Bu protokol, enjeksiyondan 4 gün sonra meydana gelen, hasta kaynaklı B ve T akut lenfoblastik lösemi (ALL) hücrelerinin in ovo ksenogreftlemesini tanımlar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Burada: Ovo Hasta Kaynaklı Akut Lenfoblastik Lösemi (ALL) Hücrelerinin Ksenogreftlenmesi (PDX-ALL)
Bu makalede
Özet
Özet
Bu çalışma, hem B hücresi hem de T hücresi soylarını kapsayan, hasta kaynaklı akut lenfoblastik lösemi (ALL) hücrelerinin in ovo ksenogreftlenmesi için hızlı, uygun maliyetli ve verimli bir yöntem sunmaktadır. Döllenmiş tavuk embriyoları kullanılarak, hastadan elde edilen B-ALL ve T-ALL hücreleri, döllenmeden 11 gün sonra (11dpf) embriyoların damar sistemine enjekte edildi. Dikkat çekici bir şekilde, enjeksiyondan dört gün sonra, aşılanmış insan lösemi hücreleri, gelişmekte olan tavuk embriyosu içinde önemli sağkalım, proliferasyon ve vasküler kolonizasyon sergiledi. 15dpf ile, embriyonun damar sisteminden alınan kan örneklerinde CD10 / CD19 + B-ALL ve CD4 / CD8 + T-ALL hücrelerinde kayda değer bir artış tespit ettik ve başarılı bir aşılamayı doğruladık. Bu sistem, diğer hayvan modelleriyle ilişkili önemli maliyetler ve etik kısıtlamalar olmaksızın canlı bir organizmada lösemi hücresi davranışının verimli ve tekrarlanabilir bir şekilde değerlendirilmesini kolaylaştırır. Bu hızlı yaklaşım, potansiyel terapötik bileşikleri değerlendirmek için yüksek verimli ve biyolojik olarak ilgili in vivo bir platform sağlar. Burada sunulan in ovo hasta kaynaklı ksenogreft (PDX)-ALL sistemi, klinik öncesi ilaç taraması, mekanik çalışmalar ve potansiyel olarak lösemi araştırmalarında kişiselleştirilmiş tıp yaklaşımları için umut verici bir araç sunmaktadır.
Giriş
Civciv koryoallantoik zarı (CAM), kuluçkayı takiben döllenmeden sonraki 7. günde şekillenmeye başlar ve 12. günde tamamlanır. CAM, anjiyogenez1 vekanser hücreleri 2,3,4,5,6,7,8,9,10, özellikle kanla ilgili kanser hücreleri11 için uygun bir in vivo model olarak ilgi odağı olmuştur ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Deneyler, Calgary Üniversitesi Etik Kurulu (REB15-1143; burada TÜM deneklerden bilgilendirilmiş onam alınmıştır) ve Alberta Kanser Komitesi Sağlık Araştırmaları Etik Kurulu (HREBA) tarafından onaylanan protokole dayalı olarak gerçekleştirildi. CC-17-0108_REN8). Tanı sırasında (herhangi bir tedaviye başlamadan önce), dolaşımdaki patlamaları (sadece kemik iliğinde değil, aynı zamanda kanda da patlamalar) olan ALL hastaları çalışmaya dahil edildi. Reaktifler ve kullanılan ekipman Malzeme Tablosunda listelenmiştir.
1. Yumurta kuluçka
- Döllenmiş tavuk yumurtası temin ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Gelişmekte olan tavuk embriyolarında insan ALL hücrelerinin aşılanmasının başarılı olup olmadığını belirlemek için, 2. nesil replikasyon-yetersiz lentivirüs taşıyan mCherry amplifiye edildi ve bunları sırasıyla B- ve T-ALL hücre hatlarını, SEM ve MOLT316,17'yi etiketlemek için kullandı. Şekil 1A'da gösterildiği gibi, B- (sol üst iki panel) ve T- (sağ üst iki panel) TÜM hücrelerinin ~P'si mCherry ile etiketlendi. Daha sonra.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Mikrobiyal kontaminasyonu önlemek ve tavuk embriyolarının hayatta kalmasını en üst düzeye çıkarmak içinin ovo ksenogreftleme sırasında üç kritik adım tanımlanmıştır: yani, (1) pencereyi yapmadan önce yumurta kabuğu yüzeyinin% 70 etanol ile sterilize edilmesi ve (2) kuluçka sırasında tavuk embriyosunun içeriğinin buharlaşmasını önlemek için yumurta kabuğu penceresinin Cellotape ile sıkıca kapatılması, ve (3) ince iğnenin kullanılması (ör., 34 G) ve ALL hücrelerinin minimum hacim.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar rekabet eden hiçbir mali çıkar beyan etmemektedir.
