İnsan CART ve miyeloid hücreler arasındaki etkileşimleri incelemek için mevcut olan sınırlı ksenogreft modelleri göz önüne alındığında, insan makrofajlarının CART hücreleri üzerindeki etkilerini anlamak için in vitro ve in vivo modeller oluşturduk. Bulgular, tümör mikroçevresindeki makrofaj rollerini değerlendirmek ve makrofaj hedefli immünoterapileri test etmek için potansiyel olarak genelleştirilebilir.
Yöntem makalesi
Miyeloid Hücreler ve CAR T Hücreleri Arasındaki Etkileşimlerin İn Vitro ve İn Vivo Olarak İncelenmesi
Bu makalede
Özet
Özet
Kimerik antijen reseptörü T (CART) hücre tedavisi, hematolojik malignitelerin tedavisinde kayda değer klinik başarılara yol açmıştır. Bununla birlikte, çoğu hasta 1-2 yıl içinde nükseder. İmmünsüpresif miyeloid hücreler tarafından T hücresi inhibisyonu dahil olmak üzere CART direncine yol açan çeşitli mekanizmalar tanımlanmıştır. Artan kanıtlar, tümör mikroçevresindeki (TME) monositlerin ve makrofajların kötü CART performansına ve klinik sonuçlara katkıda bulunduğunu göstermiştir. İnsan makrofajları ve CART hücreleri arasındaki etkileşimleri incelemek için klinik öncesi modeller sınırlıdır. Burada, insan makrofajlarının hem in vitro hem de in vivo olarak CART hücreleri üzerindeki etkilerini anlamaya yönelik yaklaşımları tartışıyoruz. İmmünsüpresif makrofajların CART fonksiyonlarını inhibe ettiğini göstermek için in vitro kokültür modelleri tanımlanmıştır. Ek olarak, insan makrofajlarının ve tümör hücrelerinin, CART hücreleri ve tümör hücreleri ile M2 benzeri makrofaj etkileşimlerini incelemek için NSG farelerinde deri altından aşılandığı bir ksenogreft modeli bildiriyoruz. Bu modeller, TME'deki makrofajların rollerini değerlendirmek ve makrofaj hedefli kanser immünoterapilerini test etmek için kullanılabilir.
Giriş
Otolog kimerik antijen reseptörü T (CART) hücre tedavisi, nüks veya refrakter hematolojik malignitelerin tedavisinde klinik başarılar elde etmiştir ve bu da CD19 veya B hücre olgunlaşma antijenini (BCMA) hedefleyen altı CART ürününün ABD FDA onayına yol açmıştır1. CART hücre tedavisinin etkileyici başlangıç aktivitesine rağmen, çoğu hasta tedaviyi takip eden ilk 1-2 yıl içinde nükseder2. Suboptimal T hücresi uygunluğu, antijen kaçışı ve zayıf CART kalıcılığının yanı sıra immünosüpresif tümör mikroçevresinin (TME) aracılık ettiği inhibisyon dahil olmak üzere çeşitli CART direnci mekanizmaları tanımlanmıştır2,3. Monositler ve makrofajlar gibi miyeloid hücreler genellikle TME'nin önemli bir bölümünü oluşturur ve T hücreleri de dahil olmak üzere diğer bağışıklık hücrelerinin ana inhibitörleri olduğu gösterilmiştir 4,5. Miyeloid hücrelerin CART hücresinin terapötik etkinliği bağlamında zararlı etkileri, klinik öncesi modellerde ve hem hematolojik hem de katı tümörlerin klinik çalışmalarında bildirilmiştir 3,6. Miyeloid aracılı inhibisyon, CART üretim sürecinin başlangıcından itibaren meydana gelebilir - başlangıç aferez ürünündeki monositlerin ex vivo CART genişlemesini inhibe ettiği gösterilmiştir 7,8. Miyeloid aracılı CART inhibisyonunun biriken kanıtları göz önüne alındığında, birçok çalışma, daha iyi bağışıklık tepkileri için TME'deki immünosüpresif makrofajları hedeflemek ve ortadan kaldırmak için CART hücrelerini tasarlamayı amaçlamıştır5. Bununla birlikte, CART hücreleri ve immünosüpresif makrofajlar arasındaki etkileşimlerin arkasındaki mekanizmalar hala tam olarak aydınlatılamamıştır. Ek olarak, bu etkileşimlerin halka açık sınırlı ksenogreft modelleri vardır. Bu nedenle, hem in vitro hem de fare modellerinde insan makrofajları ve CART hücreleri arasındaki etkileşimleri inceleyen modellere acil bir ihtiyaç vardır.
