Yöntem makalesi

Yakın Kızılötesi Işığın İntratümöral Altın Nanoçubuklar Tarafından Fototermal Dönüşümü Yoluyla Murin Tümör Modellerinde Hedeflenen Hafif Hiperterminin İndüklenmesi

DOI:

10.3791/68656

⸱

10 Ekim 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, Dalhousie University, 2Sona Nanotech Inc., 3Department of Surgery, Dalhousie University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, katı tümör modellerinde hedefe yönelik hipertermik tedavi için gerekli teknikleri ve metodolojiyi sunar. Yaklaşım, tümör mikroçevresinde lokalize ısınmayı indüklemek için intratümöral olarak enjekte edilen altın nanoçubuklar tarafından yakın kızılötesi ışığın fototermal dönüşümünden yararlanır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hafif hipertermi (42-48 °C), kontrollü tümör hücresi ölümünü indükleyebilen ve anti-kanser bağışıklık tepkilerini uyarabilen köklü bir terapötik yöntemdir. Bununla birlikte, çevredeki sağlıklı dokuyu korurken ısıyı tümör dokusuna hassas bir şekilde iletmek önemli bir zorluk olmaya devam etmektedir. İzole ekstremite perfüzyonu gibi geleneksel hipertermi yöntemleri karmaşık, invaziv prosedürler gerektirir ve önemli lokal toksisite ve hasta morbiditesi riski taşır. Buna karşılık, yakın kızılötesi (NIR) ışıkla aktive edilen altın nanopartikülleri kullanan fototermal terapi, lokalize hipertermiye ulaşmak için umut verici, daha az invaziv bir strateji olarak ortaya çıkmıştır. Özellikle altın nanoçubuklar (GNR'ler), ayarlanabilir optik özellikler ve yüksek fototermal dönüşüm verimliliği sergiler ve bu da onları tümör bölgelerinin hassas termal modülasyonu için ideal adaylar haline getirir. Bu teknik, özellikle yüzeysel ve erişilebilir tümörler için önemli umut vaat etse de, tekrarlanabilir dağıtım, uzamsal hapsetme ve güvenlik, aktif iyileştirme alanları olmaya devam etmektedir. Bu protokolde, biyouyumlu GNR'lerin intratümöral enjeksiyonunu ve ardından kısa süreli, hedefli NIR lazer maruziyetini kullanarak lokalize, hafif hipertermi elde etmek için doğrulanmış ve optimize edilmiş yöntemimizi sunuyoruz. Bu yaklaşım, terapötik aralıkta hızlı, kontrol edilebilir ısıtmayı mümkün kılar, immünojenik tümör hücresi ölümünü teşvik eder ve doğuştan gelen bağışıklık tepkilerini, özellikle immünolojik olarak "soğuk" tümörlerle ilgili mekanizmaları uyarır. Gerçek zamanlı sıcaklık izleme ve yerel dağıtım, tekrarlanabilirlik, güvenlik ve minimum sistemik maruziyet sağlar. Bu kolaylaştırılmış protokol, klinik öncesi çalışmalar için sağlam ve erişilebilir bir platform sunarak kanser immünoterapisinde hafif hipertermiden yararlanmaya yönelik daha geniş çabaları destekler.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kanser tedavisinde ilaç direnci, bağışıklıktan kaçınma ve hedef dışı toksisite gibi önemli zorluklar devam etmektedir ve bunların tümü geleneksel tedavilerin uzun vadeli başarısını baltalamaktadır. Bu sınırlamalar, sağlıklı dokuya verilen ikincil hasarı en aza indirirken direnç mekanizmalarının üstesinden gelmek için tasarlanmış tamamlayıcı terapötik stratejilerin geliştirilmesine yol açmıştır. Doku sıcaklıklarının 42-48 °C'ye yükselmesi olarak tanımlanan hafif hipertermi, uzun zamandır standart kanser tedavilerine etkili bir yardımcı olarak kabul edilmektedir1. Tarihsel olarak, hafif hipertermi, tümör perfüzyonunu artırarak, stromal mimariyi bozarak ve malign hücreleri sitotoksik ajanlara duyarlı hale getirerek bu tedavilerin etkinliğini artırmak için cerrahi, kemoterapi veya radyoterapi ile kombinasyon halinde kullanılmıştır1. Daha yakın zamanlarda, onkolojide immünoterapinin artan başarısıyla birlikte, antitümör immün yanıtları iyileştirmek için hafif hiperterminin doğal immünomodülatör potansiyelinden yararlanmaya artan bir ilgi vardır 1,2,3.

Kanıtlanmış klinik faydalarına rağmen, tümör hipertermisinin daha geniş uygulaması, hedef dışı doku hasarını önlerken tümörlerin lokalize, kontrol edilebilir ve tekrarlanabilir ısıtılmasını sağlamadaki zorluklar nedeniyle sınırlı kalmaktadır4. Bölgesel ekstremite perfüzyonu veya sistemik olarak verilen nanopartikül bazlı yaklaşımlar gibi mevcut klinik ve deneysel hipertermi teknikleri genellikle sınırlı uzamsal hassasiyet, değişken tümör alımı ve sistemik toksisite potansiyelinden muzdariptir 2,5,6,7,8,9 . Hedefe yönelik hipertermik tedavi, çevredeki sağlıklı dokuya verilen zararı en aza indirirken tümör sıcaklıklarını seçici olarak yükseltmek için tasarlanmış, kanser tedavisinin bu alanında yeni ortaya çıkan bir yöntemdir. Daha spesifik olarak, altın nanoçubukların (GNR'ler) hedeflenen dağıtımı, hafif tümör hipertermisi hassasiyeti ve toksisitesinin mevcut sınırlamalarının üstesinden gelmek için umut verici bir yöntemdir. GNR'ler, NIR bölgesindeki ayarlanabilir yüzey plazmon rezonansları, yüksek fototermal dönüşüm verimliliği ve diğer altın nanoyapılara10,11 kıyasla uygun biyolojik dağılım profilleri nedeniyle fototermal uygulamalar için özellikle uygundur. NIR dalga boylarına yanıt vermeleri, çevredeki yapılara minimum zarar vererek daha derin dokularda bile verimli ışık emilimi ve lokal ısıtma sağlar. Bu nedenle, GNR'ler hipertermik tedavilerde gelişmiş etkinlik, hedefleme ve güvenlik sağlayabilir.

Bu yöntemin amacı, katı tümörlerde hafif, altın-nanoçubuk aracılı hipertermi elde etmek için oldukça verimli, düşük kaynak yoğun ve tekrarlanabilir bir protokol sağlamaktır. GNR aracılı hedefe yönelik hipertermik tedavi (THT) olarak adlandırılan bu teknik, doğrudan tümör içi GNR enjeksiyonunu harici NIR ışık aktivasyonu ile birleştirerek geleneksel hipertermi yaklaşımlarının temel sınırlamalarını ele alır. Bu, yüksek lokal nanopartikül konsantrasyonu sağlayarak, özellikle sistemik olarak verilen ajanları verimli bir şekilde biriktiremeyen küçük veya zayıf vaskülarize tümörler için tekrarlanabilirliği ve güvenliği artırır. Ek olarak, GNR'lerin doğrudan intratümöral enjeksiyonunun kullanılması ve ardından yakın kızılötesi (NIR) ışığa maruz kalma, tümörlerin hassas, kontrollü ve lokalize ısıtılmasını sağlarken, geleneksel bölgesel hipertermi teknikleriyle ilişkili sistemik maruziyeti, toksisiteyi ve hedef dışı etkileri en aza indirir.

