Yöntem makalesi

İlaç Taraması için Üç Boyutlu Beyin Tümörü Sferoidlerinin Metabolik Profillemesindeki Gelişmeler

DOI:

10.3791/68833

⸱

5 Eylül 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Medical Innovation and Research, Peking University Third Hospital, 2Cancer Center of Peking University Third Hospital, 3Biobank, Peking University Third Hospital

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, üç boyutlu (3D) glioma sferoidlerini ve hücre dışı akı analizi yoluyla görüntülemeye dayalı normalizasyonu entegre eden bir metabolik profilleme platformu oluşturuyoruz. Bu yaklaşım, ilaç tedavilerine tümör metabolik yanıtlarının daha doğru değerlendirilmesini sağlar ve potansiyel direnç mekanizmaları hakkında bilgi sağlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Beyin tümörleri, özellikle gliomlar, agresif doğaları, karmaşık tümör mikro çevreleri ve geleneksel tedavilere dirençleri nedeniyle tedavi edilmesi zordur. Geleneksel iki boyutlu (2D) hücre kültürleri genellikle gerçek tümör ortamını kopyalamakta başarısız olur ve bu da ilaç etkinliğinin yanlış tahminlerine yol açar. Tipik olarak 2D kültürlerde gerçek zamanlı metabolik analiz için kullanılan hücre dışı akı analizi teknolojisi, hücre dışı asitleşme oranı (ECAR) ve oksijen tüketim oranı (OCR) gibi temel metabolik parametreleri ölçerek hücresel metabolizma hakkında bilgi sağlar. 3D modellerin kullanımı, in vivo tümör ortamını daha doğru bir şekilde taklit ettikleri için önemli bir ilerlemeyi temsil eder. Hücre dışı akı analizörü, üç boyutlu (3D) glioma hücre modellerine uyarlandı ve glikoliz ve oksidatif fosforilasyon dahil olmak üzere kritik metabolik yolların fizyolojik olarak daha ilgili bir bağlamda analiz edilmesini sağladı.

U87 hücreleri, 96 oyuklu düşük bağlantılı bir plakada uygun yoğunluklarda tohumlandı ve 5 gün boyunca kültürlendi. 5. günde, yüksek içerikli görüntüleme ile 3D sferoid oluşumu gözlendi. Başarılı bir şekilde oluşturulan sferoidler daha sonra metabolik analiz için poli-L-lizin ile kaplanmış bir metabolik tahlil plakasına aktarıldı. Bu ölçümlerin doğruluğunu artırmak için, yüksek içerikli görüntüleme sistemleri, 3D hücre boyutunu değerlendirerek hücre dışı akı verilerinin hassas bir şekilde normalleştirilmesine olanak tanır ve hücre boyutundaki farklılıklardan kaynaklanan metabolik varyasyonları en aza indirir. Bu entegre yaklaşım, glioma hücrelerinin ilaç tedavilerine metabolik yanıtlarının daha güvenilir bir analizini sağlayarak ilaç direncinin potansiyel mekanizmalarını ortaya çıkarır. Sonuç olarak, bu metodoloji gliomların metabolik dinamikleri hakkında değerli bilgiler sunar ve yeni, klinik olarak ilgili terapötik stratejilerin geliştirilmesini destekler.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yaygın ve agresif bir beyin tümörü formu olan gliomlar, hızlı ilerlemeleri, oldukça heterojen tümör mikro çevreleri ve geleneksel tedavilere belirgin dirençleri nedeniyle önemli klinik zorluklar oluşturmaktadır1. Bu karmaşıklıklar, terapötik değerlendirmelerin doğruluğunu artırmak için fizyolojik olarak daha ilgili deneysel modeller gerektirir. Geleneksel iki boyutlu (2D) hücre kültürü sistemleri, in vivo tümör mimarisini ve hücre-hücre etkileşimlerini2 özetlemekte başarısız olur, bu da genellikle ilaç etkinliği ve tümör biyolojisi3 ile ilgili yanıltıcı sonuçlara yol açar.

