Method Article

Yüksek Tuzlu Diyet Koşulları Altında Tuza Duyarlı Sıçanlarda Bağırsak Mikrobiyal Hücre Dışı Veziküllerinin Ayrılması ve Diferansiyel Karakterizasyonu

DOI:

10.3791/68279

⸱

June 6th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Medical Technology, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Pathology Department, Suining Central Hospital, 3School of Health Preservation and Rehabilitation, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 4Department of Pharmacy, Affiliated Sport Hospital of CDSU, 5Department of Neck, Shoulder, Waist, and Leg Pain, Sichuan Province Orthopedic Hospital, 6Neijiang Hospital of Traditional Chinese Medicine Affiliated to Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokol, yoğunluk gradyan santrifüjlemesi kullanılarak HSD ile beslenen tuza duyarlı sıçanlardan bağırsak mikrobiyal EV'lerinin izolasyonunu açıklar. EV'ler, boyut, morfoloji, bileşim ve mikrobiyota kökenini analiz etmek için nanopartikül izleme, TEM, LPS/BCA testleri ve 16S rRNA dizilimi ile karakterize edildi.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yüksek tuz alımı, hipertansiyon için önemli bir risk faktörüdür ve altta yatan mekanizması, bağırsak mikrobiyotası tarafından salgılanan hücre dışı veziküller (EV'ler) ile yakından bağlantılı olabilir. Bağırsak mikrobiyotası tarafından üretilen bu EV'ler, yüksek tuzlu bir diyetin (HSD) neden olduğu hipertansiyonun gelişiminde çok önemli bir rol oynayabilecek çeşitli biyoaktif bileşenler taşır. Bu mekanizmayı araştırmak için, EV'leri HSD ile beslenen tuza duyarlı sıçanların bağırsak mikrobiyotasından izole etmek için yoğunluk gradyan santrifüjlemesine dayalı verimli bir ekstraksiyon yöntemi geliştirdik. Partikül boyutu analizi, transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ve lipopolisakkarit (LPS) tespiti sayesinde, bağırsak mikrobiyotası EV'lerinin gradyan dağılımını belirledik ve hassas ekstraksiyon elde ettik. Ayrıca, normal ve HSD grupları arasındaki EV'lerin kökeni ve bileşimsel farklılıklarını analiz etmek için 16S rRNA gen dizilimi kullanıldı ve yüksek tuz alımının bağırsak mikrobiyotası EV'lerinin genetik özellikleri üzerindeki etkisini ortaya koydu. Bu çalışma, tuza bağlı hipertansiyonun altında yatan bağırsak mikrobiyota mekanizmaları hakkında değerli araçlar ve bilimsel bilgiler sağlamakta ve ilgili hastalıkların önlenmesi ve tedavisi için yeni bakış açıları sunmaktadır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bağırsak mikrobiyotası mikroflorası veya bağırsak mikroekolojisi olarak da bilinen bağırsak mikrobiyotası, biyolojik gastrointestinal sistemde bulunan on binlerce mikroorganizmadan oluşan bir komplekstir ve insan sağlığının korunmasında çok önemli bir rol oynar1. Son yıllarda, daha fazla araştırmayla, bağırsak mikrobiyotasının hücre dışı veziküller (EV'ler) üretebildiği bulunmuştur2. EV'ler, hücrede proteinler, nükleik asitler ve lipitler gibi çeşitli molekülleri taşıyan hücreler tarafından salınan küçük veziküllerdir 3,4. Diğer mikroplarla5, bağırsak epitel hücreleri ve hatta uzak doku ve organlarla6 etkileşime girebilirler, böylece insan vücudunun sağlığınıetkileyebilirler 7,8. Bu bağırsak mikrobiyotası tarafından üretilen EV'ler ile diyet9 arasında sıkı bir bağlantı vardır.