Birçok kanser, karmaşık ve çeşitli bağışıklık kaçış mekanizmalarını tasvir ederek, immünoterapiye çeşitli yollarla, en belirgin şekilde, tümör mikroçevresi 2,4,5 içindeki zayıf bağışıklık hücresi infiltrasyonu yoluyla direnmelerine izin verir. Hafif hipertermi, immünoterapilerle birlikte kullanıldığında sinerjik bir çözüm sunar. Doğrudan sitotoksik etkilere ek olarak, hafif hipertermi tercihen immünojenik hücre ölümünü (ICD) indükleyerek tümörle ilişkili antijenlerin (TAA'lar) ve hasarla ilişkili moleküler modellerin (DAMP'ler) salınmasına yol açar 1,2. Bu sinyaller doğuştan gelen bağışıklık yollarını aktive eder, tümör antijen sunumunu arttırır, dendritik hücre olgunlaşmasını teşvik eder ve T hücresi hazırlamasını arttırır, sonuçta tümör mikroçevresine bağışıklık hücresi infiltrasyonunu arttırır 1,6,12. Kendi klinik öncesi modellerimizde, bu GNR aracılı THT tekniği, lokal immün yanıtları aktive etme ve tümör immün infiltrasyonunu arttırma işlevi gördü13. Tümör içi interlökin-2 (IL-2) tedavisi veya sistemik anti-PD1 kontrol noktası inhibisyonu ile birleştirildiğinde, bu GNR aracılı THT tekniği, anti-tümör bağışıklığını daha da artırdı ve meme kanseri ve melanom modellerinde tek başına monoterapiden daha iyi performans gösterdi13. Bu sonuçlar, meme kanseri 14,15,16 ve beyin tümörleri 17,18 dahil olmak üzere katı tümörlerde nanopartikül aracılı hipertermi ve immünoterapi arasındaki sinerjiyi destekleyen artan kanıtlarla tutarlıdır. Kısacası, immünolojik olarak 'soğuk' tümörleri 'sıcak' tümörlere dönüştürerek, GNR aracılı THT, kontrol noktası inhibitörleri 1,2,12 dahil olmak üzere immünoterapilere yanıtı artırabilir.

Burada sunulan GNR aracılı THT protokolü, düşük kaynak yoğundur, teknik olarak basittir ve deri altı veya yüzeysel tümörlere geniş ölçüde uyarlanabilir. Bu teknik, melanom ve meme kanseri dahil olmak üzere deri altı veya yüzeysel tümörlerin fare modelleriyle çalışan araştırmacılar için özellikle uygundur. Bununla birlikte, küçük değişikliklerle diğer tümör tiplerine ve anatomik bölgelere genişletilebilir. Ek olarak, bu teknik, uzamsal olarak kontrol edilen hipertermiyi, özellikle immünoterapiyi artıran stratejileri araştıran ve immünoterapi tedavilerine karşı tedavi yanıtını iyileştirmek veya direncin üstesinden gelmek için hafif hipertermiyi keşfetmeyi amaçlayan klinik öncesi kanser çalışmalarına entegre etmek için çok yönlü bir platform sunar. Ayrıca, bu tekniğin uygulanması için gerekli bilgi ve ekipman, çeşitli sağlık hizmeti ortamlarına erişilebilir ve uyarlanabilir, bu da daha geniş klinik kullanımda fizibilitesini artırır3.

Bu yazıda, GNR aracılı THT protokolümüzü 860 nm'de çalışan bir NIR lazer sistemi kullanan fare modellerinde uygulamak için ayrıntılı adım adım talimatlar sunuyoruz. Bu protokolün başarısı, yakın kızılötesi ışığın uygun dalga boyunu kullanarak altın nanoçubukların verimli derin doku aktivasyonuna bağlıdır. Ayrıca, murin tümör modellerinde tutarlı, güvenli ve etkili hafif hipertermik dozlama elde etmek için, prosedür boyunca iç tümör sıcaklığının doğru ve gerçek zamanlı izlenmesi gibi prosedürel hususları da vurguluyoruz. Bu yöntem, daha önce bildirilen nanopartikül hipertermi yaklaşımlarının özelliklerini temel alır ve bir araya getirerek klinik öncesi kanser araştırmaları için kapsamlı, doğrulanmış, son derece hassas ve tekrarlanabilir bir alternatif sunar. Genel olarak, bu protokol, mevcut kanser immünoterapilerinin etkinliğini artırmak ve onkolojide hiperterminin klinik faydasını genişletmek için güçlü potansiyele sahip, tümör lokalize hipertermi sağlamak için biyolojik olarak güvenli, uygun maliyetli ve düşük toksisiteli bir yöntem sunar.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm deneysel protokoller, Kanada Hayvan Bakımı Konseyi etik standartlarının yönergeleri uyarınca Dalhousie Üniversitesi'ndeki Üniversite Laboratuvar Hayvanları Komitesi tarafından onaylandı. Hayvanların bakımı ve kullanımı için geçerli tüm uluslararası, ulusal ve kurumsal yönergelere uyuldu. Bu protokolde kullanılan tüm malzemelerle ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın.

1. Lazer ve tedavi tesisi gereksinimleri

  1. 4.000 mA'ya kadar yoğunlukta 860 ± 10 nm dalga boyunda ışık verebilen tam kalibre edilmiş bir lazer sistemine güvenli erişim. Lazer sisteminin uygun kapatma mekanizmalarına sahip olduğundan emin olun.
    NOT: Bu çalışmada özel olarak tasarlanmış bir lazer kullandık. Bu protokolde kullanılan modelde bir lazer etkinleştirme anahtarı, bir acil durdurma düğmesi ve bir kilitleme atlama teli bulunur (bağlanan atlama teli aynı zamanda güvenlik uyumluluğu için kullanılan bir güvenlik anahtarına da bağlanabilir, örneğin Sınıf 4 lazer odasına kapı erişimi).
  2. Uygun termokupl kayıt yazılımı aracılığıyla canlı sıcaklık verilerini iletebilen, tümör içi sıcaklık izleme için takılabilir, kalibre edilmiş bir sıcaklık probu takın.
  3. Lazer sınıfı için gerekli güvenlik standartlarını karşılayan belirlenmiş bir lazer odası hazırlayın. İyi havalandırılan, uygun aydınlatmaya sahip ve tüm yansıtıcı yüzeylerin kaplı, engelsiz bir çalışma alanı olduğundan emin olun. İstenmeyen maruziyeti önlemek için lazer işlemi sırasında oda erişimini kısıtlayın. Çalışmaya katılan tüm personelin lazer kullanımı ve güvenlik protokolleri konusunda tam eğitimli olduğundan ve uygun KKD ve göz koruması kullandığından emin olun.
  4. Lazer odasında, lazer kurulumunun yakınında bir anestezi makinesini barındıran bir çalışma alanı oluşturun. Lazerin güvenli bir şekilde monte edildiğinden, ancak ayarlanabilir olduğundan ve tümör bölgesinin doğru bir şekilde hedeflenmesini sağlamak için deney deneğinin lazer ışını kaynağından yaklaşık 1-2 cm uzağa yerleştirilebildiğinden emin olun.
  5. Lazere maruz kalma boyunca nesnenin yüzeyinden sıcaklık okumalarını yakalamak için konumlandırılmış bir tripod üzerinde bir termal görüntüleme kamerası kullanın.

