Bu protokol, enjeksiyondan 4 gün sonra meydana gelen, hasta kaynaklı B ve T akut lenfoblastik lösemi (ALL) hücrelerinin in ovo ksenogreftlemesini tanımlar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Burada: Ovo Hasta Kaynaklı Akut Lenfoblastik Lösemi (ALL) Hücrelerinin Ksenogreftlenmesi (PDX-ALL)
Bu makalede
Özet
Özet
Bu çalışma, hem B hücresi hem de T hücresi soylarını kapsayan, hasta kaynaklı akut lenfoblastik lösemi (ALL) hücrelerinin in ovo ksenogreftlenmesi için hızlı, uygun maliyetli ve verimli bir yöntem sunmaktadır. Döllenmiş tavuk embriyoları kullanılarak, hastadan elde edilen B-ALL ve T-ALL hücreleri, döllenmeden 11 gün sonra (11dpf) embriyoların damar sistemine enjekte edildi. Dikkat çekici bir şekilde, enjeksiyondan dört gün sonra, aşılanmış insan lösemi hücreleri, gelişmekte olan tavuk embriyosu içinde önemli sağkalım, proliferasyon ve vasküler kolonizasyon sergiledi. 15dpf ile, embriyonun damar sisteminden alınan kan örneklerinde CD10 / CD19 + B-ALL ve CD4 / CD8 + T-ALL hücrelerinde kayda değer bir artış tespit ettik ve başarılı bir aşılamayı doğruladık. Bu sistem, diğer hayvan modelleriyle ilişkili önemli maliyetler ve etik kısıtlamalar olmaksızın canlı bir organizmada lösemi hücresi davranışının verimli ve tekrarlanabilir bir şekilde değerlendirilmesini kolaylaştırır. Bu hızlı yaklaşım, potansiyel terapötik bileşikleri değerlendirmek için yüksek verimli ve biyolojik olarak ilgili in vivo bir platform sağlar. Burada sunulan in ovo hasta kaynaklı ksenogreft (PDX)-ALL sistemi, klinik öncesi ilaç taraması, mekanik çalışmalar ve potansiyel olarak lösemi araştırmalarında kişiselleştirilmiş tıp yaklaşımları için umut verici bir araç sunmaktadır.
Giriş
Civciv koryoallantoik zarı (CAM), kuluçkayı takiben döllenmeden sonraki 7. günde şekillenmeye başlar ve 12. günde tamamlanır. CAM, anjiyogenez1 vekanser hücreleri 2,3,4,5,6,7,8,9,10, özellikle kanla ilgili kanser hücreleri11 için uygun bir in vivo model olarak ilgi odağı olmuştur , doğası gereği immün yetmezlikli olduğu ve iyi gelişmiş vaskülarizasyona sahip olduğu için. Ayrıca, CAM, kollajen, integrin αVβ3, fibronektin, laminin ve matris metalloproteinaz-2 (MMP-2) dahil olmak üzere bir dizi hücre dışı matris proteini taşıdığı için tümör invazyonunu ve metastazı araştırmak için de arzu edilen bir sistemdir10.
Akut lenfoblastik lösemi (ALL), immatür B ve T lenfositlerinin hızlı artışı ile karakterize bir kemik iliği ve kan kanseridir. En sık görülen pediatrik kanserdir ve çocuklar arasında kanser ölümlerinin başlıca nedenidir. ALL, etkilenen çocukların %>85'inde tedavi edilebilir, ancak yetişkinler ve bebekler önemli ölçüde daha düşük iyileşme oranlarına sahiptir ve nükseden/refrakter ALL'nin 5 yıllık sağkalımı %<10'dur12. Bu nedenle, nüks veya refrakter ALL'yi önlemek veya durdurmak için yeni tedavi stratejilerinin geliştirilmesine acilen ihtiyaç vardır. Fare ve sıçan13 gibi bir dizi ksenogreft modeli geliştirilmiş olmasına rağmen, bu yöntemler zaman alıcı (örneğin aylar) ve pahalıdır ve kapsamlı etik düzenlemeler gerektirir. Yeni ALL tedavisine yönelik karşılanmamış bir klinik ihtiyacı ele almak için, temel in vitro çalışmayı genişletmeye uygun, tekrarlanabilir, zaman ve maliyet etkin bir hayvan modeli geliştirmek zorunludur.