Bağırsak mikrobiyotası tarafından üretilen EV'ler, yüksek tuzlu bir diyetin (HSD) vücut sağlığını etkilediği önemli ajanlar olabilir. HSD sadece bağırsak mikrobiyotasının10 dengesini doğrudan bozmakla kalmaz, aynı zamanda yararlı bakterilerin (Lactobacillus gibi) sayısında önemli bir azalmaya yol açar11, aynı zamanda zararlı bakterilerin (Bacteroides vb.) çoğalmasını da teşvik eder12. Bu dengesizlik bağırsak bariyeri fonksiyonunu azaltır ve bağırsak iltihabı riskini artırır. Ek olarak, bir HSD ayrıca bağırsak mikrobiyotasının metabolik aktivitelerini13 değiştirerek bağırsaktaki asit-baz dengesini ve besin emilimini daha da etkiler, örneğin çoklu fizyolojik işlevlere sahip kısa zincirli yağ asitlerinin14,15 üretimini azaltmak gibi.

Bu değişiklikler sadece bağırsak sağlığını etkilemekle kalmaz, aynı zamanda EV'lerin üretimini ve salınımını dolaylı olarak düzenleyebilir ve EV'nin bileşimini ve işlevini değiştirebilir. Yüksek tuzlu ortam, EV'lerin salınması ve taşınması dahil olmak üzere bağırsak hücrelerinin normal fizyolojik fonksiyonlarını etkileyebilir ve böylece EV'lerin hücreler arası bilgi iletimi ve bağışıklık düzenlemesindeki rolünü bozabilir. Aynı zamanda, bağırsak iltihabı, özel işlevlere sahip çeşitli EV'leriteşvik edebilir 16 ve bağırsak-organ ekseni ve diğer yollarla tüm vücuda yayılabilir17,18, bu da hipertansiyonun ortaya çıkması ve gelişimi ile yakından ilişkilidir19,20, kardiyovasküler21 ve serebrovasküler hastalıklar22,23, obezite24,25, diyabet26 ve diğer kronik hastalıklar.

Bu nedenle, bu çalışmanın genel amacı, HSD ile beslenen tuza duyarlı sıçanların bağırsak mikrobiyotasından EV'leri çıkarmak için verimli ve güvenilir bir yöntem geliştirmek ve bunların fiziksel özelliklerini, bileşimlerini ve işlevlerini sistematik olarak incelemekti. Yüksek tuzlu bir diyetten sonra kan basıncındaki önemli artışın özellikleri nedeniyle, tuza duyarlı sıçanlar seçildi ve etkili bir ekstraksiyon yöntemi oluşturularak HSD'nin bağırsak mikrobiyotası EV üzerindeki etkisi ortaya çıkarıldı. Yöntem, yoğunluk gradyanlı santrifüjlemeye dayanıyordu ve parçacık boyutu tespiti, LPS/BCA ölçümü, transmisyon elektron mikroskobu ve proteomik analiz gibi çeşitli dinamik tanımlama tekniklerini birleştirdi. Protokol, HSD'nin bağırsak mikrobiyotası EV üzerindeki etkilerini ve kardiyovasküler hastalıklardaki mekanizmalarını ortaya koymayı amaçlamaktadır. Yüksek verimliliği, tekrarlanabilirliği ve geniş uygulanabilirliği ile bu yaklaşım, tuz kaynaklı hipertansiyonda bağırsak mikrobiyotası EV'lerinin mekanizmasını keşfetmek için önemli bir araç sağlamakla kalmaz, aynı zamanda EV'lere dayalı hastalık müdahale stratejileri geliştirmek için teorik temeli de oluşturur. Bu çalışma sayesinde, hipertansiyon gibi kardiyovasküler hastalıkların önlenmesi ve tedavisi için yeni yollar açmayı umuyoruz27,28.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu hayvan deney çalışması, ilgili etik yönergelere ve uluslararası standartlara uygundur. Hayvanları içeren çalışmalar, Chengdu Çin Tıbbı Üniversitesi Laboratuvar Hayvanları Refahı ve Etik Kurulu (kurum: Chengdu Çin Tıbbı Üniversitesi; protokol numarası: 2018-21) tarafından onaylanmıştır.

1. Hayvan hazırlama ve diyet rejimi

  1. Vücut ağırlığı 180-200 g olan 6 haftalık erkek Dahl tuza duyarlı sıçanları% 50 ±% 10 nemde yetiştirerek iklimlendirin; 12 saat / 12 saat ışık döngüsü; Belirli patojen içermeyen koşullar altında 1 hafta boyunca 20.0 ± 2.0 °C.
  2. Daha sonra, sıçanları eşit olarak iki gruba bölün (n = 6). Her gruba 6 hafta süren farklı bir diyet sağlayın:% 0.5 sodyum klorür içeren normal bir tuz diyeti (NSD) ve% 8 sodyum klorür içeren bir HSD, yayınlanmış çalışmalarda yaygın olarak kullanılır 29,30,31. Fareler, çalışma boyunca yiyecek ve suya sınırsız erişime sahipti.