Bu sınırlamaları ele almak için, üç boyutlu (3D) tümör modelleri, tümörlerin yapısal ve fonksiyonel özelliklerini in vivoolarak taklit ederek gelişmiş biyolojik alaka düzeyi sunan üstün bir alternatif olarak ortaya çıkmıştır 4,5. Aynı zamanda, metabolik yeniden programlama, glioma ilerlemesinin ve tedavi direncinin ayırt edici bir özelliği olarak giderek daha fazla kabul edilmektedir 6,7,8. Hücre dışı akı analizi, hücre dışı asitleşme hızı (ECAR, esas olarak glikolitik laktat üretiminden proton akışını ölçme) ve oksijen tüketim oranı (OCR, oksidatif fosforilasyonda mitokondriyal oksijen kullanımının ölçülmesi) gibi temel metabolik parametrelerin gerçek zamanlı ölçümü için yaygın olarak benimsenen bir teknik haline gelmiştir ve glikolitik ve oksidatif fosforilasyon yolları hakkında kritik bilgiler sağlar 9,10,11.

Bu çalışmada, hücre dışı akı analizi, 3D glioma sferoidlerini analiz etmek için uyarlandı ve in vivo tümör koşullarına çok benzeyen bir bağlamda metabolik yolların araştırılmasını sağladı. U87 glioma hücreleri, şeffaf yuvarlak tabanlı ultra düşük bağlantılı 96 oyuklu plakalarda oyuk başına 1.500 hücre yoğunluğunda tohumlandı ve sferoid oluşumunu kolaylaştırmak için% 5 CO2 ile% 37 ° C'de 5 gün boyunca kültürlendi. Sferoid morfolojisini doğrulamak ve hücre boyutunu değerlendirmek için yüksek içerikli görüntüleme kullanıldı. Metabolik analizden önce, yaklaşık 220 μm çapında yoğun ve dairesel 3D hücre sferoidleri, yapışma ve ölçüm stabilitesini sağlamak için poli-L-lizin ile önceden kaplanmış test plakalarına aktarıldı. Daha da önemlisi, metabolik verilerin küresel boyut temelinde normalleştirilmesi, değişkenliği azaltan ve veri güvenilirliğini artıran entegre yüksek içerikli görüntüleme yoluyla gerçekleştirildi.

3D kültür, hücre dışı akı analizi teknolojisi ve görüntülemeye dayalı normalizasyonu birleştiren bu entegre platform, terapötik müdahalelere glioma metabolik yanıtlarının daha doğru bir şekilde değerlendirilmesini sağlar. Bu çalışma, ilaç direncinin metabolik temellerini incelemek için sağlam bir çerçeve sağlamakta ve gliomlar için daha etkili, klinik olarak çevrilebilir tedavi stratejilerinin geliştirilmesine katkıda bulunmaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: Tüm reaktiflerin ve sarf malzemelerinin tüm özellikleri Malzeme Tablosunda ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

1. 2D hücre kültürü

  1. U87 hücrelerini steril koşullar altında% 10 (h / h) fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş minimum esansiyel ortamda (MEM) tutun. Hücreler %80 birleşmeye ulaştığında standart geçiş prosedürlerini gerçekleştirin.
    NOT: Kültür süreci boyunca, hücre durumunu yakından izleyin ve anormal büyüme veya morfolojik değişiklikler sergileyen hücreleri sonraki deneylerden hariç tutun.
  2. U87 hücrelerini 10 cm'lik hücre kültürü kaplarına tohumlayın ve 37 °C'de %5 (h/h) CO2 ve %90-95 bağıl nem ile steril bir hücre kültürü inkübatöründe inkübe edin.
    NOT: Optimum büyüme koşullarını korumak için ortam düzenli olarak değiştirilmelidir.