Burada, insan CD19 hedefli CART (CART19) hücrelerinin CD19+ tümör hücreleri ve ex vivo polarize M2 benzeri makrofajlarla birlikte kültürlendiği bir yöntemi açıklıyoruz. Ek olarak, immün yetmezliği olan farelerin hem hedef hücreler hem de insan makrofajları ile deri altından aşılandığı ve immünosüpresif makrofajların olduğu bir ortamda ilgilenilen immünoterapilerin değerlendirilmesine olanak tanıyan bir ksenogreft fare modeli sunuyoruz. Spesifik olarak, in vitro immünosüpresif makrofajların varlığında veya yokluğunda CART antijene özgü proliferasyonu analiz ettik ve hem transwell hem de doğrudan ko-kültür plakalarında T hücresi genişlemesinde önemli bir inhibisyon gösterdik. Ksenogreft modelimizde, NSG fareleri, tedavi taraması için Matrigel'de süspanse edilen tümör hücreleri ve insan makrofajları ile deri altından aşılandı. Bu hayvan modeli, ex vivo farklılaşmış immünosüpresif insan makrofajlarının NSG farelerinde tümör ilerlemesini teşvik edebildiğini başarıyla gösterdi. Bu protokolü izleyerek, küçük moleküllü ilaçlar, biyolojikler ve diğer hücre bazlı tedaviler dahil olmak üzere immünosüpresif makrofaj hedefli terapötiklerin etkinliği test edilebilir. Bununla birlikte, insan TME'sini incelemek için immün yetmezliği olan farelerin kullanılmasının sınırlamaları nedeniyle, önerilen modeller kavram kanıtı çalışmaları için en uygun olanıdır.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Aşağıdaki protokol, Mayo Clinic'in Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB), Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi (IBC) ve Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi protokolü A00001767 kapsamındaki Karşılaştırmalı Tıp Anabilim Dalı'nın yönergelerini takip etmektedir.
1. İn vitro çalışma için insan klasik monositlerinin hazırlanması
- Periferik kan mononükleer hücrelerini (PBMC'ler) daha önce tarif edildiği gibi sağlıklı kan donörlerinden izole edin9. Kısaca, tam kanı PBS'de 1: 1 hacim oranında% 2 FBS ile seyreltin, ardından yoğunluk gradyan ortamında PBMC izolasyonu yapın.
- İnsan klasik monositlerini (CD14+CD16-) üreticinin talimatlarına göre negatif manyetik boncuk seçimi ile hasat edilen PBMC'lerden izole edin (Malzeme Tablosu). Kısaca, uygun sayıda PBMC'yi izolasyon tamponu ile yıkayın ve üreticinin talimatlarına göre belirtilen hacimdeki hücreleri yeniden süspanse edin. Klasik monositler dışındaki hücreleri bir antikor kokteyli ve manyetik mikro boncuklarla etiketleyin. Sütunlarda monosit olmayanları korurken, akıştan klasik monositleri toplayın.
NOT: Tüm PBMC'lerin %5'inin klasik monositler olduğunu varsayalım ve PBMC'lerin başlangıç hücre sayısını buna göre ayarlayın. Kalan PBMC'leri adım 1.7'de monosit popülasyonunun saflık onayı için saklayın. Klasik monositler her zaman önceden kriyoprezervasyon yapılmadan taze PBMC'lerden izole edilmelidir. - Bir hücre sayacı (Malzeme Tablosu) kullanarak izole edilmiş monositlerin sayısını sayın ve hücreleri 5 dakika boyunca 4 ° C'de 300 x g'da döndürün. Son konsantrasyon olarak 1 x 106 hücre / mL'ye ulaşmak için hücre izolasyon tamponundaki hücreleri yeniden askıya alın. 100 μL hücre süspansiyonu alın ve düz tabanlı 96 oyuklu bir plakaya aktarın.
- Akış sitometrisi ile klasik monosit popülasyon saflığını doğrulamak için 1 x 105 PBMC'yi negatif geçit kontrolü ile aynı plakaya aktarın. Hücreleri 3 dakika boyunca 4 ° C'de 300 x g'da döndürün. 1.5-1.12 adımlarında izole edilmiş monositleri buz üzerinde tutun.
- Hücreleri 200 μL FACS tamponu ile yeniden süspanse ederek yıkayın ve hücreleri 3 dakika boyunca 4 ° C'de 300 x g'da döndürün. Süpernatanları dikkatlice boşaltın.