2. Hücre kültürü ve aşılama (tümör hücresi enjeksiyonu)

  1. Standartlaştırılmış laboratuvar hücre kültürü hazırlama ve bakım tekniklerini izleyerek ilgilenilen tümör tipine göre uygun fare modellerini seçin. Bu protokolü takip etmek için, CT26 tümör aşılaması için 6-8 haftalık dişi BALB/c fareleri seçin.
    NOT: Çalışma gereksinimlerine bağlı olarak, farklı yaş ve suşlarda immünokompetan veya bağışıklığı baskılanmış fareler kullanılabilir.
  2. CT26 kanser hücre hattını, %100 ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu (FBS), 100 U/mL penisilin, 100 μg/mL streptomisin ve 2 mM glutamin ile desteklenmiş RPMI 1640 ortamında kültürleyin. Hücreleri %5CO2 ile nemlendirilmiş bir atmosferde 37 °C'de tutun. Ortamı her 2-3 günde bir yenileyin ve 1:4 ila 1:10'luk bir bölünme oranı kullanarak hücreleri %70-80 birleşmede alt kültürleyin. Tutarlı büyüme ve aşılama verimliliği sağlamak için erken geçişlerdeki hücreleri (örneğin, ≤10 geçiş) kullanın. Aşılama için gerekli sayıda hücre elde etmek için kültürleri gerektiği gibi genişletin.
    NOT: Fare başına gereken hücre sayısı modele bağlı olarak değişecektir, örneğin CT26 murin kolorektal kanser modeli için fare başına 5 × 105 hücreye ihtiyacımız vardı.
  3. Tripsinizasyon kullanarak yapışık hücreleri ayırın ve 2x steril 1x PBS ile yıkayın. İstenilen 5 × 106 hücre / mL konsantrasyonunu elde etmek için steril bir 1x PBS çözeltisinde yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunu enjeksiyondan önce maksimum 1 saat buz üzerinde steril 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde saklayın.
  4. Enjeksiyondan önce, 0,8 L/dak akış hızında %4 buharlaştırılmış izofluran içeren bir indüksiyon odası kullanarak fareleri uyuşturun. Anestezi uygulandıktan sonra izofluranı %2'ye düşürün ve aşılama işlemi sırasında burun konisi ile anesteziyi sürdürün. Ağrı tepkisinin olmadığından emin olmak için ayak parmağı sıkıştırma testi kullanarak anestezi derinliğini doğrulayın. Kurumayı önlemek ve olası lazer hasarını en aza indirmek için her iki göze de göz kayganlaştırıcı uygulayın.
  5. Elektrikli bir tıraş makinesi kullanarak enjeksiyon bölgesini (örneğin, bu heterotopik CT26 modeli için sol kanat) tıraş edin ve kalıntıları gidermek ve cildi dezenfekte etmek için alanı alkollü mendille temizleyin. Enjeksiyon bölgesinde cildi sıkıştırın ve 26 G'lik bir iğne ve 1 mL'lik bir şırınga kullanarak deri altına 5 × 106 hücre/mL'de 100 μL hücre süspansiyonu enjekte edin. Enjeksiyondan sonra, fareyi burun konisinden çıkarın ve 1 saat boyunca bir ısıtma battaniyesi üzerinde iyileşmesi için kafesine geri koyun.

3. Tümör büyümesi ve ölçümü

  1. Bir tümör ölçüm kumpası kullanarak, tipik olarak enjeksiyondan sonraki 7. günden başlayarak günlük tümör ölçümlerine başlayın. Tümör boyutlarını üç eksende ölçün: genişlik, uzunluk ve yükseklik ve genişlik × yükseklik × × π/6 elipsoid tümör hacmi formülü kullanarak tümör hacimlerini hesaplayın.
  2. Tümörler yaklaşık 50mm3 (± 20mm3) hacme ulaştığında GNR aracılı THT'yi başlatmayı planlayın.
    NOT: CT26 modelimiz için bu tümör hacmine, tümör hücresi enjeksiyonundan sonraki 10. ve 12. günler arasında ulaşıldı).
  3. Lazer tedavisinden önce, farelerin kontrol ve tedavi gruplarına rastgele atandığından emin olun. Tedavi grubuna intratümöral GNR enjeksiyonu ve ardından lazere maruz kalma uygulanacaktır; ve kontrol grubuna GNR'ler yerine intratümöral PBS enjeksiyonu (GNR enjeksiyonu ile aynı hacimde) ve ardından lazere maruz kalma uygulanacaktır.

