Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Dorsal Kök Gangliyon Kültürünün İn Vitro Modellerinin Oluşturulması: Kanser-Sinir Karışmasının Araştırılmasında Tamamlayıcı Yaklaşımlar

2.7K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/68552

⸱

11 Temmuz 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Cancer Biology and Genetics, Sinclair Cancer Research Institute, and Department of Pathology and Molecular Medicine, Queen's University, 2Laboratory of Mutagenesis and Oncogenetics, Department of General Biology - Center for Biological Science, State University of Londrina

Bu makalede

Özet

Bu protokol, fare Dorsal Kök Gangliyonlarının (DRG) tüm mount ve ayrışmış kültürlerinin oluşturulması için yöntemleri ve bunların tümör-sinir etkileşimlerini değerlendirmek için kullanımlarını açıklar.

Özet

Sinir sisteminin tümör mikroçevresine katkısı ve kanserin yayılması için bir yol olarak nöral istilanın önemi giderek daha fazla kabul görmektedir. Kanser hücrelerinin nöronlarla etkileşimleri, kötü klinik sonuçları olan birçok kanserin bir özelliği olan sinirlerin etrafına ve içine istila etmelerini teşvik edebilir. Nöronlar ve kanser hücreleri arasındaki karşılıklı etkileşimleri incelemek için in vitro modeller, kanser yayılımını anlamak ve onu hafifletmek için yaklaşımları belirlemek için değerli araçlar sağlar.

Burada, murin dorsal kök gangliyonları (DRG) izolasyonu ve zaman içinde nöron morfolojisini ve nörit büyümesini görselleştirmek için kullanılabilecek hem tam mount hem de ayrışmış tek katmanlı kültürlerin kurulması için bir protokol açıklıyoruz. Matrigel'e monte edilen tüm DRG'ler, in vivo sinire daha çok benzeyen heterojen bir ortamda sinir mimarisini ve uyaranlara verilen yanıtları korurken, ayrışmış sinir kültürleri doğrudan hücre-hücre etkileşimlerinin daha yakından değerlendirilmesine izin verir. DRG kültürleri kurulduktan sonra, kanser hücrelerine yanıt olarak nörit büyümesi ve sinir morfolojisindeki değişiklikleri görselleştirmek için kullanılabilecek ko-kültürler oluşturmak için kanser hücreleri eklenebilir. Zaman içinde veya büyüme stimülasyonu veya inhibisyon koşulları altında sinir kaynaklı sinyallere yanıt olarak kanser hücrelerinin büyümesi veya motilitesi değerlendirilebilir, ayrıca kanser hücreleri ve sinir uzantıları arasındaki doğrudan temasın etkilerini görselleştirebilir.

Her iki ko-kültür modeli de aynı anda oluşturulabildiğinden, bu protokol kanser-nöron etkileşimlerinin etkisinin daha kapsamlı bir görünümünü sağlar ve tedavi koşullarının karşılaştırılmasını ve hücresel düzeyden ve tüm gangliyonlardan gelen bilgilerin entegrasyonunu kolaylaştırır. Bu protokol, sinir-tümör etkileşimlerinin incelenmesini kolaylaştıracak ve hücre sinyalizasyonu çalışmaları, ilaç taraması veya tümör-sinir ortamının heterojenliği ve sinirler boyunca tümör yayılma mekanizmalarının incelenmesi dahil olmak üzere çok çeşitli uygulamalar için kullanılabilir.

Giriş

Lokal invazyon ve bölgesel veya uzak metastaz yoluyla tümör yayılımı, kansere bağlı ölümlerin birincil nedenidir. Araştırmalar vasküler veya lenfatik yayılma yollarına odaklanmış olsa da, pankreas 1,2, prostat3, baş ve boyun4, meme5 ve kolorektal6 kanserleri dahil olmak üzere birçok katı tümörde tümör hücrelerinin nöral invazyonu sıklıkla gözlenir. Son yıllarda, çok sayıda çalışma, sinirlerin tümör büyümesini ve ilerlemesini teşvik etmede ve yayılma yolları olarak metastaz gelişimini yönlendirmede ortaya çıkan rolünü vurgulamıştır 7,8. Bu bağlamda, kanser sinirbilimi, tümör hücreleri ile bu süreçlere katkıda bulunabilecek periferik sinir sisteminin (PNS) temel bileşenleri arasındaki etkileşimleri aydınlatarak onkolojide yeni bakış açıları sunan önemli bir araştırma alanı olarak ortaya çıkmıştır 8,9.

PNS, farklı boyut ve işlevlere sahip nöronlar, Schwann ve diğer glial hücreler, fibroblastlar, makrofajlar, mast hücreleri, melanositler ve lokal vaskülatürü oluşturan vasküler endotel hücreleri dahil olmak üzere çeşitli hücre tiplerinden oluşan heterojen yapılar olan hem periferik sinirlerden hem de gangliyonlardan oluşur10. PNS, tümör mikroçevresinin (TME) kritik bir bileşenidir ve kanser hücreleri ve sinirler arasında, doğrudan fiziksel temas yoluyla veya dolaylı olarak nörotrofik faktörlerin, nörotransmiterlerin, büyüme faktörlerinin ve diğer sinyallerin salınması yoluyla karşılıklı iletişim, nöral istilayı kolaylaştırabilir ve daha agresif fenotipleri teşvik edebilir8.

