leme H cre Fenotipleme Panel Tasar m

Yinelemeli Ağartma, Çekirdek Tesisler için Boyama Otomasyonu Kullanımıyla Çeşitliliği Artırıyor

Bu makalede

Özet

Özet

Giriş

Protokol

Sonuçlar

Tartışma

Açıklamalar

Teşekkürler

Malzemeler

Kaynaklar

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

İlgili makaleler