2. Kan basıncının izlenmesi

NOT: Kan basıncı ölçümü için non-invaziv bir yöntem olarak kuyruk manşet pletismografisi kullanıldı ve kan basıncı kuyruk kan hacminden ölçüldüğünde hacimsel basınç kaydı (VPR) kullanıldı.

  1. Fareleri talaşlı küçük kafeslere ayrı ayrı yerleştirin, yaklaşık 37 ° C'de 10 dakika ısıtın ve hayvan girişi için ayarlanabilir bir burun ve kapıya sahip özel bir kemirgen kısıtlamasına yerleştirin. Vücut sıcaklıklarını 37 °C'de tutmak için fareleri yüzüstü pozisyonda bir ısıtma yastığına yerleştirin.
  2. VPR sensörünü kuyruğun altına bağlayın ve BP28'i stabilize etmek için en az 10 adaptasyon döngüsü ayarlayın.
    1. Şişirilebilir manşeti kuyruk köküne doldurun ve pletizografik sensörü (veya fotoelektrik sensörü) aşağıya yerleştirin. Yavaşça sistolik basıncın üzerine (genellikle 200 mmHg) şişirin ve ardından yavaşça bırakın. Cihaz, nabız dalgasının kaybolması (sistolik kan basıncı) ve iyileşmenin (diyastolik kan basıncı) basınç değerini otomatik olarak algılar. Arka arkaya 3-5 kez ölçün ve ortalama değeri alın.
  3. Tüm fareleri kısıtlama prosedürüne uyacak şekilde eğitin ve sirkadiyen varyasyonun etkilerini en aza indirmek için bu çalışmayı sabah 9 civarında sessiz bir laboratuvarda gerçekleştirin.
  4. Kurban öncesi sistolik kan basıncını (SBP) ve diyastolik kan basıncını (DBP) iki günde bir ölçün. SBP ve DBP'den ortalama arteriyel basıncı (MAP) tahmin edin
    HARITA = (SBP + 2 DBP)/3