Bu çalışmada, hasta B- ve T-ALL hücrelerinin 3D vasküler kolonizasyonunu güvenilir bir şekilde üreten ve potansiyel olarak ALL ilerlemesini durdurabilecek yeni tedavinin tasarımı ve ALL tedavi sonuçları ve riskleri için öngörücü bir aracın geliştirilmesi için kullanılan bir in ovo ksenogreftleme protokolünün başarılı bir şekilde kurulduğunu bildiriyoruz.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Deneyler, Calgary Üniversitesi Etik Kurulu (REB15-1143; burada TÜM deneklerden bilgilendirilmiş onam alınmıştır) ve Alberta Kanser Komitesi Sağlık Araştırmaları Etik Kurulu (HREBA) tarafından onaylanan protokole dayalı olarak gerçekleştirildi. CC-17-0108_REN8). Tanı sırasında (herhangi bir tedaviye başlamadan önce), dolaşımdaki patlamaları (sadece kemik iliğinde değil, aynı zamanda kanda da patlamalar) olan ALL hastaları çalışmaya dahil edildi. Reaktifler ve kullanılan ekipman Malzeme Tablosunda listelenmiştir.
1. Yumurta kuluçka
- Döllenmiş tavuk yumurtası temin edin. Nakliye veya kırma prosedürü sırasında hasar gören yumurta sayısını göz önünde bulundurmak için gerekenden ~% 10 daha fazla yumurta elde edin.
- Döllenmiş yumurtaları canlılığını kaybetmeden 12 °C'de iki haftaya kadar saklayın.
- Yumurtaları 39 °C'de nemlendirilmiş (~%50-%60) yuvarlanan bir kuluçka makinesine aktarın.
- Yumurtaları kuluçka makinesinde 10dpf için kuluçkaya yatırın. 1. günün, yumurtaların kuluçka makinesine aktarılmasıyla başladığını unutmayın.
2. Akut lenfoblastik lösemi hücrelerinin ALL hastalarından alınan kan örneklerinden izolasyonu
- Hücreleri daha önce tarif edildiği gibi izole edin 14,15.
- B ve T-ALL hastalarından 10 mL periferik kan (veya ilik) heparinize test tüplerine toplayın.
- Kan örneklerini steril bir 50 mL santrifüj tüpüne aktarın ve 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4 ve 1.8 mM KH2PO4 içeren 2 hacim 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile üç kez seyreltin.
- Seyreltilmiş kan örneklerinin 1 hacmini 1 hacim yoğunluk gradyan ortamı üzerine yerleştirin ve oda sıcaklığında 300 x g'da 30 dakika boyunca frensiz olarak santrifüjleyin.
- Mononükleer hücrelerin (MNC'ler) buffy coat tabakasını arayüzden toplayın ve steril bir pipet kullanarak yeni bir steril 15 mL tüpe aktarın.
- 10 mL 1x PBS ekleyin ve kalan serum bileşenlerini çıkarmak için 300 x g'da 5 dakika santrifüjleyin (bu adımı iki kez tekrarlayın).
- Hücre peletine 2 mL% 0.8 NH4Cl ekleyin, hafifçe girdaplayın, oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin ve kırmızı kan hücrelerini parçalamak için 5 dakika boyunca 300 x g'da döndürün (Gerekirse, bu adımı tekrarlayın).
- Hücreleri adım 2.6'da açıklandığı gibi 1x PBS'de yıkayın.
- % 10 FBS içeren RPMI 1640'taki hücreleri yeniden askıya alın ve bir hemositometre kullanarak hücre sayısını sayın.