İn vitro modeller, sinir bakım ve onarımına katkıda bulunan süreçleri karakterize etmek için kullanılabilir ve sinirler ile kanser hücreleri arasındaki hücresel etkileşimleri incelemek için giderek daha fazla kullanılmaktadır11,12. Sıklıkla kullanılan bir in vitro model, tümör hücreleri11 ile birlikte kültürlenmiş ekstrakte edilmiş fare dorsal kök gangliyonlarını (DRG) içerir. Bu modeller, in vitro nöronal biyolojiyi incelemek için genellikle ayrışmış DRG hücrelerinin iki boyutlu (2D) tek katmanlı kültürünü kullanır ve PNS 13,14'teki hücresel etkileşimleri modellemek için kullanılmıştır. Bununla birlikte, 2D kültürler sinir mikroçevresinin karmaşıklığından yoksundur ve in vivo mimarisini zayıf bir şekilde temsil eder. Periferik nöronların veya ganglionların üç boyutlu (3D) tüm montajları, sinir-çevre etkileşimlerini daha bütünsel olarak temsil etmek için periferik sinir fizyolojisini daha etkili bir şekilde özetleyen bir alternatif sunar 15,16,17,18. Bununla birlikte, bu modelin heterojenliği, hücre-hücre etkileşimlerini görselleştirme veya nicelleştirme yeteneğini sınırlar ve bu modeller, genel periferik sinir tepkilerini gözlemlemek için, belirli hücresel etkileşimleri ve uyaranlara mekanik tepkileri keşfetmekten daha etkilidir. Bu nedenle, ayrışmış ve bütün montajlı nöronal kültürlerin tamamlayıcı olduğu ve 2D ve 3D modellerin paralel olarak değerlendirilmesinin, hem genel etkileri hem de uyaranlara bireysel hücre tepkilerini değerlendirmek için optimal olduğu açıktır.

Bu protokol, hem hücresel hem de doku seviyelerinde sinir ve kanser hücresi etkileşimlerini değerlendirmek için kullanılabilen tamamlayıcı ayrışmış (2D) ve tam montajlı (3D) sinir kültürleri oluşturma yöntemlerini açıklar ve bu etkileşimlerin yalnızca bir tür kültür kullanan yöntemlerden daha kapsamlı bir görünümünü sağlar 1,13. Bu modeller, sinir hücresi morfolojisi ve nörit büyümesinin yanı sıra nörotrofik faktörler gibi sinir tarafından salgılanan kemotaktik ajanlara tümör hücresi tepkileri ve duyusal nöronlar ile tümör hücreleri arasındaki karışma dahil olmak üzere hücresel süreçleri görselleştirmek ve değerlendirmek için kullanılabilir. Ayrıca, tümör hücreleri ile bağışıklık hücreleri, fibroblastlar ve glia gibi nöral mikroçevrenin diğer bileşenleri arasındaki potansiyel etkileşimlerin araştırılmasına izin verir. Bu modellerin, hücre etkileşimlerini ve yanıtlarını değerlendirmek veya ölçmek için yaklaşımlara örnek olarak, canlı hücre boyama veya immünofloresan ile görselleştirilen, zaman içinde sinir-kanser hücre etkileşimlerini incelemek için uygulanmasını vurguluyoruz. Birlikte, bu yöntemlerin kullanımından elde edilen sonuçlar, sinir sisteminin kanserin büyümesini ve yayılmasını nasıl desteklediğine dair anlayışımızı ilerletebilir ve bu mekanizmaları hedeflemek için stratejiler geliştirmemize yardımcı olabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm fare çalışmaları, Queen's Üniversitesi'ndeki Üniversite Hayvan Bakım Komitesi Ofisi tarafından gözden geçirildi ve onaylandı (Protokol numarası 2524). Hayvanlar, Kanada Hayvan Bakımı Konseyi ve Ulusal Araştırmada Hayvanlar Üzerinde Değiştirme, İyileştirme ve Azaltma Merkezi (İngiltere) etik yönergelerine uygun olarak doku toplanması için korundu ve ötenazi yapıldı. Bu protokolde C57BL/6 hayvanlardan izole edilen dokuları kullandık, ancak Rag2IL2Rγc KO hayvanları da dahil olmak üzere diğer genotipleri de başarıyla kullandık. Bölüm 1-6, yüzeyi sterilize edilmiş bir laboratuvar tezgahında temiz bir ortamda gerçekleştirilebilir (bkz. Şekil 1), bölüm 7-9 ise biyolojik güvenlik kabininde gerçekleştirilmelidir. Daha iyi anlaşılması için, bahsedilen adımların şematik gösterimleri oluşturulmuştur (Şekil 1).

1. Stok çözeltilerinin hazırlanması

  1. Papain solüsyonu ve Kollajenaz IV / Dispase II solüsyonu hazırlayın. Papaini 30 U/mL konsantrasyonda steril PBS (Fosfat tamponlu Salin) içinde çözün; -20 °C'de 1 mL alikotlarda saklayın. Kollajenaz Tip IV'ü PBS'de 1.25 mg / mL'de çözün ve Dispas II'yi 2.5 mg / mL'de çözün. -20 °C'de 1 mL alikotlarda saklayın.
  2. % 2 B27 Takviyesi (50x stok çözeltisi),% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 Penisilin-Streptomisin (Pen-Strep) (100x stok çözeltisi) ile desteklenmiş Nörobazal kültür ortamını (F12) hazırlayın.
  3. Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisini (HBSS) %1 Penisilin-Streptomisin (100x stok çözeltisi) ile hazırlayın.
    NOT: İlk hücre sağkalımını ve bağlanmasını desteklemek için, kültürlerin oluşumunu iyileştirmek için %10 FBS ile desteklenmiş F12 ortamı kullanılır. Bununla birlikte, FBS ayrıca fibroblastlar da dahil olmak üzere nöronal olmayan hücrelerin çoğalmasını teşvik eder. İndirgenmiş veya serumsuz ortam koşulları (ör., sadece B27 ile desteklenmiş F12), DRG kültüründe ve kanser ko-kültüründe nöronal olmayan hücre büyümesini en aza indirmek için kullanılabilir, ancak özellikle ayrışmış nöron kültürlerinin sağkalımını etkileyebilir. Kanser hücresi davranışı üzerindeki etkilerini değerlendirmek için DRG ile koşullandırılmış ortamları toplarken serumsuz ortam da dikkate alınmalıdır.