2. 3D hücresi sferoid oluşumu

  1. Deneysel hazırlık
    1. Deneysel prosedürlere başlamadan önce Şekil 1'deki tüm iş akışını gözden geçirin.
      DİKKAT: Hücre sağlığını sağlamak ve kontaminasyonu önlemek için deney boyunca aseptik tekniklere sıkı sıkıya bağlı kalın.
  2. Hücre ayrışması ve sayımı
    1. Harcanan ortamı hücre kültürü kabından çıkarın ve U87 hücrelerini 9 mL fosfat tamponlu salin (PBS) (yıkama başına 3 mL) ile üç kez yıkayın. Tüm biyoaktif malzemeleri etkisiz hale getirmek için kullanılmış reaktifleri %20-25 (h/h) ağartıcı solüsyona atın.
    2. Tabağa 1 mL tripsin çözeltisi ekleyin ve 37 ° C'de 2-3 dakika inkübe edin. Tüm hücreler mikroskobik gözlem altında ayrıldıktan sonra 37 ° C'ye önceden ısıtılmış% 10 FBS içeren 2 mL DMEM ile tripsini nötralize edin.
    3. Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın ve 200 × g'da 3 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve hücre peletini% 10 FBS ile desteklenmiş 1 mL DMEM içinde yeniden süspanse edin. Düzgün bir hücre süspansiyonu sağlamak için hücreleri nazikçe pipetleyin. Daha sonra bir hemositometre veya otomatik hücre sayacı ile sayın ve ilk hücre sayımını kaydedin.
      NOT: Mekanik hasarı önlemek için yıkama ve ortam ekleme sırasında hücreleri nazikçe tutun. Pipetleme kuvveti, hücre canlılığını ve sayım doğruluğunu etkileyebilecek kabarcık oluşumunu önlemek için kontrol edilebilir.
  3. Hücre süspansiyonu seyreltme
    1. Kullanılmayan ortamı önceden 37 °C'ye ısıtın. Hücre süspansiyonlarını oda sıcaklığında (RT; 25 ± 2 °C) 30 dakika tutun.
    2. İlk hücre sayımına dayanarak, hücre süspansiyonunu% 10 FBS içeren DMEM ile 20 mL'lik bir nihai hacme seyreltin ve yaklaşık 200.000 hücre sağlayın.
      NOT: Son seyreltmeden önce, çökelmeyi önlemek için hücre süspansiyonunu hafifçe pipetleyin. Kullanılmayan ortam 37 ° C'de tutuldu ve hücre süspansiyonları RT'de inkübe edildi. Kuyucuk başına 1.500 hücreli 96 kuyu tohumlanırsa, fazlalığı hesaba katmak için toplam 22 mL'lik bir hacim hazırlandı. Seyreltilmiş hücre süspansiyonu, 50 mL'lik bir steril santrifüj tüpüne aktarıldı ve iyice karıştırıldı.
  4. Ultra düşük ataşmanlı 96 oyuklu plakalarda hücre tohumlama
    1. Son hücre süspansiyonunu 200 μL'lik bir pipetle iyice karıştırın. Kenar boyunca şeffaf yuvarlak tabanlı ultra düşük ataşmanlı 96 oyuklu plakanın her bir oyuğuna yavaşça 200 μL süspansiyon (1.500 hücre / kuyucuk) ekleyin.
      NOT: Verimlilik için çok kanallı bir pipet kullanmayı düşünün.
    2. Kontaminasyonu önlemek için tüm kuyucuklar dolduktan sonra kalan süspansiyonu atın.
  5. Santrifüj
    1. Santrifüjleme sırasında sızıntıyı önlemek için plakayı parafilm ile sıkıca kapatın. Karışımı 200 × g'da 2 dakika boyunca santrifüjleyin ve her bir kuyucuğun dibindeki hücreleri peletleyin.
    2. Plakayı santrifüjden çıkarın, parafilmi dikkatlice çıkarın ve plakayı 37 °C,% 5 CO2 inkübatöre yerleştirin.

3. Metabolik tahlil plakalarının Poli-D-Lizin kaplaması

NOT: Metabolik tahlil mikroplakası, hücre dışı akı analizi sırasında hücre sferoid yapışması için tasarlanmış özel bir mikroplakadır.