- Tripan Mavi Dışlama testini kullanarak hücre canlılığını değerlendirin.
- Hücreleri dondurma ortamında (FBS'de %10 DMSO) yeniden süspanse edin, -80 °C'de dondurun ve sıvı nitrojen içinde saklayın.
3. mCherry taşıyan 2. nesil replikasyon-yetersiz lentivirüsün amplifikasyonu
- İnsan embriyonik böbrek hücrelerini HEK293T,% 5 CO 2 ile nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C'de% 10 FBS ve% 1 penisilin-streptomisin ile desteklenmiş DMEM içeren 6 oyuklu bir plakaya ~% 60 -% 70 birleşimde tohumlayın.
- Hücreleri (1.5 x 106) FUW-Luc-mCherry-puro transferi, pCMVΔr8.91 paketleme ve pVSV-G zarf vektörleri ile 3: 2: 1 oranında Lipofectamine 3000 kullanarak 2 gün boyunca kotransfekte edin.
- Lentivirüs içeren süpernatanı hasat edin ve 0.45 μm'lik bir filtreden süzün.
- Temizlenmiş viral süpernatanı santrifüj tüplerine aktarın, 4 ° C'de 2 saat boyunca 20.000 x g'da santrifüjleyin, süpernatanı atın ve peleti 100 μL PBS veya serumsuz ortamda yeniden süspanse edin.
- qPCR Lentivirus Titre kitini kullanarak enfeksiyonun çokluğunu (MOI) ölçün.
4. Sürekli büyüyen ALL hücre hatlarının ve hasta kaynaklı ALL hücrelerinin mCherry ile etiketlenmesi
- Plaka1 x 106 hücre/mL B-(SEM) ve T-ALL (MOLT3)16,17 hücre hattı ve RPMI 1640 + %10 FBS içeren 6 oyuklu plakalarda hasta kaynaklı B- veya T-ALL hücreleri.
- 1 x 106 hücre için 1 MOI elde etmek için hücreleri 3.47 x 106 IU / mL'lik bir viral titre ile 300 μL lentiviral preparat ile enfekte edin, hafifçe karıştırın ve 2 gün boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C'de inkübe edin.
- 2 gün boyunca stabil şekilde transdüksiyonlu hücreleri seçmek için kültür ortamına 1 μg / mL puromisin ekleyin.
- mCherry etiketli hücreleri bir floresan mikroskobu ile görselleştirin.
5. In ovo kseno aşılama
- 10. günde (yumurta kuluçka bölümünün yukarısına bakın), embriyo canlılığını değerlendirmek için civciv embriyolarının damar sistemini ışık altında inceleyin. Ardından, yüzeyi sterilize etmek için yumurtaları %70 etanol ile nazikçe yıkayın.
- Bir el matkabı kullanarak küçük (~ 2,0 cm çapında) bir pencere oluşturmak için yumurtaların hava hücresini delin.
- Şeffaf yapışkan bantla kapatın ve% 5 CO2 inkübatöre geri dönün.
- 11. günde, 1 x 107 mCherry etiketli ALL hücrelerini 34 G iğne kullanarak gelişmekte olan embriyoların kan damarlarına enjekte edin. TÜM hücrelerin farklı embriyolar arasında aynı yerlere enjekte edilip edilmediğini doğrulamanın zor olduğunu unutmayın, çünkü pencerenin aynı yerlerde açılması garanti edilmez.
- Pencereleri şeffaf yapışkan bantla kapatın,% 5 CO2 inkübatöre dönün ve embriyo canlılığını günlük olarak izleyin.
- 15. günde, embriyolardan kan damarlarını inceleyin, bunları cam slaytlara yerleştirin ve floresan yetenekleriyle donatılmış bir diseksiyon mikroskobu kullanarak başarılı ksenogreftleri fotoğraflayın.
NOT: 15dpf'nin ötesinde (tüyler tüm vücudu kapladığından ve albümin neredeyse bittiğinden), civciv embriyo damar sistemindeki TÜM hücrelerin proliferasyonu ve kolonizasyonundaki değişiklikleri değerlendirmek için immünohistokimya yapılması gerekir.