4. Tümör içi GNR'ler kullanılarak NIR ışığının fototermal dönüşümü

  1. Steril bir biyolojik güvenlik kabininde, her tümör hacmine göre uygun GNR hacmini çekmek için 31 G iğneli 0.3-1 mL'lik bir şırınga kullanın.
  2. Fareyi kanser hücresi enjeksiyonu ile aynı şekilde uyuşturun (0,8 L/dak akış hızında% 2 izofluran veren bir burun konisi ile ve ayak parmağı sıkıştırma testi kullanarak yeterli anestezi derinliğini onaylayın).
  3. Anestezi uygulandıktan sonra, izofluranı %2'ye düşürün ve bir burun konisi kullanarak anesteziyi sürdürürken fareyi lazer platformunda yüzüstü pozisyonda yerleştirin. Kurumayı önlemek ve olası lazer hasarını en aza indirmek için her iki göze de göz kayganlaştırıcı uygulayın.
  4. Cilt yüzeyinin lazere maruz kalmasını sağlamak için gerekirse tümörün etrafındaki fazla kürkü tıraş edin. Tümör yüzeyini dezenfekte etmek için etanol kullanın, kürk/kalıntıları silin.
    NOT: Bu çalışmada, 860 nm'de absorpsiyon için optimize edilmiş GNR'ler kullandık. Burada önerilenden farklı bir GNR ürünü kullanıyorsanız, lazer NIR dalga boyu iletiminin GNR'nin absorpsiyon spektrumuna göre optimize edildiğinden emin olun.
  5. Lazere maruz kalmadan önce, GNR'leri tümör hacminin 1 μg/mm3'lük bir konsantrasyonunda intratümöral olarak enjekte edin. Gerekirse, GNR'lerin tümör içinde verimli dağılımını sağlamak için enjeksiyonu iki intratümöral bölge arasında bölün.
    NOT: Bu protokol videosunda, 2 μg/μL konsantrasyonda GNR'ler kullanılmıştır; bu nedenle, 50mm3'lük bir tümör için, tümöre 25 μL GNR enjekte edildi. İlgili enjeksiyonlardan sonra cilt yüzeyindeki fazla GNR'leri sildiğinizden emin olun.
  6. Kontrol grubu fareleri için, GNR enjeksiyon grubu/grupları için kullanılan eşdeğer hacimde intratümöral steril PBS enjeksiyonu uygulayın (örneğin, 50mm3 tümör durumunda 25 μL PBS enjekte edin).
  7. İntratümöral sıcaklık probunu etanol ile dezenfekte edin ve yavaşça tümör kitlesinin ortasına yerleştirin.
  8. Cilt ülserasyonunu önlemek ve tedavi sırasında termal yaralanma riskini en aza indirmek için tümör yüzeyine yaklaşık 5 mm kalınlığında tek tip bir aloe vera jeli tabakası uygulayın.
  9. Lazerin doğrudan tümörün ortasının üzerinde hizalanacak şekilde ayarlandığından emin olun. Tümör yüzey alanını kaplamak için gerekli lazer ışını çapına göre uygun lazer yüksekliğini belirlemek için ışınım arama tablosunu (Tablo 1) kullanın. Tutarlı enerji iletimi sağlamak için lazer yüksekliğini tümör çapına göre optimize edin.
    NOT: Deneyimizde, 1,3 cm çapında bir tümör, 1,5 cm'lik bir lazer yüksekliği gerektirdi).
  10. Lazer ve termos elektrikli soğutma (TEC) kaynağını açın, ardından lazer sistemini güç kaynağına takın (üreticinin protokolüne göre uyarlanmıştır). Termos elektrikli soğutma kaynağını açın; mavi LED'in yanmasını ve lazerin TEC kaynağının sıcaklığının 30 saniye sonra 25 °C'de sabitlenmesini bekleyin.
  11. Lazer akımı çıkışını ayarlayarak 1 W/cm2 ± 0.2 W/cm2 hedef ışınımı elde etmek için ışınım arama tablosunu (Tablo 2) kullanın (lazer kaynağı düğmesini istenen akım ayar noktasına çevirin).
    NOT: Deneyimizde, 1,5 cm'lik bir lazer yüksekliği, 1,3 cm'lik bir ışın çapı ve 1.800 mA'lık bir lazer akımı, bu tümör modeli için optimize edilmiş 0.82 W/cm2'lik bir ışınım değeri ile sonuçlandı.
    Bu noktadan itibaren, lazer ameliyathanesindeki tüm kişilerin, kullanılan ışığın dalga boyu için sertifikalı lazer güvenlik gözlükleri taktığından emin olun.
  12. Lazer prosedürü sırasında cilt yüzeyi sıcaklığını izlemek için fareye yönlendirilmiş lazer platformunun yanına termo kamerayı kurun.
  13. Termokupl kayıt yazılımında yeni bir dosya oluşturun ve kayıt düğmesine tıklayın. İç tümör sıcaklığı-zaman grafiğinin gerçek zamanlı olarak görüntülendiğinden emin olun.
  14. Lazer kaynağı çıkışını etkinleştirmek için güvenlik anahtarını çevirin. Ayak pedalına basarak lazer uygulamasına başlayın.
    NOT: Bu protokolde Raspberry Pi denetleyicisi, ayak pedalı ile lazer kaynağı arasındaki dahili arayüzdür.
  15. GNR enjekte edilen tümör lazer ışınına maruz kaldığında bilgisayar yazılımının tümör sıcaklığında bir artış tespit ettiğini kontrol edin ve emin olun.
    NOT: Dahili tümör sıcaklığı, tümör modelinin boyutuna ve tipine bağlı olarak, 42 ° C'lik hedef hipertermi aralığına girmek yaklaşık 15 s ila 2 dakika sürer.
  16. İç tümör sıcaklığını tam 5 dakika boyunca hipertermik aralıkta (42 °C ile 48 °C arasında) tutun. İç tümör sıcaklığını sürekli olarak izleyin ve 48 °C'ye yaklaşırsa ayağınızı pedaldan çekin ve sıcaklığın tekrar düşmesine izin verin. Sıcaklıktaki bu düşüşü gerçek zamanlı olarak sıcaklık-zaman görüntüleme grafiğinde arayın. İç tümör sıcaklığı ~43 °C'ye düştüğünde, pedala tekrar basarak lazer uygulamasını yeniden etkinleştirin. İç tümör sıcaklığını tam 5 dakika boyunca uygun hipertermik aralıkta tutmak için bu açma/kapama lazer pedalı döngüsü modeline devam edin ve sıcaklık-zaman görüntüleme grafiğini izleyin.
    1. 5 dakikalık hipertermi periyodu boyunca herhangi bir noktada tümör sıcaklığı 42 °C'nin altına düşerse, kaybedilen zamanı telafi etmek için hipertermi süresini artırın. Örneğin, sıcaklık 20 saniye boyunca 42 °C'nin altına düşerse, ilk 5 dakikalık sürenin sonuna 20 saniye ekleyin. GNR enjekte edilen bazı tümörler 48 °C'ye ulaşmayabilir ve lazer açma/kapama döngüsü gerekli olmayacaktır.
      NOT: PBS ile intratümöral olarak enjekte edilen kontrol farelerinde, tümörler hipertermik aralığa ulaşmayacaktır. İstenirse, kontrol fareleri için lazerin açma/kapama döngüsü, beklenen hipertermik yanıt eksikliğine rağmen, GNR ile tedavi edilen grup için belirlenen aynı modeli izlemelidir.
  17. Tümör hipertermisinin sürdürülmesi boyunca, 50 °C'nin altında kalmasını sağlamak için cilt yüzey sıcaklığını sürekli izleyin. İç tümör sıcaklığından bağımsız olarak, cilt yüzeyi sıcaklığı 50 °C'ye ulaşırsa, soğumaya izin vermek için lazeri kapatın. Cilt sıcaklığının 50 °C'yi aşmasına neden olmadan iç sıcaklık istenen hipertermik aralığa ulaşamazsa, lazer gücünü azaltın ve/veya ısıyı dağıtmaya yardımcı olmak için tümör bölgesine ek aloe vera uygulayın. Hipertermik aralıkta 5 dakika sonra, lazer uygulamasını durdurmak için ayak pedalını bırakın ve dahili tümör sıcaklığının ~37 °C'ye düşmesine izin verin ve lazer güvenlik anahtarını kapatın.
    NOT: Cilt sıcaklığını 50 °C'nin altında tutarak tümör ülserasyonuna yol açabilecek cilt hasarını en aza indirmek önemlidir19.
  18. Dahili tümör sıcaklık probunu izleyerek tümör sıcaklığının yaklaşık 37 °C'ye düşmesine izin verin. Sıcaklık probunu tümörden nazikçe çıkarın ve tümör yüzeyinde kalan aloe vera jelini silin.
  19. Fareyi burun konisi anestezisinden çıkarın ve kafese geri koymadan önce hayvanın uyarılmasını izleyin. İşlemi takip eden iyileşme döneminde kafesi kısmen 37 °C'lik bir ısı yastığının üzerine yerleştirin ve farelerin vücut sıcaklıklarını düzenlemek için gerektiği gibi daha sıcak ve daha soğuk alanlar arasında hareket etmelerine izin verin. Barınma tesislerine geri göndermeden önce normal davranışlarına döndüklerinden emin olmak için her fareyi izleyin.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu GNR aracılı THT protokolünün amacı, katı tümörleri istenen hafif hipertermik aralık olan 42-48 °C'ye tutarlı ve güvenilir bir şekilde ısıtmaktır. Bu prosedürün ana adımları Şekil 1'de özetlenmiştir. Bu protokolün başarısı, belirli bir katı tümör modelinde kontrollü ve tekrarlanabilir hafif hiperterminin oluşturulmasına ve sürdürülmesine bağlıdır. Kullanılan GNR'ler, çubuk şeklindeki kristal büyümesini teşvik etmek için altın tuzunun tescilli bir yüzey aktif madde çözeltisinde indirgendiği patentli CTAB içermeyen bir yöntem kullanılarak sentezlendi. Sentez sonrası, biyouyumluluğu artırmak için doğal yüzey aktif maddeler büyük ölçüde düşük moleküler ağırlıklı PEG ile değiştirildi. Ortaya çıkan GNR'ler boyut olarak tekdüze (51.1 ± 10.8 nm x 12.2 ± 1.9 nm), 860 ± 10 nm'lik bir optimal uyarma dalga boyuna sahipti ve saptanabilir endotoksinler içermiyordu.

Uygun tümör ısıtmasını ve doğru sıcaklık takibini sağlamak için, tümörün merkezine bir intratümöral sıcaklık probu yerleştirilmelidir. Ek olarak, işlem boyunca cilt yüzeyi sıcaklığının termal görüntüleme cihazı kullanılarak izlenmesi çok önemlidir. Özellikle hacim olarak daha küçük tümörler için, intratümöral olarak enjekte edilen GNR'lerin tümörün etrafındaki peritümöral ve/veya subkutan boşluğa yayılması mümkündür. NIR ışığına maruz kaldığında, bu cildin temel fizyolojik seviyelerin üzerinde ısınmasına neden olabilir ve cilt hafif hipertermik seviyelerin (50 ° C'den fazla) üzerindeki sıcaklıklara ulaşırsa, bu, kabuklanma ve/veya ülserasyon gibi cilt hasarına yol açabilir19. Tümörün yüzeyine bir aloe vera jeli tabakası uygulamak, cilt yüzey sıcaklığını düzenlemeye ve NIR lazere maruz kalma sırasında termal hasarı önlemeye yardımcı olmak için önemli bir önlem adımıdır. Her durumda, tedavi edilen bölgenin THT'yi takip eden 48 saat boyunca ülserasyon belirtileri açısından izlenmesi önerilir. Şekil 2 , NIR lazer probu ile ilişkili olarak dahili tümör sıcaklık probu ve aloe vera jel tabakasının konumunu gösteren, tümör sıcaklık yönetimini optimize etmek için önerilen kurulumun görsel bir temsilini göstermektedir.