- Her numune için, 0.3 μL canlı/ölü reaktif (405 nm'de uyarma), 0.5 μL APC konjuge anti-insan CD1410 (1 ng/μL) ve 0.5 μL PE konjuge anti-insan CD1611 (1 ng/μL; Malzeme Tablosu).
NOT: Boyamayı tutarlı tutmak için, toplam numune sayısına göre birden fazla numune için bir ana karışım yapın. Her kuyucuğa 50 μL boyama solüsyonu aktarın. - Her bir oyuğa 50 μL boyama solüsyonu ekleyin ve kabarcıkları önlemek için hücreleri hafifçe karıştırın. Hücreleri karanlıkta oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.
- Her bir oyuğa 200 μL FACS tamponu ekleyin ve hücreleri 3 dakika boyunca 4 ° C'de 300 x g'da döndürün. Süpernatanları dikkatlice boşaltın.
- Her bir oyuğa 200 μL FACS tamponu ekleyerek yıkayın ve hücreleri 3 dakika boyunca 4 ° C'de 300 x g'da döndürün. Süpernatanları dikkatlice boşaltın ve hücreleri 200 μL FACS tamponunda yeniden süspanse edin. Numuneleri bir akış sitometresinde çalıştırın (Malzeme Tabloları).
- Kapı CD14 + CD16- nüfus. İdeal bir saflık için CD14 + CD16-
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu protokolün amacı, etkileşimlerin karmaşık doğası ve dinamikleri ve sınırlı mevcut ksenogreft modelleri nedeniyle insan immünosupresif makrofajları ve CART hücreleri arasındaki etkileşimleri incelemek için hem in vitro hem de in vivo modeller oluşturmaktır. Protokolü takiben, izole edilmiş insan klasik monositleri, M2 benzeri fenotipler elde etmek ve fonksiyonel olarak immünosupresif hale gelmek için farklılaştırılır.
İzole edilmiş insan klasik monositlerinin saflığını doğr...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
CART hücre tedavisi, hematolojik maligniteleri olan hastaların alt gruplarının tedavisinde çok sayıda klinik başarı göstermiştir, ancak çoğu hasta CART infüzyonundan1-2 yıl sonra nükseder 1,2. Çeşitli potansiyel CART direnç mekanizmaları tanımlanmıştır ve immünosupresif miyeloid hücrelerin TME immünosupresyonunda ve müteakip CART yetmezliğinde önemli bir rol oynadığı bulunmuştur 3,4,5,6,7,8.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
SSK, Novartis'e (Mayo Clinic, Pennsylvania Üniversitesi ve Novartis arasındaki bir anlaşma yoluyla), MustangBio'ya (Mayo Clinic aracılığıyla) ve Sendero'ya (Mayo Clinic aracılığıyla) lisanslı CAR immünoterapisi alanındaki patentlerin mucididir. RLS ve SSK, Humanigen'e (Mayo Clinic aracılığıyla) lisanslı CAR immünoterapi alanındaki patentlerin mucitleridir. KY, RLS, TH, BK, ES ve SSK, Immix'e lisanslı CAR immünoterapisi alanındaki patentlerin mucitleridir. SSK, Kite, Gilead, Juno, BMS, Novartis, Humanigen, MorphoSys, Tolero, Sunesis/Viracta, LifEngine Hayvan Sağlığı Laboratuvarları A.Ş., Incyte ve Lentigen'den araştırma fonu almaktadır. SSK, Kite/Gilead, Humanigen, Juno/BMS, Capstan Bio ve Novartis ile danışma toplantılarına katılmıştır. SSK, Humanigen ve Carisma ile veri güvenliği ve izleme kurulunda görev almıştır. SSK, Torque, Calibr, Novartis, Capstan Bio, Carisma ve Humanigen için danışman olarak görev yaptı.