6. Akış sitometrisi
- 15. günde, 32 G iğneli steril bir şırınga kullanarak tavuk embriyo damar sisteminden kan alın, heparin içeren 1.5 mL steril bir tüpe aktarın ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca 226 x g'da santrifüjleyin.
- Süpernatanı (plazma) çıkarın ve% 1 BSA (sığır serum albümini) içeren 1x PBS'de hücre peletini yeniden süspanse edin.
- Kırmızı kan hücrelerini parçalamak için adım 2.7 ve adım 2.8'i gerçekleştirin.
- B-ALL hücrelerini insan FITC-CD10 ve insan PE-CD19 antikorları ile ve T-ALL hücrelerini sırasıyla insan FITC-CD4 ve insan PE-CD8 antikorları ile karanlıkta 4 ° C'de 30 dakika boyunca etiketleyin.
- Etiketli hücreleri %1 BSA içeren PBS ile iki kez yıkayın, 226 x g'da 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin, 1x PBS'de yeniden süspanse edin ve akış sitometrisi ile analiz edin.
- İleri saçılma (FSC) ve yan saçılma (SSC) voltajlarını sırasıyla 400 V ve 360 V olarak ayarlayın. FITC ve PE kanalları için dedektör kazançlarını sırasıyla 450-500 V ve 400-450 V'a ayarlayın.
NOT: Geçit stratejisi: (a) ışık saçılımlı geçit (FSC vs. SSC): FSC-A ile karşılaştırın. SSC-A, lenfoblast bölgesine karşılık gelen orta ileri saçılma (boyut) ve düşük yan saçılma (granülerlik) olan bir popülasyonu tanımlamak için. Bu adımın, döküntüleri ve monositler veya granülositler gibi daha granüler hücreleri dışlamaya yardımcı olduğunu unutmayın; (b) singlet seçimi (FSC-H'ye karşı. FSC-A): FSC-H ve FSC-H üzerinde geçit yaparak ikili ayrımcılık yapın. FSC-A, yalnızca tek hücreli olayların analiz edilmesini sağlar18. - CD10/CD19+, B-ALL ve CD4/CD8+, T-ALL hücrelerini, 2. çeyrekteki olayları sayarak ölçün (Q2; FITC/PE+) FITC'ye karşı. PE parselleri18. Mevcut olan, üç bağımsız deneyin (n = 3) ± SEM'i anlamına gelir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Gelişmekte olan tavuk embriyolarında insan ALL hücrelerinin aşılanmasının başarılı olup olmadığını belirlemek için, 2. nesil replikasyon-yetersiz lentivirüs taşıyan mCherry amplifiye edildi ve bunları sırasıyla B- ve T-ALL hücre hatlarını, SEM ve MOLT316,17'yi etiketlemek için kullandı. Şekil 1A'da gösterildiği gibi, B- (sol üst iki panel) ve T- (sağ üst iki panel) TÜM hücrelerinin ~P'si mCherry ile etiketlendi. Daha sonra...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Mikrobiyal kontaminasyonu önlemek ve tavuk embriyolarının hayatta kalmasını en üst düzeye çıkarmak içinin ovo ksenogreftleme sırasında üç kritik adım tanımlanmıştır: yani, (1) pencereyi yapmadan önce yumurta kabuğu yüzeyinin% 70 etanol ile sterilize edilmesi ve (2) kuluçka sırasında tavuk embriyosunun içeriğinin buharlaşmasını önlemek için yumurta kabuğu penceresinin Cellotape ile sıkıca kapatılması, ve (3) ince iğnenin kullanılması (ör., 34 G) ve ALL hücrelerinin minimum hacim...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar rekabet eden hiçbir mali çıkar beyan etmemektedir.