2. DRG'lerin diseksiyonu için reaktiflerin ve materyallerin hazırlanması (Şekil 1A)

  1. Otoklav cerrahi aletleri. Diseksiyon mikroskobunu %70 etanol ile yüzey sterilize edin ve temiz bir tezgah üzerine kurun.
  2. İki adet 10 cm'lik kültür plakasına 6-8 mL HBSS-Pen-Strep (adım 1.3) ekleyin ve buzun üzerine yerleştirin.
    NOT: Bu plakalar diseksiyon sonrası omurgaları toplamak için kullanılacaktır. Diseke edilen omurilik sayısına bağlı olarak, ek plakalara ihtiyaç duyulabilir.
  3. 15 mL'lik konik bir tüpe 8-10 mL HBSS-Pen-Strep ekleyin ve buzun üzerine yerleştirin.
  4. 3 cm'lik bir kültür plakasına 3 mL HBSS-Pen-Strep ekleyin ve buzun üzerine yerleştirin.
    NOT: Adım 2.3'te hazırlanan 15 mL'lik tüp, ayrışma için DRG'leri toplamak için kullanılırken, 3 cm'lik kültür plakası (adım 2.4), tam montajlı model için DRG'leri toplamak için kullanılacaktır.

3. Tam montajlı DRG kültürü için reaktiflerin ve malzemelerin hazırlanması

NOT: Bu bölümdeki bazı adımlar gece boyunca hazırlık gerektirebilir. DRG kültürleri için her türlü doku kültürü plakası kullanılabilse de, bu protokoldeki hacimler ve talimatlar, analizlerimiz için optimum görüntüleme kalitesi sağlayan 8 oyuklu cam tabanlı slaytlar için optimize edilmiştir. 8 oyuklu cam alt sürgüyü, pipet uçlarını ve Matrigel'i her zaman buz üzerinde tutun.

  1. Matrigel solüsyonunu kullanmadan önce gece boyunca (veya en az 3 saat) 4 °C'de çözdürün. Matrigel'i her zaman buzla kaplı tuttuğunuzdan emin olun.
  2. Matrigel'in uçlara yapışmasını en aza indirmek ve plakada erken Matrigel polimerizasyonunu önlemek için pipet uçlarını ve 8 oyuklu cam alt sürgüyü gece boyunca -20 °C'de soğutun.
  3. Takviye edilmiş ortamı (adım 1.2) bir su banyosunda 37 °C'ye kadar ısıtın.

4. Ayrışmış DRG kültürü için reaktiflerin ve malzemelerin hazırlanması

  1. Papain solüsyonunu ve Kollajenaz IV/Dispase II solüsyonunu (adım 1.1) kullanıma hazır olana kadar 37 °C'de bir su banyosunda çözdürün.
    NOT: Diseke edilen her fare için, Papain ve Kollajenaz IV / Dispase II çözeltisinin her biri için 1 alikot (1 mL) kullanın.
  2. Sıcak takviye edilmiş kültür ortamı (adım 1.2).

5. Omurganın çıkarılması (Şekil 1B) ve DRG'lerin diseksiyonu (Şekil 1C)

  1. 4-8 haftalık fareleri aşırı dozda izofluran ve ardından servikal çıkık ile ötenazi yapın. Ötenazi yapılan hayvanı karnının üzerine yatırın ve omurganın üzerindeki alana odaklanarak kürkünü tıraş edin (Şekil 1B, adım 1,2).
  2. Hayvanın sırtına% 70 etanol püskürtün ve kürkün diseksiyonu kirletmesini önlemek için kağıt havluyla kuyruktan kafatasına kadar silerek gevşek kürkü çıkarın.
  3. Sterilize edilmiş makas kullanarak, kuyruktan kafatasına kadar traşlı sırt yüzeyi boyunca düz bir kesi yapın. Omurgayı ortaya çıkarmak için künt forseps kullanarak insizyonun her iki tarafındaki cildi geri çekin (Şekil 1B, adım 3).
  4. Kürkle kontaminasyonu önlemek için yeni bir forseps ve makas kullanarak, omurganın tabanında (kuyruk ucu) yatay bir kesi yapın (Şekil 1B, adım 4).
  5. Serbest bırakmak için omurganın her iki tarafında iki paralel uzunlamasına kesi yapın. Çevredeki bağ dokusunu çıkarmak için omurgayı nazikçe kaldırmak için forseps kullanın (Şekil 1B, adım 5).
  6. Omurgayı tamamen serbest bırakmak için, omurganın tepesinde (kafatasının proksimalinde) bir kesi yapın. Omurgayı buz üzerinde HBSS-Pen-Strep içeren önceden soğutulmuş 10 cm'lik plakalara aktarın (adım 2.2) (Şekil 1C, adım 6).
    NOT: Tüm omurga kolonlarını aynı 10 cm'lik plakada toplamak ve daha sonraki diseksiyon adımları için tek tek kolonları birer birer ayrı bir plakaya taşımak uygundur.