Bu deneysel protokolün göreceli başarısı, lazer operasyonu boyunca iç tümör sıcaklığına karşı zaman grafiğinin gözlemlenmesiyle belirlenebilir. GNR'ler intratümöral olarak enjekte edilen fareler için, tümörlerin 15 saniye ila 2 dakika içinde hafif hipertermik aralığa (42-48 °C) ısınması beklenir. İç tümör sıcaklığı hafif hipertermik aralığa girdikten sonra, iç tümör sıcaklığının 48 ° C'nin üzerine çıkmamasını sağlamak için uygun aralıkta plato yapması veya lazer uygulamasının açma/kapama döngüsünü gerektirmesi beklenir ( Şekil 3A'da gösterildiği gibi). Hafif hiperterminin 5 dakika boyunca başarılı bir şekilde sürdürülmesi olumlu bir sonuç olarak kabul edilir. PBS ile intratümöral olarak enjekte edilen fareler için, tümörlerin hipertermik aralığa ısınması beklenmez. 860 nm dalga boyunda NIR ışığına maruz kalmak, dokunun hafif hipertermik aralığa ısınmasına neden olmak için tek başına yeterli değildir ve kontrol tümörlerinin 39-40 °C civarında plato yapması beklenir. Şekil 3B , 5 dakikalık prosedür boyunca GNR ve kontrol (PBS enjekte edilmiş) fareler arasındaki dahili tümör sıcaklığına karşı zaman grafiğini göstermektedir. GNR enjekte edilen bir tümör, NIR ışığına maruz kaldığında hipertermik aralığa ulaşamazsa veya tam 5 dakika boyunca uygun hipertermik aralıkta tutulamazsa, bu negatif bir sonuç olarak kabul edilir.

Bu GNR aracılı THT protokolünün başarısını belirlemek için ek aşağı akış analizi, prosedürü takiben tümör hacmindeki değişikliklerin ölçülmesini içerir. Başarılı bir şekilde gerçekleştirilen GNR aracılı THT, hedeflenen tümör hücresi ölümüne ve antikanser immün yanıtlarının aktivasyonuna neden olur, bu da tümörün gerilemesine ve ilişkili tümör hacminin azalmasına yol açar13. Şekil 4 , iki deri altı yan murin kanseri modeli (B16-melanom ve CT26-heterotopik kolorektal kanser modeli) ve bir meme yağ yastığı murin kanseri modeli (4T1-meme kanseri) için GNR aracılı THT'yi takiben tümör hacmindeki değişiklikleri göstermektedir. Her modelde, GNR aracılı THT prosedüründen 48-72 saat sonra kontrollere kıyasla tümör hacminde önemli bir azalma belirgindir. Prosedürü takiben tümör hacmindeki azalmanın zaman çizelgesi ve büyüklüğünün, fare suşuna ve kanser modeline bağlı olarak değişmesi beklenmektedir. Tümör azalmasına ek olarak, STING-cGAS yolunda yer alan genlerin artan ekspresyonu ve hem B16F10 hem de 4T1 modellerinde dendritik hücrelerin, makrofajların ve NK hücrelerinin yukarı regülasyonu ve aktivasyonu ile karakterize edilen, GNR aracılı THT'nin 48 saati içinde güçlü bir doğuştan gelen bağışıklık tepkisi gözlemledik13. Özellikle, bilateral bir 4T1 tümör modelinde, GNR ile aktive edilmiş THT, CD8+ T hücrelerinin tedavi edilmemiş kontralateral tümörlere artan infiltrasyonu ile kanıtlandığı gibi sistemik bir bağışıklık tepkisi indükledi13. Bu bulgular, bu yaklaşımın hem doğrudan sitotoksik hem de daha geniş immünomodülatör anti-kanser etkilerini ortaya çıkarma potansiyelini daha da desteklemektedir.

Tablo 1: Işınım arama tablosu. Farklı lazer akımı çıkış ayarları (mA) ve çalışma mesafeleri (cm) için ışınım değerlerini (W/cm²) gösteren tablo. Tablo, tümör yüzeyini kaplamak için gerekli ışın çapına göre uygun lazer yüksekliğini belirlemek ve 1 W/cm2 ± 0,2 W/cm2'lik bir hedef ışınım elde etmek için kullanılır. Yeşille vurgulanan değerler, 1 W/cm2'ye yakın optimum ışınım seviyelerini gösterir. Bu ışınım tablosu LDX Lazere özeldir ve üretici tarafından sağlanmıştır. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

figure-results-1
Şekil 1: GNR aracılı THT prosedürünün grafik şeması. Bir murin modelinde deri altı yan tümörler için altın-nanoçubuk aracılı hedefe yönelik hipertermik tedavi metodolojisi. Palpe edilebilir bir tümör (yaklaşık 50mm3) ve fare anestezisi kurulduktan sonra, (1) GNR'leri 1 μg/mm3 konsantrasyonda intratümöral olarak enjekte edin, (2) tümör kitlesinin ortasına tümör içi sıcaklık probu yerleştirin, (3) tümör yüzeyine ~5 mm'lik bir aloe vera jeli tabakası uygulayın, (4) NIR lazer uygulamasına başlayın ve (5) iç tümör sıcaklığını hafif hipertermik aralıkta (42 °C-48 °C) 5 dakika koruyun. Kısaltmalar: GNR = altın nanoçubuk; THT = hedefe yönelik hipertermik tedavi; NIR = yakın kızılötesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Deney düzeneğinin görsel temsili. Merkezi olarak yerleştirilmiş bir tümör içi sıcaklık probu ve yakın kızılötesi lazer ışınına maruz kalmanın hemen altına uygulanan topikal aloe vera jel tabakası ile heterotopik kolorektal tümör taşıyan bir BALB/c faresi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Gerçek zamanlı iç sıcaklık grafikleri. Tümörün NIR lazere maruz kalması boyunca dahili sıcaklık probu tarafından kaydedilen zaman içinde (ms cinsinden) temsili dahili tümör sıcaklık profili/profilleri. (A) GNR enjekte edilen bir farede, iç tümör sıcaklığını 5 dakika boyunca hafif bir hipertermik aralıkta (42 °C-48 °C) korumak için gerekli olan açık/kapalı NIR lazer döngüsü modeli. Bu, prosedür boyunca hipotermik aralığı korumak için iç tümör sıcaklığının yakından izlenmesinin ve lazer uygulama döngüsünün önemini vurgulamaktadır. (B) GNR enjekte edilen (n = 15) ve kontrol (PBS enjekte edilen) fareler (n = 8) arasındaki iç tümör sıcaklığındaki ortalama fark, 5 dakikalık NIR lazer maruziyeti boyunca. PBS enjekte edilen farelerin tümörleri, tümörleri 42-48 ° C'lik hipertermik sıcaklıklara ulaşan GNR enjekte edilen grupla aynı uzunlukta NIR lazer maruziyeti almalarına rağmen, hafif bir hipotermik aralığa ve 39-40 ° C'ye kadar ısıtılmazlar. Kısaltmalar: GNR = altın nanoçubuk; NIR = yakın kızılötesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: GNR aracılı THT'yi takiben tümör hacim grafikleri. GNR aracılı THT, tedaviden sonraki 48-72 saat içinde birden fazla fare kanseri modelinde tümör hacminde küçülmeye neden olur. (A) GNR aracılı THT'yi takiben 4T1 (meme kanseri) modelinde tümör hacmi ölçümleri (n= 24 PBS, n = 28 THT). (B) GNR aracılı THT'yi takiben B16-F10 (Melanom) modelinde tümör hacmi ölçümleri (n = 19 PBS, n = 23 THT). (C) GNR aracılı THT'yi takiben CT26 (kolorektal kanser) modelinde tümör hacmi ölçümleri (n = 9 PBS, n = 9 THT). Tedaviyi takiben 48-72 saat içinde tümör hacmi büyümesinde azalma veya yavaşlama, pozitif bir sonucun göstergesidir. CT26 modeli için '24 saat önce' zaman noktasında tümör hacmi verileri birleştirilmemiştir - değerler benzer ve örtüşmektedir. Hata çubukları SEM'i temsil eder. * p < 0.05. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokol içindeki kritik adımlar
Bu GNR aracılı THT tekniğinin tasarımı ve uygulanması, katı tümörlerin in vivo olarak hedeflenen, doğru, düşük kaynak yoğun ve tekrarlanabilir ısıtılmasını gerçekleştirme yeteneği sağlar. Bu sistemin önemli bir avantajı, çevredeki dokuya zarar vermeden lokalize tedaviye olanak tanıyan mekansal hassasiyeti ve termal kontrolünde yatmaktadır. Başarılı fototermal dönüşüm için kritik adımlardan biri, kullanılan GNR'ler ile NIR ışık kaynağı arasındaki uyumluluğun sağlanmasıdır. Bu çalışmada, 860 nm'de absorpsiyon için optimize edilmiş GNR'ler kullandık. Bu dalga boyunda, ışık dokuya etkili bir şekilde nüfuz eder ve GNR içeren tümörlerde seçici olarak ısı üretilirken, çevredeki sağlıklı doku fizyolojik sıcaklığa20 yakın kalır. Ek olarak, bu protokolü gerçekleştirirken, hafif bir hipertermik aralığa ulaşıldığını ve tedavinin tutarlı bir şekilde verildiğini doğrulamak için iç tümör sıcaklığının doğru bir şekilde gerçek zamanlı izlenmesi çok önemlidir. Şekil 2'de gösterildiği gibi bir tümör içi sıcaklık probunun yerleştirilmesi, Şekil 3B'de görüldüğü gibi tümör termal dozunun gerçek zamanlı izlenmesine izin verir.