Teşekkürler
Columbia Üniversitesi'nden Dr. Andrew Kung'a FUW-Luc-mCherry-puro'yu sağladığı için teşekkür ederiz. Bu çalışma, CIHR'den (PJT-174983) KYL'ye ve Kore Ulusal Araştırma Vakfı'ndan (NRF; RS-2023-00284121) KYL ve M-YJ'ye.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 34 gr iğne | BD Perisafe | ||
| Attune NxT Akış Sitometresi | Termo Balıkçı | ||
| BD Perisafe Şırınga (32 G) | BD Perisafe | ||
| Sığır Serum Albümini (BSA) | Millipore Sigma | A9647 Serisi | |
| Hücre dondurma ortamı | Gibco, ThermoFisher Bilimsel | 12648010 | |
| Santrifüj (Allegra X-22R Santrifüj ) | Beckman Coulter | ||
| Tek kullanımlık eldivenler | Royal Touch300 Nitril Muayene Eldiveni | ||
| Diseksiyon Mikroskobu | Leica MZ16FA | ||
| DMEM | Gibco, ThermoFisher Bilimsel | 11965092 | |
| DMSO'nun | Invitrogen, ThermoFisher Bilimsel | D12345 Serisi | |
| Yumurta kuluçka makinesi, Vevitts 120 yuvarlanan Kuluçka Makinesi | Vixest Ticaret A.Ş. | ||
| Etil alkol (%95) | VWR Uluslararası | BDH1158-4LP | |
| Fetal Sığır Serumu (FBS) | Gibco, ThermoFisher Bilimsel | 26140079 | |
| Ficoll çözeltisi (Ficoll?? Paque Plus) | MilliporeSigma | GE17-1440-02 | |
| FITC-CD10 antikoru | Santa Cruz Biyoteknoloji | sc-46656 UYARI | |
| FITC-CD4 antikoru | Santa Cruz Biyoteknoloji | SC-19641 FITC | |
| Floresan Mikroskop | Leica Mikrosistemleri | ||
| El matkabı (Dremel3000) | Bosch | ||
| HEK293T | ATCC, VA, ABD | CRL-3216 (İngilizce) | |
| Hemositometre | VWR uluslararası, Hausser Scientific | 15170-263 | |
| Domuz bağırsak mukozasından elde edilen heparin sodyum tuzu | Millipore Sigma | H3149 Serisi | |
| Heparinize test tüpleri | BD Vacutainer | BD 366480 | |
| Lipofektamin 3000 | Invitrogen, ThermoFisher Bilimsel | L3000008 | |
| Multipleks Lentivirüs Titre Kiti (qPCR Lentivirüs Titre Kiti) | Akbulut | LV900 Serisi | |
| NH4Cl (Amonyum chloride_ | Millipore Sigma | A9434 Serisi | |
| Olympus IX71 ters mikroskop | Olympus | ||
| PE-CD19 antikoru | Santa Cruz Biyoteknoloji | SC-19650 PE | |
| PE-CD8 antikoru | Santa Cruz Biyoteknoloji | SC-1177 PE | |
| Penisilin-Streptomisin (10,000 U/mL) | Gibco, ThermoFisher Bilimsel | 15140122 | |
| Fosfat Tamponlu Salin (PBS) | Sigma | P3813 | |
| Pipetler (ayarlanabilir hacim) | Eppendorf Belediyesi | ||
| Puromisin | Gibco, ThermoFisher Bilimsel | A1113803 | |
| RPMI 1640 | Gibco, ThermoFisher Bilimsel | 11875093 | |
| Scotch Selotape | 3 milyon | ||
| Steril 6 oyuklu plakalar | VWR uluslararası, Corning | 22250-140 | |
| Steril santrifüj tüpleri | Axygen Inc, Corning | AXYMCT-150-CS | |
| Steril kültür şişeleri (75T) | VWR Uluslararası | 10062-872 | |
| Steril Falcon tüpleri (15 mL) | SARSTEDT | 62.554.502 | |
| Steril Falcon tüpleri (50 mL) | SARSTEDT | 62.547.254 | |
| Steril filtre (0.45 µ m filtresi) | VWR Uluslararası | 76778-974 | |
| Steril forseps | VWR Uluslararası | 82027-404 | |
| Steril cam slaytlar | VWR uluslararası | 48300-031 | |
| Steril pipet uçları | VWR Uluslararası | 76322-136, 76322-134, 76322-154 | |
| Steril şırıngalar | BD şırınga | 309628? | |
| Tripan Mavisi | Invitrogen, ThermoFisher Bilimsel | T10282 |
Kaynaklar
- Folkman, J. What is the evidence that tumors are angiogenesis dependent. J Natl Cancer Inst. 82 (1), 4-6 (1990).