6. Dorsal kök gangliyonlarının diseksiyonu (DRG'ler)

  1. Yaylı makas kullanarak, omurları açığa çıkararak omurga etrafındaki kalıntı bağ dokusunu çıkarın (Şekil 1C, adım 7). Bu, omurun daha net görüntülenmesini sağlar ve orta hat boyunca kesmeyi kolaylaştırır. Kesilmiş sütunları taze, önceden soğutulmuş 10 cm'lik bir plakada toplayın (adım 2.2).
  2. Her seferinde bir tane, kesilmiş omuriliği diseksiyon için mikroskop aşamasına aktarın. Yaylı makas kullanarak omurgayı sagital düzlemde dikkatlice ayırın (Şekil 1D, adım 8).
  3. İnce uçlu forsepsler kullanarak, omuriliği omurgadan çıkarın ve DRG'leri omurilik sinirlerinin kökleri boyunca bilateral olarak açığa çıkarın (Şekil 1D, adım 9).
    NOT: Bu adımda ekstra dikkatli olunmalıdır, çünkü çok sert bir şekilde kullanılırsa DRG'ler omurilik ile birlikte çıkarılabilir.
  4. Omurilik sinirlerini yaylı makasla kesin ve DRG'lerin etrafındaki bağ dokusunu çıkarın (Şekil 1D, adım 10).
    NOT: Bu adımda bağ dokusunun çıkarılması, DRG kültürlerindeki kalıntıları en aza indirir.
  5. İnce uçlu forseps kullanarak, sırt kökünden çıkarmak için DRG'yi yavaşça çekin. Tüm montaj kültürü için, DRG'leri 3 cm'lik plakaya yerleştirin (adım 2.4'te hazırlanmıştır) (Şekil 1D, adım 11). Kalan DRG'leri, ayrışma için kullanılmak üzere 15 mL'lik bir konik tüpte (adım 2.3'te hazırlanmıştır) toplayın.
    NOT: Diseksiyon işlemi boyunca plakaları ve tüpleri buz üzerinde tutun.
  6. Tüm DRG'ler ayıklanana kadar 6.4 ile 6.5 arasındaki adımları tekrarlayın. Herhangi bir ek omurga sütunu için yukarıdaki tüm adımları tekrarlayın.
    NOT: Fareler, suşa bağlı olarak 30-31 çift DRG'ye sahiptir, bu da her hayvandan 60'a kadar DRG toplanmasına izin verecektir. DRG'ler sadece omuriliğin bel kısmından toplanıyorsa, 10 DRG çıkarılabilir. Her iki kültür modelini oluşturmak için aynı hayvandan alınan DRG'lerin kullanılması, deney içi değişkenliği azaltır ve tamamlayıcı deneyler arasında tutarlı ve karşılaştırılabilir sonuçlar sağlar.
    NOT: DRG'lerin çıkarılmasını takip eden tüm adımlar bir biyolojik güvenlik kabininde gerçekleştirilmelidir.

7. Tam montajlı DRG kültürü (Şekil 2)

  1. Önceden soğutulmuş uçları kullanarak (adım 3.2), buz üzerine yerleştirilmiş 8 oyuklu bir cam alt sürgünün her bir oyuğunda bir damlacık oluşturmak için 2 μL soğutulmuş Matrigel pipetleyin (Şekil 2A, adım 1). DRG'yi eklemeden önce Matrigel'in erken polimerleşmesini önlemek için, bir seferde yalnızca tek bir damlacık pipetleyin. Slayt yüzeyinin çizilmesini önlemek için, buz üzerine yerleştirmeden önce slaytı 10 cm'lik bir plakaya yerleştirin.
  2. İnce uçlu forseps kullanarak, bir DRG'yi kuru bir plakaya aktarın ve fazla HBSS'yi çıkarmak için hafifçe hareket ettirin, böylece DRG'yi Matrigel damlacığına eklerken Matrigel'in daha fazla seyreltilmesini önleyin. DRG'yi Matrigel damlasına aktarın (Şekil 2A, adım 2).
    NOT: DRG'yi Matrigel damlacığının içine nazikçe itmek için ince uçlu forseps kullanın, DRG'nin tamamen daldırıldığından ve damlacık içinde merkezi olarak konumlandırıldığından emin olun.
  3. Bir Matrigel damlacığına eklenen her DRG için 7.1 ila 7.2 arasındaki adımları tekrarlayın.
  4. Matrigel'in polimerize olmasına izin vermek için 8 oyuklu cam alt sürgüyü 37 °C'de nemlendirilmiş bir inkübatörde 5 dakika inkübe edin (Şekil 2A, adım 3).
  5. Her bir oyuğa dikkatlice 200 μL ılık takviye edilmiş kültür ortamı ekleyin ve 37 °C'de %5 CO2 ile inkübe edin (Şekil 2B, adım 4). Ortamı her 72 saatte bir taze takviye edilmiş kültür ortamı ile değiştirin.
  6. Her 24 saatte bir canlılığını ve nöronal büyümesini değerlendirmek için parlak alan mikroskobu kullanarak DRG'yi izleyin (Şekil 2C ve Şekil 3).
    NOT: Canlılık, nöritlerin uzunluğu ve yoğunluğundaki bir artışla gösterilebilir. DRG hücre uzantılarının gelişimini göstermek için zaman içinde görüntüler yakalanabilir (Şekil 3).

8. Ayrışmış DRG kültürü (Şekil 4)

NOT: Ayrışmış DRG nöronlarını tohumlamak için herhangi bir çok kuyulu plaka kullanılabilir. Ancak bu protokolde, immünofloresan analizleri için daha iyi hücre birleşmesi ve görüntüleme kalitesi sağladıkları için 8 oyuklu cam tabanlı slaytlar kullanılmıştır.