3. EV'lerin çıkarılması

  1. Numune toplama
    1. Steril bir pamuklu çubuğu% 75 alkole batırın ve farenin anüsünü uyarmak için kullanın. Stimülasyonun bağırsak peristaltizmini teşvik etmesi ve anal sfinkteri gevşetmesi, böylece dışkılamayı teşvik etmesi amaçlandı. Dışkı dışarı atıldıktan sonra, steril forseps kullanarak uygun büyüklükte steril kaplara toplayın ve hemen -80 °C'de saklayın.
  2. Numune hazırlama
    1. Bir kaşık kullanarak, 5 g dışkıyı önceden tartılmış 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. Tüpe 50 mL önceden ısıtılmış 37 °C endotoksin içermeyen PBS (maksimum numune konsantrasyonu %10) ekleyin ve 30 dakika döndürün. Yüksek hızlı santrifüjü 4 °C'ye soğutun.
    2. Santrifüjün dengelenmesini sağlamak için numuneleri simetrik olarak yerleştirdikten sonra 15 dakika boyunca 8.000 x g'da santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı aspire edin ve yeni bir steril santrifüj tüpüne aktarın.
    3. 15 dakika boyunca 8.000 x g'da tekrar santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin ve daha fazla analiz için kullanın.
  3. Ham ekstrakt hazırlama
    1. Steril bir 0,22 μm filtre ünitesi kullanın. Filtre ünitesini buzun üzerine yerleştirin ve vakum pompasını sıkıca tutun. Elde edilen süpernatanı filtrenin üst kısmına aktarın. Filtrelenmiş numuneleri toplamak için vakum pompasını açın.
    2. Süzüntüyü bir santrifüj filtreye (10 kDa, 15 mL) aktarın, 4 °C'de, 3.000 x g'de 30 dakika santrifüjleyin ve numuneyi en az 1400 μL'ye konsantre edin.
    3. Konsantre numuneyi toplayın ve gerekirse önceden soğutulmuş endotoksin içermeyen PBS kullanarak 1400 μL'ye seyreltin. Seyreltmeden hemen sonra numuneyi buz üzerinde tutun.
      NOT: Ham ekstrakt hemen kullanılabilir veya -80 °C'de birkaç ay saklanabilir.
  4. EV'lerin ayrılması
    1. Degrade arabelleği A'yı ve degrade arabelleği B'yi aşağıda açıklandığı gibi hazırlayın. Bileşiğin tamamen çözünmesi birkaç saat sürdüğü için tamponu bir gün önceden hazırlayın. Hazırlanan tampon 4 °C'de 6 ay saklanabilir.
      1. Gradyan tamponu A'nın hazırlanması: 0.25 M sükroz, 6 mM EDTA ve 60 mM Tris'i 800 mL endotoksin içermeyen suda manyetik karıştırıcı karıştırma ile çözün, pH hidroklorik asit kullanılarak 7.4'e ayarlandı. Endotoksin içermeyen su ile 1 L'ye kadar seyreltin. Tamponu filtrelemek için 0,22 μm şişe üstü filtre kullanın.
      2. Gradyan tamponu B'nin hazırlanması: 0.25 M sükroz, 1 mM EDTA ve 10 mM Tris'i 800 mL endotoksin içermeyen su içinde manyetik karıştırıcı karıştırarak çözün, pH hidroklorik asit ile 7.4'e ayarlayın. Endotoksin içermeyen su ile 1 L'ye seyreltilir. Tamponu filtrelemek için 0,22 μm'lik bir şişe üstü filtre kullanın.
    2. Çalışma çözeltisini hazırlamak için 1 hacim gradyan tamponu A ve 5 hacim yoğunluk gradyan ortamını (ortam% 60 iyodiksanol çözeltisidir) karıştırın.
    3. İodiksanol çözeltisinin hazırlanması (% 10,% 20,% 40): % 10'luk bir iyodiksanol çözeltisi hazırlamak için 1 birim çalışma çözeltisi ve 4 birim tampon B'yi karıştırın; % 20 iyodiksanol çözeltisi için, 2 birim çalışma çözeltisi ve 3 birim tampon B'yi karıştırın; % 40 iyodiksanol çözeltisi için 4 birim çalışma çözeltisi ve 1 birim tampon B'yi karıştırın. Her çözeltiyi taze hazırlayın ve buz üzerinde saklayın.
      NOT: Her deney için yeni çalışma çözeltileri hazırlanmalıdır ve deney hatasını hesaba katmak için ek %10'luk bir çözelti hacmi hazırlanabilir.
    4. % 50'lik bir iyodiksanol çözeltisi elde etmek için adım 3.3.3'te hazırlanan çözeltiyi 7 mL yoğunluk gradyan ortamı ile karıştırın.
    5. Bir yoğunluk gradyanı hazırlamak için, farklı katmanlar arasında net bir taslak sağlamak için% 40 çözeltiye% ve% 10 (ağırlıkça / hacim) iyodiksanol çözeltisine tripan mavisi çözeltisi ekleyin.
    6. 8 mL% 50 iyodiksanol çözeltisini ince duvarlı polipropilen santrifüj tüpünün dibine aktarın. Tüpü 70 ° C'ye eğin ve 8 mL% 40 iyodiksanol çözeltisini sıvı yüzeyine aktarın. 8 mL %20 iyodiksanol solüsyonu, ardından 7 mL %10 iyodiksanol solüsyonu ve son olarak 2 mL endotoksin içermeyen PBS ekleyin.
      NOT: Yoğunluk gradyanı hazırlamak pratik gerektirir. Yoğunluk gradyanının kalitesi, deney sonuçları üzerinde büyük bir etkiye sahiptir. Tüpü, ekleme işlemindeki farklı adımlar arasında dik olarak yerleştirmeyin, çünkü bu, yoğunluk gradyanının kalitesini olumsuz etkiler.
    7. Santrifüjü önceden soğutun ve hazırlanan yoğunluk gradyanını ultrasantrifüje yerleştirin. Başlamak için parametreler girilecek, parametre değerleri: 100.000 x g, 20 h, 10 °C.
    8. Manuel gradyan yoğunluk ayrımı için, toplam 34 mL sıvı içeren sistem yüzeyinin merkezinden 2 mL çözeltiyi yavaşça çekin. Her 2 mL bir gradyandır, böylece yoğunluk gradyan çözeltisini 17 gradyana böler.
    9. Yoğunluk fraksiyonlarını bir pipet kullanarak steril bir numune tüpüne aktarın ve hemen buzun üzerine yerleştirin. Dik durduğundan emin olmak için santrifüj tüpünü başparmak ve işaret parmağı arasına sıkıştırın.
  5. EV'lerin kurtarılması
    1. Ultrafiltrasyon çipi üzerinde çift kaplinli ultrasonik salınım sistemi aracılığıyla negatif basınç salınımı uygulayan tam otomatik bir EV ekstraksiyon sistemi kullanarak, numunedeki nükleik asit ve protein safsızlıklarını nanogözenek yoluyla giderin ve EV'leri durdurun, bu da EV'lerin zenginleşmesine ve saflaştırılmasına yol açar.
      1. Adım 3.4.7'deki filtratı çıkarın ve ultrafiltrasyon çipine ekleyin.
      2. Cihazı cihaz talimatlarına göre çalıştırın ve filtrelenmiş filtratı, yani eksozomla zenginleştirilmiş çözeltiyi toplayın. Ana işlem Şekil 1'de gösterilmiştir.