  1. 5 mg poli-D-lizini 50 mL steril suda çözerek bir kaplama çözeltisi hazırlayın. İyice karıştırın.
  2. Metabolik tahlil plakasının her bir oyuğuna 30 μL kaplama çözeltisi ekleyin. Fazla çözeltiyi hafifçe sallayarak veya aspire ederek kabarcıkların olmadığından emin olun.
  3. Plakayı inkübe edin ve RT'de 20 dakika boyunca örtün. Kaplama solüsyonunu aspire edin ve kuyuları iki kez 200 μL steril su ile yıkayın.
  4. Plakayı en az 30 dakika havayla kurutun ve ardından kaplamayı stabilize etmek için 30 dakika boyunca CO2 olmadan 37 ° C'de ısıtın.
  5. Her oyuğa 175 μL önceden ısıtılmış ortam ekleyin ve plakayı hücre sferoid transferi için hazır olana kadar CO2 içermeyen bir inkübatörde 37 ° C'de tutun.

4. Küresel büyümenin izlenmesi

  1. Sferoid plakaları 5 günlük kültürden sonra yüksek içerikli bir görüntüleme sistemine aktarın.
  2. Konfigürasyon görüntüleme parametreleri: Sıcaklığı 37 °C'ye ve CO%2 ila %5'e ayarlayın ve plaka tipini, kanalları ve odak aralığını ayarlayın.
  3. 10x objektifli konfokal bir mikroskop ve bir görüntüleme yazılımı aracılığıyla küresel görüntüler elde edin.
  4. Sağlam sferoidler içeren kuyuları tanımlayın (örneğin, Şekil 2A-C) ve transfer için konumlarını kaydedin. Düzensiz sferoidlere sahip kuyuları hariç tutun (örneğin, Şekil 2D)."

5. Sferoid tedavisi

NOT: Metabolik yanıtları değerlendirmek için matür 3D sferoidlere ilaç tedavisi uygulandı.

  1. Küresel grup ataması
    1. Sağlam sferoidleri iki gruba atayın:
      Kontrol grubu: 6 adet çoğaltma kuyusu
      Tedavi grubu: 6 replike kuyusu (fenofibrat ile muamele edilmiş)
  2. İlaç çözeltisi hazırlama
    1. Fenofibrat çalışma solüsyonunu önceden ısıtılmış taze ortamda optimum konsantrasyonda (ör., 100 μM).
      NOT: Tedavi grupları, daha sonra taze önceden ısıtılmış ortamda seyreltilen stok çözeltileri oluşturmak için% 100 DMSO'da yeniden oluşturuldu. Kontrol gruplarına, ilaçla tedavi edilen örneklerde mevcut olanla aynı nihai DMSO konsantrasyonu (% 0.1 v / v) uygulandı. Nihai konsantrasyon, doz-yanıt testleri ile belirlendi.
  3. Orta değiştirme
    1. Duvar boyunca yavaşça her kuyucuktan 100 μL ortam aspire edin.
      NOT: Küresel rahatsızlığı önlemek için kuyu dibine temas etmekten kaçının.
    2. Kontrol kuyucuklarına 100 μL taze ortam ekleyin.
    3. Tedavi kuyularına 100 μL fenofibrat çalışma çözeltisi ekleyin.
  4. Tedavi sonrası inkübasyon
    1. Plakayı %5 CO2 inkübatörde yavaşça 37 °C'ye geri koyun. 72 saat için kültür.
  5. Morfolojik değerlendirme
    1. Adım 4'teki görüntüleme prosedürünü takiben sferoidlerin bütünlüğünü değerlendirin.