  1. Kültür plakalarının kollajen ile kaplanması
    1. Biyolojik bir güvenlik kabininde steril 0.01 M HCl içinde 50 μg/mL'lik bir asitleştirilmiş kollajen I çalışma çözeltisi hazırlayın.
    2. 8 oyuklu cam alt sürgünün her bir oyuğuna 100 μL kollajen I solüsyonu pipetleyin. Kollajen solüsyonunun her bir kuyucuğun tüm alt yüzeyini eşit şekilde kapladığından emin olmak için slaydı eğin ve hafifçe döndürün. Kollajen I polimerizasyonunu sağlamak için slaytı nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C'de 1 saat inkübe edin.
      NOT: Kuluçka süresi boyunca 8.2 ve 8.3 adımlarıyla devam edin.
    3. İnkübasyondan sonra, her bir oyuktan kalan polimerize edilmemiş kollajen I çözeltisini nazikçe pipetleyin. Her kuyuyu 100 μL PBS ile durulayın. Kollajenin kurumasını önlemek için ince bir kalıntı tabaka bırakarak fazla PBS'yi pipetleyin.
      NOT: 8 oyuklu cam alt sürgü, ayrışmış DRG'ler tohumlama adımı için hazır olana kadar biyolojik güvenlik kabininde kalabilir.
  2. Enzimatik sindirim
    1. DRG'leri peletlemek için ekstrakte edilmiş DRG'leri (adım 6.5) içeren 15 mL'lik tüpü oda sıcaklığında 200 × g'da 5 dakika boyunca nazikçe santrifüjleyin. HBSS'yi bir pipet kullanarak nazikçe çıkarın.
    2. DRG'leri önceden ısıtılmış takviye edilmiş ortamda durulayın, tüm içeriğin yıkandığından emin olmak için tüpe hafifçe vurun ve DRG'leri peletlemek için 200 × g'da 5 dakika santrifüjleyin.
    3. Ortamı pipetleyin ve 1 mL Papain solüsyonu ekleyin (Şekil 4A, adım 1). Nazikçe karıştırın ve bir doku kültürü inkübatöründe 37 ° C'de 20 dakika inkübe edin. Her 5 dakikada bir çalkalamak için tüpü hafifçe sallayın.
    4. 20 dakika sonra, 4,5 mL takviye edilmiş ortam ekleyin ve Papain'i nötralize etmek için hafifçe karıştırın. DRG'leri peletlemek için tüpü 400 × g'da 5 dakika santrifüjleyin. Bir pipet kullanarak süpernatanı dikkatlice çıkarın.
    5. 1 mL Kollajenaz IV / Dispas II çözeltisi ekleyin ve inkübatörde 37 ° C'de 20 dakika inkübe edin. Tüpü her 5 dakikada bir hafifçe sallayın (Şekil 4A, adım 1).
    6. 20 dakika sonra, 4.5 mL takviye edilmiş ortam ekleyin ve Kollajenaz IV / Dispas II çözeltisini nötralize etmek için hafifçe karıştırın. DRG'leri peletlemek için tüpü 400 × g'da 5 dakika santrifüjleyin. Bir pipet kullanarak süpernatanı dikkatlice çıkarın.
    7. 2 mL takviye edilmiş ortam ekleyin ve 0.2 mg / mL'lik bir nihai konsantrasyona DNaz I ekleyin. Bu noktada, DRG'ler iyice sindirilir ve gevşek bir yığın olarak görünebilir (Şekil 4A, adım 2).
  3. Mekanik ayrışma
    1. 1000 μL'lik bir filtre pipet ucu kullanarak 4-5 kat yukarı ve aşağı pipetleyerek DRG'yi nazikçe ezin (Şekil 4A, adım 2).
    2. 200 μL'lik bir pipet ucu 4-5x kullanarak ikinci bir öğütme adımı gerçekleştirin. Bu adımdan sonra, numune bulanık görünür ve geriye bazı görünür doku kümeleri kalır (Şekil 4A, adım 2).
    3. Hücre süspansiyonunu 70 μm'lik bir hücre süzgecinden 50 mL'lik bir konik tüpe süzün. Hücrelerin süzgeçten tam olarak süzülmesini sağlamak için süzgeci 10 mL ortamla kademeli olarak durulayın (Şekil 4A, adım 3).
    4. Pelet hücrelerine 1.000 × g'da 5 dakika santrifüj tüpü. Ortamı peletten çıkarın ve 500 μL takviye edilmiş ortamda yeniden süspanse edin (Şekil 4A, adım 4).
    5. 8 kuyulu cam alt sürgünün kuyularından kalan PBS'yi çıkarın. Ayrışmış DRG süspansiyonunu kollajen kaplı oyuklar arasında dağıtın. Slaytları 37 ° C'de% 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir inkübatörde inkübe edin. Gerektiği kadar daha fazla besiyeri ekleyin ve besiyerini her 48 saatte bir taze takviye edilmiş kültür besiyeri ile değiştirin (Şekil 4B, adım 5).
      NOT: DRG ile ayrışmış hücreler, kuyucuk başına tutarlı bir hücre sayısı sağlamak için bir hemositometre veya hücre sayma odası ve tripan mavisi boyama kullanılarak sayılabilir. Bu protokol için her bir kuyucuğa yaklaşık 1 × 105 hücre tohumlanmıştır.
    6. Canlılığı ve nöronal büyümeyi değerlendirmek için parlak alan mikroskobu kullanarak DRG'den türetilmiş hücreleri izleyin (Şekil 4C ve Şekil 5).
      NOT: Nöronlar, tanımlanmış sınırları olan yuvarlak hücre gövdeleri olarak görünür ve yapışması 24 saat veya daha fazla sürebilirken, nöronal olmayan hücreler tipik olarak nöronlardan önce yerleşir. Bir miktar nörit büyümesi 24 saat sonra gözlenebilir ve kültürde zamanla 7 güne kadar artar. Ayrışmış DRG'den türetilmiş hücreler ve tam montajlı DRG, kanser hücreleri eklenmeden ve ko-kültürler oluşturulmadan önce 72 saat önceden inkübe edilir.

9. Kanser hücre süspansiyonlarının hazırlanması ve ko-kültürlerin oluşturulması

NOT: Birçok türde yapışık kanser hücreleri kullanılabilir. Ko-kültürler için büyüme ortamı ve hücre sayıları hücre hattına bağlı olacaktır. Hücre toplama zamanlamasını ve optimal hücre tohumlama sayılarını belirlemek için deneyden önce ön test yapmanızı öneririz. Burada açıklanan protokol, insan pankreas kanseri hücre hatları PanC1 ve MiaPaCa2 ve prostat kanseri hücre hattı DU-145'in kullanımına dayanıyordu.