- Hagedorn, M., et al. Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (5), 1643-1648 (2005).
- Dumartin, L., et al. Netrin-1 mediates early events in pancreatic adenocarcinoma progression, acting on tumor and endothelial cells. Gastroenterology. 138 (5), 1595-1606 (2010).
- Aguirre-Ghiso, J. A., Estrada, Y., Liu, D., Ossowski, L. ERK activity as a determinant of tumor growth and dormancy: Regulation by p38. Cancer Res. 63 (7), 1684-1695 (2003).
- Baroni, T. E., et al. Ribonomic and short hairpin RNA gene silencing methods to explore functional gene programs associated with tumor growth arrest. Methods Mol Biol. 383, 227-244 (2007).
- Lopez-Rivera, E., et al. Inducible nitric oxide synthase drives mTOR pathway activation and proliferation of human melanoma by reversible nitrosylation of TSC2. Cancer Res. 74 (4), 1067-1078 (2014).
- Balke, M., et al. A short-term in vivo model for giant cell tumor of bone. BMC Cancer. 11, 241(2011).
- Balke, M., et al. Morphologic characterization of osteosarcoma growth on the chick chorioallantoic membrane. BMC Res Notes. 3, 58(2010).
- Sys, G. M. L., et al. The CAM-assay as a xenograft model for sarcoma. J Vis Exp. (77), e50522(2013).
- Li, M., et al. The Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) assay as an efficient xenograft model of hepatocellular carcinoma. J Vis Exp. (104), e52411(2015).
- Pontel, L. B., et al. Acute lymphoblastic leukemia necessitates GSH-dependent ferroptosis defenses to overcome FSP1-epigenetic silencing. Redox Biol. 102408, (2022).
- Oriol, A., et al. Outcome after relapse of acute lymphoblastic leukemia in adult patients included in four consecutive risk-adapted trials by the PETHEMA Study Group. Haematologica. 95 (4), 589-596 (2010).
- Xin, Q., Chen, Z., Wei, W., Wu, Y. Animal models of acute lymphoblastic leukemia: Recapitulating the human disease to evaluate drug efficacy and discover therapeutic targets. Biochem Pharmacol. 198, 114970(2022).
- Gilmore, M. J., Prentice, H. G., Blacklock, H. A., Janossy, G., Hoffbrand, A. V. A technique for rapid isolation of bone marrow mononuclear cells using Ficoll-Metrizoate and the IBM 2991 blood cell processor. Br J Haematol. 50 (4), 619-626 (1982).
- Boyer, T., et al. Flow cytometry to estimate leukemia stem cells in primary acute myeloid leukemia and in patient-derived xenografts, at diagnosis and follow-up. J Vis Exp. (133), e56976(2018).
- Kang, S. M., et al. Genome-wide loss-of-function genetic screening identifies opioid receptor mu1 as a key regulator of L-asparaginase resistance in pediatric acute lymphoblastic leukemia. Oncogene. 36 (42), 5910-5913 (2017).
- Lee, J. K., et al. HAP1 loss confers L-asparaginase resistance in ALL by downregulating the calpain-1-Bid-caspase-3/12 pathway. Blood. 133 (20), 2222-2232 (2019).
- Kalina, T., et al. EuroFlow standardization of flow cytometer instrument settings and immunophenotyping protocols. Leukemia. 26 (9), 1986-2010 (2012).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