Teşekkürler
Columbia Üniversitesi'nden Dr. Andrew Kung'a FUW-Luc-mCherry-puro'yu sağladığı için teşekkür ederiz. Bu çalışma, CIHR'den (PJT-174983) KYL'ye ve Kore Ulusal Araştırma Vakfı'ndan (NRF; RS-2023-00284121) KYL ve M-YJ'ye.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 34 gr iğne | BD Perisafe | ||
| Attune NxT Akış Sitometresi | Termo Balıkçı | ||
| BD Perisafe Şırınga (32 G) | BD Perisafe | ||
| Sığır Serum Albümini (BSA) | Millipore Sigma | A9647 Serisi | |
| Hücre dondurma ortamı | Gibco, ThermoFisher Bilimsel | 12648010 | |
| Santrifüj (Allegra X-22R Santrifüj ) | Beckman Coulter | ||
| Tek kullanımlık eldivenler | Royal Touch300 Nitril Muayene Eldiveni | ||
| Diseksiyon Mikroskobu | Leica MZ16FA | ||
| DMEM | Gibco, ThermoFisher Bilimsel | 11965092 | |
| DMSO'nun | Invitrogen, ThermoFisher Bilimsel | D12345 Serisi | |
| Yumurta kuluçka makinesi, Vevitts 120 yuvarlanan Kuluçka Makinesi | Vixest Ticaret A.Ş. | ||
| Etil alkol (%95) | VWR Uluslararası | BDH1158-4LP | |
| Fetal Sığır Serumu (FBS) | Gibco, ThermoFisher Bilimsel | 26140079 | |
| Ficoll çözeltisi (Ficoll?? Paque Plus) | MilliporeSigma | GE17-1440-02 | |
| FITC-CD10 antikoru | Santa Cruz Biyoteknoloji | sc-46656 UYARI | |
| FITC-CD4 antikoru | Santa Cruz Biyoteknoloji | SC-19641 FITC | |
| Floresan Mikroskop | Leica Mikrosistemleri | ||
| El matkabı (Dremel3000) | Bosch | ||
| HEK293T | ATCC, VA, ABD | CRL-3216 (İngilizce) | |
| Hemositometre | VWR uluslararası, Hausser Scientific | 15170-263 | |
| Domuz bağırsak mukozasından elde edilen heparin sodyum tuzu | Millipore Sigma | H3149 Serisi | |
| Heparinize test tüpleri | BD Vacutainer | BD 366480 | |
| Lipofektamin 3000 | Invitrogen, ThermoFisher Bilimsel | L3000008 | |
| Multipleks Lentivirüs Titre Kiti (qPCR Lentivirüs Titre Kiti) | Akbulut | LV900 Serisi | |
| NH4Cl (Amonyum chloride_ | Millipore Sigma | A9434 Serisi | |
| Olympus IX71 ters mikroskop | Olympus | ||
| PE-CD19 antikoru | Santa Cruz Biyoteknoloji | SC-19650 PE | |
| PE-CD8 antikoru | Santa Cruz Biyoteknoloji | SC-1177 PE | |
| Penisilin-Streptomisin (10,000 U/mL) | Gibco, ThermoFisher Bilimsel | 15140122 | |
| Fosfat Tamponlu Salin (PBS) | Sigma | P3813 | |
| Pipetler (ayarlanabilir hacim) | Eppendorf Belediyesi | ||
| Puromisin | Gibco, ThermoFisher Bilimsel | A1113803 | |
| RPMI 1640 | Gibco, ThermoFisher Bilimsel | 11875093 | |
| Scotch Selotape | 3 milyon | ||
| Steril 6 oyuklu plakalar | VWR uluslararası, Corning | 22250-140 | |
| Steril santrifüj tüpleri | Axygen Inc, Corning | AXYMCT-150-CS | |
| Steril kültür şişeleri (75T) | VWR Uluslararası | 10062-872 | |
| Steril Falcon tüpleri (15 mL) | SARSTEDT | 62.554.502 | |
| Steril Falcon tüpleri (50 mL) | SARSTEDT | 62.547.254 | |
| Steril filtre (0.45 µ m filtresi) | VWR Uluslararası | 76778-974 | |
| Steril forseps | VWR Uluslararası | 82027-404 | |
| Steril cam slaytlar | VWR uluslararası | 48300-031 | |
| Steril pipet uçları | VWR Uluslararası | 76322-136, 76322-134, 76322-154 | |
| Steril şırıngalar | BD şırınga | 309628? | |
| Tripan Mavisi | Invitrogen, ThermoFisher Bilimsel | T10282 |
Kaynaklar
- Folkman, J. What is the evidence that tumors are angiogenesis dependent. J Natl Cancer Inst. 82 (1), 4-6 (1990).
- Hagedorn, M., et al. Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model. Proc Natl Acad Sc....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