6. Hücre sferoidlerinin transferi

  1. Sferoid içeren düşük bağlantılı plakayı görüntüleme sisteminden dikkatli bir şekilde çıkarın ve bir biyogüvenlik kabini içinde steril bir yüzeye yerleştirin. Poli-L-lizin kaplı tahlil plakasını transfer için birbirine bitişik olarak yerleştirin.
  2. Hücre sferoidlerinin zarar görmeden nazikçe aspirasyonunu kolaylaştırmak için 20 μL'lik bir pipetin ucunu kesin.
  3. Her bir sağlam sferoidi kuyunun dibinden nazikçe aspire edin ve hücre plakasının karşılık gelen kuyucuğuna aktarın ve 20 saniye boyunca oturmasına izin verin. 10 × mikroskobunun altında yüzen parçaların yokluğuyla yapışmayı onaylayın.
  4. Tüm sferoidler için tekrarlayın ve 4. adımda açıklanan görüntüleme sistemi aracılığıyla aktarım verimliliğini doğrulayın.

7. Metabolik tahlil

  1. Numune gaz giderme
    1. İlaçla tedavi edilmiş sferoid tahlil plakasını CO2 içermeyen önceden dengelenmiş 37 ° C'lik bir hidrasyon odasına yerleştirin.
      NOT: Metabolik ölçüm doğruluğunu sağlamak için sıkı çevresel kontrol ile 1 saat boyunca sürekli gaz giderme işlemi gerçekleştirilmiştir.
  2. Reaktif hazırlama ve ilaç uygulaması
    1. Paralel olarak reaktifi hazırlayın ve 1 saatlik gaz giderme süresi boyunca ilacı yükleyin.
      NOT: Bu deneyin birincil amacı mitokondriyal stresi değerlendirmektir; Tüm prosedürler bu hedefle titizlikle uyumlu hale getirilmelidir. Veri doğruluğunu ve güvenilirliğini garanti etmek için farklı deney türleri için özel protokoller izlenmelidir.
    2. İlaç hazırlama: Aşağıdaki bileşikleri kullanın:
      Oligomisin (mitokondriyal kompleks V inhibitörü)
      Karbonil siyanür-4 (triflorometoksi) fenilhidrazon (FCCP, birleştirici)
      Rotenon (bir kompleks I inhibitörü) ve antimisin A (bir kompleks III inhibitörü) karışımı
      NOT: İlaçlar bu çalışmada kullanılan Mitokondriyal Stres Test Kitinden elde edilmiştir. Bazı bileşikler biyolojik olarak tehlikelidir; Sıkı biyogüvenlik protokolleri (kişisel koruyucu ekipman ve acil durum hazırlığı) kullanılmalıdır.
    3. İlaç formülasyonu
      1. Toz haline getirilmiş ilaçların stok çözeltilerini Tablo 1'de gösterildiği gibi hazırlayın.
      2. Stok çözeltilerini Tablo 2'de belirtilen çalışma konsantrasyonlarına seyreltin.
        NOT: Çözeltiler, konsantrasyon gradyanları arasında homojenliği sağlamak için iyice girdaplanır veya çalkalanır.
  3. Bileşiklerin algılama probu kartuşlarına yüklenmesi
    NOT: Algılama probu kartuşu, oksijen ve pH'ın gerçek zamanlı ölçümü için biyosensör probları içeren tek kullanımlık bir kartuştur.
    1. Prob kartuşu aktivasyonu (bileşik yüklemeden önce gelmelidir):
      NOT: Kullanmadan en az 12 saat önce bu adımları tamamlayarak sensörün etkinleştirildiğinden emin olun:
      1. Hidrasyon plakasının her bir oyuğuna 200 μL kalibran solüsyonu ekleyin.
      2. Algılama probu kartuşunu dikkatli bir şekilde hidrasyon plakasına yerleştirin ve tüm probların kalibant çözeltisine tamamen daldırılmasını sağlayın.
      3. Sensörleri etkinleştirmek için monte edilen üniteyi 37 °CCO2 içermeyen bir inkübatörde 12-24 saat inkübe edin.
        NOT: Eksik daldırma veya yetersiz hidrasyon, ölçüm sapmasına neden olur (%±15 OCR hatası).
    2. Kuyucuklara hassas hacimler vermek için çok kanallı veya elektronik pipetler kullanın ve kuyu kenarlarında artık damlacıklardan kaçının.