4. EV'lerin tanımlanması

  1. Partikül boyutu ve konsantrasyonu tespiti
    1. Dirençli darbe algılama (RPS) tabanlı bir nanokulometre sayacı kullanarak boyut dağılımını ve zeta potansiyelini değerlendirin. Bu deney için 60-200 nm ölçüm aralığına sahip nanopor çipleri seçin. Ayrıca, bir nano kütüphane sayacı kullanarak EV'lerin parçacık boyutu dağılımını ve zeta potansiyelini değerlendirin.
      1. Uygun miktarda EV çözeltisi alın ve (1/10, 1/100, 1/1000, 1/10000) seyreltin.
      2. Test için cihaza EV çözeltilerinin farklı seyreltmeleri yerleştirildi.
      3. Daha iyi stabiliteye sahip seyreltme çarpanı seçildi ve daha doğru veriler elde etmek için tekrar test edildi.
  2. LPS ve BCA testi
    1. BCA testi: RIPA tamponu kullanarak EV'leri parçalayın ve ardından proteinleri ayırın. BCA protein konsantrasyonu belirleme kitini kullanarak EV'lerin protein içeriğini belirleyin.
    2. LPS testi: Endotoksin tespit kitini kullanarak, kit adımlarına göre numuneler, bir endotoksin dedektörü ve kromojenik ekleyin. 545 nm'de absorbansı ölçün ve standart eğriye göre dış veziküllerin LPS ifadesini hesaplayın.
  3. TEM değerlendirmesi: Negatif boyama ve TEM analizi için, numuneleri sürekli karbon film ile kaplanmış ışıldayan bir bakır ızgaraya uygulayın ve %0,75 uranil format ile boyayın. Cryo-EM için, EV'leri hidrofilik bir yüzeye sahip 300 gözenekli bir EM karbon ızgarasına emdirin ve sıvı nitrojen içinde dondurun. Cryo-TEM kullanarak ızgaraları gözlemleyin ve analiz edin ve görüntüleri 22.000 büyütmede kaydedin32.
  4. Proteinlerin karakterizasyonu: EV'leri RIPA tamponu kullanarak parçalayın ve ardından proteinleri ayırın. BCA protein test kitini kullanarak protein konsantrasyonunu belirleyin, SDS-PAGE ile her numuneden eşit miktarda proteini ayırın ve protein profillerini33,34 görselleştirmek için elektroforezden sonra Coomassie mavi boya çözeltisi ile boyayın.
  5. S dizilimi ve analizi: Bir dışkı DNA ekstraksiyon kiti kullanarak dışkı örneklerinden genomik DNA'yı çıkarın. Agaroz jel elektroforezi ve bir spektrofotometre ile DNA'nın bütünlüğünü ve konsantrasyonunu değerlendirin. 16S rRNA geninin V3 - V4 bölgesini evrensel primerlerle amplifiye edin, PCR ürünlerini saflaştırın, niceliklerini belirleyin ve Illumina platformunda dizileyin. QIIME2 boru hattını35 kullanarak veri analizi gerçekleştirin.
    1. DADA2 kullanarak amplikon dizi varyantlarını (ASV'ler) sınıflandırın ve VSEARCH algoritmasını kullanarak Silva veritabanıyla eşleştirin. Örnekler içindeki tür zenginliğini ve çeşitliliğini değerlendirmek için, esas olarak Shannon indeksi ve Chao1 indeksi gibi indeksleri kullanarak α-Çeşitlilik analizini kullanın. β-Çeşitlilik analizi, numuneler arasındaki mikrobiyal topluluk bileşimini karşılaştırır ve genellikle temel koordinat analizi (PCoA) ile görselleştirilir. Önemli ölçüde farklı koşullara sahip veya gruplar arasında mikrobiyal taksonları tanımlamak için doğrusal diskriminant analizi etki boyutu (LEfSe) ve volkan grafiği analizi gibi diferansiyel analiz yöntemlerini kullanın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