  1. Hücreleri serumsuz ortamla yıkayın ve 2 mL tripsin / 10 cm plaka ile yaklaşık 3 dakika boyunca tripsinize edin.
  2. 6 mL takviye edilmiş ortam ekleyerek tripsini nötralize edin ve tek hücreli bir süspansiyon sağlamak için hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin. Bir hemositometre ve tripan mavisi lekesi kullanarak hücreleri sayın.
  3. Kanser hücrelerini, takviye edilmiş ortamda 2 × 105 hücre / mL konsantrasyonda askıya alın (adım 1.2).
    NOT: Optimal hücre yoğunluğu, hücre boyutuna, iki katına çıkma süresine ve ko-kültür süresine bağlı olarak değişebilir ve gerektiği gibi ayarlanabilir.
  4. Tam montajlı DRG ve kanser hücresi ko-kültürü (Şekil 6B)
    1. 8 oyuklu cam alt slaytta medyayı tüm DRG montaj kültürlerinden aspire edin.
    2. 200 μL kanser hücresi süspansiyonunu (adım 9.3) tüm DRG dağını içeren Matrigel damlacığının üzerine nazikçe pipetleyin.
      NOT: Bu, damlacık etrafında kanser hücrelerinin düzgün bir şekilde dağılmasını sağlar. Pipet ucuyla Matrigel damlacığını rahatsız etmemeye dikkat edin.
    3. Ko-kültür slaytını nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C'de% 5 CO2 ile inkübe edin. Ortamı her gün 200 μL ısıtılmış takviye edilmiş ortamla bir kez yıkayarak ve ardından her oyuğa 300 μL takviye edilmiş ortam ekleyerek yenileyin.
      NOT: DRG kanseri hücrelerinin ko-kültürünü bozmamak için ortamı bir pipet kullanarak nazikçe aspire edin. Zamanla, ortak kültürler daha karmaşık ve organize hale geldikçe, hücresel etkileşimleri ve ortak kültür bütünlüğünü etkileyebilecek rahatsızlıklara karşı daha duyarlı hale gelirler.
    4. Kanser hücresi davranışını ve nöronal etkileşimleri değerlendirmek için 24 saatlik aralıklarla parlak alan veya floresan mikroskobu kullanarak ko-kültürü izleyin (Şekil 6B).
      NOT: Gözlem frekansı, deneysel zaman çizelgesine ve ilgilenilen hücre etkileşimlerine göre ayarlanabilir.
  5. Dissosiyasyon DRG ve kanser hücresi ko-kültürü (Şekil 6C)
    1. 8 oyuklu cam tabanlı slaytta medyayı ayrışmış kültürlerden aspire edin.
    2. Her bir oyuğa 200 μL kanser hücresi süspansiyonunu (adım 9.3) nazikçe dağıtın. Tam montajlı ko-kültürler için ana hatlarıyla belirtilen aynı inkübasyon, medya yenileme ve izleme adımlarını izleyin (adım 9.4.3 ve 9.4.4).
      NOT: Hücresel süreçlerin ve kanser hücresi-nöron etkileşimlerinin daha iyi görselleştirilmesi için, üreticinin protokolünü izleyerek kültüre floresan hücre izleyicileri eklenebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Protokolümüz, birincil fare DRG'den türetilmiş hücrelerin izolasyonunu ve iki tamamlayıcı kültür modelinin oluşturulmasını açıklar: farklı karmaşıklık seviyelerinde sinir-kanser hücresi etkileşimlerini araştırmamıza izin veren ayrışmış DRG ve tam monteli DRG kültürleri. Bu protokolün önemli bir avantajı, her iki kültür türünün de aynı hayvandan izole edilen DRG'ler kullanılarak üretilebilmesidir, bu da hayvanlar arası ve deneyler arası değişkenliği en aza indirir ve her modelden üretilen ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada sunulan protokol, 2D ve 3D DRG primer sinir kültürlerinin oluşturulması için geliştirilmiş yöntemleri ve bunların kanser hücreleri ile ko-kültürde uygulanmasını açıklamaktadır. Bu protokol, iki modeli paralel olarak kurarak önceki yöntemlerde ilerler. 2D ve 3D modeller aynı anda oluşturulduğundan, aynı hayvanlardan izole edilen primer sinirler kullanılarak, hayvanlar arası ve deneyler arası varyasyon en aza indirilir ve her iki modelden elde edilen veriler daha kolay karşılaştırıl...