      NOT: Akut ilaç stimülasyonu gerekmediğinden, standart yükleme dizilerini takip edin.
    3. Taşıma sırasında rahatsızlıkları önlemek için yüklemeden sonra prob plakasını sabit bir yüzeye yerleştirin.
      NOT: Yükleme doğruluğu sonuçları önemli ölçüde etkiler.
  4. Yazılım yapılandırması
    1. Yazılımı başlatın ve mitokondriyal stres testi test protokolünü seçin.
    2. Grupları önceden tanımlanmış deneysel gruplandırmaya göre atayın.
    3. Dosya adını ayarlayın ve Çalıştırmayı Başlat'a tıklayın.
  5. Algılama probu kartuşlarının kalibrasyonu.
    1. Yüklenen prob plakasını sistem istemine göre cihaz yuvasına yavaşça yerleştirin.
    2. Kalibrasyonu başlatın (15-20 dk). İstikrarlı koşulları koruyun; Titreşimlerden kaçının.
    3. Kalibrasyondan hemen sonra hidrasyon plakasını çıkarın (ekrandaki talimatları izleyerek).
      NOT: Kalibrasyondan önce plaka kapağını çıkarın.
  6. 3D sferoidlerin metabolik profilinin çıkarılması
    1. Gazdan arındırılmış 3D küresel tahlil plakasını cihaz ölçüm yuvasına aktarın. Aşağıdakileri onaylayarak prob dizisi ile hassas hizalama sağlayın: (i) Plaka köşe eşleşme yuvası kılavuzları; (ii) Kuyu A1, indekslenmiş konumla hizalanır; (iii) Plaka ve cihaz yüzeyi arasında görünür bir boşluk yok
    2. Mitokondriyal stres testlerini başlatmak için Başlat'a tıklayın (süre: ~ 1,5 saat). Cihaz parametrelerini baştan sona izleyin.
      NOT: Ölçümden önce 3D küresel tahlil plakası kapaklarını çıkarın.
  7. Veri analizi
    1. Görüntüleme analizi
      1. 3D sferoid tahlil plakalarını yüksek içerikli bir görüntüleme sistemine aktarın.
        NOT: Görüntüler 4. adımda açıklandığı gibi alınmıştır. Görüntüleme, sferoidlerin çoğunluğunun sağlam kaldığını, buna karşın Şekil 3'te gösterildiği gibi transfer işlemi sırasında azınlığın hasar gördüğünü ortaya koydu.
      2. Harmony yazılım sürümü 5.2 aracılığıyla, 7.7.1.3-7.7.1.7 adımlarını izleyerek hücre sferoidlerinin morfolojik verilerini (örn. alan, uzunluk, genişlik) analiz edin.
      3. Görüntü içeriğini görüntülerdeki nesnelerin doku özelliklerine göre üç kümeye bölerek 3B sferoidleri arka plandan ayırmak için Doku Bölgesi modülünü kaba bir şekilde uygulayın.
      4. Safsızlıkları gidermek ve bozulmamış sferoidleri korumak için hacim tabanlı boyut özellikleri aracılığıyla önceden yalıtılmış 3B sferoidlerin ayrımını iyileştirmek için Görüntü Bölgesi Bul modülünü uygulayın.
      5. Morfoloji Özellikleri modülü aracılığıyla 3D sferoidlerin morfolojik parametrelerini ölçün.
      6. Orijinal 3B hücre sferoidlerini filtrelemek için Popülasyon Seç modülünü uygulayın.
      7. Morfolojik veri sonuçlarını Tablo 3'te gösterildiği gibi dışa aktarın.
    2. Bilgi işlem
      NOT: Deneysel artefaktları en aza indirmek için görüntüleme çıktılarından gelen parametreler aracılığıyla hücre verilerini normalleştirin.
      1. Ham metabolik verileri analiz yazılımı aracılığıyla açın.
      2. Normalleştirme modu düzenleme arayüzüne erişmek için Normalleştirme Seçeneğini seçin.
      3. Normalizasyon Değerleri alanına tahlil plakasının karşılık gelen her bir oyuğunda bulunan sferoidlerin kesit alanını girin.
      4. Ölçek faktörü parametresini 1.000.000 olarak ayarlayın.
      5. Normalleştirme işlemini sonlandırmak için Uygula düğmesine tıklayın. Nihai sonuçlar Şekil 4'te gösterilmektedir.