EV konsantrasyonları farklı fraksiyonlarda belirlendi (Şekil 2A). Deneysel sonuçlar, EV'lerin konsantrasyonunun bir dizi yoğunluk gradyan çözümünde tipik bir normal dağılım modeli sergilediğini gösterdi (Şekil 2B). Spesifik olarak, 9. fraksiyonda, EV'lerin konsantrasyonu en yüksek noktasına (3.85 x 109) ulaştı, bu da EV'lerin ana dağılım fraksiyonunun 936 olabileceğini düşündürdü.

Protein içeriğinin ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada, HSD'deki tuza duyarlı sıçanlarda bağırsak mikrobiyotası EV'lerine odaklandık ve bir dizi önemli başarı elde ettik. İlk olarak, EV'leri HSD üzerindeki tuza duyarlı sıçan bağırsak mikrobiyotasından izole etmek için yoğunluk gradyan santrifüjlemeye dayalı verimli bir ekstraksiyon yöntemi başarıyla oluşturuldu ve EV olmayan bileşenlerin çoğu titiz, standartlaştırılmış bir hayvan deneysel manipülasyonu ve numune işleme süreci yoluyla izole edildi. EV'lerin yoğunluk gradyanlı san...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, bu yazıda rapor edilen çalışmayı etkilemiş gibi görünebilecek bilinen hiçbir rakip mali çıkarları veya kişisel ilişkileri olmadığını beyan ederler.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (82205240), Sichuan Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (2025ZNSFSC1836) ve Sichuan İl Ortopedi Hastanesi (PY202414) Klinik Temel Projesi tarafından desteklenmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Temel Malzemeler
Santrifüj Filtre (10nkDa 2 mL)MiliporeUFC903096
Santrifüj Tude(50 mL)BKMAN20220404
Santrifüj TudesBECKMAN COULTERZ30815SCA
Vakum Filtrasyon SistemiBiosharp24902581
Reaktifler< / güçlü >
Kromojenik LAL Endotoksin Test KitiBeyotime022124240705
EDTADamas-betaP3117308
Geliştirilmiş BCA Protein Test KitiBeyotimeA006241112
EtanolKESH
HCl
OptiPrep (ağırlıkça %60/hacim, iyodiksanol)Serumwerk00124
PBSLabshark130114005
fosfotungstik asitRUIXIN
SükrozDamas-betaP1917057
Tris (VWR)Damas-betaP3061764
Tripan mavisi boyama çözeltisi (% 0.4)BeyotimeBD07242904
Ekipman
Emicilik Mikroplaka OkuyucuSpectraMaxABP01690
BiyomikroskopMoticBA210Dijital
Masa santrifüjüCenceCHT210R
Masaüstü yüksek hızlı mikro santrifüjDLABD3024
Sabit Açılı Alüminyum Rotor + 500 mL Santrifüj KapCence
Yüksek hassasiyetli elektronik dengeSKRBN-200
Laminer akış kabiniNantong Hunan Scientific Instrument Co., Ltd.SW-CJ-2FDS
SW 32.1 Ti Salıncak kovası dönüş+ SW 32.1 Ti Rotor kovasıBECKMAN COULTER
Transmisyon elektron mikroskobuJEOLJEM-1400FLASH
Tüp döndürücü
UltrasantrifüjBECKMAN COULTEROptima XE-100
Ultra saf su sistemiULPHWUPR-II-15TNZ
Su Döngüsü Çok İşlevli Vakum PompasıQiang QiangSHZ-D (III)
Coomassie Blue Hızlı Boyama Çözeltisi Beyotime Z972241010