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri'nden (PJT-178274) (LMM) ve Ontario Yüksek Lisans Bursu'ndan (LCBO) ve Yüksek Öğretim Personelinin Geliştirilmesi Koordinasyonu'ndan bir burs ile desteklenmiştir - Brezilya (CAPES) - Finans Kodu 001 (ERP). LMM, Queen's Üniversitesi'nde Genetik ve Moleküler Tıp alanında Bracken Kürsü'dür. Bazı görüntüler kısmen Biorender kullanılarak oluşturulmuştur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Araçlar
70 &mikro; m Hücre SüzgeciProgen71-229483-ULTİHücre süspansiyonunu filtrelemek için kullanılır
8 oyuklu cam alt kızaklarIBidi, Münih, Almanya80807
Dumont #5 - İnce ForsepsGüzel Bilim Araçları, Foster City, ABD11254-20
Dumont #5 ForsepsGüzel Bilim Araçları, Foster City, ABD11252-20
İnce MakasGüzel Bilim Araçları, Foster City, ABD91460-11
Desen ForsepsGüzel Bilim Araçları, Foster City, ABD91121-12
Yaylı MakasGüzel Bilim Araçları, Foster City, ABD91500-09
Reaktifler
1x Fosfat tamponlu salinSigma, St. Louis, ABDD8662-500MLEnzimleri çözmek için kullanılır
B-27 Takviye Edici Gıdalar (50x)Thermo Fisher Bilimsel, Massachusetts, ABD17504044F12 ortamında %2 konsantrasyonda kullanılır
Sığır Tip I KollajenCorning Incorporated, New York, ABD354231Plakaları kaplamak için kullanılır, Çalışma çözümü 50 µ 0,01 M HCl'de g/mL
Kollajenaz Tip IVSigma-Aldrich, St. Louis, ABDC4-BIOCPBS'de 1.25 mg/mL'de çözün, alikot, -20 °'de saklayın; C
Dağıtma IIRoche, Basel, İsviçre4942078001PBS'de 2.5 mg/mL'de çözün, alikot, -20 °'de saklayın; C
DNase IRoche, Basel, İsviçre.11284932001Son konsantrasyonda eklendi  Ayrışma sırasında 0,2 mg/mL
Fetal Sığır Serumu (FBS)Sigma-Aldrich, St. Louis, ABDF1051 SerisiF12 ortamında %10 konsantrasyonda kullanılır
HBSS (Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi)Sigma, St. Louis, ABDH6648-500ML%1 Penisilin-Streptomisin ile hazırlanmıştır
Matrigel Büyüme Faktörü AzaltıldıCorning Incorporated, New York, ABD3562314 °'de çözülür; Gece boyunca C, buzda kalın
Besin Karışımı F-12 JambonSigma-Aldrich, St. Louis, ABDN6658-500MLTakviye edilmiş kültür ortamının hazırlanması için bazal ortam
PapainRoche, Basel, İsviçre.10108014001PBS'de 30 U/mL'de çözün, alikot, -20 °'de saklayın; C
Penisilin-Streptomisin (100x)Sigma-Aldrich, St. Louis, ABDP4333-100MLOrtamda %1 konsantrasyonda kullanılır
Tripan Mavisi ÇözeltisiSigma-Aldrich, St. Louis, ABDT8154-100MLHücre canlılığını değerlendirmek için
TrypLE EkspresThermo Fisher Bilimsel, Massachusetts, ABD12605-028Kanser hücrelerini toplamak için
Antikorlar
β-Tubulin III antikoruAbcam (Cambridge, Birleşik Krallık)AB15568Seyreltme 1:200
Alexa Flor 488Thermo Fisher Bilimsel, Massachusetts, ABDA-11008Seyreltme 1:2000
Alexa Flor 594Thermo Fisher Bilimsel, Massachusetts, ABDA-21442Seyreltme 1:2000
Alexa Flor 647Thermo Fisher Bilimsel, Massachusetts, ABDA-21245 SerisiSeyreltme 1:2000
NeuN antikoruSigma-Aldrich, St. Louis, ABDMAB377 (İngilizce)Seyreltme 1:100
Floresan Boyalar ve Problar
ActinGreen 488 ReadyProbes Reaktifi (Phalloidin)Thermo Fisher Bilimsel, Massachusetts, ABDR37110 SerisiSeyreltme 1:40
CellTrace Calcein Kırmızı-TuruncuThermo Fisher Bilimsel, Massachusetts, ABDC34851 (İngilizce)Floresan mikroskobu altında nöronları görselleştirmek için kullanılan hücre izleyici
Hoechst 33342Thermo Fisher Bilimsel, Massachusetts, ABDH3570 SerisiSeyreltme 1:5000