8. Atık bertarafı

  1. Tüm deneysel atıkları (ortam, reaktifler, sarf malzemeleri ve hücre süspansiyonları) biyolojik tehlike ve laboratuvar atık yönetimi protokollerine göre atın. Çevresel kontaminasyonu önlemek için biyoaktif atıkları atmadan önce otoklavlayın veya kimyasal olarak dezenfekte edin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

3D hücre sferoidlerinin enerji metabolizması tespit sürecindeki en kritik üç adım, 3D hücre sferoidlerinin kültürü, sferoid transfer süreci ve tespitten sonra sferoidlerin görüntülenmesi ve miktarının belirlenmesidir (Şekil 1). Ek olarak, hücre sferoidlerinin durumunu gözlemlemek son derece önemlidir. Deneyler yukarıda belirtilen deneysel prosedürlere göre yapıldığında, 5. günde sferoidler tespit edildi (Şekil 2) ve sferoidler ortalama yaklaşık 50.000...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre dışı akı analizinin 3D glioma modellerine uyarlanması, tümör hücresi metabolizması çalışmasında kritik bir metodolojik ilerlemeyi temsil etmektedir. Geleneksel 2D kültürler uzun süredir in vitro deneylerin temelini oluştururken, in vivo tümörlerin mekansal mimarisini, hücre-hücre ve hücre-matris etkileşimlerini ve karakteristik oksijen ve besin gradyanlarını yakalayamazlar12. Bu özellikler, metabolik yeniden programlamanın tümör ilerlemesin...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu araştırma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı tarafından finanse edildi, 82471329 ve 82001248 numaralı hibeler.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
10 cm çanakCorning430167
15 mL santrifüj tüpüCorning430791
50 mL santrifüj tüpüCorning430828
Calcein,DavetliC1430 Serisi
Kontes 3Termo BalıkçıOtomatik Hücre Sayacı
Fetal Sığır SerumuGibcoA5669701
Uyum 5.2PerkinElmer ÖdülüGörüntüleme yazılımı
Hoechst 33342Güneş EnerjisiC0031
MEM EBSS OrtaHyCloneSH30024.01
Operet CLSPerkinElmer ÖdülüYüksek içerikli görüntüleme analiz sistemi
PBSHyCloneSH30256.01
Poli-D Lizin hidrobromürSigma P7280 Serisi
Yuvarlak tabanlı ultra düşük ataşmanlı 96 oyuklu plakalarCorning4515
Seahorse Wave Masaüstü yazılımıGilent
Denizatı XFe96GilentEkstrakorporeal metabolik test cihazı
Sorvall ST8RTermo BalıkçıMerkezkaç
TRIPSIN %0.25 EDTAGibco25200072
U87MG hücre hattı Hücre Kaynağının Ulusal Altyapısı
XF 1,0 m glikoz çözeltisi, 50 mLGilent103577-100
XF 100 mM Piruvat Çözeltisi, 50 mLGilent103578-100
XF 200 mM Glutamin Çözeltisi, 50 mLGilent103579-100
XF Kalibrant Solüsyonu 500 mL Gilent100840-000
XF Cell Mito Stres Test KitiGilent103015-100
XF DMEM Ortamı, pH 7,4, 500 mLGilent103575-100
XFe96/XF Pro Fluxpak Algılama Probu DizisiGilent103792-100
XFe96/XF Pro Fluxpak-Metabolik Test PlakalarıGilent103792-100