Teşekkürler
Bu çalışma kısmen Mayo Clinic Kapsamlı Kanser Merkezi (SSK), Mayo Clinic Bireyselleştirilmiş Tıp Merkezi (SSK), Mayo Clinic Rejeneratif Biterapötikler Merkezi (SSK), Ulusal Sağlık Enstitüleri hibe R37CA266344-01 (SSK) ve Savunma Bakanlığı hibe CA201127 (SSK) aracılığıyla finanse edilmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 0,5 mL şırınga | Fisher Bilimsel | 329461 | |
| 1,5 mL mikrosantrifüj tüpü | Eppendorf Belediyesi | 1415-2508 | |
| 15 mL konik tüp | Corning Yaşam Bilimleri | 352097 | |
| 24-kuyu transwell plaka (0.4 μ m) | Corning Yaşam Bilimleri | 3397 | |
| 50 mL konik tüp | Corning Yaşam Bilimleri | 352098 | |
| APC/Cy7-konjuge anti-insan CD206 | Biyolojik Efsane | 321119 | Akış antikoru |
| APC konjuge anti-insan CD14 | Biyolojik Efsane | 325607 | Akış antikoru |
| APC konjuge anti-insan CD3 | Biyolojik Efsane | 344811 | Akış antikoru |
| autoMACS Durulama Solüsyonu | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | Classcial monosit izolasyon tamponu |
| Bazal Membran Matrisi | Corning Yaşam Bilimleri | CLS356237 | Çözündürülmüş bazal membran matrisi |
| Hücre kültürü ortamı | %10 insan AB serumu %1 penisilin-streptomisin-glutamin X-VIVO'da 15 Serumsuz Hematopoietik Hücre Ortamı | ||
| Klasik monosit izolasyon kiti, insan | Miltenyi Biotec | 130-117-337 | |
| CytoFLEX Sistemi B5-R3-V5 | Beckman Coulter | C04652 (İngilizce) | Akış sitometresi |
| D-lusiferin | Altın Biyoteknoloji | ŞANS-1G | |
| D-PBS (Dulbecco'nun fosfat tamponlu salini) | Gibco | 14190250 | |
| Göz merhemi | Termo Fisher | 19-090-832 | |
| FACS arabelleği | PBS'de %2 FBS %1 sodyum azid | ||
| Fetal sığır serumu | Corning Yaşam Bilimleri | 35-011-CV | |
| Düz tabanlı 96 oyuklu plaka | Corning Yaşam Bilimleri | CLS3997 | |
| Isıyla inaktive edilmiş havuzlanmış insan AB serumu | Yenilikçi Araştırma | 4931 | |
| İnsan TruStain FcX (Fc Reseptör Bloke Edici Solüsyon) | Biyolojik Efsane | 422301 | |
| İzofluran sıvı | Piramal İlaç Sınırlı | 66794-017-10 | |
| IVIS Spektrum İn Vivo Görüntüleme Sistemi | PerkinElmer Ödülü | 124262 | |
| JeKo-1 hücre hattı kültür ortamı | %10 FBS RPMI-1640 ortamında %1 penisilin-streptomisin-glutamin | ||
| Canlı/ölü Düzeltilebilir Aqua Ölü Hücre Leke Kiti, 405 nm uyarımı için | Davetli | L34966 Serisi | |
| LS sütunu | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Negatif boncuk seçimi |
| Lenfoprep | Kök Hücre Teknolojileri | 07811 | Yoğunluk gradyan ortamı |
| MACS BSA Stok Çözümü | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | Classcial monosit izolasyon tamponu |
| Fare-anti-insan CD206 antikoru, AF546 ile konjuge edilmiştir; | Santa Cruz Biyoteknoloji | SC-376232 | |
| NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) fareleri | Jackson Laboratuvarı | 5557 | |
| PE konjuge anti-insan CD16 | Biyolojik Efsane | 302007 | Akış antikoru |
| Penisilin-Streptomisin-Glutamin (100x), Sıvı | Gibco | 10378-016 | |
| PerCP-konjuge anti-insan CD163 | Biyolojik Efsane | 333625 | Akış antikoru |
| AF647 ile konjuge tavşan-anti-insan iNOS antikoru | Protein teknolojisi | CL647-18985 | |
| Rekombinant insan GM-CSF'si | Kök Hücre Teknolojileri | 78015 | |
| RPMI-1640 orta | Gibco | 11875093 | |
| SepMate-50 IVD | Kök Hücre Teknolojileri | 85450 | PBMC izolasyonu yoğunluk gradyan santrifüjü ile |
| Sodyum Azid, %5 (a/h) | Ricca Kimya | 7144.8-16 | |
| Doku kültürü ile işlenmiş 48 oyuklu plaka | Corning Yaşam Bilimleri | 3548 | |
| Vi-cell XR Hücre Canlılığı Analiz Cihazı | Beckman Coulter | Hücre sayacı | |
| X-VIVO 15 Serumsuz Hematopoietik Hücre Ortamı | Lonza | 04-418Soru |
Kaynaklar
- Yun, K., Siegler, E. L., Kenderian, S. S. Who wins the combat, CAR or TCR. Leukemia. 37 (10), 1953-1962 (2023).