Tekniğin sorun giderme
İn vivo modele ve tümör tipine bağlı olarak, sonuçları optimize etmek için protokolde küçük değişiklikler gerekebilir. Örneğin, Şekil 4'te atıfta bulunulan murin melanomu, kolorektal kanser ve meme kanseri modellerinde, GNR-tümör hacim konsantrasyonunu 1 μg/mm3'te optimize ettik. Ayrıca, bu enjeksiyon ve tedavi zamanlaması 0,5, 1, 4, 18 veya 24 saatlik daha uzun aralıklarla karşılaştırıldığında tedavi etkinliğinde hiçbir fark gözlenmediğinden, GNR enjeksiyonunun hemen ardından NIR lazer maruziyeti gerçekleştirerek bu protokolün verimliliğini optimize ettik. Tümör patofizyolojisi veya vücut lokalizasyonu açısından model(ler)imizden farklı olan tümör modelleri için, farklı bir zaman noktasında enjekte edilen farklı bir GNR konsantrasyonu, hipertermik aralığa ulaşmak ve/veya bu aralıkta kalmak için optimal olabilir. Bu işlemi takiben, tümör hacmindeki değişiklikleri kaydetmek için günlük tümör hacmi ölçümleri yapılmalıdır. Tümörün 2-3 gün içinde gerilemesi tedavi başarısının olumlu bir göstergesidir.

Lazer protokolünün doğası gereği, yüzeysel cilt yanıkları ve ülserasyonlar, özellikle pigmentli veya hassas ciltlerde potansiyel bir risk faktörüdür. Kullanılan in vivo modele bağlı olarak, cilt yüzeyi ile iç tümör sıcaklığı arasında uygun bir denge sağlamak için lazer akımı çıkışında ayarlamalar gerekli olabilir. Örneğin, ciltteki su içeriği ve melanin pigmentindeki farklılıklar nedeniyle21, C57Bl/6 farelerinin cilt sıcaklığını 50°C'nin altında tutmak için BALB / c farelerine kıyasla daha düşük bir akımda NIR lazer uygulaması gerektirdiğini bulduk. Lazer akımı çıkışını değiştirirken, lazer ışını çapıyla tümör yüzeyinin çoğunu kaplarken 1 W/cm2 ± 0,2 W/cm2'lik bir hedef ışınımı korumak için lazer yüksekliğinin uygun şekilde ayarlandığından emin olun. Alternatif olarak, ilave aloe vera jeli uygulamak, iç tümör sıcaklığını büyük ölçüde etkilemeden işlem sırasında cilt sıcaklığının düşürülmesine yardımcı olabilir. Gerekli modifikasyonlarla uygun cilt yüzeyi sıcaklığının korunması, bu tedavinin potansiyel bir yan etkisi olarak gözlemlenen ülserasyon riskini en aza indirmek için önemlidir. Aloe vera jel tabakasında değişiklik yaparken, NIR lazer ışınının uygulanmasını anlık olarak durdurduğunuzdan emin olun. Lazer protokolünü takip eden günlerde, farelerin olası yanıklar ve/veya ülserasyonlar açısından yakından izlendiğinden emin olun.

GNR aracılı THT'nin sınırlamaları
Bu prosedürü gerçekleştirirken ele alınması gereken önemli bir güvenlik endişesi, lazer işlemi sırasında kullanılan ışığın dalga boyu için sertifikalı lazer güvenlik gözlüklerinin kullanılmasıdır. Lazer sistemi, yanlışlıkla etkinleştirmeyi önlemek için anahtarlı kilitleme gibi yerleşik güvenlik özelliklerine sahip olmalıdır. Bununla birlikte, yansıyan veya saçılan ışınlardan kaynaklanan potansiyel maruziyete karşı koruma sağlamak için ek kişisel koruyucu ekipman - özellikle uygun lazer güvenlik gözlükleri - gereklidir. Göz, bir lazer ışınından kaynaklanan yaralanmalara karşı en savunmasız olanıdır ve retina yanıkları NIR lazerler22 ile ilgili büyük bir endişe kaynağıdır. Son olarak, lazeri çalıştıran tüm personelin uygun eğitime sahip olması gerekir.

Bu protokol, sistem toksisitesini en aza indirmek, karaciğer, dalak ve böbrekler gibi hedef dışı organlarda nanopartikül dağılımını sınırlamak ve hipertermik tedavinin doğruluğunu, etkinliğini ve güvenlik profilini geliştirmek için sistemik bir enjeksiyon yerine GNR'lerin intratümöral enjeksiyonunu tercih etti. Bununla birlikte, bu protokol GNR'lerin intratümöral enjeksiyonlarını gerektirdiğinden, bazı tümör modellerinde hipertermiyi indükleme kabiliyeti sınırlı olabilir. Şimdiye kadar, her ikisi de cilt yüzeyine yakın yerleşimli ve GNR enjeksiyonu ve NIR ışığına maruz kalma açısından kolay erişilebilir olan cilt altı ve meme yağ yastıkçığı tümörlerinde bu yöntemin etkinliğini kanıtladık. Periton gibi vücut boşluklarında bulunan tümörleri hedeflemede veya birincil tümörün metastatik bölgelerini hedeflemeye çalışırken lojistik zorluklar ortaya çıkabilir. Bu protokolde yapılacak potansiyel bir değişiklik, nanopartiküllerin NIR maruziyeti23'ten önce tümör bölgelerinde verimli birikimi sağlamak için tasarlanması veya modifiye edilmesi koşuluyla, sistemik GNR enjeksiyonunu içerebilir. Ek olarak, intratümöral GNR enjeksiyonunun tümörde eşit olmayan nanopartikül dağılımına neden olarak ısıtma homojenliğini etkilemesi mümkündür. Bununla birlikte, bu GNR aracılı THT protokolünün birincil sonucunun, anti-kanser bağışıklığını aktive etmek için ICD'nin indüklenmesi olduğu göz önüne alındığında, tek tip olmayan tümör ısıtmasının tedavi etkinliği derecesi üzerinde büyük bir etkiye sahip olması beklenmemektedir. Son olarak, tümör içi sıcaklık okuması, sıcaklık probunun tümör içindeki konumuna bağlıdır. Tümörün ortası, probun genel ortalama tümör sıcaklığını doğru bir şekilde yansıtması için en uygun yerdir. Bununla birlikte, tümör boyutu ve/veya şekli nedeniyle merkezi bir prob yerleştirilmesini sağlamak ve/veya onaylamak zorsa, farklı konumlarda iki veya daha fazla sıcaklık probu kullanılarak kayıt yapılması gerekebilir.