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wu, W., et al. Glioblastoma multiforme (GBM): An overview of current therapies and mechanisms of resistance. Pharmacol Res. 171, 105780(2021).
  2. Crowley, A. E. 85th annual report on medical education in the United States. Executive summary. Jama. 254 (12), 1553-1554 (1985).
  3. Zhang, X., et al. Nutritionally physiological cell culture medium and 3D culture influence breast tumor proteomics and anticancer drug effectiveness. Pharmacol Res. 210, 107519(2024).
  4. Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. Assay Drug Dev Technol. 12 (4), 207-218 (2014).
  5. Bahl, R., et al. Growing desmoplastic three-dimensional pancreatic cancer spheroids from coculture. J Vis Exp. 211, e66625(2024).
  6. Faubert, B., Solmonson, A., Deberardinis, R. J. Metabolic reprogramming and cancer progression. Science. 368 (6487), eaaw5473(2020).
  7. Baksh, S. C., Finley, L. W. S. Metabolic diversity drives cancer cell invasion. Nature. 605 (7911), 627-628 (2022).
  8. Yoshida, G. J. Metabolic reprogramming: The emerging concept and associated therapeutic strategies. J Exp Clin Cancer Res. 34, 111(2015).
  9. Plitzko, B., Loesgen, S. Measurement of oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in culture cells for assessment of the energy metabolism. Bio Protoc. 8 (10), e2850(2018).
  10. Hong, X., Muñoz-Cánoves, P. Measuring oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in muscle stem cells using a Seahorse analyzer: Applicability for aging studies. Methods Mol Biol. 2640, 73-88 (2023).
  11. Yoo, I., Ahn, I., Lee, J., Lee, N. Extracellular flux assay (Seahorse assay): Diverse applications in metabolic research across biological disciplines. Mol Cells. 47 (8), 100095(2024).
  12. Kapałczyńska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Arch Med Sci. 14 (4), 910-919 (2018).
  13. Rybkowska, P., et al. The metabolic changes between monolayer (2D) and three-dimensional (3D) culture conditions in human mesenchymal stem/stromal cells derived from adipose tissue. Cells. 12 (1), 178(2023).
  14. Białkowska, K., Komorowski, P., Bryszewska, M., Miłowska, K. Spheroids as a type of three-dimensional cell cultures-examples of methods of preparation and the most important application. Int J Mol Sci. 21 (17), 6225(2020).
  15. Pinto, B., Henriques, A. C., Silva, P. M. A., Bousbaa, H. Three-dimensional spheroids as in vitro preclinical models for cancer research. Pharmaceutics. 12 (12), 1186(2020).
  16. Juarez-Moreno, K., Chávez-García, D., Hirata, G., Vazquez-Duhalt, R. Monolayer (2D) or spheroids (3D) cell cultures for nanotoxicological studies? Comparison of cytotoxicity and cell internalization of nanoparticles. Toxicol In Vitro. 85, 105461(2022).
  17. Renner, H., et al. A fully automated high-throughput workflow for 3D-based chemical screening in human midbrain organoids. Elife. 9, e52904(2020).
  18. Beaufort, I. N., et al. Author commentary on Ilse N. Beaufort et al. Endoscopy. 56 (5), v6(2024).
  19. Liu, D., Chen, S., Win Naing, M. A review of manufacturing capabilities of cell spheroid generation technologies and future development. Biotechnol Bioeng. 118 (2), 542-554 (2021).
  20. Trettner, K. J., Hsieh, J., Xiao, W., Lee, J. S. H., Armani, A. M. Nondestructive, quantitative viability analysis of 3D tissue cultures using machine learning image segmentation. APL Bioeng. 8 (1), 016121(2024).
  21. Dominijanni, A. J., Devarasetty, M., Forsythe, S. D., Votanopoulos, K. I., Soker, S. Cell viability assays in three-dimensional hydrogels: A comparative study of accuracy. Tissue Eng Part C Methods. 27 (7), 401-410 (2021).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

H cre D Ak AnaliziOksijen T ketim H zGlikoliz AnaliziY ksek erikli G r nt lemePoli D Lizin Kaplama3D H cre K lt rFenofibrat Uygulamas

İlgili makaleler