- Neelapu, S. S., et al. Axicabtagene Ciloleucel CAR T-Cell Therapy in Refractory Large B-Cell Lymphoma. New England J Med. 377 (26), 2531-2544 (2017).
- Shah, N. N., Fry, T. J. Mechanisms of resistance to CAR T cell therapy. Nat Rev Clin Oncol. 16 (6), 372-385 (2019).
- Kiss, M., Caro, A. A., Raes, G., Laoui, D. Systemic Reprogramming of Monocytes in Cancer. Fronti Oncol. 10, (2020).
- Rodriguez-Garcia, A., et al. cell-mediated depletion of immunosuppressive tumor-associated macrophages promotes endogenous antitumor immunity and augments adoptive immunotherapy. Nat Commun. 12 (1), (2021).
- Kankeu Fonkoua, L. A., Sirpilla, O., Sakemura, R., Siegler, E. L., Kenderian, S. S. CAR T cell therapy and the tumor microenvironment: Current challenges and opportunities. Mol Ther Oncolyt. 25, 69-77 (2022).
- Stroncek, D. F., et al. Elutriated lymphocytes for manufacturing chimeric antigen receptor T cells. J Trans Med. 15 (1), (2017).
- Stroncek, D. F., et al. Myeloid cells in peripheral blood mononuclear cell concentrates inhibit the expansion of chimeric antigen receptor T cells. Cytotherapy. 18 (7), 893-901 (2016).
- Sterner, R. M., Cox, M. J., Sakemura, R., Kenderian, S. S. Using crispr/cas9 to knock out gm-csf in car-t cells. J Vis Exp. (149), e59629(2019).
- Ali, L. R., et al. PD-1 blockade and CDK4/6 inhibition augment nonoverlapping features of T cell activation in cancer. J Exp Med. 220 (4), e20220729(2023).
- Wang, T., et al. Proteomic and Metabolomic Characterization of SARS-CoV-2-Infected Cynomolgus Macaque at Early Stage. Front Immunol. 13, 954121(2022).
- Ruella, M., et al. Overcoming the immunosuppressive tumor microenvironment of Hodgkin lymphoma using chimeric antigen receptor T cells. Cancer Dis. 7 (10), 1154-1167 (2017).
- Sakemura, R., et al. Development of a Clinically Relevant Reporter for Chimeric Antigen Receptor T-cell Expansion Trafficking, and Toxicity. Cancer Immunol Res. 9 (9), 1035-1046 (2021).
- Sterner, R. M., et al. GM-CSF inhibition reduces cytokine release syndrome and neuroinflammation but enhances CAR-T cell function in xenografts. Blood. 133 (7), 697-709 (2019).
- Smith, A., et al. A Novel Three-Dimensional Skin Disease Model to Assess Macrophage Function in Diabetes. Tissue Eng Meth. 27 (2), 49-58 (2021).
- Nowak, W., et al. Pro-inflammatory monocyte profile in patients with major depressive disorder and suicide behaviour and how ketamine induces anti-inflammatory M2 macrophages by NMDAR and mTOR. EBioMedicine. 50, 290-305 (2019).
- Ajith, A., et al. Humanized Mouse Model as a Novel Approach in the Assessment of Human Allogeneic Responses in Organ Transplantation. Front Immunol. 12, 687715(2021).
- Tsukamoto, A., Serizawa, K., Sato, R., Yamazaki, J., Inomata, T. Vital signs monitoring during injectable and inhalant anesthesia in mice. Exp Animals. 64 (1), 57-64 (2015).
- Hickman, D. L. Minimal Exposure Times for Irreversible Euthanasia with Carbon Dioxide in Mice and Rats. J Am Assoc Lab Animal Sci. 61 (3), 283-286 (2022).
- Zhou, R., Mei, L. Neural Development: Methods and Protocols. , Humana Press. Totowa, NJ. (2013).
- Gutierrez-Ruiz, O. L., et al. Ectopic expression of DOCK8 regulates lysosome-mediated pancreatic tumor cell invasion. Cell Rep. 42 (9), 113042(2023).
- Kirkiles-Smith, N. C., et al. Development of a Humanized Mouse Model to Study the Role of Macrophages in Allograft Injury. Transplantation. 87 (2), 189-197 (2009).
- Chuprin, J., et al. Humanized mouse models for immuno-oncology research. Nat Rev Clin Oncol. 20 (3), 192-206 (2023).
- Yun, K., et al. Intrinsic immunosuppressive features of monocytes suppress CAR-T19 through IL-1 pathway modulation in mantle cell lymphoma. Mol Ther Oncol. 33 (2), 200985(2025).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste
İzin iste