Mevcut yöntemlere göre önemi
Bu makale, katı ve yüzeysel olarak erişilebilir tümörlerde GNR aracılı THT için kapsamlı, optimize edilmiş ve tekrarlanabilir bir protokol sunmaktadır. Hipertermiyi indüklemenin diğer yöntemleriyle karşılaştırıldığında, bu teknik, düşük kaynak yoğun, uzamsal olarak hassas ve minimum sistemik toksisite ile ilişkili olması gibi belirgin avantajlar sunar. GNR'lerin fototermal terapi için kullanımı iyi belgelenmiş olsa da, bu protokollerin nasıl uygulandığı konusunda literatürde önemli farklılıklar bulunmaktadır. NIR ışınlamasının süresi, termal izleme araçlarının seçimi (termokupl probları veya termal kamera), GNR çözeltisinin hazırlanması ve GNR enjeksiyon yöntemleri gibi temel prosedür unsurları genellikle çalışmalar arasında farklılık gösterir.

Örneğin, diğer yöntemler bizimkine benzer sonuçlar elde etmek için daha uzun (20 dakika)24 veya çoklu doz (4 x 15 dakika)25 NIR maruziyeti gerektiriyordu. Ayrıca, çoğu protokol ya termokupl probları ya da termal kameralar kullanır, ancak nadiren her iki aracı da birleştirir26,27. Ek olarak, GNR çözeltileri genellikle CTAB 28,29,30 ile hazırlanır ve uygulama yöntemleri sistemik enjeksiyonlar 24,30 ve tümör içi enjeksiyonlar31 arasında değişir ve bu da TME içindeki dağılımlarını/konumlarını etkileyebilir. Bu nedenle, GNR aracılı THT için mevcut protokolleri optimize eden ve geliştiren kapsamlı ve uyarlanabilir bir yöntem henüz oluşturulmamıştır.

Protokolümüz, literatürdeki en etkili ve tekrarlanabilir bileşenleri tek ve standart bir yaklaşıma entegre ederek bu eksiklikleri giderir. Özellikle, hassas ve güvenli ısı dağıtımı sağlamak için çift termal izleme (hem termokupl hem de termal kamera) kullanıyoruz; tümör lokalizasyonunu en üst düzeye çıkarmak ve toksisiteyi en aza indirmek için CTAB içermeyen GNR'lerin tümör içi enjeksiyonunu kullanıyoruz; Ve yüzeysel cilt yanıklarına karşı koruma sağlamak için aloe vera jeli kullanımını dahil ediyoruz. Ek olarak, bu protokolde kullanılan GNR'ler, 860 nm NIR'de verimli fototermal dönüşüm için optimize edilmiştir ve hafif hipertermik sıcaklıkların saniyeler içinde hızlı bir şekilde elde edilmesine olanak tanır. Bu sıcaklık aralığına ulaşıldığında, immünojenik hücre ölümünü ve immün aktivasyonu indüklemek için yeterli olduğunu belirlediğimiz 5 dakikalık tedavi süresi boyunca stabil bir şekilde korunabilir. 860 nm NIR dalga boyunun kendisi de doku penetrasyon derinliği ile güvenlik arasında uygun bir denge sağlayarak bu yöntemin terapötik penceresini daha da geliştirir.

Özetle, protokolümüz mevcut GNR aracılı hipertermi yaklaşımlarına konsolide, doğrulanmış ve biyolojik olarak etkili bir alternatif sunmakta ve klinik öncesi kanser araştırmaları ve kombinasyon tedavisi geliştirmeye uygun, tamamen ayrıntılı ve uyarlanabilir bir yöntem sağlayarak bu alandaki kritik bir boşluğu doldurmaktadır.

Tekniğin gelecekteki uygulamaları
Son olarak, bu protokol çeşitli kanser tedavileriyle kolayca birleştirilebilse de, THT'nin anti-kanser bağışıklığını uyarma konusundaki doğal yeteneği göz önüne alındığında, immünoterapilerin etkinliğini arttırmak için özellikle uygundur. GNR aracılı THT, immünojenik hücre ölümünü indükleyerek, tümöre özgü antijenlerin salınımını teşvik ederek ve tedaviden sonraki 48 saat içinde TME'ye alınan doğuştan gelen bağışıklık hücrelerinin sayısını artırarak, immünolojik olarak soğuk tümörlerin bağışıklık sistemi tarafından tespit edilmeye ve saldırıya karşı 'yeniden duyarlı hale getirilmesine' yardımcı olur13. Sonuç olarak, bu teknik, daha önce direnç geliştirmiş olabilecek kanserlerin tedavisinde immünoterapilerin etkinliğini artırmak için kullanılabilir ve kanser tedavisi engellerinin ve hastalığın ilerlemesinin üstesinden gelmek için potansiyel bir strateji sunar13.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, bu çalışmanın Sona Nanotech Inc.'den fon aldığını beyan eder. Fon sağlayıcının çalışmaya şu şekilde katılımı vardı: araştırma için gerekli malzeme ve kaynaklar için finansman sağlamanın yanı sıra genel proje hedeflerini desteklemek. Carman Giacomantonio, Sona Nanotech Inc.'in Baş Tıbbi Görevlisidir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, Sona Nanotech Inc.'in mali desteğini minnetle kabul ederler. Ayrıca Sidney Crosby Vakfı'na, Dr. Mark Johnston'a, Dalhousie Üniversitesi Cerrahi Bölümü'ne, Cibran ve Jamile Ramia QEII Cerrahi Onkoloji Araştırma Vakfı Sağlık Bilimleri Merkezi Başkanı'na ve DMRF Sermaye Ekipmanı Hibesi'ne cömert katkılarından dolayı teşekkür ederiz. Film ekipmanı sağladıkları ve sahne yönetmenliğine yardımcı oldukları için Rick ve Lindsay Clark'a teşekkür ederiz. Şekil 1 https://BioRender.com ile oluşturulmuştur.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0.25% Tripsin Thermo Fisher Bilimsel25200-056
10 mL ŞeritFisher Bilimsel7200574
15 mL Falcon tüpüCorning352095
1 mL şırıngaBD Biyolojik Bilimler3331431
28 gr iğneBD Biyolojik Bilimler1298811
4T1 meme kanseri hücre dizisiAmerikan Tipi Kültür KoleksiyonuCRL-2539 (İngilizce)
5 mL ŞeritFisher Bilimsel7200573
50 mL Falcon tüpüFisher Bilimsel14-432-22
%70 EtanolTicari Alkoller36195
Aloe vera jeliYaşam Markası57800985495
B16-F10 melanom hücre dizisiAmerikan Tipi Kültür KoleksiyonuCRL-6475 (İngilizce)
Biyolojik renderBiyolojik RenderYOK
Bigüvenlik kabiniNuaireYOK
Sınıf 4 lazer güvenlik gözlüğü Lazer görüşüF22. P5P18.5000P5P18 filtreli bir P22 çerçevesi kullandık
CO2 inkübatör (37 &derece; C, %5 CO2)NuaireYOK
Corning 1-200 µ L Evrensel Uyumlu Raflı Pipet  Ipuç -larıCorning4865
Corning Filtreli Pipet  İpuçları, 30 µ LFisher Bilimsel07-200-265
CT26 murin kolorektal hücre hattıAmerikan Tipi Kültür KoleksiyonuCRL-2638 (İngilizce)
DPBS'ninThermo Fisher Bilimsel10010-049
Eppendorf tüpleriThermo Fisher Bilimsel3451
Dişi BALB/c fareleriCharles River Laboratuvarları (Montreal, Kanada)028
Dişi C57Bl/6Charles River Laboratuvarları (Montreal, Kanada)027
Fetal Sığır SerumuThermo Fisher bilimsel davetli12483020
GNRSona Nanoteknoloji A.Ş.YOK
Tümör içi sıcaklık probuOMEGAHYP1-30-1/2-T-G-60-SMP-MTermokupl Probu Modeli HYP-1
IsoTip 1000 µ L Evrensel Filtreli Pipet  Ipuç -larıCorning4809
LDX Lazer (Model: LDX- 3520-860-HHLFC)MinnetronixYOKMaksimum 4600 mA ayar noktasına sahip lazer akımı
Optixcare Göz YağıAventixYOK
Penisilin-StreptomisinThermo Fisher Bilimsel15140148
Prizma 10.6.0Grafik Tuş TakımıYOK
RPMI 1640 OrtaThermo Fisher Bilimsel11875119
TC-08 Termokupl Veri Kaydedici Yazılımı Pico TeknolojisiPicoLog V5.25.3
Termal kamera HIKmicroEA-1086922 (İngilizce)
Doku Kültürü Kabı 100 x 20 mmFisher Bilimsel877222
Tripan Mavisi Çözeltisi %0,4Thermo Fisher Bilimsel15250061
Tümör ölçüm kumpası Giles bilimselMitutoyo şirketi500-321