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thursby, E., Juge, N. Introduction to the human gut microbiota. Biochem J. 474 (11), 1823-1836 (2017).
  2. Aschtgen, M. S., et al. Rotation of Vibrio fischeri Flagella Produces Outer Membrane Vesicles That Induce Host Development. J Bacteriol. 198 (16), 2156-2165 (2016).
  3. Gurung, S., Perocheau, D., Touramanidou, L., Baruteau, J. The exosome journey: from biogenesis to uptake and intracellular signalling. Cell Comm Signal. 19 (1), 47(2021).
  4. Avila-Calderón, E. D., et al. Outer Membrane Vesicles of Gram-Negative Bacteria: An Outlook on Biogenesis. Front Microbiol. 12, 557902(2021).
  5. Melo-Marques, I., Cardoso, S. M., Empadinhas, N. Bacterial extracellular vesicles at the interface of gut microbiota and immunity. Gut Microbes. 16 (1), 2396494(2024).
  6. Kim, N. Y., et al. Effect of gut microbiota-derived metabolites and extracellular vesicles on neurodegenerative disease in a gut-brain axis chip. Nano Converg. 11 (1), 7(2024).
  7. Ahmadi Badi, S., et al. Microbiota-Derived Extracellular Vesicles as New Systemic Regulators. Front Microbiol. 8, 1610(2017).
  8. Barathan, M., Ng, S. L., Lokanathan, Y., Ng, M. H., Law, J. X. The Profound Influence of Gut Microbiome and Extracellular Vesicles on Animal Health and Disease. Int J Mol Sci. 25 (7), 4024(2024).
  9. Maukonen, J., Saarela, M. Human gut microbiota: does diet matter. Proc Nutri Soc. 74 (1), 23-36 (2015).
  10. Bier, A., et al. A High Salt Diet Modulates the Gut Microbiota and Short Chain Fatty Acids Production in a Salt-Sensitive Hypertension Rat Model. Nutrients. 10 (9), 1154(2018).
  11. Aghamohammad, S., et al. Anti-inflammatory and immunomodulatory effects of Lactobacillus spp. as a preservative and therapeutic agent for IBD control. Immun Inflamm Dis. 10 (6), e635(2022).
  12. Dong, Z., et al. The Effects of High-Salt Gastric Intake on the Composition of the Intestinal Microbiota in Wistar Rats. Med Sci Monit. 26, e922160(2020).
  13. Yan, X., et al. Intestinal Flora Modulates Blood Pressure by Regulating the Synthesis of Intestinal-Derived Corticosterone in High Salt-Induced Hypertension. Circ Res. 126 (7), 839-853 (2020).
  14. Wang, X., Lang, F., Liu, D. High-Salt Diet and Intestinal Microbiota: Influence on Cardiovascular Disease and Inflammatory Bowel Disease. Biology. 13 (9), 674(2024).
  15. Qi, L., et al. Microbiome-metabolome analysis insight into the effects of high-salt diet on hemorheological functions in SD rats. Front Nutri. 11, 1408778(2024).
  16. Wu, Q., et al. Insights into the unique roles of extracellular vesicles for gut health modulation: Mechanisms, challenges, and perspectives. Curr Res Microb Sci. 7, 100301(2024).
  17. Zhang, H., et al. Effects of bacterial extracellular vesicles derived from oral and gastrointestinal pathogens on systemic diseases. Microbiol Res. 285, 127788(2024).
  18. Wang, H. X., Wang, Y. P. Gut Microbiota-brain Axis. Chinese Med J. 129 (19), 2373-2380 (2016).
  19. Huang, S., et al. A cross-tissue transcriptome association study identifies key genes in essential hypertension. Front Genet. 14, 1114174(2023).
  20. Gao, H., et al. Microbial DNA Enrichment Promotes Adrenomedullary Inflammation, Catecholamine Secretion, and Hypertension in Obese Mice. J Am Heart Assoc. 11 (4), e024561(2022).
  21. Chen, P. Gut Microbiota and Pathogenesis of Organ Injury. , Springer. Singapore. (2020).
  22. Xie, N., et al. hPSCs-derived brain organoids for disease modeling, toxicity testing and drug evaluation. Exp Neurol. 385, 115110(2024).