Kaynaklar

  1. Thiel, V., et al. Characterization of single neurons reprogrammed by pancreatic cancer. Nature. 640 (8060), 1042-1051 (2025).
  2. Zhu, M., Luo, F., Xu, B., Xu, J. Research progress of neural invasion in pancreatic cancer. Curr Cancer Drug Targets. 24 (4), 397-410 (2024).
  3. Zareba, P., et al. Perineural invasion and risk of lethal prostate cancer. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 26 (5), 719-726 (2017).
  4. Fu, Y., et al. Worst pattern of perineural invasion redefines the spatial localization of nerves in oral squamous cell carcinoma. Front Oncol. 11 (766902), (2021).
  5. Hu, J., Chen, W., Shen, L., Chen, Z., Huang, J. Crosstalk between the peripheral nervous system and breast cancer influences tumor progression. Biochim Biophys Acta Rev Cancer. 1877 (6), 188828(2022).
  6. Li, J., Mei, S., Zhou, S., Zhao, F., Liu, Q. Perineural invasion is a prognostic factor in stage ii colorectal cancer but not a treatment indicator for traditional chemotherapy: A retrospective cohort study. J Gastrointest Oncol. 13 (2), 710-721 (2022).
  7. Schmitd, L. B., Perez-Pacheco, C., D'silva, N. J. Nerve density in cancer: Less is better. FASEB Bioadv. 3 (10), 773-786 (2021).
  8. Zahalka, A. H., Frenette, P. S. Nerves in cancer. Nat Rev Cancer. 20 (3), 143-157 (2020).
  9. Winkler, F. Neuroscience and oncology: State-of-the-art and new perspectives. Curr Opin Neurol. 36 (6), 544-548 (2023).
  10. Lanigan, L. G., et al. Comparative pathology of the peripheral nervous system. Vet Pathol. 58 (1), 10-33 (2021).
  11. Jiang, S. -H., Zhang, S., Wang, H., Xue, J. -L., Zhang, Z. -G. Emerging experimental models for assessing perineural invasion in human cancers. Cancer Lett. 535 (215610), (2022).
  12. Moysidou, C. -M., Barberio, C., Owens, R. M. Advances in engineering human tissue models. Front. Bioeng. Biotechnol. 8 (620962), (2021).
  13. Bayat, F. K., et al. Adult mouse dorsal root ganglia neurons form aberrant glutamatergic connections in dissociated cultures. PloS ONE. 16 (3), e0246924(2021).
  14. Lin, Y. -T., Chen, J. -C. Dorsal root ganglia isolation and primary culture to study neurotransmitter release. J Vis Exp. (140), e57569(2018).
  15. Schmidt, H., Rathjen, F. G. Dii-labeling of drg neurons to study axonal branching in a whole mount preparation of mouse embryonic spinal cord. J Vis Exp. (58), e3667(2011).
  16. Klimovich, P., Rubina, K., Sysoeva, V., Semina, E. Three-dimensional model of dorsal root ganglion explant as a method of studying neurotrophic factors in regenerative medicine. Biomedicines. 8 (3), 49(2020).
  17. Neto, E., et al. Axonal outgrowth, neuropeptides expression and receptors tyrosine kinase phosphorylation in 3d organotypic cultures of adult dorsal root ganglia. PLoS ONE. 12 (7), e0181612(2017).
  18. Melli, G., Höke, A. Dorsal root ganglia sensory neuronal cultures: A tool for drug discovery for peripheral neuropathies. Expert Opin Drug Discov. 4 (10), 1035-1045 (2009).
  19. Du, J., Sudlow, L. C., Luzhansky, I. D., Berezin, M. Y. Drg explant model: Elucidating mechanisms of oxaliplatin-induced peripheral neuropathy and identifying potential therapeutic targets. bioRxiv. , (2023).
  20. Mo, Y. J., Kim, Y. -S., Kim, M. S., Lee, Y. -I. Advantages of adult mouse dorsal root ganglia explant culture in investigating myelination in an inherited neuropathic mice model. Methods Protoc. 5 (4), 66(2022).
  21. Nguyen, U. N., et al. Type i collagen concentration affects neurite outgrowth of adult rat drg explants by altering mechanical properties of hydrogels. J Biomater Sci Polym Ed. 35 (2), 164-189 (2024).
  22. Ito, K., et al. Histological effects of combined therapy involving scar resection, decellularized scaffolds, and human ipsc-ns/pcs transplantation in chronic complete spinal cord injury. Sci Rep. 14 (1), (2024).
  23. Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L., Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L. Synthetic alternatives to matrigel. Nat Rev Mater. 5 (7), 539-551 (2020).
  24. Berkovitch, Y., Seliktar, D. Semi-synthetic hydrogel composition and stiffness regulate neuronal morphogenesis - pubmed. Int J Pharm. 523 (2), 545-555 (2017).
  25. Carozzi, V. A., Salio, C., Rodriguez Menendez, V., Ciglieri, E., Ferrini, F. 2d vs 3d morphological analysis of dorsal root ganglia in health and painful neuropathy. Eur J Histochem. 65 (Suppl 1), 3276(2021).
  26. Smith, P. R., Meyer, A., Loerch, S., Campbell, Z. T. Protocol for the isolation and culture of mouse dorsal root ganglion neurons for imaging applications. STAR Protocols. 4 (4), (2023).
  27. Bunge, R. P. Expanding roles for the schwann cell: Ensheathment, myelination, trophism and regeneration - pubmed. Curr Opin Neurobiol. 3 (5), 805-809 (1993).
  28. Chen, Z., Fang, Y., Jiang, W. Important cells and factors from tumor microenvironment participated in perineural invasion. Cancers. 15 (5), 1360(2023).
  29. Jang, K., Garraway, S. M. A review of dorsal root ganglia and primary sensory neuron plasticity mediating inflammatory and chronic neuropathic pain. Neurobiol Pain. 15 (100151), (2024).
  30. Hanani, M., et al. Age-related changes in neurons and satellite glial cells in mouse dorsal root ganglia. Int J Mol Sci. 24 (3), 2677(2023).
  31. Martinelli, C., Sartori, P., Ledda, M., Pannese, E. Age-related quantitative changes in mitochondria of satellite cell sheaths enveloping spinal ganglion neurons in the rabbit. Brain Res Bull. 61 (2), 147-151 (2003).
  32. Niwa, H., et al. Differential age-dependent trophic responses of nodose, sensory, and sympathetic neurons to neurotrophins and gdnf: Potencies for neurite extension in explant culture. Neurochem Res. 27 (6), 485-496 (2002).
  33. Adler, J. E. Age-dependent differential regulation of sensory neuropeptides by glial cell line-derived neurotrophic factor. J Neurochem. 71 (1), 170-177 (1998).
  34. Podratz, J. L., et al. Neurotoxicity to drg neurons varies between rodent strains treated with cisplatin and bortezomib. J Neurol Sci. 362, 131-135 (2015).
  35. Lawson, S. N., Biscoe, T. J. Development of mouse dorsal root ganglia: An autoradiographic and quantitative study. J Neurocytol. 8 (3), 265-274 (1979).
  36. Monje, M., et al. Roadmap for the emerging field of cancer neuroscience. Cell. 181 (2), 219-222 (2020).
  37. Silverman, D. A., et al. Cancer-associated neurogenesis and nerve-cancer cross-talk. Cancer Res. 81 (6), 1431-1440 (2021).
  38. Vermeer, P. D., Restaino, A. C., Barr, J. L., Yaniv, D., Amit, M. Nerves at play: The peripheral nervous system in extracranial malignancies. Cancer Discov. 15 (1), 52-68 (2025).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

DRG K lt rN ron Kanser Etkile imiT m Katman K lt rAyr t r lm N ron K lt rN rit UzamasKo K lt r ModeliT m r Mikro evresiN ral nvazyon
Dorsal Kök Gangliyon Kültürünün İn Vitro Modellerinin Oluşturulması: Kanser-Sinir Karışmasının Araştırılmasında Tamamlayıcı Yaklaşımlar
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.