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Crezee, J., Franken, N. A. P., Oei, A. L. Hyperthermia-based anti-cancer treatments. Cancers (Basel). 13 (6), 1-4 (2021).
  2. Zhang, Y., Li, Z., Huang, Y., Zou, B., Xu, Y. Amplifying cancer treatment: advances in tumor immunotherapy and nanoparticle-based hyperthermia. Front Immunol. 14, 1258786(2023).
  3. Huang, X., Lu, Y., Guo, M., Du, S., Han, N. Recent strategies for nano-based PTT combined with immunotherapy: from a biomaterial point of view. Theranostics. 11, 7546-7569 (2021).
  4. Yi, G. Y., Kim, M. J., Kim, H. I., Park, J., Baek, S. H. Hyperthermia treatment as a promising anti-cancer strategy: therapeutic targets, perspective mechanisms and synergistic combinations in experimental approaches. Antioxidants (Basel). 11, 625(2022).
  5. Hajebi, S., et al. Advances in stimuli-responsive gold nanorods for drug-delivery and targeted therapy systems. Biomed Pharmacother. 180, 117493(2024).
  6. Cancino-Bernardi, J., et al. Gold-based nanospheres and nanorods particles used as theranostic agents: an in vitro and in vivo toxicology studies. Chemosphere. 213, 41-52 (2018).
  7. Cheng, D., et al. Dual-responsive nanohybrid based on degradable silica-coated gold nanorods for triple-combination therapy for breast cancer. Acta Biomater. 128, 435-446 (2021).
  8. Qin, H., et al. Biosynthesized gold nanoparticles that activate Toll-like receptors and elicit localized light-converting hyperthermia for pleiotropic tumor immunoregulation. Nat Commun. 14, 5178(2023).
  9. Wu, L., et al. Enzyme-responsive multifunctional peptide coating of gold nanorods improves tumor targeting and photothermal therapy efficacy. Acta Biomater. 86, 363-372 (2019).
  10. Chatterjee, D. K., Diagaradjane, P., Krishnan, S. Nanoparticle-mediated hyperthermia in cancer therapy. Ther Deliv. 2, 1001-1014 (2011).
  11. Scutigliani, E. M., Liang, Y., Crezee, H., Kanaar, R., Krawczyk, P. M. Modulating the heat stress response to improve hyperthermia-based anticancer treatments. Cancers (Basel). 13 (6), 1-20 (2021).
  12. Liu, Y. T., Sun, Z. J. Turning cold tumors into hot tumors by improving T-cell infiltration. Theranostics. 11, 5365-5386 (2021).
  13. Kennedy, B. E., et al. Targeted intra-tumoral hyperthermia using uniquely biocompatible gold nanorods induces strong immunogenic cell death in two immunogenically 'cold' tumor models. Front Immunol. 15, 1512543(2025).
  14. Chen, H., et al. Depleting tumor-associated Tregs via nanoparticle-mediated hyperthermia to enhance anti-CTLA-4 immunotherapy. Nanomedicine (Lond). 15, 77-92 (2020).
  15. Oei, A. L., et al. Enhancing the abscopal effect of radiation and immune checkpoint inhibitor therapies with magnetic nanoparticle hyperthermia in a model of metastatic breast cancer. Int J Hyperthermia. 36, 47-63 (2019).
  16. Mouratidis, P. X. E., Costa, M., Rivens, I., Repasky, E. E., Ter Haar, G. Pulsed focused ultrasound can improve the anti-cancer effects of immune checkpoint inhibitors in murine pancreatic cancer. J R Soc Interface. 18, 20210266(2021).
  17. Liu, Y., et al. Plasmonic gold nanostar-mediated photothermal immunotherapy for brain tumor ablation and immunologic memory. Immunotherapy. 11, 1293-1302 (2019).
  18. Cano-Mejia, J., et al. Prussian blue nanoparticle-based photothermal therapy combined with checkpoint inhibition for photothermal immunotherapy of neuroblastoma. Nanomedicine. 13, 771-781 (2017).
  19. Okuyama, S., et al. Avoiding thermal injury during near-infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT): the importance of NIR light power density. Oncotarget. 8, 113194-113201 (2017).
  20. Ruggiero, E., Alonso-de Castro, S., Habtemariam, A., Salassa, L. Upconverting nanoparticles for the near infrared photoactivation of transition metal complexes: new opportunities and challenges in medicinal inorganic photochemistry. Dalton Trans. 45, 13012-13020 (2016).
  21. Sabino, C. P., et al. The optical properties of mouse skin in the visible and near infrared spectral regions. J Photochem Photobiol B. 160, 72-78 (2016).
  22. Lasers in health care. , Canadian Centre for Occupational Health and Safety. Available: https://www.ccohs.ca/oshanswers/phys_agents/lasers.html#section-6-hdr (2021).
  23. Kesharwani, P., et al. Gold nanoparticles and gold nanorods in the landscape of cancer therapy. Mol Cancer. 22, 98(2023).
  24. Zhang, Z., et al. Near infrared laser-induced targeted cancer therapy using thermoresponsive polymer encapsulated gold nanorods. J Am Chem Soc. 136, 7317-7326 (2014).
  25. Liu, X., et al. antigen-trapping gold nanorods elicit anticancer immunity against abscopal tumors by photothermal therapy-induced in situ vaccination. Biomaterials. 275, 120921(2021).
  26. Schuh, E. M., Portela, R., Gardner, H. L., Schoen, C., London, C. A. Safety and efficacy of targeted hyperthermia treatment utilizing gold nanorod therapy in spontaneous canine neoplasia. BMC Vet Res. 13, 294(2017).
  27. Dickerson, E. B., et al. Gold nanorod assisted near-infrared plasmonic photothermal therapy (PPTT) of squamous cell carcinoma in mice. Cancer Lett. 269, 57-66 (2008).
  28. Huff, T. B., et al. Hyperthermic effects of gold nanorods on tumor cells. Nanomedicine (Lond). 2, 125-132 (2007).
  29. Ghafarkhani, M., et al. Mild hyperthermia induced by gold nanorods acts as a dual-edge blade in the fate of SH-SY5Y cells via autophagy. Sci Rep. 11, 23984(2021).
  30. Gong, B., et al. Thermo-responsive polymer encapsulated gold nanorods for single continuous wave laser-induced photodynamic/photothermal tumour therapy. J Nanobiotechnology. 19, 41(2021).
  31. Hainfeld, J. F., et al. Gold nanoparticle hyperthermia reduces radiotherapy dose. Nanomedicine. 10, 1609-1617 (2014).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Fototermal Terapintrat m ral EnjeksiyonGer ek Zamanl S cakl kLazer I nlamasT m r Hacmi l mKanser mm noterapisi

İlgili makaleler