  23. Liu, N., et al. The underlying mechanisms of DNA methylation in high salt memory in hypertensive vascular disease. Sci Rep. 14 (1), 925(2024).
  24. Li, M., et al. Wheat β-glucan reduces obesity and hyperlipidemia in mice with high-fat and high-salt diet by regulating intestinal flora. Int J Biol Macromol. 288, 138754(2024).
  25. Kerem, G., et al. Small intestinal microbiota composition altered in obesity-T2DM mice with high salt fed. Sci Rep. 13 (1), 8256(2023).
  26. Díez-Sainz, E., Milagro, F. I., Riezu-Boj, J. I., Lorente-Cebrián, S. Effects of gut microbiota-derived extracellular vesicles on obesity and diabetes and their potential modulation through diet. J Physiol Biochem. 78 (2), 485-499 (2022).
  27. Wu, S., et al. Liuzijue training improves hypertension and modulates gut microbiota profile. Front Cardiovasc Med. 10, 1075084(2023).
  28. Qi, L. M., et al. Salvia miltiorrhiza bunge extract improves the Th17/Treg imbalance and modulates gut microbiota of hypertensive rats induced by high-salt diet. J Funct Foods. 117, 106211(2024).
  29. Wilck, N., et al. Salt-responsive gut commensal modulates T(H)17 axis and disease. Nature. 551 (7682), 585-589 (2017).
  30. Jiang, X., et al. Intestinal Gastrin/CCKBR (Cholecystokinin B Receptor) Ameliorates Salt-Sensitive Hypertension by Inhibiting Intestinal Na(+)/H(+) Exchanger 3 Activity Through a PKC (Protein Kinase C)-Mediated NHERF1 and NHERF2 Pathway. Hypertension. 79 (8), 1668-1679 (2022).
  31. Zheng, T., et al. Hypertension of liver-yang hyperactivity syndrome induced by a high salt diet by altering components of the gut microbiota associated with the glutamate/GABA-glutamine cycle. Front Nutr. 9, 964273(2022).
  32. Mulligan, S. K., et al. Multiplexed TEM Specimen Preparation and Analysis of Plasmonic Nanoparticles. Microsc Microanal. 21 (4), 1017-1025 (2015).
  33. Olson, B. Assays for Determination of Protein Concentration. Curr Protoc Pharmacol. 73, A.3a.1-a.3a.32 (2016).
  34. Matsumoto, H., Haniu, H., Komori, N. Determination of Protein Molecular Weights on SDS-PAGE. Methods Mol Biol. 1855, 101-105 (2019).
  35. Sanschagrin, S., Yergeau, E. Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons. J Vis Exp. (90), e51709(2014).
  36. Tulkens, J., De Wever, O., Hendrix, A. Analyzing bacterial extracellular vesicles in human body fluids by orthogonal biophysical separation and biochemical characterization. Nat Protoc. 15 (1), 40-67 (2020).
  37. Ruhal, R., Kataria, R. Biofilm patterns in gram-positive and gram-negative bacteria. Microbiol Res. 251, 126829(2021).
  38. Maldonado, R. F., Sá-Correia, I., Valvano, M. A. Lipopolysaccharide modification in Gram-negative bacteria during chronic infection. FEMS Microbio Rev. 40 (4), 480-493 (2016).
  39. Honda, K., Littman, D. R. The microbiota in adaptive immune homeostasis and disease. Nature. 535 (7610), 75-84 (2016).
  40. Guzik, T. J., et al. Role of the T cell in the genesis of angiotensin II induced hypertension and vascular dysfunction. J Exp Med. 204 (10), 2449-2460 (2007).
  41. Huang, J., et al. Extracellular vesicles as a novel mediator of interkingdom communication. Cytokine Growth Factor Rev. 73, 173-184 (2023).
  42. Li, W., et al. Alleviation of colitis by honeysuckle MIR2911 via direct regulation of gut microbiota. J Control Release. 376, 123-137 (2024).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Gut Microbial VesiclesExtracellular VesiclesDensity Gradient CentrifugationHigh Salt DietSalt Sensitive RatsTransmission Electron MicroscopyNanoparticle TrackingLipopolysaccharide Detection16S rRNA SequencingHypertension Mechanism

Related Articles